專利名稱：：苦參酮及其衍生物、類似物在制備抗腫瘤藥物中的用途的制作方法
技術領域：
：本發(fā)明涉及一種苦參酮及其衍生物、類似物的制藥用途，具體涉及苦參酮、槐黃烷酮G和2’-甲氧基-苦參酮在制備抗腫瘤藥物中的用途。
背景技術：
：傳統(tǒng)中藥苦參(SophoraflavescensAit)為豆科槐屬植物，其性寒味苦，有清熱解毒、明目止淚、祛風殺蟲、安五臟、轉(zhuǎn)身定志的作用。從中分離出的主要化學成分可分為兩大類，即苦參生物堿和苦參黃酮。有人已從苦參根、莖、葉和花中共分離出23種生物堿及32種黃酮與異黃酮類化合物(苗抗立，張建中等，天然產(chǎn)物研究與開發(fā)，2000，13(2)69～73)。其中，對于苦參生物堿如苦參堿、氧化苦參堿、槐果堿和槐定堿等的抗腫瘤作用已有了較為廣泛的研究。體外研究結果表明苦參生物堿對白血病及表皮癌具有較強的抑制作用(王秀坤，李家實等，中華血液學雜志，1991，12(1)89～90)。而對苦參黃酮在抗腫瘤方面的研究尚有限。韓國的ShiYongRyu于1997年首次報道了其分離的15種苦參黃酮類單體化合物(包括苦參酮和槐黃烷酮G)對非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌，中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤和結腸癌細胞株具有不同程度的抑制作用(ShiYongRyu，SangUnChoi，etal.，PhytotherapyResearch，1151～53，1997)。2000年W.G.KO等進一步報道了苦參黃酮類化合物(lavandulyfiavonoids)(包括苦參酮和2’-甲氧基-苦參酮)可誘導白血病細胞HL-60及肝癌細胞Hep-G2的凋亡(W.G.Ko，T.H.Kang，etal.，ToxicologyinVitro，14429～433，2000)。苦參酮(Kurarinone)的主要植物來源為豆科的苦參(SophoraflavescensAit)和龍膽科的秦艽(GentianamacrophyllaPall)，其化學結構式為分子式C26H30O6，分子量438.52，熔點121～123℃2’-甲氧基-苦參酮(2’-methoxy-Kurarinone)又名異苦參酮(Isokurarinone)，為黃色晶體，其化學結構式為分子式C27H32O6，分子量438，熔點102-104℃槐黃烷酮G(SophoraflavanoneG)又名降苦參酮(Norkurarinone)，為無色針晶(苯)，其化學結構式為分子式C25H28O6，分子量424.49，熔點173-175℃苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮及槐黃烷酮G對其他癌株的抑制作用或臨床應用未見有文獻報道。
發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明的目的旨在尋找并開發(fā)苦參酮、其衍生物、類似物以及它們的前藥、可藥用鹽的新的醫(yī)藥用途，提供一種苦參酮及其衍生物、類似物以及它們的前藥、可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明涉及下列通式(I)所示的苦參酮、其衍生物、類似物以及它們的前藥、可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的用途其中，R1、R2、R3、R4代表OR6，R6為氫、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6炔基或C1～C6苯烷基；R5代表C1～C5直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基或苯烷基。本發(fā)明還涉及包含上述化合物的藥物組合物。本發(fā)明人經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，下述通式(I)的化合物或其前藥、可藥用鹽可明顯抑制多種腫瘤細胞的活性，故可用于制備抗腫瘤藥物其中，R1、R2、R3、R4代表OR6，R6為氫、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6炔基或C1～C6苯烷基；R5代表C1～C15直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基或苯烷基。優(yōu)選R6代表氫、C1～C6烷基；R5代表C1～C15直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基。