專利名稱：一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物及其制劑和制備方法
技術領域：
本發(fā)明涉及醫(yī)藥技術領域，具體地是涉及一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物及其制劑和制備方法。
背景技術：
急性胰腺炎(Acute Pancreatitis，縮寫為AP)為臨床常見的急腹癥之一，其發(fā)病率逐年上升。其中85％以上為水腫型AP，發(fā)達國家(日本、西歐)的發(fā)病率高于不發(fā)達國家的，其病因及發(fā)病機理尚未完全明確。AP的治療是近年來普外科研究的重點和難點，也是研究的熱門課題。
根據(jù)《2002年世界胃腸病大會急性胰腺炎診治指南》，認為“對AP的治療，目前還沒有公認的特效藥物”。
心腦血管疾病是目前人類疾病死亡的頭號殺手，其致病機理多年來人們進行了深入研究，但到目前為止，仍未徹底研究清楚。隨著社會的進步，人們生活水平逐步提高，其發(fā)病率呈逐年快速上升趨勢。
蒲黃系香蒲科植物狹葉香蒲、長苞香蒲等的干燥花粉，性味甘平無毒，歸肝、心包二經(jīng)，為臨床常用的活血化瘀藥。公元17世紀，元朝羅天益用蒲黃五靈脂治療“心氣痛不可忍”，效果卓越，該方也就成為中藥名方，命名為“失笑散”?！侗静菥V目》記載“蒲黃性甘平，利小便......止心腹諸痛?！苯陙韺ζ腰S進行了一系列現(xiàn)代研究表明蒲黃中含有異鼠李素，槲皮素、柚皮素、山奈黃素及其甙等黃酮類成分，香草酸、原兒茶酸、反式對羥基肉桂酸，琥珀酸，對羥基苯甲酸性成分以及6-氨基嘌呤、三十一烷醇，β-谷甾醇，還含有賴氨酸等十幾種氨基酸等，其中異鼠李素有強心、利尿、消腫、提高心肌C-AMP水平，抗血栓形成等作用，槲皮素有解痙、抗炎、抗過敏、抗菌等活性。
蒲黃具有抗菌、抗過敏、消腫、改善微循環(huán)、抗動脈粥樣硬化，抗血栓形成等作用。體外試驗證明其具有促進動脈內(nèi)皮細胞合成PGI2(前列環(huán)素)，降低TXA2/PGI2的比值(TXA2為血漿血栓素)，使之恢復正常，據(jù)認為該比值異常是胰腺血流損傷和病理過程加重的重要因素。許多專家指出氧自由基引起的脂質過氧化在急性胰腺炎發(fā)病過程中起重要作用，蒲黃含有多種黃酮類化合物，后者具有較強的抗脂質過氧化作用；最新研究表明，胰腺炎的發(fā)生和發(fā)展與微循環(huán)因素有極其重要的聯(lián)系，而蒲黃具有顯著改善微循環(huán)的作用；近年蘇州醫(yī)學院又從蒲黃中分離純化了有改善微循環(huán)作用的纖維蛋白溶介酶，國內(nèi)又有報道其中所含香草酸能使血小板不可逆聚集發(fā)生解聚作用。同時，國內(nèi)外不少研究也發(fā)現(xiàn)蒲黃水提部分B對心腦血管疾病的治療可能有較好的作用。

發(fā)明內(nèi)容
由于目前臨床尚缺乏治療AP公認的中藥治療藥，研究其治療藥物在臨床上很有意義。從繼承和發(fā)展祖國醫(yī)藥學的角度來看也很有意義，雖然近年來西藥抑肽酶(廣譜蛋白酶抑制劑)取得較好療效，但一則該藥需要進口，應用地區(qū)受到很大限制；二則藥費高昂，給患者帶來沉重負擔。丞需研發(fā)新藥，滿足臨床應用。根據(jù)我們的研究，發(fā)現(xiàn)蒲黃的有效成分對胰腺炎治療有較好作用；而以該有效成分制成的蒲黃注射液本身具有三個特點1活性部位明確，療效肯定，其中總黃酮及總有機酸具有抗菌、抗炎、消腫、解痙、止血、改善微循環(huán)，抗血小板聚集，抗脂質過氧化、促進動脈內(nèi)皮細胞合成PGI2(前列環(huán)素)，保護血管內(nèi)皮細胞、調節(jié)免疫、對水腫型AP動物有降低血清淀粉酶、減輕病理改變等作用，經(jīng)反復進行藥理試驗均證明其對水腫型AP有效。2資源豐富，價廉易得，工藝不復雜，成本低，相當用量的抑肽酶180元/支，而蒲黃注射液成本不足15元。3為靜脈注射劑，見效快，可提供一個治療AP的中藥急癥用藥。同時利用蒲黃提取的活性部位還可以制備成多種劑型藥物，供臨床應用。
蒲黃注射液治療水腫型AP具有療效肯定，起效快，符合臨床禁食治療的原則，并有藥源豐富、價格低廉、無明顯毒副作用等特點，可填補中草藥注射劑治療AP領域的空白，開發(fā)前景廣闊，在發(fā)展祖國醫(yī)學的理論與實踐、提供新的治療手段、減輕病人負擔、發(fā)展經(jīng)濟等方面均有重大意義。
