專利名稱：用于預(yù)防和/或治療粥樣動脈硬化的組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于預(yù)防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導(dǎo)免疫口服耐受性的組合物。
背景技術(shù)：
在西方社會，粥樣動脈硬化和它的臨床后遺癥就其發(fā)病率和死亡率而論，是其中一個最危險的危害。因此，為了提供減緩或阻止粥樣動脈硬化的早期無痛進(jìn)程的方法，已經(jīng)花費(fèi)巨大的力量來研究它的發(fā)病機(jī)理也就不奇怪了。雖然沒有明確的答案，但正逐步顯示出動脈粥樣硬化斑的逐漸形成并非僅與某一單獨(dú)機(jī)制有關(guān)，就像以前在脂平衡的異常調(diào)節(jié)方面所推測的。
臨床醫(yī)師利用詞語粥樣動脈硬化來定義導(dǎo)致身體各部分的動脈閉塞的組織病理學(xué)過程。閉塞是由于循環(huán)中逐步被大量脂肪填充的各種來源的不同細(xì)胞積聚而引起的。脂肪是沉積于脈管壁的主要物質(zhì)，它主要是由“有害”膽固醇低密度脂蛋白(LDL)組成的。在粥樣動脈硬化的后期，脂質(zhì)填充區(qū)開始積聚鈣。鈣的沉積致使動脈更硬、柔韌性更差，因此引起了它們的“石狀”外觀，這是導(dǎo)致了我們眾所周知的“動脈硬化癥”(粥樣動脈硬化)的外觀。當(dāng)所涉及的動脈阻礙了血液流向心臟，一個人就會“心臟病發(fā)作”；當(dāng)腦部動脈閉塞時，這個人就會表現(xiàn)出中風(fēng)。當(dāng)四肢的動脈狹窄時，就會導(dǎo)致劇烈疼痛、降低身體可動性并可能需要進(jìn)行截肢。
很明顯，許多年內(nèi)都不能夠察覺到以上提到的疾病的進(jìn)展，而只在晚期才表現(xiàn)出來。當(dāng)能夠察覺到表現(xiàn)時，由于已經(jīng)處于疾病晚期，因此進(jìn)行治療要難得多。
像在上面提到的，粥樣動脈硬化是由于脂肪沉積于血管壁，因此形成了一個動脈粥樣硬化斑層，該層阻礙了血液流向生命器官，從而導(dǎo)致中風(fēng)綜合癥，心肌梗塞或外周血管疾病。已知的可加快病程的風(fēng)險因素包括高血壓、糖尿病、肥胖、吸煙和缺乏運(yùn)動。
最近的研究表明，傳染性因子如巨細(xì)胞病毒(CMV)、愛潑斯坦-巴爾病毒(EBV)和肺炎衣原體也可能與粥樣動脈硬化的發(fā)展有關(guān)。除了血管阻塞和再狹窄與抗-CMV抗原的自身抗體效價之間的聯(lián)系，或是在動脈粥樣硬化斑上發(fā)現(xiàn)傳染性顆粒之外，以上的發(fā)現(xiàn)還通過粥樣動脈硬化和齦炎之間的聯(lián)系得到了證實(shí)。
最近十年，已經(jīng)積累了許多證據(jù)來支持粥樣動脈硬化具有一個重要的傳染性自身免疫組分這一理論。
在自身免疫疾病中，免疫系統(tǒng)除攻擊外來入侵物外，也攻擊我們身體的組分(自身抗原)。自身免疫疾病可分為自身抗體介導(dǎo)的疾病或細(xì)胞介導(dǎo)的疾病。典型的自身抗體介導(dǎo)的自身免疫疾病包括重癥肌無力和特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)，而典型的細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫疾病是橋本氏甲狀腺炎和I型糖尿病。
在粥樣動脈硬化中涉及免疫網(wǎng)絡(luò)公認(rèn)在粥樣動脈硬化損傷中免疫介導(dǎo)過程是普遍的，這種認(rèn)識產(chǎn)生于在最初階段，即脂肪紋中一貫觀測到淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞。與更晚期的損傷相比，在早期損傷中，發(fā)現(xiàn)大部分為CD4+細(xì)胞(其余為CD8+細(xì)胞)的這些淋巴細(xì)胞要比巨噬細(xì)胞更多，在更晚期的損傷中，這個比例趨向于逆轉(zhuǎn)。這些發(fā)現(xiàn)引出的問題是它們是反映了對于一個潛在抗原的初次免疫致敏作用，還是作為先前引起的局部組織損傷的一個純粹副現(xiàn)象而保持。無論這些因子是否將炎癥細(xì)胞募集到早期動脈粥樣硬化斑，它們似乎表現(xiàn)出一種活化的狀態(tài)，這通過伴隨的II類MHC的HLA-DR和白介素(IL)受體以及白細(xì)胞共同抗原(CD45R0)和極晚期抗原1(VLA-1)整合蛋白的表達(dá)而得到證明。
在粥樣動脈硬化損傷早期階段，正在發(fā)生的炎癥反應(yīng)或者可能是主要的起始事件，從而導(dǎo)致局部細(xì)胞(即內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和炎性細(xì)胞)產(chǎn)生各種細(xì)胞因子，或者這個反應(yīng)可能是機(jī)體防御免疫系統(tǒng)對抗危害過程的一種形式。已經(jīng)表明被居留細(xì)胞上調(diào)的細(xì)胞因子包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6、IL-8、IFN-γ和單核細(xì)胞化學(xué)引誘肽-1(MCP-1)。也顯示出在動脈粥樣硬化斑中由細(xì)胞成分表達(dá)的血小板衍生生長因子(PDGF)是超量表達(dá)的，因此可能強(qiáng)化了由有絲分裂和趨化因子形式的共同刺激支持的先存炎癥反應(yīng)。就在最近，在UyemuraK，Demer LL，Castle SC等，粥樣動脈硬化中IL-12和IL-10的交叉調(diào)節(jié)作用.J Clin Invest 1996 97；2130-2138中闡述了與正常動脈相比，在人粥樣動脈硬化損傷中1型T細(xì)胞的細(xì)胞因子型，例如強(qiáng)表達(dá)IFN-γmRNA而不是IL-4 MRNA。此外，在損傷中發(fā)現(xiàn)了主要由活化單核細(xì)胞產(chǎn)生的并且是Th1細(xì)胞因子型的選擇性誘導(dǎo)物的T細(xì)胞生長因子—IL-12超量表達(dá)，這通過存在大量的它的主要異源二聚體形式p70和p40(它的顯性誘導(dǎo)型蛋白)mRNA而得到證明。
