專利名稱：一種新型乳腺癌基因治療藥物hdm2－siRNA的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種短干擾核糖核酸(short interfering RNA，siRNA)藥物的設(shè)計、合成及其對生長抑制作用、凋亡誘導(dǎo)作用、周期阻滯作用和體內(nèi)抗腫瘤作用的檢測等。
背景技術(shù)：
隨著環(huán)境污染的日益嚴重和其它生存條件的變化，近年來乳腺癌病人的死亡率逐漸升高，全球每年有50-100萬人死于乳腺癌。美國2003年乳腺癌死亡率在女性惡性腫瘤中僅次于皮膚癌(CA Cancer J Clin.2003，53(1)5-26)，而在北京地區(qū)其死亡率已成為女性惡性腫瘤之首。因此，對乳腺癌進行基因治療方面的研究具有一定的實際意義。
乳腺癌是受多個基因的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控作用，hdm2基因是1987年Cahilly等從轉(zhuǎn)化小鼠細胞系的雙微染色體上克隆成功的癌基因，在鼠和人的很多組織中都有表達，人hdm2基因定位于12號染色體長臂12q13-14，且有不同的mRNA剪接形式。人體許多器官都有hdm2 mRNA(5.5kb)的存在，以骨骼肌最高。1992年Oliner等首次報道hdm2基因在人體的一些軟組織和骨肉瘤中有擴增，Sheikh等發(fā)現(xiàn)在雌激素受體陽性的乳腺癌細胞系中hdm2 mRNA水平是雌激素受體陰性的乳腺癌細胞系的30倍，5％-10％的人類腫瘤中雖無基因擴增但有hdm2過度表達，hdm2的基因擴增也與細胞的成瘤性及腫瘤的轉(zhuǎn)移密切相關(guān)(Cancer Research.1993，53(4)3226-3228)。HDM2的一個重要功能是抑制野生型p53的轉(zhuǎn)錄激活功能及抗腫瘤活性。由于野生型p53具有抑制腫瘤生長的作用，已成為腫瘤基因治療的一個重要靶標。當(dāng)細胞受到某種刺激而使p53升高時，它可以激活hdm2基因轉(zhuǎn)錄，增加HDM2的胞內(nèi)蛋白水平，而HDM2蛋白N端又可以與p53的N端轉(zhuǎn)錄激活功能區(qū)相結(jié)合，抑制其激活轉(zhuǎn)錄功能，同時促進p53蛋白經(jīng)泛素化途徑降解，使之失活，將p53的生長抑制活性限制在一種相對平衡的水平上，使細胞能夠繼續(xù)增殖。因此，從理論上講，若能降低HDM2基因的表達水平，即可以解除HDM2與p53的相互作用，恢復(fù)野生型p53介導(dǎo)周期阻滯和細胞凋亡的功能，從而抑制腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。
以干擾HDM2-p53的相互作用為靶點而設(shè)計或得到的藥物目前主要有人工合成多肽、微生物代謝產(chǎn)物、及非肽類的小分子化合物等，它們主要是通過阻止HDM2與p53的相互結(jié)合來發(fā)揮作用。通過降低HDM2的表達水平來發(fā)揮作用的反義核酸也是干擾HDM2-p53相互作用的一類主要藥物。有報道表明，針對HDM2基因的反義核酸在體內(nèi)和體外實驗中均有一定的抗腫瘤作用。但是，由于反義核酸本身具有一定的局限性，其特異性不夠強及給藥劑量偏高等問題使其進一步的應(yīng)用研究進展緩慢。而1998年發(fā)現(xiàn)的RNA干擾(RNAi)現(xiàn)象，是從低等生物到高等生物都普遍存在的一種防御外源性核酸侵擾的生理機制，它是由siRNA介導(dǎo)的高度特異的轉(zhuǎn)錄后基因沉默效應(yīng)(Nature.1998，391806-811)。通過siRNA發(fā)揮導(dǎo)向作用來激活RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplex，RISC)，由其中的RNase III來高度特異地切割靶mRNA。RNA干擾技術(shù)已發(fā)展成為抑制靶基因表達的一個有效工具。