本發(fā)明的目的在于提供一種治療急性胰腺炎和腦血管疾病的蒲黃提取物及其制劑和制備方法，本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和腦血管疾病的制劑是由中藥蒲黃提取物(活性部位)和藥學上可接受的載體或賦形劑組制成的，該制劑可以是藥劑學上可以接受的任何劑型，包括注射液、粉針劑、凍干粉針劑、輸液劑、軟膠囊、膠囊、片劑、緩釋片劑及顆粒劑。
本發(fā)明的制備方法包括蒲黃提取物的提取方法和制劑的制備方法。
蒲黃提取物的提取包括下述步驟A、取蒲黃加1-3倍量(以蒲黃重量計)60-80％(V/V)乙醇浸泡8-24小時后，每次加8-12倍量(以蒲黃重量計)的60-90％(V/V)乙醇加熱回流提取2-4次，每次1.5-3小時，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.2-1.3(55±5℃)；B、濃縮液2-4℃冷藏8-12天，使分層；C、將上層油狀物水洗，分層，水層濃縮，與下層合并，得浸膏I；D、浸膏I加10-20倍量(以浸膏I體積計)水溶解、煮沸、過濾、濃縮至相對密度為1.10，得浸膏II；E、浸膏II加8-12倍量(以浸膏II體積計)95％乙醇充分攪拌，濾過，反復二次，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.20，得浸膏III；F、浸膏III加10-20倍量(以浸膏III體積計)水溶解、煮沸、濾過，濾渣用2-4倍量水洗，濾液濃縮至相對密度為1.10，得浸膏IV；G、浸膏IV在水中通過聚酰胺交換柱，水洗至近無色，Mg粉-HCL反應(+)，棄去水洗液，以40-70％乙醇洗脫至Mg粉-HCL反應(-)，合并乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，蒸干，得浸膏粉；H、浸膏粉加10-20倍量(以浸膏粉重量計)水煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏10-24hr，過濾，反復二次，濾液蒸干，浸膏100℃烘干、粉碎，得蒲黃活性部位提取物的棕黃色粉末。
上述步驟A蒲黃浸泡乙醇用量優(yōu)選為2倍量(以蒲黃重量計)，乙醇濃度優(yōu)選為65-75％，浸泡時間優(yōu)選為10-14h；回流用乙醇濃度優(yōu)選為65-75％，乙醇用量優(yōu)選為8-10倍量(以蒲黃重量計)，回流提取2-3次，每次2-2.5小時。濾液濃縮至相對密度優(yōu)選為1.23-1.26(55±5℃)。
步驟B中，濃縮液冷藏時間優(yōu)選為9-11天。
步驟D中，溶解浸膏I的用水量優(yōu)選為13-16倍(以浸膏I體積計)。
步驟E中，溶解浸膏II的乙醇用量優(yōu)選為8-10倍(以浸膏II體積計)。
步驟G中，洗脫乙醇濃度優(yōu)選為45-55％。
步驟H中，冷藏時間優(yōu)選為10-14h。
本發(fā)明蒲黃提取物制劑的制備A、注射液的制備取蒲黃提取物，溶于注射用水中，攪拌使溶解，煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏12hr，過濾，重復煮沸、冷藏、過濾步驟二次，加注射用水至1000ml，每毫升溶液中含蒲黃提取物3.5mg調節(jié)PH至6-8，濾過，4號垂熔漏斗濾過或超濾(半成品質量檢查、調節(jié)含量)，濾液灌裝，每安瓿10-100ml，充氮、熔封、100℃45min滅菌、燈檢、漏氣檢查、印字、包裝，即得。
B、粉針劑的制備取蒲黃提取物，溶于500ml注射用水中，攪拌使溶解，煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏12hr，過濾，煮沸冷藏重復二次，加入適量藥用輔料，溶解后加注射用水至1000ml，調節(jié)PH至6-8，濾過，4號垂熔漏斗濾過或超濾(半成品檢查、調節(jié)含量)，濾液經(jīng)噴霧干燥，密閉冷卻24h，按規(guī)定量無菌分裝于西林瓶中，每瓶折合含蒲黃提取物30-100mg，扎蓋、包裝即得。
C、凍干粉針劑的制備凍干粉針劑制備過程與粉針劑制備過程基本相同，調節(jié)溶液中蒲黃提取物濃度為30-50mg/ml，經(jīng)超濾后，濾液分裝于安瓿瓶或西林瓶中，每安瓿裝量1ml，每西林瓶裝量2ml，冷凍干燥，每安瓿折合含蒲黃提取物30-50mg；每西林瓶折合含蒲黃提取物60-100mg；熔封或扎蓋包裝即得。