與證明在動脈粥樣硬化斑中細(xì)胞免疫系統(tǒng)占優(yōu)勢的有力證據(jù)相似，同樣也有充足的證據(jù)證明了也涉及局部體液免疫系統(tǒng)。因此，除了居留巨噬細(xì)胞中C3b和C3Bi受體的表達(dá)增加之外，在動脈粥樣硬化斑中還顯示出免疫球蛋白和補(bǔ)體組分的沉積。
關(guān)于免疫介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)促進(jìn)粥樣動脈硬化進(jìn)程的有價值線索來自動物模型。因此，與免疫活性小鼠相比，無免疫應(yīng)答小鼠(I類MHC缺陷型)似乎趨向于出現(xiàn)加速粥樣動脈硬化。另外，利用IL-2轉(zhuǎn)錄的有效抑制劑環(huán)孢菌素A治療C57BL/6小鼠(Emeson EE，Shen ML.環(huán)孢菌素A治療高脂血C57BL/6小鼠的加速粥樣動脈硬化.Am JPathol 1993；1421906-1915)和新西蘭白兔(Roselaar SE，Schonfeld G，Daugherty A.抑制細(xì)胞介導(dǎo)的免疫在膽固醇喂養(yǎng)兔中增強(qiáng)出現(xiàn)粥樣動脈硬化.J Clin Invest 1995；961389-1394頁)在“正常”脂蛋白“負(fù)載”下可導(dǎo)致明顯增強(qiáng)的粥樣動脈硬化。這些隨后的研究可能使人們深入地了解參與對抗粥樣動脈硬化斑中的自我保持的炎性過程的免疫系統(tǒng)的可能作用。
雖然粥樣動脈硬化的一些表現(xiàn)如產(chǎn)生阻塞血管的硬化斑可能與免疫系統(tǒng)作用有關(guān)，但它并不是一種典型的自身免疫疾病。在典型的自身免疫疾病中，可以很明確地確定受免疫系統(tǒng)攻擊的自身抗原；可以確定攻擊屬于免疫系統(tǒng)的自身抗原(自身抗體或細(xì)胞)的免疫系統(tǒng)部分，即淋巴細(xì)胞。最重要的是可以表明通過被動轉(zhuǎn)移這些免疫系統(tǒng)組分，在健康動物上可以誘導(dǎo)疾病，或是在人類中，患病孕婦可能將疾病傳給她的下一代。在粥樣動脈硬化中，以上幾點(diǎn)并不是很普遍。另外，粥樣動脈硬化的確具有共同的風(fēng)險因素，如高血壓、糖尿病、缺乏體育運(yùn)動、吸煙等；它影響老年人；它比典型自身免疫疾病具有不同的遺傳優(yōu)勢。
從本世紀(jì)初以來就已經(jīng)知道了誘導(dǎo)口服耐受的方法以減小變態(tài)反應(yīng)。為變應(yīng)性患者喂食低劑量的已知變應(yīng)原，則機(jī)體的免疫耐受就會恢復(fù)，而不發(fā)生變態(tài)反應(yīng)。
自身免疫疾病的口服耐受在自身免疫疾病中，口服耐受是用于描述減弱自身免疫疾病的免疫應(yīng)答的術(shù)語。通過給動物喂食“有罪”抗原而產(chǎn)生的耐受，由于對免疫應(yīng)答的“麻痹”作用，可以消除疾病的發(fā)生。最近本發(fā)明人揭示出，在用β2GP-1免疫之前口服人β2GP-1導(dǎo)致改善相當(dāng)于抗磷脂(APS)的綜合癥(anti-phospholipid(APS)-equivalent syndrome)。
口服耐受已經(jīng)應(yīng)用于自身免疫疾病領(lǐng)域，在自身免疫疾病中進(jìn)行對抗自身抗原的免疫反應(yīng)，而且也存在恢復(fù)免疫系統(tǒng)對自身抗原耐受的需要。這是通過給受治療者喂食低劑量的自身抗原進(jìn)行的。迄今為止，已經(jīng)報道了幾個動物模型，其中恢復(fù)了口服耐受，除通過給受治療者喂食膠原蛋白和HSP-65分別預(yù)防佐劑性關(guān)節(jié)炎和膠原性關(guān)節(jié)炎之外，包括通過給受治療者喂食來自神經(jīng)膜的一種蛋白，即髓磷脂堿性蛋白(MBP)，防治了相當(dāng)于多發(fā)性硬化癥(MS)的實(shí)驗性變應(yīng)性腦脊髓炎(EAE)的發(fā)生，。建于波士頓的一家名為“自身免疫”的公司已經(jīng)進(jìn)行了幾個預(yù)防糖尿病、多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和眼色素層炎的人體實(shí)驗。人體實(shí)驗的結(jié)果并不比非人體實(shí)驗更令人印象深刻，然而在預(yù)防關(guān)節(jié)炎上卻獲得了成功。
抗原組分A.氧化的低密度脂蛋白LDL是一種大分子量蛋白的復(fù)合物，包括載脂蛋白B、中性脂、極性脂和親脂性抗氧化劑(維生素E和β胡蘿卜素)。氧化修飾LDL，導(dǎo)致在天然分子中形成新表位(neoepitopes)(在Apo B結(jié)構(gòu)域中)，使得它能夠被巨噬細(xì)胞上的清除受體所識別。粥樣動脈硬化斑中的所有細(xì)胞組分(即內(nèi)皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞)有可能增強(qiáng)脂類過氧化，產(chǎn)生不同程度的LDL氧化，然而并不能確定它們各自的相對影響。不考慮這些細(xì)胞的精確作用，看來血管壁水平的氧化和抗氧化力之間的平衡決定了暴露于Ox LDL的程度以及隨后有害作用。Ox LDL具有活化衍生物，如溶血磷脂酰膽堿(LPC)，而且Ox LDL盡管是小分子量的，也仍然保留了一些生物活性。
溶血磷脂酰膽堿(LPC)在人粥樣動脈硬化斑中表達(dá)。它是一種可以誘導(dǎo)粥樣動脈硬化第一步的活性生物物質(zhì)。實(shí)際上，它比Ox LDL甚至更有效。
Ox LDL和它的副產(chǎn)品對于硬化斑的發(fā)生的總體體內(nèi)和體外影響大大超出了本發(fā)明的范圍，但它對于闡明Ox LDL和免疫系統(tǒng)間的已知關(guān)系是重要的。
我們已經(jīng)知道OxLDL是T細(xì)胞和單核細(xì)胞的趨化因子。而且OxLDL和它的副產(chǎn)品可以誘導(dǎo)如單核細(xì)胞趨化因子1的因子的表達(dá)；誘導(dǎo)集落刺激因子的分泌和發(fā)揮血小板活化特性，所有這些都是有效的生長刺激物。