最優(yōu)選R6代表氫、-CH3；R5代表當R1代表-OH、R2代表-OH、R3代表-OCH3、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為苦參酮，所述腫瘤不是非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結腸癌、白血病或肝癌；當R1代表-OH、R2代表-OH、R3代表-OH、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為槐黃烷酮G，所述腫瘤不是非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤或結腸癌；當R1代表-OCH3、R2代表-OH、R3代表-OCH3、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為2’-甲氧基-苦參酮，所述腫瘤不是白血病或肝癌。特別是，當所述化合物為苦參酮(R1代表-OH、R3代表-OCH3、R5代表)時，所述腫瘤包括但不限于食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤或惡性黑色素瘤。當所述化合物為槐黃烷酮G(R1代表-OH、R3代表-OH、R5代表)時，所述腫瘤包括但不限于食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤或惡性黑色素瘤。當所述化合物為2’-甲氧基-苦參酮(R1代表-OCH3、R3代表-OCH3、R5代表-)時，所述腫瘤包括但不限于食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤、結腸癌、肺癌或惡性黑色素瘤。這些化合物均可按本領域的常規(guī)方法從苦參中提取或者通過商業(yè)途徑獲得。本發(fā)明的化合物的可藥用鹽包括各種無機或有機酸鹽如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、磷酸鹽、硫酸鹽、檸檬酸鹽、乳酸鹽、酒石酸鹽、馬來酸鹽、延胡索酸鹽、扁桃酸鹽和草酸鹽；各種無機或有機堿鹽如氫氧化鈉、三羥甲基氨基甲烷(TRIS，tromethane)和N-甲基-葡萄糖胺。本發(fā)明的化合物的前藥包括含有該化合物的羧酸酯(可按本領域的常規(guī)方法用C1-4的醇濃縮制得)、含有該化合物的羥基酯(可按本領域的常規(guī)方法用C1-4的羧酸，C3-6的二羧酸或其酸酐，如馬來酸酐，富馬酸酐等濃縮制得)、含有該化合物的烯胺(可按本領域的常規(guī)方法用C1-4的醛或酮濃縮制得)或含有該化合物的縮醛或者縮酮(可按本領域的常規(guī)方法用氯甲基甲醚或氯甲基乙醚濃縮制得)等(AlbertS.KearneyAdvancedDrugReviews.19(1996)229-234).。本發(fā)明的苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮或槐黃烷酮G可以單獨使用或以藥物組合物的形式使用。藥物組合物包括作為活性成份的苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮或槐黃烷酮G及可藥用載體。所述可藥用載體為各種常用的藥物輔料如填充劑(無水乳糖、淀粉、乳糖珠粒、葡萄糖)、粘合劑(微晶纖維素)、崩解劑(交聯(lián)羧甲基淀粉鈉、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、低取代羥丙基纖維素、交聯(lián)PVP)、潤滑劑(硬酯酸鎂)以及吸收促進劑、吸附載體、香味劑、甜味劑、稀釋劑、賦形劑、潤濕劑等。所述藥物組合物可按本領域常規(guī)方法制備并可以通過腸道或非腸道或局部途徑給藥?？诜苿┌ㄆ瑒㈩w粒劑、膠囊、懸浮液、溶液等，非腸道給藥制劑包括注射液；局部給藥制劑包括如霜劑、軟膏劑、貼劑、噴霧劑等。所述藥物的給藥途徑可以為口服、舌下、皮下、肌肉、粘膜、尿道、陰道、靜脈等。本發(fā)明的苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G或其藥物組合物的用量可根據(jù)給藥途徑，患者的年齡和體重，所治療腫瘤的類型及嚴重程度的不同而不同，其日劑量可以是0.001～100mg/kg，可一次或多次給藥。圖1苦參酮(K1)、2’-甲氧基-苦參(K2)、槐黃烷酮G(K3)對胃腺癌細胞(AGS)增殖的抑制作用。圖2苦參酮(K1)、2’-甲氧基-苦參(K2)、槐黃烷酮G(K3)對肺腺癌細胞(SPC-A-1)增殖的抑制作用。具體實施例方式以下結合具體實施例對本發(fā)明作進一步說明。但并不意味著本發(fā)明僅限于此。實施例1三種單體的分離與鑒定。苦參酮的分離與鑒定500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得10克的粗品。粗品依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶2，及反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝65∶35洗脫得2克的苦參酮(得率0.4％)。