D、軟膠囊的制備取蒲黃提取物適量備用。按規(guī)定量取食用油和蜂蠟，加熱至蜂蠟完全溶解，冷卻至40-50℃，加入蒲黃提取物，膠體磨研磨，用常規(guī)軟膠囊壓制法或注射液成型法制備軟膠囊，1000粒，每粒膠囊內(nèi)含蒲黃提取物35mg，檢驗合格，包裝即得。
E、片劑、膠囊劑、顆粒劑、緩釋片劑的制備均按常規(guī)工藝制備，每片、或每顆膠囊中含蒲黃提取物35mg；顆粒劑每小袋為1g，含蒲黃提取物100mg；經(jīng)檢驗合格后，包裝即得。
本發(fā)明的蒲黃提取物注射劑型的PH值優(yōu)選為7.0-7.5，最優(yōu)選擇為7.2。
本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑具有很好的治療效果。以下通過本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的中藥制劑的注射液藥學試驗對本發(fā)明作進一步說明。
1 動物模型的制作參照文獻方法，動物在禁食、戊巴比妥鈉麻醉下無菌開腹，經(jīng)十二指腸主胰管，逆行加壓注射生理鹽水(1ml/kg)制成輕型急性胰腺炎模型，麻醉維持8-12小時，其間滴注1％葡萄糖鹽水500ml，次日給予流汁，以后逐步改為普通食。
2 給藥方法動物手術后4小時將蒲黃注射液1ml/kg與500ml 5％葡萄糖鹽水混合滴注，手術后1天開始將同樣劑量的藥物進行推注，每日一次，連續(xù)給藥六天，對照組靜脈注射等體積生理鹽水。
3 血清淀粉酶測定手術前、手術后1、3、7天分別采血用碘比色法測定血清淀粉酶活力，結果見表1。
表1不同供試品對狗急性胰腺炎血清淀粉酶的影響

實驗小結1 實驗結果表明手術后所有動物均發(fā)生急性胰腺炎。
2 靜脈注射蒲黃注射液能抑制狗急性胰腺炎血清淀粉酶的升高。實驗結果提示本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的中藥制劑對急性胰腺炎具有較好的治療效果。
本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物及其制劑和制備方法中的注射液對大鼠大腦中動脈栓線法局灶性腦缺血再灌注損傷模型的治療作用。
1 方法將大鼠用10％的水合氯醛3ml/kg腹注(ip)麻醉，頸正中切口、分離、結扎右側頸總動脈、頸外動脈及其分支動脈。分離右側頸內(nèi)動脈，沿頸內(nèi)動脈向下分離翼頸動脈，根部結扎該分支。在頸內(nèi)動脈近端備線、遠端放置動脈夾，頸總動脈分叉處切口，插入4-0尼龍線，深度為17-20mm，栓線進入頸內(nèi)動脈，入顱至大腦前動脈，阻斷大腦中動脈所有血流來源。撤掉動脈夾，扎緊備線，外留1cm長線頭?？p合皮膚。缺血1h后靜脈注射(iv)給藥或生理鹽水。缺血2h后再灌注，勿需再次麻醉和切開皮膚，輕輕提拉線頭至有阻力時，提示尼龍線頭端已至頸總動脈切口處，血流再通，假手術組除不插線外，其余步驟同上。存活鼠再灌注24h后，觀察大鼠行為學變化，進行神經(jīng)病學評分。
參考Zea Longa的5分制評分標準0分，無神經(jīng)損傷癥狀1分，不能完全伸展對側前爪
2分，向外側轉圈3分，向對側傾倒4分，不能自發(fā)行走，意識喪失腦含水量測定神經(jīng)病學評分后，快速斷頭取鼠大腦。一部分分別稱左右腦半球濕重，置120℃烤箱烘干至恒重，按以下公式計算腦組織含水量，腦組織含水量(％)＝(濕重-干重)/濕重*100％。
腦梗塞范圍的測定另一部分大鼠斷頭取腦，去掉嗅球、小腦和低位腦干后切成5片，以紅四氮唑(TTC)染色。正常組織經(jīng)染色后呈紅色，梗塞組織呈白色。用圖像分析儀計算梗塞組織重量占總腦重的百分比作為梗塞范圍。
病理檢查將TTC染色后的腦片置10％福爾馬林中固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、染色等步驟制備組織切片，并用JEM1200-EX透射電子顯微鏡(日本電子)進行超微結構的觀察。
觀察指標及觀察時間觀察大鼠行為學、腦水腫、腦梗塞、組織形態(tài)學的變化。觀察時間為再灌注后24小時。
數(shù)據(jù)及統(tǒng)計學處理實驗數(shù)據(jù)用X±S表示，采用方差分析和Student t test進行顯著性檢驗。
腦梗塞模型大鼠分組假手術組20只；模型(給予溶劑治療)組20只本發(fā)明注射液iv小劑量組20只；本發(fā)明注射液iv中劑量組20只；本發(fā)明注射液iv大劑量組20只。