Stemme S，F(xiàn)aberB，HolmJ等最近已經(jīng)證實(shí)了在粥樣動脈硬化中細(xì)胞免疫應(yīng)答的主動介入。來自人粥樣動脈硬化斑的T淋巴細(xì)胞識別氧化的低密度脂蛋白。Proc Natl Acad Sci USA 1995；923893-3897公開了從對作為刺激物的Ox LDL應(yīng)答的硬化斑克隆中分離了CD4+。與Ox LDL相應(yīng)的克隆(每27個中有4個)主要產(chǎn)生γ干擾素，而不是IL-4。尚須了解上述T細(xì)胞克隆是否說明僅以細(xì)胞免疫系統(tǒng)與強(qiáng)烈刺激免疫原(Ox LDL)接觸，還是這個反應(yīng)為對抗明顯的無痛粥樣動脈硬化過程而提供方法。
關(guān)于涉及體液機(jī)制的數(shù)據(jù)及其含義倍受爭議。幾篇報道已經(jīng)將抗Ox LDL抗體水平的增加與粥樣動脈硬化的進(jìn)程(通過頸動脈狹窄程度、外周血管病的嚴(yán)重程度等表現(xiàn))相聯(lián)系。然而，其它科學(xué)家沒有重現(xiàn)這些數(shù)據(jù)，也許是因為沒有對用來測定對LDL抗體的測定進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。在所有情況下，似乎關(guān)于在粥樣動脈硬化斑中存在免疫復(fù)合物形式的Ox LDL抗體是一致的，盡管尚未確定這一發(fā)現(xiàn)的真正意義。
已經(jīng)假設(shè)Ox LDL的抗體在脂蛋白代謝中起積極作用。因此，知道與Ox LDL相比，Ox LDL的免疫復(fù)合物和它的對應(yīng)抗體在懸浮液中可以更有效的被巨噬細(xì)胞所吸收。由于Ox LDL被巨噬細(xì)胞加速吸收是有益的還是有害的問題仍然沒有解決，因此從對于粥樣動脈硬化的發(fā)病機(jī)理的這一一致的發(fā)現(xiàn)中并不能夠得出任何的結(jié)論。
從動物模型中獲得了關(guān)于體液免疫系統(tǒng)在粥樣動脈硬化中重要性的重要數(shù)據(jù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與用磷酸鹽緩沖鹽水(PBS)超免疫的對照組相比，用同源氧化LDL超免疫LDL-受體缺陷兔導(dǎo)致產(chǎn)生高水平的抗-Ox LDL抗體，并與粥樣動脈硬化損傷程度的明顯減小有關(guān)。利用富含膽固醇的脂質(zhì)體免疫兔也減少了硬化斑的形成，并伴隨抗-膽固醇抗體的產(chǎn)生，而這個效應(yīng)也伴隨有極低密度脂蛋白膽固醇水平下降35％。本發(fā)明人研究表明，在apoE剔除(knockout)小鼠中，利用同源Ox LDL重復(fù)免疫導(dǎo)致產(chǎn)生抗-Ox LDL抗體并減緩粥樣動脈硬化。
B.熱休克蛋白(HSP)60/65另外的一個起始炎癥損傷并使損傷永存，從而最終導(dǎo)致增強(qiáng)粥樣動脈硬化的主要抗原組分是60Kd的熱休克蛋白。這種線粒體蛋白是HSP家族中的一員，該家族是由在不同物種間具有高度序列同源性的大約24種蛋白組成的。這些蛋白就像它們的名字所顯示的，對于各種脅迫損害包括暴露于自由基、熱、機(jī)械剪切應(yīng)力、感染和細(xì)胞因子等做出反應(yīng)而被上調(diào)。HSP的目的論重要性來自于它們對抗脅迫刺激物促進(jìn)的細(xì)胞蛋白解折疊的保護(hù)作用。這個作用使它們被命名為分子“伴侶蛋白”。然而，HSP的這些明顯有利作用也是一把雙刃劍，因為它們的高度表達(dá)在一定條件下可能促進(jìn)自身免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致組織損傷。負(fù)責(zé)HSP免疫介導(dǎo)的損傷的機(jī)制目前仍不是完全清楚，并假設(shè)隱藏的新表位在上調(diào)后，暴露于免疫系統(tǒng)而不再被免疫系統(tǒng)識別為“自身抗原”。另一方面，有人認(rèn)為在“外來”HSP和在感染后引入的自身HSP間存在交叉反應(yīng)，這起作用而觸發(fā)針對自身結(jié)構(gòu)的免疫攻擊。
HSP 60是一種特殊蛋白，它構(gòu)成上面提到的HSP家族內(nèi)的一個不同“類別”，并與HSP65一起為一個亞組蛋白的體內(nèi)折疊提供一個隔離的環(huán)境。
在哺乳動物HSP60和細(xì)菌HSP65之間存在相似性，它容易被宿主的免疫效應(yīng)子交叉識別。
證明在一些自身免疫疾病中自身抗體增強(qiáng)和對于HSP 60/65的細(xì)胞應(yīng)答的研究支持了HSP涉及自身免疫的觀點(diǎn)。
HSP65和粥樣動脈硬化間的聯(lián)系最初開始于Georg Wick小組在二十世紀(jì)九十年代初開展的開拓性工作(Xu Q，Dietrich H，Steiner HJ等，通過用免疫熱休克蛋白65免疫在正常膽固醇血小鼠、兔中誘導(dǎo)粥樣動脈硬化.Arteriosclerosis Thrombosis 1992；12789-799)。他們發(fā)現(xiàn)，只要用于免疫的制劑含有弗氏完全佐劑(CFA)，則利用不同的抗原免疫的兔發(fā)生粥樣動脈硬化，。由于CFA的主要成分是熱滅活的結(jié)核分枝桿菌，而它的首要組分是HSP-65，他們由此認(rèn)為針對此組分的免疫應(yīng)答導(dǎo)致粥樣動脈硬化的發(fā)生。當(dāng)所述動物隨后僅僅用HSP-65免疫后，并且顯現(xiàn)出明顯的粥樣動脈硬化時，這個假設(shè)得到證實(shí)。需要強(qiáng)調(diào)的是，注意到各組之間在脂蛋白分布型方面沒有差別。隨后Wick的小組開展的另外工作揭示出，與來自相應(yīng)動物的外周血相比，發(fā)現(xiàn)從誘發(fā)粥樣動脈硬化的兔的損傷處提取的T細(xì)胞超量表達(dá)HSP-65，從而證明在受脅迫的主動脈脈管的附近存在局部和受限的免疫反應(yīng)。本發(fā)明人加強(qiáng)了Wick的發(fā)現(xiàn)，表明HSP-65(或結(jié)核分枝桿菌)免疫初次實(shí)驗的小鼠導(dǎo)致加速形成脂肪紋。
當(dāng)在患有粥樣動脈硬化的患者中觀察到了涉及對HSP-65應(yīng)答的體液免疫機(jī)制時，進(jìn)一步證明了這些發(fā)現(xiàn)。因此，在高水平抗-HSP65抗體和在篩選健康個體中根據(jù)聲波圖估計的頸動脈狹窄程度之間建立了相互關(guān)系。
