專利名稱：治療癌癥的聯(lián)合療法的制作方法
相關申請本申請要求保護2002年4月15日提交的美國臨時申請No.60/373,033的利益。上述申請的完整教導內(nèi)容結合在此作為參考。
政府支持本發(fā)明全部或部分地得到來自National Cancer Institute的CoreGrant(Grant No.08748)和來自NIH的CA 05826的支持。政府在本發(fā)明中享有某些權利。
背景技術：
正常的組織內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定借助細胞增殖率與細胞死亡之間的復雜平衡而實現(xiàn)。這種平衡因增加細胞增殖率或降低細胞死亡率而破壞能夠?qū)е录毎漠惓ＩL，被認為是癌癥形成中的主要事件。治療癌癥的常規(guī)策略包括化療、放療、手術、生物療法或它們的組合；不過這些策略受到特異性的缺乏和對正常組織的過分毒性的限制。另外，某些癌癥對治療(例如化療)而言是頑固的，而有些策略(例如手術)不總是可用的選擇對象。
利用某些種類放射的轟擊可以弱化并最終殺死癌細胞，因此放射療法是一種重要的治療癌癥的措施。癌癥放療的既往分析，例如在前列腺癌的情況下，已經(jīng)證明了實現(xiàn)原發(fā)性腫瘤的局部控制的失敗與疾病的最終轉移性擴散密切有關(Yorke，E.D.等，Cancer Res.532987-93(1993)；Fuks，Z.等，Int.J.Radiat.Onco.l Biol.Phys.21537-47(1991))。早期復發(fā)標記(例如PSA)的可利用性也已提示了用在前列腺癌放療中的標準服藥制度是不恰當?shù)?Pollack，A.等，Int J RadiatOncol Biol Phys.531097-1105(2002))。這兩項觀察結果已經(jīng)為3-D共形治療和強度調(diào)控放療(IMRT)等技術的研究提供了動力，使增加治療性放射劑量且僅微小增加正常器官照射成為可能(Zelefsky，M.J.等，Radiother.Oncol.55241-9(2000))。使用放射致敏劑增加治療功效而不增加劑量遞送也已受到檢驗(Lawton，C.A.等，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.36673-80(1996))。
癌癥治療還可以包括化療劑的使用。例如，辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)是一種異羥肟酸類雜合極性化合物，它抑制組蛋白脫乙酰酶(Histone Deacetylase)(HDAC)活性，體外誘導腫瘤細胞的末期分化、細胞生長停止和/或細胞凋亡(Richon，V.M.等，Proc.Natl.Acad SciUSA.953003-7(1998)；Marks，P.A.等，Curr.Opin.Oncol.13477-83(2001)；Marks，P.A.等，Nature Reviews Cancer 1.194-202(2001))。SAHA屬于一類組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑，能夠誘導腫瘤細胞的末期分化、細胞生長停止和/或細胞凋亡。該化合物已經(jīng)顯示對裸鼠前列腺腫瘤異種移植物的抑制，僅有微小至沒有可檢測的毒性(Butler，L.M.等，Cancer Res.60.5165-70(2000))。它已經(jīng)完成了實體與血液學腫瘤包括前列腺癌的I期治療試驗(Kelly，W.K.等，Expert Opin.Investig.Drugs 111695-713(2002)；Kelly，W.K.等，InASCO Proceedings，Orlando，F(xiàn)L，2002，pp.1831)。
通常，HDAC抑制劑分為五大類A)異羥肟酸衍生物；B)環(huán)狀四肽；C)短鏈脂肪酸(SCFA)；D)苯甲酰胺衍生物；和E)親電性酮衍生物。
在癌癥治療中經(jīng)常采用聯(lián)合療法。例如，已經(jīng)采用兩種或多種被公認的療法，例如化療和放療。某些聯(lián)合療法的治療利益已經(jīng)被Steel和Peckham分為四大類(Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.585-91(1979))。這些分類是1)空間上的合作——化療和放療在不同的解剖學部位根除疾??；2)毒性的獨立性——化療的殺死作用加上放療的殺死作用，因為正常器官毒性是不重疊的；3)對正常組織的保護——使向靶遞送更大劑量的放射成為可能的試劑；4)腫瘤響應的增強——一種試劑(化療或放療)優(yōu)先使腫瘤細胞“敏感”于另一種，以便這兩種的效果大于單獨每種的加和效果。
前兩種策略不需要兩種試劑之間的相互作用。聯(lián)合放療/化療的治療利益的臨床實例屬于第1和2類，第1類是聯(lián)合方式療法的主要臨床原理。已經(jīng)在實驗室中觀察到相當于第3和4類的治療利益，但是向臨床的轉換仍然緩慢。
鑒于上述，癌癥是一種有很多潛在有效治療可用的疾病。不過，由于各種類型癌癥的普遍性和可能具有的嚴重后果，需要更有效的治療，尤其是不利副作用少于目前可用的治療形式的那些。
發(fā)明概述本發(fā)明基于這樣的發(fā)現(xiàn)，組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑(例如SAHA)能夠與放射源聯(lián)合使用，例如外束輻射(external beam irradiation)或一種放射性同位素，例如放射藥物，以提供治療上有效的抗癌效果。進而，HDAC抑制劑與放射源之間的意外協(xié)同作用產(chǎn)生增強了的或協(xié)同性治療效果，其中該聯(lián)合效果大于這兩種治療各自按治療劑量給藥所得加和效果。這些觀察結果提示了HDAC抑制劑(例如SAHA)能夠充當放射致敏劑，它們能夠與放療聯(lián)合用于治療癌癥。以前還沒有描述過HDAC抑制劑(例如SAHA)作為放射致敏劑的能力。
已經(jīng)意外地發(fā)現(xiàn)，如本文所述包括組蛋白脫乙酰酶(HDAC)抑制劑給藥的第一治療程序與如本文所述采用放射治療的第二治療程序的組合對需要治療的患者能夠提供治療上有效的抗癌效果。每種治療(HDAC抑制劑的給藥和放射療法的給藥)的使用量或劑量與另一種聯(lián)合提供治療上有效的治療。
因此，本發(fā)明涉及治療需要治療的患者癌癥的方法。本文所用的癌癥治療表示在哺乳動物、例如人類中部分或完全地抑制、延遲或防止癌癥的進展，包括癌癥轉移；抑制、延遲或防止癌癥的復發(fā)，包括癌癥轉移；或者防止癌癥的發(fā)生或形成(化學預防)。
本發(fā)明的方法可用于治療多種癌癥，包括但不限于實體腫瘤(例如肺、乳腺、結腸、前列腺、膀胱、直腸、腦或子宮內(nèi)膜的腫瘤)、血液學惡性腫瘤(例如白血病、淋巴瘤、骨髓瘤)、癌(例如膀胱癌、腎癌、乳腺癌、結腸直腸癌)、成神經(jīng)細胞瘤或黑素瘤。
該方法包含對需要治療的患者在第一治療程序中給以第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中給以第二量或劑量放射。第一與第二量一起構成治療有效量。
本發(fā)明進一步涉及可用于治療癌癥的藥物組合物。該藥物組合物包含第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑和第二量放射(例如一種放射藥物)。第一與第二量一起構成治療有效量。
本發(fā)明進一步涉及第一量HDAC抑制劑和第二量放射(例如一種放射藥物試劑)在藥劑制備中的用途，該藥劑用于治療癌癥。