雖然RNAi的研究尚處于不完善階段，但它已被認為是一種生物體固有的基因組“免疫系統(tǒng)”，使得它具有許多反義核酸不可比的優(yōu)勢。siRNA與反義核酸相比具有如下一些特點前者是由雙鏈RNA分子在細胞內(nèi)發(fā)揮作用，由于細胞內(nèi)可能存在某種穩(wěn)定機制，使得siRNA的穩(wěn)定性較高；siRNA的正義鏈和反義鏈在反應(yīng)過程中都是必需的，而不是僅由一條反義鏈來發(fā)揮作用；siRNA本身沒有催化活性，要求有許多輔助因子形成復(fù)合體才能發(fā)揮作用；在某些生物體內(nèi)發(fā)現(xiàn)RNAi還具有遺傳性，擴增性和可傳遞性。正是由于這些特點，使RNAi與傳統(tǒng)的反義技術(shù)相比具有高效性，高特異性的特點(Lancet.2001，358(9282)489-497)。目前已有大量報道表明，向哺乳動物和人類的細胞中導(dǎo)入siRNA可以引起靶mRNA分子高效特異的降解。
因此，以這種生物體本身存在的RNA干擾機制為基礎(chǔ)，人工設(shè)計并合成針對hdm2基因的特異siRNA作為誘發(fā)RNA干擾的前體，高效特異地降解hdm2基因的mRNA，降低HDM2蛋白水平，誘導(dǎo)腫瘤細胞發(fā)生凋亡和周期阻滯，殺死腫瘤細胞，可以為乳腺癌等腫瘤的基因治療提供更為有效的藥物。
本發(fā)明目的在于以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，設(shè)計針對hdm2基因的siRNA藥物，闡明hdm2-siRNA對人乳腺癌MCF-7細胞的生長抑制作用、對細胞凋亡和周期阻滯的誘導(dǎo)作用，及其對體內(nèi)移植腫瘤的生長抑制作用，為hdm2-siRNA在乳腺癌基因治療中的應(yīng)用提供一定的理論依據(jù)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明以RNA干擾技術(shù)為基礎(chǔ)，從GenBank中獲得hdm2基因的cDNA序列，根據(jù)siRNA靶序列選擇的基本原則，針對hdm2基因設(shè)計了長度為21個核苷酸的siRNA，siRNA的3’端有兩個脫氧核糖核苷酸(dTdT)呈單鏈懸掛狀態(tài)，以此增強siRNA在體內(nèi)和體外對核酸酶(RNase)的耐受性。本發(fā)明中所使用的siRNA系由本發(fā)明人自行設(shè)計、委托美國Dharmacon公司通過化學(xué)法合成的。本發(fā)明涉及利用MTT法檢測siRNA對腫瘤細胞的細胞毒作用，以不同濃度的siRNA進行轉(zhuǎn)染，用MTT法檢測轉(zhuǎn)染后活細胞生存率，根據(jù)劑量反應(yīng)曲線計算出siRNA對腫瘤細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)。結(jié)果表明，不對任何基因產(chǎn)生沉默作用的mock-siRNA對MCF-7細胞的IC50為2416nM，hdm2-siRNA對MCF-7細胞的IC50為137nM，hdm2-siRNA對MCF-7細胞的生長抑制作用強于已公開專利(申請?zhí)?2159031.1)報道的mdm2-siRNA(其IC50為173nM)。本發(fā)明還涉及采用RT-PCR法檢測hdm2-siRNA對靶mRNA的影響。細胞經(jīng)100nMhdm2-siRNA處理24h后，進行一步法RT-PCR反應(yīng)。結(jié)果顯示，經(jīng)hdm2-siRNA處理后細胞hdm2基因的mRNA水平明顯下降，而經(jīng)mock-siRNA處理后細胞hdm2基因的mRNA水平?jīng)]有變化。本發(fā)明同時涉及用Western Blotting法檢測hdm2-siRNA的沉默作用。采用100nM hdm2-siRNA分別處理細胞6，12，24，36，48h，和分別采用5nM，50nM，100nM，500nM的hdm2-siRNA處理細胞36 h，Western Blotting結(jié)果顯示，hdm2-siRNA對HDM2蛋白水平的影響呈現(xiàn)明顯的時間和劑量依賴效應(yīng)，100nM和500nM siRNAs分別在48h和36h對HDM2水平產(chǎn)生明顯的抑制作用，而mock-siRNA對HDM2蛋白水平?jīng)]有影響。本發(fā)明還涉及用TUNEL標記法檢測hdm2-siRNA的凋亡誘導(dǎo)作用。