最近，用于評價HSP-60/65對于培養(yǎng)內(nèi)皮細(xì)胞的影響的體外分析加強(qiáng)了這些發(fā)現(xiàn)。因此，已經(jīng)表明內(nèi)皮細(xì)胞與HSP65一起溫育可引起它們對單核細(xì)胞和粒細(xì)胞的粘連性，這種粘連性是濃度和時間依賴性的。此外，已經(jīng)證實(shí)，這種作用是由內(nèi)皮細(xì)胞E-選擇蛋白(C62E)、血管細(xì)胞粘附分子-1(CD106)和細(xì)胞內(nèi)粘附分子-1(CD54)的超量表達(dá)介導(dǎo)的。
磷脂和β2GP1作為粥樣動脈硬化中的自身抗原組分本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，在用人抗心磷脂抗體(aCL)免疫的LDL-受體剔除小鼠中，抗心磷脂的產(chǎn)生會促進(jìn)早期粥樣動脈硬化。這個發(fā)現(xiàn)是由關(guān)于抗心磷脂抗體在粥樣動脈硬化中的可能前致動脈粥樣化(proatherogenic)作用方面積累的的間接資料一致。
β2GP1是一種證明為自身免疫病患者的aCL目標(biāo)的分子。已經(jīng)表明抗-β2GP1抗體會導(dǎo)致實(shí)驗性APS并活化內(nèi)皮細(xì)胞和血小板。本發(fā)明人已經(jīng)證明，用β2GP1免疫的轉(zhuǎn)基因型LDL-RD缺陷小鼠會產(chǎn)生相應(yīng)的抗體以及促進(jìn)早期脂肪紋的形成，并伴隨有CD4+細(xì)胞的局部聚集。因此，在粥樣動脈硬化中，β2GP1可能作為自身免疫應(yīng)答的一個自身抗原目標(biāo)。
在動物和人類疾病模型中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了自身抗原HSP60-65和OxLDL的自身抗體效價與粥樣動脈硬化水平之間的相互聯(lián)系。體內(nèi)OxLDL是由于天然LDL的氧化產(chǎn)生的并且被認(rèn)為是粥樣動脈硬化的有害因子。對所述毒素應(yīng)答產(chǎn)生抗-Ox LDL抗體。β2GP-1是人血液中對血液凝結(jié)過程起作用的一個天然蛋白；HSP65是各種脅迫刺激的結(jié)果。
在利用具有粥樣動脈硬化發(fā)生的遺傳素因的小鼠(LDL-R剔除小鼠)進(jìn)行的實(shí)驗中，通過喂食小鼠低劑量Ox LDL表明粥樣動脈硬化病癥縮減了30％。
此外，免疫系統(tǒng)參與粥樣動脈硬化的誘發(fā)的事實(shí)以及免疫系統(tǒng)(淋巴細(xì)胞、自身抗體)的明確參與，指出了利用自身抗原例如Ox LDL、HSP60/65和β2GP1誘發(fā)口服耐受而控制疾病的能力。
美國專利第5,348,945號公開了一種在脅迫下的細(xì)胞或組織中對抗死亡率的方法。該方法包括將促進(jìn)該細(xì)胞或組織存活有效量的熱休克蛋白70(HSP70)接觸該細(xì)胞或組織。該方法也許可以應(yīng)用于在需要這樣的治療的人類或動物受治療者中對抗粥樣動脈硬化、血管成形術(shù)后的再狹窄和神經(jīng)損傷。也公開了在藥學(xué)上可接受的制劑中包含治療有效量HSP70的藥用組合物。
雖然HSP70和HSP60屬于包括大約24種高度保守的熱休克蛋白的家族，但它們表現(xiàn)出兩種截然不同的特性。例如，它們的機(jī)制看來在控制抵抗脅迫刺激的保護(hù)作用方面的作用不一致。
HSP70最初獲得專利是由于其在熱暴露和其他脅迫損傷如缺血性預(yù)調(diào)節(jié)中具有明顯的誘發(fā)作用。確實(shí)在轉(zhuǎn)基因動物中HSP70的超量表達(dá)與防止脅迫危害的保護(hù)作用有關(guān)。
因此，美國專利第5,348,945號沒有指出或提示本發(fā)明的主題。
本發(fā)明的公開因此，依照本發(fā)明現(xiàn)在提供了一種通過口服給予預(yù)防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導(dǎo)免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種用于口服的藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種通過口服給予預(yù)防和/或治療心臟病發(fā)作的誘導(dǎo)免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發(fā)明的另一個優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種通過口服給予用于預(yù)防和/或治療血管成形術(shù)-再狹窄的誘導(dǎo)免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發(fā)明的一個更優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種通過口服給予預(yù)防和/或治療中風(fēng)的誘導(dǎo)免疫及口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發(fā)明的一個甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種誘導(dǎo)免疫及口服耐受的組合物，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65(HSP60/65)或β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本發(fā)明提供了一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，其中所述活性衍生物是溶血磷脂酰膽堿(LPC)。
本發(fā)明也提供了一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