在本發(fā)明的特定實施方案中，HDAC抑制劑與放射療法的組合被視為治療上協(xié)同性的，這種聯(lián)合治療方案產(chǎn)生顯著好于每種成分單獨按治療劑量給藥時的加和效果的抗癌結果(例如生長的抑制)?？梢圆捎脴藴式y(tǒng)計學分析來確定這些結果顯著更好的時機。例如，可以采用Mann-Whitney檢驗或一些其他公認的統(tǒng)計學分析。
用在放射治療中的放射源可以是電磁放射(例如X-射線或γ-射線)或粒子放射(例如電子束(β粒子)、質(zhì)子束、中子束、α粒子或負π介子)。
放射治療可以是外束放射，或者可以牽涉放射性同位素的使用(例如一種放射藥物試劑的給藥，如本文所述)。放射治療還可以是外束放射與放射性同位素的組合，例如與一種放射藥物試劑的組合。
在一個特定的實施方案中，放射是借助靶放射性綴合物的靶向遞送或全身遞送而提供的，例如一種放射性標記的抗體。
放射的劑量可以根據(jù)患者和所治療癌癥的類型加以確定。在特定的實施方案中，患者可以接受至少約1Gy放射，例如約5-40Gy放射，例如約5、6、7、8、9或10Gy、20Gy或40Gy放射等。
治療程序可以按照任意順序先后發(fā)生、同時發(fā)生或其組合。例如，第一治療程序、即組蛋白脫乙酰酶抑制劑的給藥可以發(fā)生在第二治療程序即放射之前、在放射治療之后、與放射同時或其組合。例如，總治療周期可以根據(jù)組蛋白脫乙酰酶抑制劑來決定。放射可以在抑制劑治療開始之前或者在抑制劑治療之后給予。另外，放射治療可以在抑制劑給藥期間給予，但是不必完全跨越整個抑制劑治療階段。
適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑包括但不限于異羥肟酸衍生物、短鏈脂肪酸(SCFA)、環(huán)狀四肽、苯甲酰胺衍生物或親電性酮衍生物，如本文所定義。
適用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑的具體非限制性實例有A)異羥肟酸衍生物，選自SAHA、Pyroxamide、CBHA、制滴菌素A(TSA)、制滴菌素C、水楊異羥肟酸(SBHA)、壬二酸雙異羥肟酸(ABHA)、壬二酸-1-異羥肟酸-9-?；桨?AAHA)、6-(3-氯苯基脲基)己酸異羥肟酸(6-(3-Chlorophenylureido)-carpoic Hydroxamic Acid)(3Cl-UCHA)、Oxamflatin、A-161906、Scriptaid、PXD-101、LAQ-824、CHAP、MW2796和MW2996；B)環(huán)狀四肽，選自Trapoxin A、FR901228(FK 228，Depsipeptide)、FR225497、Apicidin、CHAP、HC-Toxin、WF27082和Chlamydocin；C)短鏈脂肪酸(SCFA)，選自鈉的丁酸鹽、異戊酸鹽、戊酸鹽、4-苯基丁酸鹽(4-PBA)、苯基丁酸鹽(PB)、丙酸鹽、丁酰胺、異丁酰胺、苯基乙酸鹽、3-溴丙酸鹽、甘油三丁酸酯、丙戊酸(Valproic acid)和丙戊酸鹽；D)苯甲酰胺衍生物，選自CI-994、MS-27-275(MS-275)和MS-27-275的3′-氨基衍生物；E)親電性酮衍生物，選自三氟甲基酮和一種α-酮基酰胺，例如N-甲基-α-酮基酰胺；和F)DEPUDECIN。
具體HDAC抑制劑包括由下列結構式代表的辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)
由下列結構式代表的Pyroxamide 由下列結構式代表的間-羧基肉桂酸雙異羥肟酸(CBHA) 適用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑的其他非限制性實例有由下列結構代表的化合物 其中R1和R2可以是相同或不同的；當R1與R2相同時，各自是取代或未取代的芳基氨基(例如苯氨基、吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、環(huán)烷基氨基或哌啶子基；當R1與R2不同時，R1＝R3-N-R4，其中每個R3和R4是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、芳基(例如苯基或吡啶基)、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基或吡啶基，或者R3和R4一起鍵合構成哌啶基，R2是羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基；n是約4至約8的整數(shù)；由下列結構代表的化合物
其中R是取代或未取代的苯基、哌啶、噻唑、2-吡啶、3-吡啶或4-吡啶；n是約4至約8的整數(shù)；和由下列結構代表的化合物 其中A是酰胺部分；R1和R2各自選自取代或未取代的芳基、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基、芳氧基、芳基烷氧基；R4是氫、鹵素、苯基或環(huán)烷基；n是約3至約10的整數(shù)。
鑒于與兩種治療用藥程式有關的不同毒性，聯(lián)合療法可以提供治療上的優(yōu)點。更具體地，HDAC抑制劑治療可以引起血液學毒性，而放射療法可以是對鄰近腫瘤部位的組織有毒性的。因此，這種有差別的毒性能夠允許每種治療按其治療劑量給藥，不會增加患者發(fā)病率。不過驚人地，由聯(lián)合治療所實現(xiàn)的治療效果是增強了的或協(xié)同性的，例如顯著好于加和治療效果。
附圖的簡要說明
圖1A-D是LNCaP細胞球狀體積圖，(A)未處理；(B)用1μM SAHA處理；(C)用2.5μM SAHA處理；(D)用5μM SAHA處理，均連續(xù)處理和處理120小時。粗實線相當于每種個別實驗的中位線。
圖2A-B是LNCaP細胞球狀體的光學顯微鏡圖象掃描，在用(A)5μMSAHA和(B)2.5μM SAHA(上方的1D和1C)連續(xù)溫育開始后不同時間進行。每欄底部左側的數(shù)字相當于溫育后的時間，以天計。
圖3A-D是按照下列方案處理的LNCaP細胞球狀體積的中位線(粗線)和個別線(細線)A)未處理；B)用5μM SAHA溫育96小時；C)用急性劑量外束放射照射，利用6Gy Cs-137輻射器(LET 02.keV/μm)；和D)用5μM SAHA處理96小時，在SAHA處理中點(48小時后)開始用急性劑量放射束處理，利用6Gy Cs-137輻射器(LET 02.keV/μm)。
圖4是如圖3D所述用SAHA與6Gy放射組合處理的球狀體的光學顯微鏡圖象掃描。每欄底部左側的數(shù)字相當于用SAHA培育開始后的時間。
圖5A-C是經(jīng)過處理的LNCaP球狀體的TUNEL染色切片掃描。欄(A-C)已經(jīng)用單獨的SAHA處理過(5μM，96h)。欄(A)顯示在溫育，處理結束后不久的球狀體；欄(B)顯示在用SAHA溫育處理結束后24小時的球狀體；欄(C)顯示在用SAHA溫育處理結束后48小時的球狀體。欄(D-F)顯示用SAHA+6Gy放射組合處理過的LNCaP球狀體的TUNEL染色欄(D)是溫育結束后不久；欄(E)是溫育結束后24小時；欄(F)是溫育結束后48小時。關于TUNEL染色欄(G)為陽性DNA酶處理過的對照；欄(H)為未處理的球狀體；欄(I)為用6Gy放射處理過的球狀體。所有切片都是用蘇木精復染色的。
圖6A-C是經(jīng)過處理的LNCaP球狀體的Ki67染色切片掃描。欄(A-C)已經(jīng)用單獨的SAHA處理過(5μM，96h)。欄(A)顯示用SAHA溫育結束后不久的球狀體；欄(B)顯示溫育結束后24小時的球狀體；欄(C)顯示溫育結束后48小時的球狀體。欄D至F顯示用SAHA+6Gy放射組合處理過的球狀體的Ki67染色，分別為培育結束后(D)不久、(E)24小時和(F)48小時。也顯示了未處理球狀體(G)和用6Gy放射處理過的球狀體(H)的Ki67染色。所有切片都是用蘇木精復染色的。