結(jié)果顯示，細胞經(jīng)300nM hdm2-siRNA處理36h后，細胞發(fā)生明顯的DNA斷裂，提示hdm2-siRNA能夠誘導(dǎo)MCF-7細胞發(fā)生凋亡。本發(fā)明還涉及用流式細胞法檢測hdm2-siRNA對細胞周期的影響。結(jié)果顯示，以300nM hdm2-siRNA處理后，細胞發(fā)生明顯的G1期阻滯，G1期細胞的百分比由49.8％增加到83.2％。本發(fā)明還涉及hdm2-siRNA體內(nèi)抗腫瘤作用的檢測，采用MCF-7腫瘤細胞裸鼠體內(nèi)移植模型來檢測hdm2-siRNA的體內(nèi)抑制腫瘤增殖作用。hdm2-siRNA的給藥劑量為0.5mg/kg，每隔一天給藥，共給藥8次。結(jié)果顯示，hdm2-siRNA在體內(nèi)能夠有效地抑制腫瘤的生長。在第29天，hdm2-siRNA對腫瘤的抑制率為60％。實驗中發(fā)現(xiàn)，mock-siRNA也對腫瘤生長有一定的抑制作用。hdm2-siRNA還可能增強DNA損傷類藥物的抗腫瘤活性。將hdm2-siRNA與絲裂霉素C聯(lián)合用藥，絲裂霉素C的給藥劑量是0.5mg/kg，在第5，8，13，21天共給藥4次，hdm2-siRNA的給藥劑量同前。結(jié)果顯示，hdm2-siRNA能夠協(xié)同增強絲裂霉素C的抗腫瘤作用，在第23天，聯(lián)合用藥組腫瘤生長抑制率是88.8％，hdm2-siRNA和絲裂霉素C單獨給藥組的抑制率分別是67.8％和46.8％，在停藥后仍舊能夠觀察到這種協(xié)同作用。實驗中對照組和給藥組裸鼠的體重接近，且各組均無動物死亡。
綜上所述，本發(fā)明提出了獲取靶基因序列并設(shè)計特異siRNA的方法，建立了檢測siRNA細胞毒作用、基因沉默作用、凋亡和周期阻滯誘導(dǎo)作用及體內(nèi)抗腫瘤作用的一系列方法。所有結(jié)果表明，hdm2-siRNA可能成為一種新型的乳腺癌基因治療藥物。
發(fā)明效果本發(fā)明以RNA干擾為技術(shù)平臺，提出了一種全新的乳腺癌基因治療藥物hdm2-siRNA的一系列研究方法，包括siRNA設(shè)計、體外生長抑制作用檢測、mRNA和蛋白水平沉默效果檢測、誘導(dǎo)細胞凋亡和周期阻滯作用檢測、體內(nèi)抗腫瘤作用檢測等。合成的hdm2-siRNA能夠高效特異地降低靶mRNA和靶蛋白水平，誘導(dǎo)細胞凋亡和周期阻滯的發(fā)生，對MCF-7細胞的半數(shù)抑制濃度(IC50)為137nM，其生長抑制作用強于已公開專利報道的mdm2-siRNA(其IC50為173nM)。與絲裂霉素聯(lián)合用藥對體內(nèi)移植腫瘤的生長抑制率達88％。因此，hdm2-siRNA對乳腺癌等腫瘤的基因治療有著廣泛的應(yīng)用前景。


圖1.hdm2-siRNA對MCF-7細胞的劑量-反應(yīng)曲線，其中■-hdm2-siRNA○-轉(zhuǎn)染mock-siRNA組圖2.hdm2-siRNA降低靶mRNA水平。其中Marker泳道-DNA分子量標準Control泳道-未轉(zhuǎn)染任何siRNA組Mock泳道-轉(zhuǎn)染mock-siRNA組siRNA泳道-轉(zhuǎn)染hdm2-siRNA組圖3.hdm2-siRNA降低靶蛋白水平。其中Control泳道-未轉(zhuǎn)染任何siRNA組Mock泳道-轉(zhuǎn)染mock-siRNA組siRNA泳道-轉(zhuǎn)染hdm2-siRNA組圖4.hdm2-siRNA誘導(dǎo)MCF-7細胞DNA斷裂。其中Control泳道-未轉(zhuǎn)染任何siRNA組
Mock泳道-轉(zhuǎn)染mock-siRNA組hdm2-siRNA泳道-轉(zhuǎn)染hdm2-siRNA組圖5.hdm2-siRNA的體內(nèi)抗腫瘤作用。其中○-以生理鹽水作為對照組□-瘤內(nèi)注射mock-siRNA組●-瘤內(nèi)注射hdm2-siRNA組■-瘤內(nèi)注射絲裂霉素組△-瘤內(nèi)注射絲裂霉素和hdm2-siRNA組以下實施例是為所屬領(lǐng)域技術(shù)人員更好地理解本發(fā)明，但不以任何方式限制本發(fā)明。