本發(fā)明的另一個方面提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者的粥樣動脈硬化的方法，包括口服給予一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者的心臟病發(fā)作的方法，包括口服給予一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個更優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者的血管成形術(shù)-再狹窄的方法，包括口服給予一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(OxLDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在一個甚至更優(yōu)選實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者中風(fēng)的方法，包括口服給予一種誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP60/65)、β2-糖蛋白1(β2GP-1)、及它們的功能性衍生物和混合物。
在本發(fā)明的另一個實(shí)施方案中，提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)，或其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)的活性衍生物，或其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65(HSP60/65)或其中所述活性組分是β2-糖蛋白1(β2GP-1)。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述活性衍生物是溶血磷脂酰膽堿(LPC)。
本發(fā)明還提供了一種預(yù)防和/或治療受治療者粥樣動脈硬化的方法，其中所述LDL是丙二醛LDL(MDA-LDL)。
其中用到的名詞“功能性衍生物”預(yù)計包括標(biāo)記蛋白、綴合蛋白、融合嵌合蛋白和可溶形式的純化受體以及所述蛋白的片段、缺失和保守置換。
本發(fā)明人從粥樣動脈硬化中存在針對Ox LDL的免疫應(yīng)答和針對Ox LDL的反應(yīng)與該疾病嚴(yán)重性之間的相互聯(lián)系，并結(jié)合在小鼠和兔中Ox LDL的活性疫苗可以阻止粥樣動脈硬化的發(fā)生的證據(jù)得出以下結(jié)論通過給人類受治療者服用Ox LDL誘導(dǎo)免疫耐受，可以導(dǎo)致粥樣動脈硬化進(jìn)程速度減緩。需要提到的是，通過口服誘導(dǎo)免疫耐受的機(jī)制有可能是通過細(xì)胞因子TGFβ的刺激和產(chǎn)生以及非特異性抑制T細(xì)胞的發(fā)育而介導(dǎo)的。
本發(fā)明的口服耐受可以擴(kuò)展以產(chǎn)生旁路(bystandard)抑制效應(yīng)即阻斷發(fā)生在粥樣動脈硬化斑附近并對它的發(fā)生起一定作用的其他(非抗原特異性)自身免疫(抗自身)應(yīng)答。
需要注意的是，本發(fā)明的目的是誘導(dǎo)耐受或者麻痹針對HSP65的免疫應(yīng)答，而不是僅僅獲得血清升高來幫助蛋白解折疊。
因此，一方面本發(fā)明結(jié)合了口服耐受、Ox LDL和粥樣動脈硬化，粥樣動脈硬化是一種部分由于免疫因素引起的疾病。已經(jīng)報道Ox LDL在小鼠和兔中誘導(dǎo)Ox LDL抗原的免疫反應(yīng)(與誘導(dǎo)免疫耐受相對比)并促進(jìn)粥樣動脈硬化病癥。在這些動物模型中，沒有報道Ox LDL進(jìn)行口服實(shí)驗，也完全沒有提出用于口服耐受。
依照本發(fā)明用于口服給予的藥用組合物是按照本身已經(jīng)清楚的方法制備的，以及其給予也是按照已知的口服給予方法。
治療前面描述的疾病的有效量取決于一些平常的因素，例如所述疾病的性質(zhì)以及嚴(yán)重性和哺乳動物的體重對于口服給予，最好以單位劑量組合物的形式給予所述活性成分。
這些組合物是通過混合制備的，并適合于以片劑、膠囊、口服液體制劑、粉劑、顆粒劑等形式口服給予。
用于口服給予的片劑和膠囊通常呈現(xiàn)為單位劑量，并包括常規(guī)的賦形劑，如粘合劑、填充劑、稀釋劑、壓片劑、潤滑劑、崩解劑、著色劑、添味劑和甜味劑。片劑可以依照本領(lǐng)域的已知方法進(jìn)行包衣。
可用的合適填充劑包括纖維素、甘露醇、乳糖和其他相似填充劑。合適的崩解劑包括淀粉、聚乙烯吡咯烷酮、淀粉衍生物如淀粉羥基乙酸鈉。合適的潤滑劑包括例如硬脂酸鎂。藥學(xué)上可接受的合適潤濕劑包括硫酸月桂酯鈉。
這些固體口服組合物可以通過摻和、填充或壓片的常規(guī)方法制備。重復(fù)的摻和操作可以使得活性劑均勻分散在使用了大量填充劑的那些組合物中。當(dāng)然，這樣的操作在本領(lǐng)域是常規(guī)的。
口服液體制劑可以是某些形式，例如水性或油性懸浮劑、溶液劑、乳劑、糖漿劑或酏劑，或者是做為干粉，在使用前用水或其他合適介質(zhì)重建。這些液體制劑可以包括一些常規(guī)添加劑，例如懸浮劑，如山梨醇、糖漿、甲基纖維素、明膠、羥乙基纖維素、羧甲基纖維素、硬脂酸鋁凝膠或氫化食用脂；乳化劑，例如卵磷脂、山梨糖醇酐單油酸脂或阿拉伯膠；非水性介質(zhì)(可以包括食用油)，例如杏仁油、分級椰子油、油性脂例如甘油脂、丙二醇或乙醇；防腐劑，例如對羥基苯甲酸或山梨酸甲酯或丙酯(proply)，以及如果需要，可以包括常規(guī)添味劑或著色劑。
口服形式也包括常規(guī)的緩釋制劑，例如具有腸溶衣的片劑或顆粒劑。
優(yōu)選實(shí)施方案的描述雖然在下列實(shí)施例中描述了本發(fā)明的某些優(yōu)選實(shí)施方案，以便可以更全面理解和認(rèn)識本發(fā)明的許多方面，但并不是要將本發(fā)明限制于這些特定的實(shí)施方案。相反地，它意圖包括所有，可以包括在所附權(quán)利要求書中確定的本發(fā)明范圍內(nèi)的替代方案、修改方案和等同方案。因此，下面包括優(yōu)選實(shí)施方案的實(shí)施例用來說明本發(fā)明的實(shí)施，應(yīng)該理解，所顯示的具體的實(shí)施例是作為實(shí)例，只是為了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案的解說性討論，以及為了提供關(guān)于配制程序以及本發(fā)明原理和概念方面被認(rèn)為是最有用而且容易理解的描述。