圖7A-B顯示(A)TUNEL和(B)Ki67染色的細胞陽性百分比的平均和標準偏差。每項實驗為三至五份不同的切片評分。在48小時時，僅有SAHA與SAHA+放射處理過的細胞的陽性染色百分比顯著不同于Ki67染色(p＜0.01)。
圖8顯示按照下列方案處理過的LNCaP細胞球狀體積未處理的對照；■用Ac225-HuM195處理；用5μM SAHA處理96小時；X用Ac225-HuM195和5μM SAHA處理。
本發(fā)明的上述與其他目的、特征和優(yōu)點將因下列優(yōu)選的發(fā)明實施方案的具體說明而顯而易見，如附圖中所述。
發(fā)明的詳細說明本發(fā)明涉及治療需要治療的患者癌癥的方法。該方法包含對需要治療的患者在第一治療程序中給以第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中給以第二量或劑量放射。第一與第二量一起構成治療有效量。
在一種實施方式中，該方法提供協(xié)同性的抗癌效果。
本文所用的癌癥治療表示在哺乳動物、例如人類中部分或完全地抑制、延遲或防止癌癥的進展，包括癌癥轉移；抑制、延遲或防止癌癥的復發(fā)，包括癌癥轉移；或者防止癌癥的發(fā)生或形成(化學預防)。
在一種實施方式中，HDAC抑制劑使患者癌細胞對放射敏感。因此，HDAC抑制劑可以充當放射致敏劑。例如，不希望受任何特定機理或理論的局限，HDAC抑制劑與放射治療聯(lián)合給藥的治療效果可以是由HDAC抑制劑充當放射致敏劑的能力所引起的，從而增加患者癌細胞對放射治療的敏感性。因此，HDAC抑制劑可以按照放射致敏量給藥。致敏作用可以是由不可逆的細胞周期停止所引起的。
在另一種實施方式中，放射使患者癌細胞對HDAC抑制劑的作用敏感。
本發(fā)明還涉及測定特定癌對本發(fā)明聯(lián)合療法敏感性的方法。該方法包含使癌細胞在第一治療程序中暴露或接觸于第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中暴露或接觸于第二量或劑量放射，再評估抗癌效果。第一與第二量一起構成治療有效量?？拱┬Ч梢岳萌我膺m合的測定法進行評估。
在進一步的實施方式中，本發(fā)明涉及篩選確定就特定癌癥類型而言HDAC抑制劑與放射療法最佳組合的方法。篩選方法包含使癌細胞在第一治療程序中暴露于第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中暴露于第二量或劑量放射。第一與第二治療一起構成治療有效量。細胞可以是在培養(yǎng)物中或者存在于需要治療的患者體內(nèi)。治療的抗癌效果可以利用適合的方法進行評估。
本文所用的術語“治療有效量”意欲限定聯(lián)合療法中第一與第二治療的組合量。該組合量將實現(xiàn)所需的生物響應。在本發(fā)明中，所需的生物響應是哺乳動物、例如人類癌癥進展包括癌癥轉移的部分或完全抑制、延遲或防止；癌癥復發(fā)包括癌癥轉移的抑制、延遲或防止；或者癌癥發(fā)生或形成的防止(化學預防)。
本發(fā)明聯(lián)合療法適用于多種癌癥的治療。本文所用的癌癥表示腫瘤、贅生物、癌、肉瘤、白血病、淋巴瘤等。例如，癌癥包括但不限于白血病與淋巴瘤，例如皮膚T-細胞淋巴瘤(CTCL)，非皮膚外周T-細胞淋巴瘤，與人T-細胞親淋巴病毒(HTLV)有關的淋巴瘤，例如成人T-細胞白血病/淋巴瘤(ATLL)，急性淋巴細胞性白血病，急性非淋巴細胞性白血病，慢性淋巴細胞性白血病，慢性骨髓性白血病，何杰金氏病，非何杰金氏淋巴瘤和多發(fā)性骨髓瘤，兒童實體腫瘤，例如腦腫瘤，成神經(jīng)細胞瘤，成視網(wǎng)膜細胞瘤，維爾姆斯腫瘤，骨腫瘤和軟組織肉瘤，成人普通實體腫瘤，例如頭頸癌(例如口、喉和食管)，泌尿生殖癌(例如前列腺、膀胱、腎、子宮、卵巢、睪丸、直腸和結腸)，肺癌，乳腺癌，胰腺癌，黑素瘤和其他皮膚癌，胃癌，腦癌，肝癌和甲狀腺癌。
組蛋白脫乙酰酶和組蛋白脫乙酰酶抑制劑本文所用的術語組蛋白脫乙酰酶(HDAC)是催化從核小體核心組蛋白氨基末端賴氨酸殘基上除去乙?；拿?。因此，HDAC與組蛋白乙酰轉移酶(HAT)一起調(diào)節(jié)組蛋白的乙?；癄顟B(tài)。組蛋白乙酰化影響基因表達，HDAC抑制劑、例如異羥肟酸類雜合極性化合物辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)體外誘導轉化細胞的生長停止、分化和/或細胞凋亡，體內(nèi)抑制腫瘤生長。HDAC基于結構同源性可以分為三類。第I類HDAC(HDAC 1，2，3和8)與酵母RPD3蛋白具有相似性，位于核中，見于與轉錄共抑制物有關的復合物中。第II類HDAC(HDAC 4，5，6，7和9)與酵母HDA1蛋白相似，具有核性與胞質(zhì)性亞細胞定位化。第I和II類HDAC都受異羥肟酸類HDAC抑制劑、例如SAHA的抑制。第III類HDAC構成一類在結構上疏遠的NAD依賴性酶，它們與酵母SIR2蛋白相關，不受異羥肟酸類HDAC抑制劑的抑制。
本文所用的術語組蛋白脫乙酰酶抑制劑或HDAC抑制劑是能夠體內(nèi)和/或體外抑制組蛋白脫乙酰化的化合物。因此，HDAC抑制劑抑制至少一種組蛋白脫乙酰酶的活性。抑制至少一種組蛋白脫乙酰化的結果，導致乙酰化組蛋白的增加，乙酰化組蛋白的蓄積是適合于評估HDAC抑制劑活性的生物標記。因此，能夠測定乙?；M蛋白蓄積的方法也能用于測定有關化合物的HDAC抑制活性?？梢岳斫獾氖悄軌蛞种平M蛋白脫乙酰酶活性的化合物也能與其他底物結合，因此能夠抑制其他生物活性分子，例如酶。
例如，在接受HDAC抑制劑的患者中，能夠與適合對照相比測定乙酰化組蛋白在用HDAC抑制劑處理的外周單核細胞以及組織中的蓄積。
特定化合物的HDAC抑制活性可以在體外例如利用一種酶測定法加以測定，該測定法顯示至少一種組蛋白脫乙酰酶的抑制。進而，乙?；M蛋白在用特定組合物處理的細胞中的蓄積的測定可以是確定化合物的HDAC抑制活性。
乙?；M蛋白的蓄積測定是文獻所熟知的。例如參見Marks，P.A.等人，J.Natl.Cancer Inst.，921210-1215，2000，Butler，L.M.等人，Cancer Res.605165-5170(2000)，Richon，V.M.等人，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，953003-3007，1998和Yoshida，M.等人，J.Biol.Chem.，26517174-17179，1990。
例如，測定組蛋白脫乙酰酶抑制劑化合物活性的酶測定法可以如下進行。簡而言之，HDAC抑制劑化合物對親和性純化人表位-標記(Flag)HDAC1的效果可以這樣測定，在沒有底物的存在下，將酶制備物與所示量抑制劑化合物在適合溫度下溫育約20分鐘。加入底物([3H]-乙?；?標記的鼠紅白血病細胞組蛋白)，將樣本在約37℃下溫育20分鐘，總體積為30μL。然后終止反應，提取所釋放的乙酸鹽，借助閃爍計數(shù)測定所釋放的放射性的量?？捎糜跍y定組蛋白脫乙酰酶抑制劑化合物活性的替代測定法是″HDAC Fluorescent Activity Assay；DrugDiscovery Kit-AK-500″，可從BIOMOLResarch Laboratories，Inc.，Plymouth Meeting，PA獲得。