經(jīng)波譜鑒定所得化合物為苦參酮C26H30O6(T15)1HNMR(DMSO-d6，400MHz)10.2(2’-OH)，9.4(4’-OH)，9.2(7-OH)，7.4(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.32(1H，d，J＝2.28Hz，H-3’)，6.25(1H，dd，J＝8.2，2.4Hz，H-5)，6.12(1H，s，H-6)，5.4(1H，dd，J＝2.6，13.1Hz，H-2)，4.9(1H，q，J＝6.7，1.4Hz)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.7(3H，s)，2.8(1H，dd，J＝13.1，16.3Hz，H-3a)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.6(3H，s)，1.57(3H，s)，1.42(3H，s)。13CNMR(DMSO-d6，75MHz)188.5，162.1，161.7，159.2，157.7，154.9，147.6，130.3，127.0，123.1，116.1，110.5，106.7，106.0，104.1，102.1，92.3，73.4，55.2，46.3，44.3，30.7，26.9，25.5，18.6，17.6。ESIMS(m/z)439。2’-甲氧基-苦參酮的分離與鑒定500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。12克浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得50毫克的粗品。粗品依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶3，及反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝75∶25洗脫得20mg的2’-甲氧基苦參酮(得率0.01％)。經(jīng)波譜技術鑒定所得化合物為2’-甲氧基-苦參酮C27H32O61HNMR(CDCl3，400MHz)7.4(1H，d，J＝8.2Hz，H-6’)，6.48(1H，dd，J＝8.21，2.34Hz，H-5’)，6.44(1H，d，J＝2.35Hz，H-3’)，6.08(1H，s，H-6)，5.62(1H，m，H-2)，5.0(1H，m)，4.72(1H，brs)，4.66(1H，brs)，3.8(3H，s)，3.76(3H，s)，2.84(1H，m，H-3a)，2.4(3H，m)，1.67(3H，s)，1.63(3H，s)，1.6(2H，m)，1.52(3H，s)。ESIMS(m/z)451(M-1)。為黃色晶體，mp102-104℃，UV(MeOH)λmax(logε)286(4.3)nm，IR(KBr)vmax3291，2955，2920，1650，1590，1500，1465，1410，1280cm-1?；秉S烷酮G的分離與鑒定500克的苦參干藥材用3000毫升95％的乙醇室溫浸提3次，提取液合并，經(jīng)真空濃縮蒸干，得粗提物65克。提取物經(jīng)水和乙酸乙酯分配三次，合并乙酸乙酯溶液，濃縮蒸干得30克浸膏。浸膏經(jīng)LH-20柱層析，以甲醇為洗脫劑，得15克的總黃酮。粗品依次用硅膠柱層析，洗脫劑丙酮/石油醚＝1∶3，得到Norkurarinone粗品500mg，接著反相材料(RP-18)柱層析，以甲醇/水＝70∶30洗脫得300mg的槐黃烷酮G(Norkurarinone，得率0.06％)。經(jīng)波譜技術鑒定所得化合物為槐黃烷酮GC25H28O61HNMR(DMSO-d6，400MHz)12.1(s，5-OH)，9.6(4’-OH)，9.4(7-OH)，7.22(1H，d，J＝8.4Hz，H-6’)，6.33(1H，d，J＝2.3Hz，H-3’)，6.26(1H，dd，J＝8.4，2.5Hz，H-5’)，5.92(1H，s，H-6)，5.50(1H，dd，J＝2.8，13.3Hz，H-2)，4.89(1H，t，J＝6.8Hz，H-4”)，4.55(1H，brs)，4.47(1H，brs)，3.1(1H，dd，J＝13.3，17.2Hz，H-3a)，2.62(1H，dd，J＝2.9，17.2Hz，H-3b)，2.4(3H，m)，1.9(2H，m)，1.56(3H，s)，1.52(3H，s)，1.43(3H，s)。ESIMS(m/z)423。實施例2在細胞水平上檢測苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G對多種腫瘤細胞的生長抑制作用。實驗材料人腫瘤細胞株及其培養(yǎng)食管癌(Eca-109)、胃腺癌(AGS和BGC-823)、乳腺癌細胞(MCF-7和Bcap-37)、前列腺癌細胞(PC3和DU145)、肺癌(A549)、肺腺癌(SPC-A-1)、宮頸癌細胞(Hela)、惡性黑色素瘤(A375)、結腸腺癌(Caco-2)、Burkitt’s淋巴瘤(Raji)、肝癌(Bel-7402)及白血病(K562和U937)細胞均購自中科院生化細胞研究所。