實施例1siRNA靶序列的選擇首先，從特定基因完整cDNA序列起始密碼子下游的50個核苷酸以后和終止密碼子前100個核苷酸之間的序列中選擇21個核苷酸靶區(qū)域可能更為有效(Genes and Development 2001，15188-200)。由于5’或3’的非翻譯區(qū)及起始密碼子附近調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合位點較多，所以一般不選擇這些部位。非翻譯區(qū)的結(jié)合蛋白和翻譯起始復(fù)合物可能會對短干擾核糖核蛋白(short interferingRibonucleoprotein，siRNP)和RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體(RNA-induced silencingcomplex，RISC)與靶mRNA的結(jié)合有影響。所用的序列一般是前兩個為AA后兩個為TT且G/C含量在30％-50％的21核苷酸序列。如果cDNA中不含有這樣的序列，也可采用僅前兩個核苷酸為AA的21核苷酸序列。這種情況下，在合成siRNA時需將其正義鏈3’端后兩個核苷酸變?yōu)門T。如果靶mRNA上沒有前兩個為AA的21核苷酸序列，那就采用僅第二個核苷酸為A的21核苷酸序列，或者不選擇有A開頭的序列。此外RNaseIII能夠較為高效地在GG，GA或AU間快速切斷其間的共價鍵，而高度保守的CGG序列可能是一個甲基化酶作用中心，若能夠在siRNA的正義鏈序列中盡量含有2-3個酶切序列即GG，GA或AU和一個CGG序列，形成一個酶切中心CGGG(A)N(N為A，U，C)，使它們中的第二個G位于siRNA中第十或第十一位，則可能有利于提高siRNA對靶mRNA的切割效率。此外，還要考慮設(shè)計的siRNA所在靶序列位置是否存在單核苷酸多態(tài)性(SNP)，及siRNA的正義鏈和反義鏈的能量值等項指標，這些都有利于得到更有效的siRNA。
選定靶序列后要對其同源性進行檢索，使該靶序列與其它基因不具有較高的同源性，同時盡量選擇針對靶基因或者其整個基因家族中高保守序列位置的siRNA序列進行合成。合成出的siRNA雙鏈是由21個核苷酸的正義鏈和反義鏈組成，每條鏈的3’端都懸掛突出兩個核苷酸dTdT，中間19個核苷酸配對，正義鏈和反義鏈3’端的懸掛突出序列dTdT是對稱的。siRNA正義鏈懸掛突出部分的修飾不會影響其對靶mRNA的識別，而反義鏈該部分的修飾則可引導(dǎo)其對靶mRNA的識別。懸掛突出的兩個脫氧核糖核苷酸與核糖核苷酸同樣有效，但前者合成更便宜，而且可耐受更多的核酸酶，同時3’懸掛突出部分用dTdT的方式也可提醒合成者采用正確的合成方向(Nature 2001，411494-498)。所以本發(fā)明選擇懸掛突出為dTdT的siRNA序列(PNAS 2001，9814428-14433)。本發(fā)明所使用的siRNA雙鏈復(fù)合體純度＞97％。用水溶解RNA雙鏈后，可直接用于轉(zhuǎn)染。這種方式可保證雙鏈復(fù)合體以適當(dāng)形式存在并易于轉(zhuǎn)染。
綜合以上多方面因素，本發(fā)明設(shè)計了實驗中所需要的hdm2-siRNA序列，經(jīng)后續(xù)的實驗證明所設(shè)計的siRNA序列能夠有效抑制靶基因的表達。
本發(fā)明從GenBank中獲得了hdm2基因序列，它在GenBank中的登錄號以及對應(yīng)的siRNA序列相對于起始密碼子的位置如下hdm-2(Acc.No.NM_002392) 61-79hdm2-siRNA的靶mRNA序列及siRNA寡核苷酸序列如下mRNA Target(AA-N19)5’-AAG CUU C AAG AGA CCC-3’(SEQ ID No1)寡核苷酸序列為5’-G CUU CGG AAC AAG AGA CCCdTdT-3’(SEQ ID No2)3’-dTdTC GAA GCC UUG UUC UCU GGG-5’(SEQ ID No3)在上面的hdm2-siRNA靶序列中含有一個CGGAA酶切中心，與已公開專利(申請?zhí)?2159031.1)的mdm2-siRNA靶序列完全不同。
實驗中采用的mock-siRNA序列為mRNA Target(AA-N19)5’-AAAAUAGUGUAUACGGCAUGC-3’.