體內(nèi)研究可以如下進行。向動物、例如小鼠腹膜內(nèi)注射HDAC抑制劑化合物。在給藥后預定時間分離所選定的組織，例如腦、脾、肝等。從組織中分離組蛋白，基本上如Yoshida等，J.Biol.Chem.26517174-17179，1990所述。將等量組蛋白(約1μg)在15％SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳，轉移至Hybond-P濾膜(可從Amersham獲得)。將濾膜用3％乳封閉，用兔純化多克隆抗-乙?；M蛋白H4抗體(αAc-H4)和抗乙?；M蛋白H3抗體(αAc-H3)(Upstate Bioteclmology，Inc.)探查。利用辣根過氧化物酶-綴合的山羊抗-兔抗體(1∶5000)和SuperSignal化學發(fā)光底物(Pierce)使乙酰化組蛋白水平可視化。作為組蛋白的加載對照，進行平行的凝膠電泳，用考馬斯藍(CB)染色。
另外，已經(jīng)顯示異羥肟酸類HDAC抑制劑如SAHA上調(diào)p21WAFI基因的表達，所述基因負責細胞周期蛋白依賴性激酶的抑制，有助于細胞周期G1相的暫時停止(Richon，V.M.等，Proc Natl Acad Sci USA.9710014-9.，2000)。利用標準方法，在多種轉化細胞中在與HDAC抑制劑培養(yǎng)2小時內(nèi)誘導p21WAFI蛋白。p21WSFI基因的誘導與乙酰化組蛋白在這種基因的染色質(zhì)區(qū)域中的蓄積有關。p21WAFI的誘導因此可以被視為參與轉化細胞中由HDAC抑制劑所導致的G1細胞周期停止。
最近，已經(jīng)顯示HDAC抑制劑、象SAHA上調(diào)硫氧還蛋白結合性蛋白-2(Butler，L.M.等，Proc Natl Acad Sci USA.9911700-5.，2002)。TBP-2參與硫氧還蛋白的調(diào)節(jié)(Nishiyama，A.等，J Biol Chem.27421645-50.，1999)。它抑制硫醇還原活性，減少硫氧還蛋白的水平。硫氧還蛋白是一種主要的細胞蛋白質(zhì)二硫化物還原酶(Arner，E.S.等，Eur J Biochem.2676102-9.，2000)。除了大量其他功能以外(Gasdaska，J.R.等，Cell Growth Differ.61643-50.，1995；Berggren，M.等，Anticancer Res.16.3459-66.，1996；Gallegos，A.等，Cancer Res.565765-70.，1996；Grogan，T.M.等，Hum Pathol.31475-81.，2000；Baker，A.等，Cancer Res.57.5162-7.，1997)，硫氧還蛋白在核糖核苷酸還原酶反應中充當電子供體，負責核苷三磷酸向脫氧核苷三磷酸的還原，后者是DNA復制和修復所必需的(Arner，E.S.等，Eur J Biochem.2676102-9.，2000)。象谷胱甘肽一樣，硫氧還蛋白也是一種還原劑，參與解毒反應和放射-誘發(fā)的反應性氧屬與其他游離基的消除(Didier，C.等，P Radic Biol Med.30537-46.，2001)。
因此，異羥肟酸衍生物、例如SAHA適用于治療或預防多種硫氧還蛋白(TRX)-介導的疾病和病癥，例如炎性疾病、變應性疾病、自體免疫疾病、與氧化性應激反應有關的疾病或以細胞過度增殖為特征的疾病(Richon等2003年2月15日提交的美國申請No.10/369,094，題為“利用組蛋白脫乙酰酶抑制劑治療TRX-介導疾病的方法”，其完整內(nèi)容結合在此作為參考)。
進而，最近已經(jīng)顯示異羥肟酸衍生物、例如SAHA可用于治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)疾病，例如神經(jīng)變性疾病，和用于治療腦癌(Richon等2002年10月16日提交的美國申請No.10/273,401，題為“利用組蛋白脫乙酰酶抑制劑治療神經(jīng)變性疾病和腦癌”，其完整內(nèi)容結合在此作為參考)。
通常，HDAC抑制劑分為五大類1)異羥肟酸衍生物；2)短鏈脂肪酸(SCFA)；3)環(huán)狀四肽；4)苯甲酰胺；和5)親電性酮。
因而，所有HDAC抑制劑化合物都適用于本發(fā)明。例如，適合的HDAC抑制劑包括1)異羥肟酸衍生物；2)短鏈脂肪酸(SCFA)；3)環(huán)狀四肽；4)苯甲酰胺；5)親電性酮；和/或任意其他類能夠抑制組蛋白脫乙酰酶的化合物。
這類HDAC抑制劑的實例包括但不限于A.異羥肟酸衍生物，例如辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)(Richon等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 95，3003-3007(1998))；間-羧基肉桂酸雙異羥肟酸(CBHA)(Richon等，見上)；pyroxamide；CBHA；制滴菌素類似物，例如制滴菌素A(TSA)和制滴菌素C(Koghe等，1998.Biochem.Pharmacol.561359-1364)；水楊異羥肟酸(Salicylhydroxamic)(SBHA)(Andrews等，International J.Parasitology 30，761-768(2000))；壬二酸雙異羥肟酸(ABHA)(Andrews等，見上)；壬二酸-1-異羥肟酸-9-?；桨?AAHA)(Qiu等，Mol.Biol.Cell 11，2069-2083(2000))；6-(3-氯苯基脲基)己酸異羥肟酸(3Cl-UCHA)；Oxamflatin((2E)-5-[3-[(苯磺?；?氨基]苯基-戊-2-烯-4-炔基異羥肟酸)(Kim等，Oncogene，182461-2470(1999))；A-161906，Scriptaid(Su等，2000 Cancer Research，603137-3142)；PXD-101(Prolifix)；LAQ-824；CHAP；MW2796(Andrews等，見上)；和MW2996(Andrews等，見上)。
B.環(huán)狀四肽，例如Trapoxin A(TPX)-環(huán)狀四肽(環(huán)-(L-苯丙氨酰-L-苯丙氨酰-D-哌啶甲酰(pipecolinyl)-L-2-氨基-8-氧代-9，10-環(huán)氧癸酰))(Kijima等，J Biol.Chem.268，22429-22435(1993))；FR901228(FK 228，Depsipeptide)(Nakajima等，Ex.Cell Res.241，126-133(1998))；FR225497環(huán)狀四肽(H.Mori等，PCT申請WO00/08048(17 Feb.2000))；Apicidin環(huán)狀四肽(環(huán)-(N-O-甲基-L-色氨酰-L-異亮氨酰-D-哌啶甲酰-L-2-氨基-8-氧代癸酰))(Darkin-Rattray等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93，13143-13147(1996))；Apicidin Ia、Apicidin Ib、Apicidin Ic、Apicidin IIa和Apicidin IIb(P.Dulski等，PCT申請WO97/11366)；CHAP，HC-Toxin環(huán)狀四肽(Bosch等，Plant Cell 7，1941-1950(1995))；WF27082環(huán)狀四肽(PCT申請WO98/48825)；和Chlamydocin(Bosch等，見上)。
C.短鏈脂肪酸(SCFA)衍生物，例如鈉的丁酸鹽(Cousens等，J.Biol.Chem.254，1716-1723(1979))；異戊酸鹽(McBain等，Biochem.Pharm.531357-1368(1997))；戊酸鹽(McBain等，見上)；4-苯基丁酸鹽(4-PBA)(Lea和Tulsyan，Anticancer Research，15，879-873(1995))；苯基丁酸鹽(PB)(Wang等，Cancer Research，59，2766-2799(1999))；丙酸鹽(McBain等，見上)；丁酰胺(Lea和Tulsyan，見上)；異丁酰胺(Lea和Tulsyan，見上)；苯基乙酸鹽(Lea和Tulsyan，見上)；3-溴丙酸鹽(Lea和Tulsyan，見上)；甘油三丁酸酯(Guan等，CancerResearch，60，749-755(2000))；丙戊酸和丙戊酸鹽。