細胞于含10％胎牛血清(Gibco)的RPMI-1640(Gibco)培養(yǎng)基中，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)。其他試劑MTT及DMSO均為Sigma公司產(chǎn)品。樣品自制苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G分別溶解在DMSO中，分別得到10mg/ml貯存液。實驗方法苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G對上述腫瘤細胞株的細胞毒性分別通過MTT法測得。具體步驟如下1.細胞經(jīng)胰酶消化并洗滌后懸浮于含10％胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，經(jīng)胎盤藍染色排除法計活細胞數(shù)，并調(diào)節(jié)細胞懸浮液密度至1×105細胞/ml。2.在平底96孔板中，每孔加入100微升細胞，每孔中細胞總數(shù)為1×104。于37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜。3.將10mg/ml樣品貯存液以細胞生長培養(yǎng)基稀釋為以下濃度系列32，62，125，250，500，1000和2000ug/ml。每孔加入5微升以細胞生長培養(yǎng)基稀釋的樣品，使反應終濃度分別為1.6、3.1、6.25、12.5、25、50、和100μg/ml。將相應量的DMSO加入不加藥的細胞中作為對照，不加藥物及DMSO的含細胞孔作為背景。每點作三個平行測試。4.將加藥細胞在37℃，5％CO2細胞培養(yǎng)箱中保溫48小時。5.每孔中加入10μl5mg/mlMTT溶液，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中保溫3～4小時。6.將細胞板于1000rpm離心15分鐘，真空吸去培養(yǎng)液，加入150μlPBS洗滌后離心并小心地吸去溶液。7.每孔加入150μlDMSO，置于搖床上以150rpm搖動15分鐘，使生成的甲簪晶體充分溶解。測定492nm光吸收值。8.根據(jù)光吸收值計算苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G處理后細胞相對存活率。計算公式如下9.10.通過XLfit軟件計算苦參總黃酮及苦參酮對各腫瘤細胞的IC50。實驗結果1.苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G對腫瘤細胞的毒性呈劑量依賴關系；(見圖1、2)2.苦參酮、2’-甲氧基-苦參酮、槐黃烷酮G對各種腫瘤細胞的生長抑制IC50測定。三種化合物對各種腫瘤細胞的生長抑制IC50測定(μg/ml)實施例3苦參酮在小鼠體內(nèi)對幾種腫瘤株的抑制作用實驗材料腫瘤株小鼠肝癌(H22)、小鼠肉瘤(S180)、小鼠肺癌(Lewis肺癌)，均由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院藥理室傳代維持。動物昆明種小鼠，由上海醫(yī)藥工業(yè)研究院動物房提供，合格證號滬動合證字107號。C57BL/6小鼠，由中科院上海實驗動物中心提供，合格證號中科動管會第005號。其他試劑DMSO(批號20030415)為上海化學試劑公司產(chǎn)品。CremophorEL(批號082K0173)為SIGMA公司產(chǎn)品。樣品自制苦參酮用DMSO和CremophorEL助溶后，加蒸餾水配成溶液。實驗方法取生長良好的腹水，用生理鹽水以1∶4稀釋(H22和S180)，或者取生長良好的瘤塊，制成單細胞懸液(1×107/ml)(Lewis肺癌)，每只小鼠腋皮下接種0.2ml，隨機分組，接種后次日起給藥，給藥體積為0.5ml/20g體重。接種后10日脫頸處死動物，解剖取瘤塊，稱瘤重。結果判定根據(jù)以下公式實驗結果苦參酮在劑量200、50和12.5mg/kg腹腔注射時，對小鼠肝癌H22的生長有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為48.64、70.91、64.09％；口服200mg/kg抑瘤率達87.37％。試驗結果見表1。樣品苦參酮在劑量200、50和12.5mg/kg，腹腔注射時，對小鼠S180肉瘤的生長有一定的抑制作用，抑瘤率分別為26.54、20.85、42.60％；口服200mg/kg抑瘤率達60.51％。試驗結果見表2。樣品苦參酮在劑量200、50和12.5mg/kg，腹腔注射時，對小鼠Lewis肺癌的生長有明顯的抑制作用，抑瘤率分別為53.57、30.36和39.88％；口服200mg/kg抑瘤率達42.86％。