寡核苷酸序列為5’-AAU AGU GUA UAC GGC AUG CdTdT-3’3’-dTdTU UAU CAC AUA UGC CGU ACG-5’實施例2
siRNA的傳染本發(fā)明使用LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體(Life Technologies，產(chǎn)品貨號11668-027)進行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后18-45小時進行沉默效果測定。將合成的siRNA粉末用水溶解，配成4000nM的儲備溶液。實驗細胞是在轉(zhuǎn)染前18-20小時用200μl含10％胎牛血清的無抗生素DMEM組織培養(yǎng)液以6000-8000個/孔接種到96孔板中。將4000nM的siRNA用無抗生素?zé)o血清的Opti-MEM培養(yǎng)液分別稀釋至120nM、400nM、1200nM、2000nM、4000nM各75μl，在另外一個Eppendorf管中，向370μl Opti-MEM培養(yǎng)液中加入5μl脂質(zhì)體，孵育5分鐘后，向各濃度的siRNA溶液中分別加入75μl脂質(zhì)體稀釋液并輕輕混勻。siRNA與脂質(zhì)體復(fù)合物于室溫靜置20分鐘后，把50μl siRNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加到細胞培養(yǎng)板(細胞生長覆蓋率為80％-90％)中。細胞在給藥前用無抗生素?zé)o血清的DMEM培養(yǎng)液洗一遍后，再加入新的50μl無抗生素?zé)o血清Opti-MEM培養(yǎng)液。這樣，轉(zhuǎn)染后每孔溶液終體積為100μl。各孔中siRNA的給藥濃度分別為30nM、100nM、300nM、500nM、1000nM，每個濃度同時作三個平行孔，每次實驗至少重復(fù)三次。轉(zhuǎn)染后五小時，每孔中補加100μl Opti-MEM培養(yǎng)液。第一次轉(zhuǎn)染后每間隔15小時，同樣方法進行第二次、第三次轉(zhuǎn)染。本發(fā)明所采用的乳腺癌MCF-7細胞來源于美國經(jīng)典細胞庫(ATCC HTB22)，由本室自行凍存。轉(zhuǎn)染后用MTT法測定細胞存活率，計算IC50值。
實施例3用MTT法檢測siRNA對腫瘤細胞的生長抑制作用按實施例2方法轉(zhuǎn)染的細胞在37℃，含5％CO2空氣及100％濕度的溫箱中孵育45小時左右。MTT用PBS緩沖液配成2mg/ml溶液，每孔加50μl，37℃溫育4小時，使MTT還原為Formazan。吸出上清液，加入150μl DMSO(二甲基亞砜)使Formazan溶解。用酶標儀(Mode13550，Bio-Rad)在570nm處測定每個孔的光密度OD570。將各測試孔的OD值減去本底OD值(完全培養(yǎng)基加MTT，無細胞)或空白藥物孔OD值(完全培養(yǎng)基加受試藥物的不同稀釋度加MTT，無細胞)，各重復(fù)孔的OD值取平均數(shù)±SD。細胞的存活率以T/C％表示，T為加藥細胞的OD值，C為對照細胞的OD值。細胞存活率％＝(加藥細胞OD/對照細胞OD)×100，求出T/C＝50％時的藥物濃度即IC50，同時繪出hdm2-siRNA對MCF-7細胞的劑量反應(yīng)曲線(圖1)，mock-siRNA對MCF-7細胞的IC50為2416nM，hdm2-siRNA對MCF-7細胞的IC50為137.7nM，而去年公開專利(申請?zhí)?2159031.1)的mdm2-siRNA對MCF-7細胞的IC50為173nM。因此，hdm2-siRNA較mdm2-siRNA有更強的生長抑制作用。
實施例4RT-PCR檢測siRNA的基因沉默效果細胞經(jīng)100nM siRNA處理24小時后，倒掉培養(yǎng)液加入TRIzol(Ivitrogen，產(chǎn)品貨號15596-026)，每平方厘米加1ml TRIzol試劑，提取總RNA，并用紫外分光光度計(BECKMAN DU800)測定RNA的濃度和質(zhì)量。采用RT-PCR試劑盒(Invitrogen，Cat.No.10928-34)進行對mRNA水平的檢測，反應(yīng)時加入每種總RNA1μg作為模板，10μM的β-actin對照引物各加0.5μl，10μM的hdm2引物各加1μl，反應(yīng)體系為25μl，反應(yīng)條件如下50℃×30min反轉(zhuǎn)錄，之后94℃×1min打開雙螺旋，94℃×15sec，57℃×30sec，72℃×40sec，反應(yīng)進行30循環(huán)，最后延伸反應(yīng)72℃×10min。RT-PCR反應(yīng)完成后將產(chǎn)物進行瓊脂糖電泳，EB染色后用凝膠成像儀照相并分析結(jié)果。結(jié)果表明hdm2-siRNA能夠有效降低hdm2基因mRNA的水平，而mock-siRNA對hdm2基因mRNA的水平?jīng)]有影響(圖2)。