D.苯甲酰胺衍生物，例如CI-994；MS-27-275(N-(2-氨基苯基)-4-[N-(吡啶-3-基甲氧羰基)氨基甲基]苯甲酰胺)(Saito等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 96，4592-4597(1999))；和MS-27-275的3’-氨基衍生物(Saito等，見上)。
E.親電性酮衍生物，例如三氟甲基酮(Frey等，Bioorganic & Med.Chem.Lett.(2002)，12，3443-3447；U.S.6,511,990)和α-酮酰胺，例如N-甲基-α-酮酰胺。
F.其他HDAC抑制劑，例如Depudecin(Kwon等，1998.PNAS 953356-3361)。
優(yōu)選的異羥肟酸類HDAC抑制劑是辛二酰苯胺異羥肟酸(SAHA)、間-羧基肉桂酸雙異羥肟酸(CBHA)和pyroxamide。已經(jīng)顯示SAHA直接結合在組蛋白脫乙酰酶的催化部位。SAHA誘導培養(yǎng)物中轉化細胞的細胞周期終止、分化和/或細胞凋亡，抑制嚙齒動物中腫瘤生長。SAHA在實體腫瘤和血液學癌癥中都有效地誘導這些效應。已經(jīng)顯示SAHA有效地抑制動物腫瘤生長，對動物沒有毒性。SAHA-誘導的腫瘤生長抑制與乙?；M蛋白在腫瘤中的蓄積有關。SAHA有效地抑制致癌物(N-甲基亞硝基脲)-誘導的大鼠乳房腫瘤的形成和持續(xù)生長。在進行研究的130天中，將SAHA在飼料中對大鼠給藥。因而，SAHA是一種無毒的、口服有活性的抗腫瘤劑，它的作用機理牽涉組蛋白脫乙酰酶活性的抑制。
SAHA可以由下列結構式代表 Pyroxamide可以由下列結構式代表 CBHA可以由下列結構式代表
在一種實施方式中，HDAC抑制劑可以由式I代表 其中R1和R2可以是相同或不同的；當R1與R2相同時，各自是取代或未取代的芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、環(huán)烷基氨基或哌啶子基；當R1與R2不同時，R1＝R3-N-R4，其中每個R3和R4是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基或吡啶基，或者R3和R4一起鍵合構成哌啶基，R2是羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基；n是約4至約8的整數(shù)；因此，在另一種實施方式中，用在本發(fā)明方法中的HDAC抑制劑可以由式II代表 其中每個R3和R4獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芳氧基或芳基烷氧基，或者R3和R4一起鍵合構成哌啶基，R2是羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基；n是約4至約8的整數(shù)。
在特定的式II實施方式中，R2是羥氨基、羥基、氨基、甲氨基、二甲氨基或甲氧基，n是6。在式II的另外一種實施方式中，R4是氫原子，R3是取代或未取代的苯基，n是6。在式II的進一步實施方式中，R4是氫，R3是α-、β-或γ-吡啶。
在其他具體的式II實施方式中，R4是氫原子，R3是環(huán)己基；R4是氫原子，R3是甲氧基；R3和R4一起鍵合構成哌啶基；R4是氫原子，R3是羥基；R3和R4都是甲基；R3是苯基，R4是甲基。
進一步適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑可以由結構式III代表 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；R是氫原子、羥基、取代或未取代的烷基、芳基烷氧基或芳氧基；每個m和n獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
在特定的實施方式中，HDAC抑制劑是式III化合物，其中X、Y和R各自是羥基，m和n都是5。
在另外一種實施方式中，適用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑化合物可以由結構式IV代表 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的烷基、芳基、烷氧基或芳氧基；每個m、n和o獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
其他適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑包括具有結構式V的化合物
其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的烷基、芳基、烷氧基或芳氧基；每個m和n獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
在進一步的實施方式中，適用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑可以具有結構式VI 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；每個m和n獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
在另外一種實施方式中，可用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑可以具有結構式VII 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的烷基、芳基烷氧基或芳氧基；每個m和n獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
在更進一步的實施方式中，適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑可以具有結構式VIII 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基或芳氧基烷基氨基；n是約0至約8的整數(shù)。
另外適用于本發(fā)明方法的化合物包括由式IX代表的那些 其中每個X和Y獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、氨基或羥氨基、取代或未取代的烷氧基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基；每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、羰基羥氨基或氟代基團；每個m和n獨立地是彼此相同或不同的，各自是約0至約8的整數(shù)。
在進一步的實施方式中，適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑包括具有結構式X的化合物 其中每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、烷氧基、氨基、羥氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基。在特定的實施方式中，HDAC抑制劑是結構式X化合物，其中R1和R2都是羥氨基。