結果一般觀察經(jīng)過腦梗塞的大鼠麻醉清醒后即有偏癱樣癥狀出現(xiàn)。主要表現(xiàn)為不同程度的手術對側前肢內(nèi)收，肩內(nèi)旋，肌張力降低，推右肩向對側移動，抵抗阻力降低，甚至有些動物還出現(xiàn)不停地向一側轉圈現(xiàn)象。與模型組(生理鹽水治療)比較，術后模型組動物的一般狀態(tài)較差，活動減少，大多數(shù)動物體重有所下降，而各治療組動物一般狀況均有明顯的改善。
隨機選取各實驗組前8只大鼠進行神經(jīng)病學評分，術后24h的行為評分，本發(fā)明各劑量治療組均有明顯低的行為學評分，統(tǒng)計分析有顯著差異(P＜0.01)，結果見表2。iv本發(fā)明注射液高、中組大鼠與模型組比較，大鼠的行為障礙明顯地改善，有些動物基本恢復正常。假手術組動物行為無異常，結果見表3。
表2本發(fā)明注射液對大鼠大腦中動脈梗塞后的神經(jīng)病學評分影響(X±S)

與模型組比較*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.0001腦含水量從表3可以看出，各組大鼠未梗塞的左側大腦的濕重，干重均無明顯的差別；而對于梗塞的右側腦組織，模型組腦含水量顯著高于假手術組；本發(fā)明注射液大劑量組和中劑量組則顯著低于模型對照組，而與假手術組接近，本發(fā)明注射液小劑量組的腦含水量雖有降低趨勢，但與模型對照組相比無統(tǒng)計學意義。
表3腦梗塞大鼠腦含水量的比較(X±S，n＝8)

與假手術組比較，**P＜0.01；與模型組比較#P＜0.05，#P＜0.01。
大鼠腦梗塞范圍的觀察及本發(fā)明注射液對梗塞范圍的影響由于TTC染色適合于腦缺血24-48h內(nèi)檢測腦梗塞情況，本實驗是腦梗塞后24h利用TTC染色技術檢查腦梗塞程度。由表4可以看出，腦缺血再灌注24h后腦組織梗塞程度明顯，梗塞面積占總腦面積的36.68±10.51％。本發(fā)明注射液給藥后，使腦梗塞面積百分比明顯下降。假手術動物未見腦梗塞發(fā)生。
表4本發(fā)明注射液對大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷的保護作用(X±S)

與模型組比較，**P＜0.01，***P＜0.001。
大鼠腦梗塞后組織形態(tài)學變化及本發(fā)明注射液的影響大鼠經(jīng)腦梗塞術后24h，病灶側腦表面蒼白、無光，腦表面血管較對側充血，血管數(shù)目也有所增多，位于嗅束和大腦下靜脈之間的一段大腦中動脈顏色變暗。術后48h病灶側腦組織水腫明顯，隨時間延長逐漸出現(xiàn)軟化。在光鏡下觀察腦組織切片，可見大腦中動脈內(nèi)有血栓形成，血栓成分主要是血小板、紅細胞和纖維蛋白，表現(xiàn)為混合血栓的特征。腦組織主要呈缺血性改變，隨時間延長，缺血軟化灶范圍和深度有所增加。假手術組無明顯病理改變。
經(jīng)本發(fā)明藥物治療后的動物，肉眼即可看見大腦中動脈較對照組動物紅潤，組織切片示血栓明顯減輕甚至完全溶解。腦組織缺血程度減輕，只有小片軟化灶。各實驗組大腦組織病理學改變?nèi)缦录偈中g組神經(jīng)元及腦實質細胞結構基本正常，細胞核未見腫脹，核仁清楚，虎斑清晰可見，細胞周圍間隙略擴大，毛細血管內(nèi)有輕微充血，呈輕度變性水腫改變。
模型(生理鹽水)組左側大腦半球結構基本正常，呈輕度水腫改變；右側見神經(jīng)元及腦實質細胞周圍間隙明顯擴大，細胞核腫脹明顯，核仁模糊，腦實質內(nèi)有出血，毛細血管周圍間隙擴大，成變性、壞死、出血改變。
本發(fā)明注射液(2.92mg/kg)組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增大。神經(jīng)元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，細胞輕度水腫，核仁不清，毛細血管內(nèi)有充血，周圍間隙增大，呈變性，水腫改變。
本發(fā)明注射液(5.83mg/kg)組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增大，呈輕度變形改變。右側神經(jīng)元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，神經(jīng)元細胞核輕度腫脹，核仁不見，可見較多膠制細胞增生，呈變性，水腫改變。