實施例5Western Blotting檢測siRNA對靶蛋白水平的影響用2ml含10％胎牛血清的DMEM(Gibco公司產(chǎn)品)培養(yǎng)液在35mm細胞培養(yǎng)皿中于5％二氧化碳100％濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)MCF-7細胞，覆蓋率達到80％-90％時，按照LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體操作方案轉(zhuǎn)染100nM siRNA于細胞中，分別在6，12，24，36，48小時后，將細胞用預(yù)冷的1×PBS(本實施例中各種試劑和常規(guī)操作方法按照《分子克隆實驗指南》第二版中相關(guān)說明部分配制)洗兩遍，加入120μl新鮮配制的細胞裂解液(50mM Tris-HCl，pH7.5；1％NP-40；150mM NaCl；1mM PMSF，1mM EGTA，0.1mg/ml aprotinin；1mg/mlleupeptin；1mM Na3VO4；1mM NaF)，立即用細胞刮刀刮下細胞使其與裂解液充分混合，冰浴30分鐘至1小時。4℃、13,000g離心15分鐘，收集上清至新的EP管中，用標準Bradford法測定蛋白含量。取各樣品等量總蛋白(20-50μg)分別加入等體積的2倍上樣緩沖液，沸水煮沸變性5分鐘后于7.5％-12％的SDS-PAGE凝膠電泳分離各蛋白，按照《分子克隆實驗指南》第二版中相關(guān)部分說明轉(zhuǎn)印蛋白到PVDF膜上。轉(zhuǎn)完的膜浸于含5％(w/v)脫脂奶粉TBS溶液中后室溫振搖封閉過夜，TBS(10mM Tris HCl，pH7.5，150mM NaCl)室溫潤洗5次，每次5分鐘，裝入雜交袋，用含1％BSA的TBS溶液稀釋第一抗體，室溫振搖孵育3小時，TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。裝入新的雜交袋內(nèi)，用二抗(辣根過氧化物酶標記羊抗鼠二抗)室溫孵育3小時，TBS室溫潤洗5次，每次5分鐘。膜上滴加化學(xué)發(fā)光增強劑(Santa Cruz Biotechnology公司產(chǎn)品)，按照試劑說明進行操作，通過化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)ChemiImager5500(Alpha Innotech.)捕獲圖像?？贵w的稀釋比例如下，小鼠單克隆HDM2抗體(Santa Cruz產(chǎn)品，sc-5304)1/150稀釋，小鼠單克隆PCNA抗體(Oncogene Product，NA-03)1/200稀釋，辣根過氧化物酶標記羊抗鼠抗體(ZB-2305)1/3000稀釋。同樣方法分別用5，50，100，500nM的siRNA轉(zhuǎn)染細胞36小時后，檢測HDM2蛋白表達情況。結(jié)果表明hdm2-siRNA能抑制MCF-7細胞中相應(yīng)蛋白的表達，并呈現(xiàn)出時間和劑量依賴性，100nM和500nM siRNA分別在48h和36h對HDM2水平產(chǎn)生明顯的抑制作用，而經(jīng)mock-siRNA對HDM2蛋白水平?jīng)]有影響(圖3)。同時檢測PCNA(Proliferating cell nuclear antigen)蛋白表達量，作為上樣對照，以保證各組樣品總蛋白上樣量的一致。
實施例6TUNEL標記法檢測細胞凋亡細胞接種于含有經(jīng)100μg/ml多聚賴氨酸處理過的蓋玻片的培養(yǎng)瓶中，放入CO2孵箱培養(yǎng)18-20小時，使細胞覆蓋80％-90％瓶底面積，轉(zhuǎn)染300nMhdm2-siRNA，處理36小時，取出長有細胞的蓋玻片，用PBS洗3次。按照試劑盒說明書進行TUNEL標記法(Promega公司產(chǎn)品)檢測DNA斷裂情況。用Leica顯微成像系統(tǒng)(Leica Q500IW)拍攝圖像。結(jié)果顯示hdm2-siRNA可以使細胞發(fā)生DNA斷裂，表明hdm2-siRNA可誘導(dǎo)細胞凋亡，在圖像中呈現(xiàn)棕褐色斑點，而mock-siRNA對DNA斷裂的影響很小(圖4)。
實施例7流式細胞法檢測細胞周期變化按照LipofectAMINETM2000脂質(zhì)體操作方案轉(zhuǎn)染300nM hdm2-siRNA于細胞中，分別在0，12，24，36小時后，將細胞用胰蛋白酶消化，離心收集處理過的細胞，用冰冷的PBS緩沖液洗兩遍后，離心倒掉上清保留少許液體，加-20℃預(yù)冷的酒精至70％濃度，-20℃固定過夜，磷酸緩沖液洗3次后，經(jīng)0.5mg/mlRNase A消化30min，用終濃度65μg/ml的碘化丙錠(propidium iodide，PI)染色1h后，F(xiàn)ACS 420型流式細胞儀測定凋亡細胞百分率和細胞周期分布。結(jié)果表明hdm2-siRNA能夠使細胞發(fā)生G1期阻滯，G1期細胞所占百分比升高，而mock-siRNA對細胞周期的影響較小(表1)。