在進一步的實施方式中，適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑具有結構式XI 其中每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、烷氧基、氨基、羥氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基。在特定的實施方式中，HDAC抑制劑是結構式XI化合物，其中R1和R2都是羥氨基。
在進一步的實施方式中，適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑包括由結構式XII代表的化合物 其中每個R1和R2獨立地是彼此相同或不同的，是羥基、烷氧基、氨基、羥氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳基氨基、烷基芳基氨基、烷氧基氨基、芳氧基氨基、烷氧基烷基氨基或芳氧基烷基氨基。在特定的實施方式中，HDAC抑制劑是這樣的結構式XII化合物，其中R1和R2都是羥氨基。
另外適用于本發(fā)明方法的化合物包括由結構式XIII代表的那些
其中R是取代或未取代的苯基、哌啶、噻唑、2-吡啶、3-吡啶或4-吡啶，n是約4至約8的整數(shù)。
在另外一種實施方式中，適用于本發(fā)明方法的HDAC抑制劑可以由結構式XIV代表 其中R是取代或未取代的苯基、吡啶、哌啶或噻唑基團，n是約4至約8的整數(shù)，或其藥學上可接受的鹽。
在特定的實施方式中，R是苯基，n是5。在另一種實施方式中，n是5，R是3-氯苯基。
其他可用于本發(fā)明的HDAC抑制劑可以由結構式XV代表 其中每個R1和R2是直接或者通過連接基團連接的，是羥基、取代或未取代的芳基(例如萘基、苯基、喹啉基、異喹啉基或吡啶基)、環(huán)烷基、環(huán)烷基氨基、哌啶子基、直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、芳基氨基(吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、烷氧基、芳氧基或芳基烷氧基；n是約3至約10的整數(shù)；R3是異羥肟酸、羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基或烷氧基。
連接基團可以是酰胺部分、-O-、-S-、-NH-或-CH2-。
在某些實施方式中，R1是-NH-R4，其中R4是羥基、取代或未取代的芳基(例如萘基、苯基、喹啉基、異喹啉基或吡啶基)、環(huán)烷基、環(huán)烷基氨基、哌啶子基、直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、烷氧基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基。
進一步和更具體的式XV HDAC抑制劑包括可以由式XVI代表的那些 其中每個R1和R2是羥基、取代或未取代的芳基(例如苯基、萘基、喹啉基、異喹啉基或吡啶基)、環(huán)烷基、環(huán)烷基氨基、哌啶子基、芳基氨基(吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、烷氧基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；R3是異羥肟酸、羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基或烷氧基；R4是氫、鹵素、苯基或環(huán)烷基部分；A可以是相同或不同的，代表酰胺部分、-O-、-S-、-NR5-或-CH2-，其中R5是取代或未取代的C1-C5烷基；n是約3至約10的整數(shù)。
例如，進一步具有更具體的式XVI結構的化合物可以由結構式XVII代表 其中A是酰胺部分；R1和R2各自選自取代或未取代的芳基(例如苯基、萘基、喹啉基、異喹啉基或吡啶基)、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；n是約3至約10的整數(shù)。
例如，在A具有酰胺部分的化合物可以由下式代表
或 在另一種實施方式中，HDAC抑制劑可以具有式XVIII 其中R7選自取代或未取代的芳基(例如苯基、萘基、喹啉基、異喹啉基或吡啶基)、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；n是約3至約10的整數(shù)；Y選自 或其藥學上可接受的鹽。
在進一步的實施方式中，HDAC抑制劑化合物可以具有式XIX 其中n是約3至約10的整數(shù)；Y選自
R7’選自 或其藥學上可接受的鹽。
進一步用在本發(fā)明中的化合物可以由結構式XX代表 其中R2選自取代或未取代的芳基、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；n是3至10的整數(shù)；R7’選自
進一步可用于本發(fā)明的HDAC抑制劑可以由結構式XXI代表 其中A是酰胺部分；R1和R2各自選自取代或未取代的芳基、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；R4是氫、鹵素、苯基或環(huán)烷基部分；n是約3至約10的整數(shù)，或其藥學上可接受的鹽。
例如，式XXI化合物可以由下列結構代表 或者可以由下列結構代表 其中R1、R2、R4和n具有式XXI的含義。
進而，HDAC抑制劑具有結構式XXII
其中L是連接基團，選自由-(CH2)n-、-(CH＝CH)m、苯基、-環(huán)烷基-或其任意組合組成的組；其中每個R7和R8獨立地是取代或未取代的芳基、芳基氨基(例如吡啶氨基、9-嘌呤-6-氨基或噻唑氨基)、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；n是約3至約10的整數(shù)；m是0-10的整數(shù)。
例如，式XXII化合物可以是 其他適用于本發(fā)明的HDAC抑制劑包括如下更具體的結構式所示那些 其中n是3至10的整數(shù)，或?qū)τ丑w，或者
其中n是3至10的整數(shù)，或?qū)τ丑w，或者 其中n是3至10的整數(shù)，或?qū)τ丑w，或者 其中n是3至10的整數(shù)，或?qū)τ丑w，或者
其中n是3至10的整數(shù)，或?qū)τ丑w。
進一步適用于本發(fā)明的具體HDAC抑制劑包括
其中n各自是3至10的整數(shù)，和下列化合物 進一步具體的HDAC抑制劑包括可以由式XXIII代表的那些 其中R1是取代或未取代的芳基、芳基烷基、芳基氨基、芳基烷基氨基、芳氧基或芳基烷氧基；n是3至10的整數(shù)。在特定的結構式XXIII化合物實施方式中，n是5。
在具體的實施方式中，式XXIII化合物是由下列結構代表的 在另一種具體的實施方式中，式XXIII化合物是由下列結構代表的
在另外一種具體的實施方式中，式XXIII化合物是由下列結構代表的 在另一種具體的實施方式中，式XXIII化合物是由下列結構代表的 進一步具體的HDAC抑制劑包括可以由式XXIV代表的那些 其中Q1是取代或未取代的喹啉基或異喹啉基；n是3至10的整數(shù)。在特定的結構式XXIV化合物實施方式中，n是5。
在具體的實施方式中，式XXIV化合物是由下列結構代表的
進一步具體的HDAC抑制劑包括可以由式XXV代表的那些 其中Q1和Q2獨立地是取代或未取代的喹啉基或異喹啉基；n是3至10的整數(shù)。在特定的結構式XXV化合物實施方式中，n是5。