本發(fā)明注射液(11.66mg/kg)組左側腦細胞結構未見異常，細胞周圍間隙略增寬，呈輕度變形改變。右側神經(jīng)元及腦實質細胞、毛細血管周圍間隙略增大，神經(jīng)元細胞核輕度腫脹，核仁清楚，可見較多胞質細胞增生現(xiàn)象。呈變性，水腫改變。
大鼠腦梗塞后超微結構的觀察
假手術組細胞結構清晰，可見完整的神經(jīng)元軸突，核膜完整，染色質分布均勻，線粒體，高爾基體及粗面內(nèi)質網(wǎng)清晰可見。
模型(生理鹽水)組細胞腫脹，細胞器數(shù)量變少，染色質凝聚，高爾基體池擴大，空泡變，粗面內(nèi)質網(wǎng)，線粒體腫脹，線粒體嵴紊亂，結構不清，周圍間隙擴大。
本發(fā)明注射液(2.92mg/kg)組缺血、再灌注損傷較重，核內(nèi)染色質溶解。
本發(fā)明注射液(5.83mg/kg)組水腫程度稍重，染色質凝聚，粗面內(nèi)質網(wǎng)，高爾基體及線粒體均有不同程度的腫脹。
本發(fā)明注射液(11.66mg/kg)組水腫程度較輕，細胞大致結構存在，粗面內(nèi)質網(wǎng)及線粒體均有腫脹，線粒體嵴消失。
本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑對大鼠冠狀動脈結扎心肌缺血的影響。
方法體重200-300g Wistar種大鼠，雌雄各半，隨機分4組，分別灌服本發(fā)明的中藥制劑顆粒劑(以蒲黃總黃酮計)25、50、100mg/kg、FDS 100g/kg和同容積生理鹽水(簡稱NS)，每天1次，連續(xù)給藥7天，末次藥后1小時，用600mg/kg烏拉坦腹腔注射麻醉，背部固定，測標準II及V3導聯(lián)心電圖為梗塞前心電圖。開胸后，用醫(yī)用無損傷縫合針(5個零號線)，在肺動脈圓錐與左心耳根部之間向下約1.5mm處，穿線結扎冠狀動脈，造成急性心肌梗塞，迅速關胸。梗塞后1小時測定心電圖，取心電圖有明顯心肌缺血改變者實驗用。于梗塞后8小時同前灌服藥物1次，24小時測定心電圖后，由眼眶靜脈叢取血，測定血清肌酸磷酸激酶和乳酸脫氫酶含量，用紅細胞電泳儀測定紅細胞電泳速度，然后處死大鼠，摘取心臟，放-20℃冰箱中冷凍30分鐘，沿冠狀動脈剪取心室，將心室橫向切成5片、放N-BT液中38℃水浴保溫15分鐘，將各片心肌非蘭染區(qū)(梗塞區(qū))切下，稱濕重，計算與心室重之比為心肌梗塞范圍。
結果1 對心肌梗塞范圍的影響NS組心肌梗塞范圍為14.79％，給藥各組梗塞范圍顯著減小(P＜0.01)(見表5)。表明本發(fā)明的蒲黃提取物制劑有顯著縮小心肌梗塞范圍的作用，同時看到隨劑量增加作用增強的量效關系。
表5蒲黃顆粒劑對結扎冠狀動脈大鼠梗塞范圍的(X±SD)

與NS組比較**P＜0.012 對肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶水平的影響。
測定給藥組血清肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶水平與NS組比較均有顯著性差異(P＜0.001)，實驗證明，蒲黃顆粒劑具有顯著降低肌酸磷酸激酶和乳酸膠氫酶含量，表明該藥能顯著降低心肌損傷，改善心肌無氧代謝和改善血液流變學。
表6蒲黃顆粒劑對結扎冠狀動脈大清肌酸磷酸激酶、乳酸脫氫酶水平的影響(X±SD)

與NS組比較**P＜0.013 對心和心電圖的影響測定心肌梗塞前后II導聯(lián)心電圖計算心率變化；測定V3導聯(lián)心電圖T波高度變化，以梗塞前后T波高度差值進行統(tǒng)計，結果各組大鼠梗塞前后心率變化不明顯(見表7)，NS組梗塞后略有增加，給藥各組梗塞后1小時心率略有降低，24小時基本恢復正常，梗塞前后心率變化均無顯著性差異(P＞0.05)；NS組梗塞后心電圖T波明顯增高，給藥各組心電圖T波抬高均明顯減小(見表7)，表明該藥對心率無明顯影響，但能明顯改善心肌梗塞所致的缺血性心電圖。
表7蒲黃顆粒劑對結扎冠狀動脈大鼠心電圖T波的影響(X±SD)

二 對小鼠耐缺氧的影響方法體重18-22g昆明種小鼠60只，雌雄各半，隨機分5組，分別灌服DA 100g/kg、本發(fā)明的蒲黃提取物制劑顆粒劑(以蒲黃提取物計)100、50、25mg/kg和同容積NS，每天1次，連續(xù)給藥7天，末次給藥后1小時，im 10u的異丙腎上腺素后將小鼠放置250ml廣口瓶內(nèi)，瓶內(nèi)放15g鈉石灰，一瓶只放一只小鼠，觀察記錄動物存活時間。