試驗結果見表3。表1.苦參酮對小鼠肝癌H22的抑瘤作用<tablesid="table1"num="001"><tablewidth="716">組別劑量(mg/kg)給藥方案動物數(shù)始終動物體重(g)(去瘤后)瘤重(g)X±SD抑瘤率％對照組(相應溶劑)CTX苦參酮苦參酮苦參酮苦參酮25ml/kg3012.550200200ip×7ip×7ip×7ip×7ip×7p.o×7101010101091010101010927.58±2.2924.35±1.45**25.56±3.4025.94±3.1026.07±2.1826.63±2.462.17±0.560.42±0.13**0.79±0.57**0.64±0.48**1.13±0.64**0.28±0.15**80.9164.0970.9148.6487.37</table></tables>與對照組比較*P＜0.05，**P＜0.01。試驗例5將實施例1與比較例2中制得的粒料用注射成形機成形，制成圖3所示的晶片筐。將此晶片筐浸于純凈水中。用超聲清洗裝置以40KHz經(jīng)8分鐘洗凈后，用粒子計算器對洗凈液中的粒子進行計數(shù)。用同一成形品更換純凈水將相同的試驗進行了8次，對從第二次到第八次的洗凈液分別測定的粒子數(shù)進行累計計算。結果示明于表3。表3從表3可知，本發(fā)明的包含晶片的半導體導件的載運/保管用容器在晶片筐的洗滌液中的粒子數(shù)少，從而即便是在耐洗滌性方面也顯著地優(yōu)于含碳纖維的材料。權利要求1.下述通式(I)的化合物或其前藥、可藥用鹽在制備抗腫瘤藥物中的用途其中，R1、R2、R3、R4代表OR6，R6為氫、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6炔基或C1～C6苯烷基；R5代表C1～C15直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基或苯烷基；當R1代表-OH、R2代表-OH、R3代表-OCH3、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為苦參酮，所述腫瘤不是非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、結腸癌、白血病或肝癌；當R1代表-OH、R2代表-OH、R3代表-OH、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為槐黃烷酮G，所述腫瘤不是非小細胞肺癌、卵巢癌、皮膚癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤或結腸癌；當R1代表-OCH3、R2代表-OH、R3代表-OCH3、R4代表-OH、R5代表時，所述化合物為2’-甲氧基-苦參酮，所述腫瘤不是白血病或肝癌。2.權利要求1的用途，其中R6代表氫、C1～C6烷基；R5代表C1～C15直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基。3.權利要求2的用途，其中R6代表氫、-CH3；R5代表4.權利要求1或2或3的用途，其中R2、R4代表-OH，R1代表-OH或-OCH3、R3代表-OH或-OCH3、R5代表其特征在于，當R1代表-OH、R3代表-OCH3、R5代表時，所述化合物為苦參酮，所述腫瘤選自食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤或惡性黑色素瘤；當R1代表-OH、R3代表-OH、R5代表時，所述化合物為槐黃烷酮G，所述腫瘤選自食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤或惡性黑色素瘤；當R1代表-OCH3、R3代表-OCH3、R5代表時，所述化合物為2’-甲氧基-苦參酮，所述腫瘤選自食管癌、胃癌、前列腺癌、乳腺癌、宮頸癌、淋巴瘤、結腸癌、肺癌或惡性黑色素瘤。5.一種藥物組合物，包含下述通式(I)的化合物或其前藥、可藥用鹽其中，R1、R2、R3、R4代表OR6，R6為氫、C1～C6烷基、C1～C6烯基、C1～C6炔基或C1～C6苯烷烴；R5代表C1～C5直鏈或支鏈的烷基、烯基、炔基或苯烷基。6.權利要求5的藥物組合物，其中R2、R4代表-OH，R1代表-OH或-OCH3、R3代表-OH或-OCH3、R5代表全文摘要本發(fā)明涉及一種苦參酮及其衍生物、類似物的制藥用途，具體涉及苦參黃酮及其衍生物、類似物在制備抗腫瘤藥物中的用途。本發(fā)明開發(fā)了苦參酮及其衍生物、類似物新的醫(yī)藥用途。文檔編號A61P35/00GK1676521SQ200410030938公開日2005年10月5日申請日期2004年4月1日優(yōu)先權日2004年4月1日發(fā)明者嚴孝強,崔玉敏,顏建華,潘柯,張維漢,黃偉暉,洪建榮,段繼峰,左劍申請人:和記黃埔醫(yī)藥企業(yè)有限公司