在具體的實施方式中，式XXV化合物是由下列結構代表的 進一步具體的HDAC抑制劑包括可以由式XXVI代表的那些 其中R1是芳基烷基，R2是取代或未取代的芳基、芳基烷基、芳基氨基、芳基烷基氨基、芳氧基或芳基烷氧基；A是酰胺；n是3至10的整數(shù)。在特定的結構式XXVI化合物實施方式中，n是5。
在具體的實施方式中，式XXVI化合物是由下列結構代表的
在具體的實施方式中，式XXVI化合物是由下列結構代表的 在具體的實施方式中，式XXVI化合物是由下列結構代表的 這類化合物和其他HDAC抑制劑的其他實例可以參見頒布于1994年11月29日的美國專利No.5,369,108、頒布于1997年12月23日的5,700,811、頒布于1998年6月30日的5,773,474、頒布于1999年8月3日的5,932,616、頒布于2003年1月28日的6,511,990，均頒發(fā)給Breslow等；1991年10月8日頒布的美國專利No.5,055,608、1992年12月29日頒布的5,175,191和1997年3月4日頒布的5,608,108，均頒發(fā)給Marks等；以Breslow等的名義于2003年4月1日提交的美國臨時申請No.60/459,826；以及Yoshida，M.，等，Bioassays 17，423-430(1995)；Saito，A.，等，PNAS USA 96，4592-4597，(1999)；Furamai R.等，PNAS USA 98(1)，87-92(2001)；Komatsu，Y.，等，Cancer Res.61(11)，4459-4466(2001)；Su，G.H.，等，Cancer Res.60，3137-3142(2000)；Lee，B.I.等，Cancer Res.61(3)，931-934；Suzuki，T.等，J.Med.Chem.42(15)，3001-3003(1999)；Sloan-Kettering Institute for Cancer Research和The Trustees ofColumbia University的PCT申請公報WO01/18171，2001年3月15日公開；Hoffmann-La Roche的PCT申請公報WO02/246144；Novartis的PCT申請公報WO02/22577；Prolifix的PCT申請公報WO02/30879；Methylgene，Inc.的PCT申請公報WO01/38322(2001年5月31日公開)、WO01/70675(2001年9月27日公開)和WO00/71703(2000年11月30日公開)；Fujisawa Pharmaceutical Co.，Ltd.的PCT申請公報WO00/21979，1999年10月8日公開；Beacon Laboratories，L.L.C.的PCT申請公報WO98/40080，1998年3月11日公開；Curtin M.(Current patent status of histone deacetylase inhibitors，ExpertOpina.Ther.Patents(2002) 12(9)1375-1384和其中引用的參考文獻)。
下表提供HDAC抑制劑的具體非限制性實例。應當注意，本發(fā)明涵蓋任何在結構上與下列化合物相似并且能夠抑制組蛋白脫乙酰酶的化合物。
定義“脂族基團”是非芳族的，僅由碳和氫組成，可以可選地含有一個或多個不飽和單元，例如雙鍵和/或叁鍵。脂族基團可以是直鏈的、支鏈的或環(huán)狀的。若為直鏈或支鏈，脂族基團通常含有約1至約12個碳原子，更通常約1至約6個碳原子。若為環(huán)狀，脂族基團通常含有約3至約10個碳原子，更通常約3至約7個碳原子。脂族基團優(yōu)選地是C1-C12直鏈或支鏈烷基(也就是完全飽和的脂族基團)，更優(yōu)選C1-C6直鏈或支鏈烷基。實例包括甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基和叔丁基。
本文所用的“芳族基團”(也稱為“芳基”)包括碳環(huán)芳族基團、雜環(huán)芳族基團(也稱為“雜芳基”)和稠合多環(huán)芳族環(huán)系，如本文所定義。
“碳環(huán)芳族基團”是5至14個碳原子的芳族環(huán)，包括與5-或6-元環(huán)烷基稠合的碳環(huán)芳族基團，例如茚滿(indan)。碳環(huán)芳族基團的實例包括但不限于苯基；萘基，例如1-萘基和2-萘基；蒽基，例如1-蒽基、2-蒽基；菲基；芴基，例如9-芴基；二氫茚基(indanyl)等。碳環(huán)芳族基團可選地被指定數(shù)量的取代基取代，取代基如下所述。
“雜環(huán)芳族基團”(或“雜芳基”)是5-至14-環(huán)原子的單環(huán)、二環(huán)或三環(huán)芳族環(huán)，所述環(huán)原子是碳和一至四個選自O、N或S的雜原子。雜芳基的實例包括但不限于吡啶基，例如2-吡啶基(也稱為α-吡啶基)、3-吡啶基(也稱為β-吡啶基)和4-吡啶基(也稱為γ-吡啶基)；噻吩基，例如2-噻吩基和3-噻吩基；呋喃基，例如2-呋喃基和3-呋喃基；嘧啶基，例如2-嘧啶基和4-嘧啶基；咪唑基，例如2-咪唑基；吡喃基，例如2-吡喃基和3-吡喃基；吡唑基，例如4-吡唑基和5-吡唑基；噻唑基，例如2-噻唑基、4-噻唑基和5-噻唑基；噻二唑基；異噻唑基；噁唑基，例如2-噁唑基、4-噁唑基和5-噁唑基；異噁唑基；吡咯基；噠嗪基；吡嗪基等。如上所定義的雜環(huán)芳族基團(或雜芳基)可以可選地被指定數(shù)量的取代基取代，取代基如下關于芳族基團所述。
“稠合多環(huán)芳族”環(huán)系是碳環(huán)芳族基團或雜芳基，與一個或多個其他雜芳基或非芳族雜環(huán)稠合。實例包括喹啉基和異喹啉基，例如2-喹啉基、3-喹啉基、4-喹啉基、5-喹啉基、6-喹啉基、7-喹啉基和8-喹啉基，1-異喹啉基、3-異喹啉基、4-異喹啉基、5-異喹啉基、6-異喹啉基、7-異喹啉基和8-異喹啉基；苯并呋喃基，例如2-苯并呋喃基和3-苯并呋喃基；氧芴基，例如2，3-二氫苯并呋喃基；硫芴基；苯并噻吩基，例如2-苯并噻吩基和3-苯并噻吩基；吲哚基，例如2-吲哚基和3-吲哚基；苯并噻唑基，例如2-苯并噻唑基；苯并噁唑基，例如2-苯并噁唑基；苯并咪唑基，例如2-苯并咪唑基；異吲哚基，例如1-異吲哚基和3-異吲哚基；苯并三唑基；嘌呤基；硫茚基等。稠合多環(huán)芳族環(huán)系可以可選地被指定數(shù)量的取代基取代，取代基如本文所述。
“芳烷基”(芳基烷基)是被芳族基團、優(yōu)選苯基取代的烷基。優(yōu)選的芳烷基是芐基。適合的芳族基團是如本文所述的，適合的烷基是如本文所述的。適合于芳烷基的取代基是如本文所述的。
“芳氧基”是經(jīng)由氧附著于化合物的芳基(例如苯氧基)。
本文所用的“烷氧基”(烷基氧基)是經(jīng)由氧原子連接于化合物的直鏈或支鏈C1-C12或環(huán)狀C3-C12烷基。烷氧基的實例包括但不限于甲氧基、乙氧基和丙氧基。
“芳基烷氧基”(芳基烷基氧基)是經(jīng)由芳基烷基的烷基部分上的氧附著于化合物的芳基烷基(例如苯基甲氧基)。
本文所用的“芳基氨基”是經(jīng)由氮附著于化合物的芳基。
本文所用的“芳基烷基氨基”是經(jīng)由芳基烷基的烷基部分上的氮附著于化合物的芳基烷基。
本文所用的很多部分或基團被稱為“取代或未取代的”。若一個部分被稱為取代的，這表示該部分上任意為本領域技術人員已知可用于取代的部分都可以被取代。例如，可取代的基團可以是氫原子，它被除氫以外的基團(即取代基)所代替。可以存在多個取代基。若存在多個取代基，這些取代基可以是相同或不同的，取代可以發(fā)生在任意可取代的位置。這種取代含義是本領域熟知的。出于例證的目的，所述例證不應被解釋為限制本發(fā)明的范圍，一些取代基的實例有烷基(它也可以被一個或多個取代基取代，例如CF3)、烷氧基(它可以被取代，例如OCF3)、鹵素或鹵代基團(F，Cl，Br，I)、羥基、硝基、氧代、-CN、-COH、-COOH、氨基、疊氮基、N-烷基氨基或N，N-二烷基氨基(其中的烷基也可以被取代)、酯(-C(O)-OR，其中R可以是烷基、芳基等基團，它可以被取代)、芳基(最優(yōu)選的是苯基，它可以被取代)、芳基烷基(它可以被取代)和芳氧基。