材料和方法動物12周齡的LDL-RD小鼠(C57BL/6J和129Sv品系的雜種)是通過同源重組產(chǎn)生的。小鼠購自Jackson實(shí)驗室(Bar-Harbor ME)。當(dāng)LDL-RD小鼠服用狗食具有高膽固醇水平(與人的值相似)，并且在食用高脂肪食物后發(fā)生明顯的粥樣動脈硬化，因此使用LDL-RD小鼠。給LDL-RD小鼠或者喂食包含4.5％(重量)脂肪(0.02％膽固醇)的正常狗食，或者喂食含有1.25％膽固醇、7.5％酪蛋白和0.5％(wt/)膽酸鈉的致動脈粥樣化飲食(Harlan，Teklad Premier Laboratory Diets，Madison，WI)。將小鼠保持在12小時光/12小時黑暗的周期中，而且允許它們隨意接觸到食物和水。
LDL的分離、氧化和特性鑒定空腹12小時后將用于脂蛋白分離的血液收集到EDTA(1mg/ml)中。用Kbr-調(diào)節(jié)密度后，用50型轉(zhuǎn)子以50,000rpm/min制備性超速離心22小時，將LDL(密度＝1.019-1.063g/l)從血漿中分離出來。通過超速離心清洗LDL樣品，在pH7.4、0.15mol/L的EDTA中透析，通過Acrodisc濾膜(孔徑0.22μm)除去聚集體，然后保存于氮中，置于黑暗處。
LDL的氧化是通過將預(yù)透析的LDL(在無EDTA的PBS中的濃度為1mg蛋白/ml)與硫酸銅(10μM)一起在37℃溫育24小時來進(jìn)行。通過對硫代巴比妥酸反應(yīng)性物質(zhì)(TBARS)的分析可以確定脂蛋白的氧化，TBARS可以通過脂肪過氧化試驗來測量丙二醛(MDA)相當(dāng)物，也可以通過對脂蛋白的共軛雙烯含量的分析來確定。
抗-Ox LDL抗體效價的測定預(yù)先制備天然LDL和銅氧化的LDL的制劑。將96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(Nunc Maxisorp，丹麥)在4℃用Ox LDL、天然LDL(在PBS中濃度為5μg/ml)或PBS包被過夜。利用含有0.05％吐溫和0.001％抑酶肽(Sigma，美國)的PBS清洗4次后，再用2％牛血清清蛋白(BSA)在室溫下封閉酶標(biāo)板2小時。血清部分按1∶50稀釋到含有0.05％吐溫和0.2％BSA的PBS中。酶標(biāo)板在再溫育過夜后，洗板，然后加入堿性硝酸酶綴合的山羊抗-鼠IgG(Jackson ImmunoResearch laboratory Inc.，美國)，按1∶10,0000稀釋到含有0.05％吐溫、0.2％BSA的PBS中，室溫下保留1小時。在徹底清洗后，加入在含有1mM MgCl2pH9.8的50mM碳酸緩沖液中濃度為1mg/ml的對硝基苯磷酸(Sigma)作為底物。30分鐘后加入1M NaOH終止反應(yīng)。利用Titertek酶標(biāo)儀(S.L.TLaboratory Instruments，Vienna，Austria)在405nm波長讀數(shù)，結(jié)果以405nm的OD值顯示?？?Ox LDL抗體的效價通過從結(jié)合Ox LDL中獲得的數(shù)值減去從結(jié)合天然LDL中獲得的數(shù)值而計算出來。
進(jìn)行抑制測定是為了確定抗-Ox LDL抗體的特異性，并檢查與HSP-粥樣動脈硬化中重要的免疫源的可能交叉反應(yīng)性。確定達(dá)到最大結(jié)合Ox LDL一半的HSP-65免疫的小鼠血清的濃度，并應(yīng)用濃度增加的不同抑制物(即HSP-65、Ox LDL、牛血清白蛋白)。
抗-HSP-65抗體的檢測通過在4℃溫育過夜將磷酸緩沖鹽溶液(PBS，pH7.2)中的重組HSP-65(1μg/ml)包被到平底96孔酶標(biāo)板(Nunc Maxisorp，丹麥)上。用含0.02％吐溫的PBS(0.02％PBS Tween)洗板后，再用含1％BSA的PBS封閉，然后按不同稀釋度(1∶50、1∶100、1∶200，PBS中)加入血清，在室溫下溫育1小時。加入過氧化酶綴合的兔抗-鼠IgG(DakoLtd，HighWycombe，UK)，在室溫下溫育1小時，然后用PBS/Tween清洗4次。最后，加入含有0.53mg/ml 2，2-連氮基-二(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)(ABTS，Sigma)的枸櫞酸鹽磷酸緩沖液(0.1M，pH4.2)100μl，30分鐘后利用Titertek酶標(biāo)儀在490nm測定吸光率。
抗-磷脂抗體的檢測利用改良ELISA對抗PL的小鼠和人抗體的反應(yīng)性進(jìn)行測定。利用陰離子PL[心脂質(zhì)(CL)、磷脂酰絲氨酸(PS)、磷脂酰肌醇(PI)]和磷脂酰膽堿(PC)中任一種包被微量酶標(biāo)板(Nunc Maxisorp，丹麥)，以上的所有試劑來自Sigma化學(xué)公司，St.Louis，Mo，濃度50μg/ml，除了PC(氯仿-甲醇，1∶3)外其余溶解于乙醇中。酶標(biāo)板在真空中干燥并用含有0.5％明膠的TBS封閉。然后用TBS清洗酶標(biāo)板三次，再將不同濃度的小鼠制品加入到用人β2GP1(5μg/ml，30分鐘)或僅僅是0.1％明膠/TBS處理的酶標(biāo)板孔內(nèi)。利用羊抗-鼠堿性磷酸酶綴合物和加入底物(對硝基苯磷酸)來檢測抗體結(jié)合。結(jié)果通過405nm的吸光率(OD405)顯示。
抗-b2GP1抗體的檢測在96孔聚苯乙烯酶標(biāo)板(Nunc)中4℃過夜溫育50mM碳酸氫鹽緩沖液pH9.6中的1μg/ml β2GP1或不同的DM。用TBS清洗3次后，再用0.5％明膠/TBS封閉2小時(如抗-PL ELISA一樣)。然后清洗酶標(biāo)板3次，再加入鼠血清(按1∶100稀釋到明膠/TBS中)，在室溫下溫育2小時。3次清洗后，加入分別稀釋到0.1％明膠/TBS(1∶10,000)中的堿性磷酸酶綴合的羊抗-人IgG。再清洗3次后，加入在碳酸鈉緩沖液pH9.8中的底物對硝基苯磷酸，在405nm測吸光率。