表1 siRNA對細胞周期分布比例的影響組別時間(小時)G1期比例(％)S期比例(％)G2期比例(％)0 49.839.810.412 70.322.57.2hdm2-siRNA24 77.612.99.536 83.212.04.90 68.725.65.8Mock-siRNA36 68.927.83.3實施例8體內(nèi)抗腫瘤作用檢測采用MCF-7細胞裸鼠體內(nèi)移植模型來檢測siRNA在體內(nèi)的抗腫瘤作用。選擇5-6周齡雌性BALB/c裸鼠，于無菌條件中飼養(yǎng)，將MCF-7細胞300-1000萬消化成單細胞后用無血清培養(yǎng)液洗一次，用不大于0.4ml的培養(yǎng)液懸浮細胞，用一次性注射器將細胞懸液注射至裸鼠右側(cè)腋窩。待瘤塊長至足夠大時，將其在生理鹽水中剪成2×2mm大小的小塊。用套管針將瘤塊移植到裸鼠右側(cè)腋窩，用火棉膠將切口粘住。待瘤塊長至大約4×4mm大小時，將裸鼠按瘤塊大小分組，使每組動物的瘤塊大小平均值約為4×4mm，同時考慮動物的體重，使各組動物體重的平均值接近。分組后進行給藥，siRNA采用瘤內(nèi)注射，劑量為0.5mg/kg，每隔一天給藥一次。siRNA與脂質(zhì)體的比例為1∶5，將siRNA與脂質(zhì)體混合后靜置20分鐘，再加入30μl的Opti-MEM培養(yǎng)液，采用微量注射器注射，注射后用火棉膠粘住皮膚上的針孔。注射時要分幾次向瘤塊的不同方向推進藥液，注意不能堵住注射器的針孔，注射器用乙醇消毒。用游標卡尺測量瘤塊的大小，每隔一天或兩天測量一次，根據(jù)公式ab2/2計算瘤塊的體積，a為長徑，b為短徑。計算每組動物的瘤塊體積平均值和S值。據(jù)此計算每組實驗中藥物對腫瘤生長的抑制率。同是觀察動物的體重變化和死亡情況。聯(lián)合用藥絲裂霉素C時，采用腹腔注射，0.5mg/kg，在第5，8，13，21天給藥。實驗設(shè)生理鹽水對照組，單獨siRNA組，單獨絲裂霉素組，mock-siRNA組，siRNA與絲裂霉素聯(lián)合用藥組。動物給藥并觀察一定天數(shù)后，將動物處死，取出瘤塊于液氮中保存，用來作免疫組化或RT-PCR等實驗。結(jié)果表明hdm2-siRNA在體內(nèi)能夠有效地抑制腫瘤的生長。在第29天，hdm2-siRNA對腫瘤的抑制率為60％。hdm2-siRNA還可能增強DNA損傷類藥物的抗腫瘤活性。將hdm2-siRNA與絲裂霉素C聯(lián)合用藥，絲裂霉素C的給藥劑量是0.5mg/kg，在第5，8，13，21天共給藥4次，hdm2-siRNA的給藥劑量同前。結(jié)果顯示，hdm2-siRNA能夠協(xié)同增強絲裂霉素C的抗腫瘤作用，在第23天，聯(lián)合用藥組腫瘤生長抑制率是88.8％，hdm2-siRNA和絲裂霉素C單獨給藥組的抑制率分別是67.8％和46.8％，在停藥后仍舊能夠觀察到這種協(xié)同作用(圖5)。
序列表<110>中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所<120>一種新型乳腺癌基因治療藥物hdm2-siRNA<160>1<210>1<211>1476<212>DNA<213>人(Homo sapiens)<220>
<222>(61-79)<400>11 atgtgcaata ccaacatgtc tgtacctact gatggtgctg taaccacctc acagattcca61 t ggttagacca aagccattgc ttttgaagtt attaaagtct121 gttggtgcac aaaaagacac ttatactatg aaagaggttc ttttttatct tggccagtat181 attatgacta aacgattata tgatgagaag caacaacata ttgtatattg ttcaaatgat241 cttctaggag atttgtttgg cgtgccaagc ttctctgtga aagagcacag gaaaatatat301 accatgatct acaggaactt ggtagtagtc aatcagcagg aatcatcgga ctcaggtaca361 tctgtgagtg agaacaggtg tcaccttgaa ggtgggagtg atcaaaagga ccttgtacaa421 gagcttcagg aagagaaacc ttcatcttca catttggttt