結果NS組動物存活時間為29.4分鐘，給藥各組存活時間均延長了11分鐘(見表8)，與NS組比較高中低劑量組有顯著差異(P＜0.01)。本發(fā)明的中藥制劑蒲黃提取物顆粒劑有明顯耐受缺氧、降低氧代謝的作用。
表8蒲黃顆粒劑對小鼠耐缺氧的影響(X±SD)


與NS組比較**P＜0.01三 對大鼠血栓形成的影響方法體重250-300g小鼠，雌雄各半，隨機分5組，每組8只，分別灌服DA 100g/kg，本發(fā)明的中藥制劑顆粒劑(以蒲黃總黃酮計)100、50、25mg/kg和同容積NS，每天給藥1次，連續(xù)7天，末次給藥后30分鐘，以烏拉坦腹腔注射麻醉，分離右頸總動脈和左頸外靜脈，用頸動脈-頸外靜脈血管旁路法進行血栓形成實驗(參考《中藥藥理研究方法學》)，在開放血流15分鐘后取出絲線，稱量血栓濕重。比較在各藥物作用下血栓重量。
結果NS組血栓濕重19.1mg，DA、本發(fā)明的蒲黃提取物顆粒劑三個劑量組血栓濕重明顯下降(見表9)，血栓形成抑制率分別為45.5％、30.9％和27.7％(P＜0.01)，表明該藥具有顯著抑制血栓形成的作用。
表9蒲黃顆粒劑對大鼠血栓形成的影響(n＝10，X±SD)


與NS組比較**P＜0.01結論通過結扎大鼠冠狀動脈致心肌缺血的模型結果表明100、50、25mg/kg，本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑可顯著縮小心肌梗塞面積，對缺血性心電圖的改變有明顯保護作用，可明顯降低該心肌缺血大鼠血清肌酸磷酸激酶(LDH)和乳酸脫氫酶(CK)水平。200、100mg/kg能顯著延長小鼠缺氧存活時間、具有耐缺氧作用。實驗還證明，該藥可顯著抑制血栓形成，表明該藥經(jīng)口服給藥具有顯著活血化瘀作用。綜上結果可見本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑對心肌缺血有明顯的防治作用。
藥理學研究表明，本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑，靜脈注射小鼠LD50為123.03mg/kg；口服給藥LD50為1.5g/kg。提示在治療劑量下，對人是安全的。
下面通過實施例對本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑及其制備方法作進一步說明。但本發(fā)明決不只限于實施例的范圍。
實施例1
取蒲黃加2倍量70％乙醇浸泡12小時，每次加9倍量70％乙醇加熱回流提取3次，每次2小時，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.25(55±5℃)，2-4℃冷藏10天，使分層，上層油狀物水洗，分層，水層濃縮，與下層合并，下層浸膏加15倍量水溶解、煮沸、過濾、濃縮至相對密度為1.10得浸膏I，浸膏加9倍量95％乙醇充分攪拌，濾過，反復二次，濾液減壓回收乙醇，濃縮至相對密度為1.20得浸膏II，浸膏II加15倍量水溶解、煮沸、濾過，濾渣用2倍量水洗，濾液濃縮至相對密度為1.10得浸膏III，浸膏III在水中通過聚酰胺交換柱，水洗至近無色，Mg粉-HCL反應(+)，棄去水洗液，以50％乙醇洗脫至Mg粉-HCL反應(-)，合并乙醇洗脫液，減壓回收乙醇，蒸干得浸膏IV，浸膏IV加15倍量水煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏12hr，過濾，反復二次，濾液蒸干，粉碎，得蒲黃有效部位提取物的棕黃色粉末。
取蒲黃提取物3.5g，溶于500ml注射用水中，攪拌使溶解，煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏12hr，過濾，煮沸冷藏重復二次，加注射用水至1000ml，調節(jié)PH至7.2，濾過，4號垂熔漏斗濾過或超濾(半成品質量檢查、調節(jié)含量)，濾液灌裝，每安瓿10ml，充氮、熔封、100℃ 45min滅菌、燈檢、漏氣檢查、印字、包裝，即得本發(fā)明的蒲黃提取物制劑的注射液。
取蒲黃提取物70g，溶于500ml注射用水中，攪拌使溶解，煮沸50min(補充損失的水)，2-4℃冷藏12hr，過濾，煮沸冷藏重復二次，加入適量藥用輔料，溶解后加注射用水至1000ml，調節(jié)PH至7.2，濾過，4號垂熔漏斗濾過或超濾(半成品檢查、調節(jié)含量)，濾液經(jīng)噴霧干燥，密閉冷卻24h，按規(guī)定量無菌分裝于西林瓶中，每瓶含蒲黃提取物30-50mg，扎蓋、包裝即得蒲黃粉針劑。