脾臟淋巴細(xì)胞的增殖測定處死時從小鼠中取出脾臟，然后分離淋巴細(xì)胞。在不同濃度的HSP-65、OxLDL、β2GP1或卵清蛋白存在下在微量酶標(biāo)板中，在0.2ml培養(yǎng)基中培養(yǎng)三份平行的1×106個細(xì)胞/ml 72小時。通過在培養(yǎng)的最后12個小時內(nèi)在DNA中[3H]胸腺嘧啶的摻入來測定淋巴細(xì)胞的增殖。結(jié)果通過刺激指數(shù)(S.I.)計算出來抗原平均cpm與缺乏抗原時獲得的平均背景cpm之比。
細(xì)胞因子水平的檢測小鼠處死后取出脾臟細(xì)胞，利用Ox LDL、HSP-65或卵清蛋白培養(yǎng)脾細(xì)胞3天，然后收集上清。檢測在脾細(xì)胞培養(yǎng)上清中細(xì)胞因子分布型(IL-4、IL-10、IFN-γ和TGF-β)。
實(shí)施例實(shí)施例1在這個實(shí)驗中用到的小鼠被稱為LDL-受體缺陷(LDL-RD)小鼠。這些動物具有導(dǎo)致全身細(xì)胞中LDL受體缺陷的遺傳突變。該受體負(fù)責(zé)從循環(huán)中排泄和清除“有害的”膽固醇(LDL)，當(dāng)該受體缺乏時，若給小鼠喂食3-5周的高脂肪食物，小鼠會患有高血脂癥，并發(fā)生粥樣動脈硬化。
使用3組小鼠(每組15只LDL-RD小鼠)。通過一個特殊的裝置(導(dǎo)管)進(jìn)行喂食，所述裝置設(shè)計成將食物導(dǎo)入小鼠的食道，以確保食物基本上全部到達(dá)胃部。
第1組隔天給小鼠喂食5劑溶于PBS的1mg人Ox LDL。在最后一劑量結(jié)束時，給小鼠喂食高脂肪食物并在喂食3周或5周后處死。
第2組給小鼠喂食5劑溶于PBS的1mg對照蛋白(卵清蛋白)，然后給小鼠喂食所述特殊食物3周或5周。
第3組在開始所述飲食之前，不給小鼠喂食任何東西。
處死小鼠時評估小鼠粥樣動脈硬化損傷的存在、血清膽固醇數(shù)值以及Ox LDL抗體水平。
結(jié)果在本研究之前及結(jié)束時所有的小鼠都具有相似的重量。我們發(fā)現(xiàn)喂食Ox LDL的小鼠產(chǎn)生的粥樣動脈硬化要少(減少30％)。
在本研究中，已經(jīng)顯示出在小鼠中用Ox LDL的口服耐受對誘發(fā)粥樣動脈硬化的有益作用。有許多結(jié)果指出口服耐受在各種自身免疫疾病中的效果的研究，例如膠原蛋白在佐劑性關(guān)節(jié)炎(類似于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎)中的作用、在糖尿病中的作用、在眼色素層炎中的作用、在EAE(類似于多發(fā)性硬化癥)中的作用。在以上提到的研究中已經(jīng)進(jìn)行了人體實(shí)驗。最近在給患有風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的病人通過口服給予膠原蛋白II(口服耐受)時，注意到了一個顯著的功效。在對各種自身免疫疾病的小鼠研究和人體研究之間具有相類似的功效，表明外推至人類可獲得成功。應(yīng)該強(qiáng)調(diào)的是這種治療沒有任何副作用。
實(shí)施例2在LDL-受體缺陷小鼠中通過喂食人Ox LDL抑制高脂肪食物誘發(fā)的粥樣動脈硬化給LDL-RD小鼠(n＝15)喂食5個劑量(隔天)的3種不同濃度(1mg/劑量、100μg/劑量和1mg/劑量)的人Ox LDL。給另外的LDL-RD小鼠(每組n＝15)喂食對照抗原(相似劑量的卵清蛋白)。
在最后一次喂食的第2天，所有小鼠用高脂肪食物(“paigen”)攻擊5周。
在實(shí)驗的最后，檢測所有小鼠的血清中抗-OxLDL抗體、抗-HSP65抗體和抗磷脂抗體是否存在，并進(jìn)行脂質(zhì)分布型的檢測(總膽固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
在研究的最后取出所有小鼠的心臟，使用前冷凍于-70℃(見“材料與方法”)。利用抗CD3、CD4、CD8的單克隆抗體、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化標(biāo)記進(jìn)行在恒冷箱切片上進(jìn)行免疫組織化學(xué)研究。
利用Ox LDL的活性衍生物-LPC進(jìn)行相似的喂食方案。
實(shí)施例3通過喂食HSP-65抑制結(jié)核分枝桿菌引起的粥樣動脈硬化本發(fā)明人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用MT免疫一次的LDL-RD小鼠產(chǎn)生增強(qiáng)的早期粥樣動脈硬化。
給LDL-RD小鼠(n＝15)喂食5個劑量(隔天)的3種不同濃度(1mg/劑量、100μg/劑量和1μg/劑量)的重組HSP65。給另外的LDL-RD小鼠(每組n＝15)喂食對照抗原(相似劑量的卵清蛋白)。
在最后喂食的第2天，所有的小鼠經(jīng)過用在完全弗氏佐劑中乳化的MT熱滅活懸浮液(10mg/ml、100μg/只)免疫來進(jìn)行攻擊。小鼠在用MT免疫后12周處死。
在實(shí)驗的最后，檢測所有小鼠的血清中抗-HSP65抗體是否存在，并進(jìn)行脂質(zhì)分布型的檢測(總膽固醇、LDL、VLDL、HDL和甘油三脂)。
評估來自HSP-65耐受小鼠和喂食對照物小鼠的引流(draining)淋巴結(jié)細(xì)胞對HSP的增殖應(yīng)答。
評估在從培養(yǎng)基收集的上清液中細(xì)胞因子(IL-4、IFN-γ、IL-10和TGF-β)的水平，在所述培養(yǎng)基中用HSP65體外誘發(fā)淋巴細(xì)胞。
從所有小鼠中取出心臟，于-70℃冷凍。為了確定粥樣動脈硬化的程度，進(jìn)行恒冷箱切片(每個切片5μm厚)。有關(guān)切片(來自主動脈竇區(qū)域)利用油紅O染色，通過計算用方格網(wǎng)統(tǒng)計的區(qū)域就可確定粥樣動脈硬化的程度。
利用抗CD3、CD4、CD8的單克隆抗體、巨噬細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞和淋巴細(xì)胞活化標(biāo)記進(jìn)行關(guān)于恒冷箱切片的免疫組織化學(xué)研究。
實(shí)施例4通過喂食人b2GP1抑制粥樣動脈硬化實(shí)驗程序與用于Ox LDL和HSP65的程序相類似，而且基于用β2GP1免疫誘發(fā)早期粥樣動脈硬化的觀察。