ctagaccatc tacctcatct481 agaaggagag caattagtga gacagaagaa aattcagatg aattatctgg tgaacgacaa541 agaaaacgcc acaaatctga tagtatttcc ctttcctttg atgaaagcct ggctctgtgt601 gtaataaggg agatatgttg tgaaagaagc agtagcagtg aatctacagg gacgccatcg661 aatccggatc ttgatgctgg tgtaagtgaa cattcaggtg attggttgga tcaggattca721 gtttcagatc agtttagtgt agaatttgaa gttgaatctc tcgactcaga agattatagc781 cttagtgaag aaggacaaga actctcagat gaagatgatg aggtatatca agttactgtg841 tatcaggcag gggagagtga tacagattca tttgaagaag atcctgaaat ttccttagct901 gactattgga aatgcacttc atgcaatgaa atgaatcccc cccttccatc acattgcaac961 agatgttggg cccttcgtga gaattggctt cctgaagata aagggaaaga taaaggggaa1021 atctctgaga aagccaaact ggaaaactca acacaagctg aagagggctt tgatgttcct1081 gattgtaaaa aaactatagt gaatgattcc agagagtcat gtgttgagga aaatgatgat1141 aaaattacac aagcttcaca atcacaagaa agtgaagact attctcagcc atcaacttct1201 agtagcatta tttatagcag ccaagaagat gtgaaagagt ttgaaaggga agaaacccaa1261 gacaaagaag agagtgtgga atctagtttg ccccttaatg ccattgaacc ttgtgtgatt1321 tgtcaaggtc gacctaaaaa tggttgcatt gtccatggca aaacaggaca tcttatggcc1381 tgctttacat gtgcaaagaa gctaaagaaa aggaataagc cctgcccagt atgtagacaa1441 ccaattcaaa tgattgtgct aacttatttc ccctag
權(quán)利要求
1.一種新型乳腺癌基因治療藥物hdm2-siRNA，其特征是所說的siRNA序列具有21-nt的雙鏈RNA復(fù)合體，每一鏈3’端有兩個脫氧核糖核酸dTdT呈單鏈懸掛狀態(tài)，正義鏈與反義鏈有19個堿基互補配對。
2.如權(quán)利要求1所述的hdm2-siRNA，其特征是hdm2-siRNA的靶mRNA序列為5'-AAG CUU CGGAACAAGAGACCC-3’(SEQ ID No1)寡核苷酸序列為5'-G CUU CGG AAC AAG AGA CCCdTdT-3’(SEQ ID No2)3'-dTdTC GAA GCC UUG UUC UCU GGG-5’(SEQ ID No3)
3.hdm2-siRNA在制備抗乳腺癌腫瘤基因治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種新型乳腺癌基因治療藥物hdm2－siRNA的設(shè)計、合成、細胞毒作用檢測、靶mRNA和靶蛋白水平的沉默作用檢測、誘導(dǎo)細胞凋亡和周期阻滯作用的檢測以及體內(nèi)抗腫瘤作用的檢測等，針對hdm2基因設(shè)計的短干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染細胞后可以抑制MCF－7細胞的生長，特異性降低hdm2基因的mRNA水平和HDM2蛋白表達水平，同時誘導(dǎo)MCF－7細胞發(fā)生凋亡和G1期阻滯，hdm2－siRNA對裸鼠體內(nèi)移植腫瘤MCF－7的抑制率達60％，與絲裂霉素聯(lián)合用藥對該腫瘤生長的抑制率可達88％，且對動物的毒副作用較小，因此，hdm2－siRNA有望發(fā)展成為一種治療乳腺癌等腫瘤的新型高效基因治療藥物。
文檔編號A61K48/00GK1594347SQ20041004966
公開日2005年3月16日 申請日期2004年6月23日 優(yōu)先權(quán)日2004年6月23日
發(fā)明者邵榮光, 劉鐵剛, 殷勤偉, 何紅偉 申請人:中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所