凍干粉針劑制備過程與粉針劑制備過程基本相同，經(jīng)超濾后，調整溶液中蒲黃提取物含量為30-50mg/ml，濾液分裝于安瓿瓶或西林瓶中，每安瓿裝量1ml，每西林瓶裝量2ml，冷凍干燥，熔封或扎蓋包裝即得蒲黃凍干粉針劑。
取蒲黃提取物35g備用。按規(guī)定量取食用油和蜂蠟，加熱至蜂蠟完全溶解，冷卻至40-50℃，加入蒲黃提取物，膠體磨研磨，用常規(guī)軟膠囊壓制法或注射成型法制備軟膠囊，每粒膠囊含蒲黃提取物35mg。檢驗合格，包裝即得蒲黃軟膠囊。
片劑、膠囊劑、顆粒劑、緩釋片劑均按常規(guī)工藝制備，片劑每片或每顆膠囊中含蒲黃提取物35mg；顆粒劑每小袋為1g，含蒲黃提取物100mg，經(jīng)檢驗合格后，包裝即得。
實施例2取蒲黃，加入3倍量65％乙醇浸泡10hr，加入8倍量75％乙醇回流提取3次，第一次2hr，第二次、第三次每次1.5hr，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇至相對密度為1.25，2-4℃冷藏10-11天，分層；上層油狀物水洗，水層濃縮至相對密度為1.25后與下層合并，加入浸膏體積15倍量水煮沸，過濾；濃縮至相對密度為1.10；向濃縮液中加入9倍量95％乙醇攪拌，濾過；重復乙醇浸提步驟2次，合并3次濾液，濾液減壓濃縮，回收乙醇，得浸膏；加入浸膏體積15倍量水，煮沸、溶解，過濾，濾液濃縮至相對密度為1.10；將濃縮液帶水上AB-8大孔吸附樹脂柱，用水洗脫至洗脫液近無色，用50％乙醇洗脫，至Mg粉-HCL反應(-)，洗脫液減壓回收乙醇，水浴蒸干，得洗脫液浸膏；向浸膏中加入20倍量水煮沸50min，2-4℃冷藏，過濾；重復煮沸、冷藏，過濾一次，濾液蒸干，粉碎得蒲黃提取物深棕黃色粉末。
制備本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎、心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑的制備方法同實施例1。
權利要求
1.一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物，它是通過以下方法得到的A、取蒲黃，加1-3倍蒲黃重量的60％-80％乙醇浸泡8-24 hr后，每次加8-12倍蒲黃重量的60％-90％乙醇，加熱回流提取2-4次，每次1.5-3hr，趁熱過濾，合并濾液，減壓回收乙醇，濃縮至55±5℃時相對密度為1.2-1.3；B、濃縮液于2-4℃冷藏，使分層；C、將上層油狀物水洗，分層，將水層濃縮至55±5℃時相對密度1.2-1.3，將濃縮液與步驟A中的水層合并，得浸膏I；D、向浸膏I中加入浸膏I體積的10-20倍量的水，溶解、煮沸、過濾、濃縮至相對密度為1.10，得浸膏II；E、向浸膏II中加8-12倍浸膏II體積的95％乙醇，充分攪拌，溶解，濾過，濾液減壓回收乙醇，并濃縮至相對密度1.20，得浸膏III；F向浸膏III中加10-20倍浸膏III體積的水，溶解、煮沸、過濾，濾渣用2-4倍濾渣重量的水洗，濾液濃縮至相對密度為1.10，得浸膏IVG、將浸膏IV在水中通過樹脂交換柱吸附，水洗至近無色，Mg粉-HCL反應(+)，棄去水洗液，以40％-70％乙醇洗脫至Mg粉-HCL反應(-)，合并乙醇洗脫液，減壓回收乙醇后蒸干，得浸膏粉；H、向浸膏粉中加入其重量10-20倍量的水，煮沸50min，于2-4℃冷藏10-24hr，過濾；重復本步驟操作二次，合并濾液；濾液蒸干，粉碎，得有效部位蒲黃提取物的棕黃色粉末。
2.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟A中蒲黃浸泡的乙醇用量為蒲黃重量2倍量。
3.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟A中乙醇濃度為65％-75％，浸泡時間為10-14hr，回流用乙醇濃度為65％-75％，乙醇用量為8-10倍量，回流提取次數(shù)為2-3次，回流時間為每次2-2.5hr；濾液濃縮至相對密度為1.23-1.26。
4.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟B中濃縮液冷藏時間為9-11天。