粥樣動脈硬化程度的評估通過計算主動脈竇內(nèi)粥樣動脈硬化脂肪紋損傷的大小(作一定的修正)，可以定量測定定所述損傷。簡而言之，從動物中取出心臟和主動脈的上段切片，細(xì)心剝離外周的脂肪。上段切片包埋在OCT培養(yǎng)基中并冷凍。取整個主動脈竇(400μm)的每隔一個切片(10μm厚)進(jìn)行分析。通過作為動脈與心臟連接點(diǎn)的3個瓣前尖來識別主動脈竇的遠(yuǎn)側(cè)部。在用油紅O染色后評估切片的脂肪紋損傷。一個不熟悉檢測標(biāo)本的觀察者利用網(wǎng)格來統(tǒng)計每個切片的損傷。
在主動脈竇的水平來評估粥樣動脈硬化程度。將組織進(jìn)行加工和染色。通過Rubin EM、Kraus RM、Spanler EA等的修正方法(在轉(zhuǎn)基因小鼠中人載脂蛋白AI抑制早期粥樣動脈硬化.Nature 1991；353265-267頁)來定量測定損傷區(qū)域。
粥樣動脈硬化損傷的免疫組織化學(xué)mAbs大鼠單克隆抗體H129.19(L3T4)-抗-小鼠CD4+和S3-6.7(Ly-2)-抗-小鼠CD8a得自PharMingen(San Diego，CA，USA)；MCA497(F4/80)-抗-小鼠巨噬細(xì)胞得自Serotec(Oxford，UK)。
在主動脈竇5μm厚的冷凍切片中對CD4、CD8和巨噬細(xì)胞進(jìn)行免疫組化染色。切片在甲醇中-20℃固定4分鐘，接著用乙醇在-20℃溫育10分鐘。然后用非免疫山羊血清在室溫下封閉切片15分鐘，接著用CAS封閉劑在室溫下溫育30分鐘。隨后，加入抗-小鼠CD4/CD8的大鼠-單克隆抗體1小時。清洗后，在室溫下加入親和純化生物素基化的兔抗-大鼠IgG抗體30分鐘。清洗后，用0.3％H2O2溫育玻片，接著再進(jìn)行清洗，然后在室溫下用鏈霉抗生物素蛋白-過氧化酶綴合物溫育30分鐘。清洗后，用3-氨基-9-乙基carbonasole(AEC)底物(Dako)對玻片進(jìn)行顯色15分鐘。切片用蘇木精復(fù)染。脾臟切片作為陽性對照。在缺乏第1或第2抗體的情況下染色作為陰性對照。
過繼轉(zhuǎn)移實(shí)驗在每一個研究中都從耐受小鼠和非耐受小鼠中分離T-細(xì)胞(CD4或CD8細(xì)胞)，并把它們轉(zhuǎn)移到將用致動脈粥樣化食物攻擊6周的LDL-RD同窩小鼠中。在實(shí)驗的結(jié)束時取出心臟用于評估粥樣動脈硬化和進(jìn)行免疫組化分析。
對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，顯然本發(fā)明并非限制于前面的說明性實(shí)施例的細(xì)節(jié)，而且在沒有違背本發(fā)明必要的特征的情況下，本發(fā)明可以體現(xiàn)為其他特定形式，因此，本發(fā)明的實(shí)施方案和實(shí)施例在所有方面都應(yīng)該被要求認(rèn)為是例證性的而不是限制性的，并且參考所附的權(quán)利要求書，而不是前面的描述，因此包括在所述權(quán)利要求書等同物的含義和范圍之內(nèi)的所有變化，都將包括在本發(fā)明中。
權(quán)利要求
1.用于預(yù)防和/或治療選自心臟病發(fā)作、血管成形術(shù)-再狹窄和中風(fēng)的疾病的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其含有治療有效量的選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白、熱休克蛋白60/65、β2-糖蛋白-1、其功能性衍生物和混合物的活性組分，該活性組分與藥學(xué)上可接受的載體結(jié)合以便于口服給藥。
2.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是心臟病發(fā)作。
3.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是血管成形術(shù)-再狹窄。
4.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述疾病是中風(fēng)。
5.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是修飾的低密度脂蛋白。
6.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白。
7.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是氧化低密度脂蛋白的功能性衍生物。
8.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65。
9.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是熱休克蛋白60/65的功能性衍生物。
10.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是β2-糖蛋白-1。
11.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述活性組分是β2-糖蛋白-1的功能性衍生物。
12.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述修飾的低密度脂蛋白是溶血磷脂酰膽堿。
13.權(quán)利要求1的誘導(dǎo)免疫口服耐受的藥用組合物，其中所述修飾的低密度脂蛋白是丙二醛LDL。
全文摘要
公開了用于預(yù)防和/或治療粥樣動脈硬化的誘導(dǎo)免疫口服耐受的組合物，該組合物包含結(jié)合一種口服用藥學(xué)上可接受載體的一種活性組分，所述活性組分選自修飾的低密度脂蛋白、氧化低密度脂蛋白(Ox LDL)、熱休克蛋白60/65(HSP 60/65)、β
文檔編號A61K38/17GK1616085SQ200410011940
公開日2005年5月18日 申請日期1999年9月30日 優(yōu)先權(quán)日1998年10月4日
發(fā)明者耶胡達(dá)·索恩菲爾德, 德羅爾·哈拉特斯, J·喬治 申請人:脈管生物生長有限公司