5.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟D中溶解浸膏I的用水量為13-16倍。
6.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟E中，溶解浸膏II的乙醇用量為8-10倍。
7.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟F中，溶解浸膏III的水用量為14-16倍。
8.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟G中，洗脫乙醇濃度為45％-55％。
9.根據(jù)權利要求1所述的蒲黃提取物，其特征在于步驟H中，冷藏時間為10-14hr。
10.根據(jù)權利要求1-9任一所述的蒲黃提取物，其特征在于所述樹脂是聚酰胺或大孔吸附樹脂AB-8中的一種。
11.一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑，其特征在于它是由權利要求1-10任一所述的蒲黃提取物和任意藥劑學上可接受的載體或賦形劑制成的。
12.根據(jù)權利要求11所述的制劑，其特征在于它可以是片劑、分散片劑、顆粒劑、膠囊劑、軟膠囊劑、注射液、粉針劑、或凍干粉針劑。
13.權利要求12所述的注射液制劑的制備方法，其特征在于取權利要求1-10所述的任一蒲黃提取物溶于注射用水中，煮沸50min，補充損失的水量，2-4℃冷藏12hr后過濾，重復煮沸、冷藏、過濾，加注射用水，調PH至6-8，過濾后，濾液經(jīng)4號垂熔漏斗濾過或超濾，調節(jié)至蒲黃提取物含量為3-5mg/ml，無菌灌裝，每安瓿10-100ml，充氮、熔封或軋蓋、100℃45min滅菌。
14.權利要求12所述的粉針劑的制備方法，其特征在于取權利要求1-10所述的任一蒲黃提取物溶于注射用水中，煮沸50min，補充損失的水量，2-4℃冷藏12hr后過濾，重復煮沸、冷藏、過濾一次，濾液中加入注射用水溶性藥用輔料適量，加注射用水；調節(jié)PH至6-8，過濾后，濾液經(jīng)0.2um微孔濾膜超濾，調節(jié)至蒲黃提取物含量為3-5mg/ml，噴霧干燥，密閉冷卻，無菌分裝。每瓶含蒲黃提取物30-50mg。
15.權利要求12所述的凍干粉針劑的制備方法，其特征在于取權利要求1-10所述的任一蒲黃提取物溶于注射用水中，煮沸50min，補充損失水量，2-4℃冷藏12小時后過濾，重復煮沸。冷藏、過濾一次，濾液中加入注射用水溶性藥用輔料適量，調節(jié)PH為6-8，過濾后，濾液經(jīng)0.2um微孔濾膜超濾，調節(jié)蒲黃提取物含量為30-50mg/ml，無菌分裝于安瓿或西林瓶中，每安瓿1ml，每西林瓶2ml，凍干即得。
16.權利要求12所述的軟膠囊制劑的制備方法，其特征在于適量食用油和蜂蠟，加熱完全溶解，冷卻至40-50℃，將權利要求1-10所述的任一蒲黃提取物加入，膠體磨研磨后，用常規(guī)軟膠囊壓制工藝或注射成型工藝制備軟膠囊。
17.根據(jù)權利要求13、14或15所述的制備方法，其特征在于PH為7.0-7.5，更優(yōu)選擇為7.2。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物及其制劑和制備方法，該制劑是由蒲黃中提取的有效部位為活性成分和任意藥學上可接受的載體或賦形劑制備而成，其劑型是藥劑學上所有可以接受的劑型，本發(fā)明還涉及到一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑的制備方法，包括從蒲黃中提取有效部位和以蒲黃有效部位提取物為活性成分制備不同劑型制劑的方法。藥效學研究表明，本發(fā)明的一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的蒲黃提取物制劑對急性胰腺炎模型動物具有良好的治療作用；對心腦血管疾病模型動物有極佳的治療效果，提示本發(fā)明藥物是一種治療急性胰腺炎和心腦血管疾病的有效藥物。
文檔編號A61K9/48GK1528331SQ20031010192
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月13日 優(yōu)先權日2003年10月13日
發(fā)明者張晴龍 申請人:張晴龍