立體化學很多有機化合物存在旋光活性形式，具有繞平面偏振光的平面旋轉的能力。在描述旋光活性化合物時，前綴D和L或R和S用于表示分子關于其手性中心的絕對構型。前綴d和l或(+)和(-)用于表示化合物繞平面偏振光旋轉的符號，(-)或l意味著化合物是左旋的。帶有前綴(+)或d的化合物是右旋的。就既定的化學結構而言，這些被稱為立體異構體的化合物是等同的，除非它們是彼此的不可疊加鏡像。特殊的立體異構體也可以被稱為對映體，這類異構體的混合物經(jīng)常被稱為對映體混合物。對映體的50∶50混合物被稱為外消旋混合物。很多本文所述化合物可以具有一個或多個手性中心，因此可以存在不同的對映體形式。如果需要的話，手性碳可以用星號(*)表示。若與手性碳的鍵合在本發(fā)明結構式中被描繪為直線，這被理解為在該結構式內(nèi)涵蓋該手性碳的(R)與(S)構型，以及兩種對映體及其混合物。正如本領域所用的，若需要指定關于手性碳的絕對構型，與該手性碳的鍵合之一可以被描繪為楔形(與平面以上的原子鍵合)，其他可以被描繪為一系列或楔形的短平行線(與平面以下的原子鍵合)。Cahn-Inglod-Prelog系統(tǒng)可以用于指派(R)或(S)構型給手性碳。
若本發(fā)明HDAC抑制劑含有一個手性中心，這些化合物存在兩種對映體形式，本發(fā)明包括這兩種對映體和對映體混合物，例如特殊的50∶50混合物，稱為外消旋混合物。對映體可以借助本領域技術人員已知的方法加以拆分，例如生成非對映體鹽，后者例如可以借助結晶分離(CRCHandbook of Optical Resolutions via Diastereomeric SaltFormation by David Kozma(CRC Press，2001))；生成非對映體衍生物或絡合物，后者例如可以借助結晶、氣-液或液相色譜加以分離；一種對映體與對映體特異性制劑的選擇性反應，例如酶的酯化作用；或者在手性環(huán)境中的氣-液或液相色譜，例如在手性載體上，例如結合有手性配體的二氧化硅，或者在手性溶劑的存在下。將被領會到的是，在所需對映體借助上述分離工藝之一轉化為另一種化學實體時，需要進一步的步驟釋放所需的對映體形式?；蛘?，特殊的對映體可以這樣合成，使用旋光活性的試劑、底物、催化劑或溶劑，進行不對稱合成，或者進行不對稱轉化，使一種對映體轉化為另一種。
本發(fā)明化合物手性碳上特殊絕對構型的指定被理解為意味著所指定的化合物對映體形式是對映體過量的(ee)，或者換句話說是基本上不含其他對映體的。例如，化合物的“R”型基本上不含化合物的“S”型，因而是對映體過量于“S”型的。相反，化合物的“S”型基本上不含化合物的“R”型，因而是對映體過量于“R”型的。本文所用的對映體過量是特定對映體的存在大于50％。例如，對映體過量可以是約60％或以上，例如約70％或以上，例如約80％或以上，例如約90％或以上。在特定的實施方式中，若指定特殊的絕對構型，所述化合物的對映體過量為至少約90％。在更特定的實施方式中，化合物的對映體過量為至少約95％，例如至少約97.5％，例如至少99％對映體過量。
若本發(fā)明化合物具有兩個或多個手性碳，它可以具有兩種以上旋光異構體，并且可以存在非對映體形式。例如，若存在兩個手性碳，化合物可以具有至多4種旋光異構體和2對對映體((S，S)/(R，R)和(R，S)/(S，R))。對映體對(例如(S，S)/(R，R))是彼此的鏡像立體異構體。不是鏡像的立體異構體(例如(S，S)和(R，S))是非對映體。非對映體對可以借助本領域技術人員已知的方法加以分離，例如色譜或結晶，每對中的個別對映體可以如上所述分離。本發(fā)明包括這類化合物的每種非對映體及其混合物。
本文所用的“一個”、“一種”和“該”包括單獨和復數(shù)指示物，除非上下文另有明確指示。因而例如，對“一種活性劑”或“一種藥理活性劑”的稱謂包括單一的活性劑以及兩種或多種不同的活性劑組合，對“一種載體”的稱謂包括兩種或多種載體的混合物以及單一的載體，等等。
所公開的活性化合物如上所述，可以被制成它們藥學上可接受的鹽。藥學上可接受的鹽是保留母體化合物所需生物活性并且不會帶來不希望的毒理學后果的鹽。這類鹽的實例有(a)與無機酸生成的酸加成鹽，所述無機酸例如鹽酸、氫溴酸、硫酸、磷酸、硝酸等；和與有機酸生成的鹽，所述有機酸例如乙酸、草酸、酒石酸、琥珀酸、馬來酸、富馬酸、葡萄糖酸、檸檬酸、蘋果酸、抗壞血酸、苯甲酸、鞣酸、棕櫚酸、藻酸、聚谷氨酸、萘磺酸、甲磺酸、對-甲苯磺酸、萘二磺酸、聚半乳糖醛酸等；(b)從元素陰離子生成的鹽，例如氯、溴和碘；和(c)從堿衍生的鹽，例如銨鹽、堿金屬鹽(例如鈉和鉀的鹽)、堿土金屬鹽(例如鈣和鎂的鹽)和有機堿的鹽，所述有機堿例如二環(huán)己胺、N-甲基-D-葡糖胺、異丙胺、三甲胺、2-乙氨基乙醇、組氨酸、普魯卡因等。
所公開的活性化合物如上所述，可以被制成它們水合物的形式，例如半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物等。
本發(fā)明還打算涵蓋本文所公開的HDAC抑制劑的前體藥物。任意化合物的前體藥物都可以利用熟知的藥理學技術加以制備。
除了上面列舉的化合物以外，本發(fā)明還打算涵蓋這類化合物的同系物和類似物的用途。在上下文中，同系物是具有上述化合物的實質(zhì)性結構相似性的分子，類似物是具有實質(zhì)性生物相似性的分子，與結構相似性無關。
放射療法適用于本文所述聯(lián)合治療的放射療法包括a)外束放射(externalbeam radiation)和b)放射藥物試劑的使用，其中b)包含發(fā)出輻射的放射性同位素。
外束放射用于癌癥治療的外束放射療法采用一種放射源，它對患者而言是外部的，通常為一種放射性同位素，例如60Co、137Cs，或者一種高能X-射線源，例如直線加速器。外部光源產(chǎn)生準直束(collimated beam)，直接進入患者至腫瘤部位。外部光源放射療法避免內(nèi)部光源放射療法的一些問題，但是它不可取地和必然地照射位于放射束路徑中的顯著體積非腫瘤組織或健康組織，以及腫瘤組織。
通過以不同“龍門(gantry)”角發(fā)射外束放射進入患者，并且使光束集中在腫瘤部位上，可以減少照射健康組織的不利后果，同時在腫瘤組織中維持既定劑量的放射。沿放射束路徑的健康組織的特定體積要素發(fā)生變化，減少在整個治療階段到達健康組織每一這類要素的總劑量。
通過使放射束緊緊準直于與放射束軸垂直的腫瘤全截面，也可以減少對健康組織的照射。現(xiàn)有大量系統(tǒng)產(chǎn)生這樣一種周緣準直，其中一些使用多個滑動光閘，它們能夠分段生成任意輪廓的不透射線的屏蔽。
放射藥物試劑如本文所定義的“放射藥物試劑”表示含有至少一種發(fā)出放射的放射性同位素的藥物試劑。放射藥物試劑習慣上在核醫(yī)學中用于各種疾病的診斷和/或治療。放射性標記的藥物試劑、例如放射性標記的抗體含有充當放射源的放射性同位素(RI)。正如本文所示，術語“放射性同位素”包括金屬與非金屬放射性同位素。放射性同位素是基于放射性標記藥物試劑的醫(yī)學應用加以選擇的。若放射性同位素是一種金屬放射性同位素，通常采用螯合劑使金屬放射性同位素與分子其余部分結合。若放射性同位素是一種非金屬放射性同位素，該非金屬放射性同位素通常直接或者經(jīng)由一種連接劑與分子其余部分連接。
本文所用的“金屬放射性同位素”是任意適合用在體內(nèi)或體外治療或診斷程序中的金屬放射性同位素。適合的金屬放射性同位素包括但不限于錒-225、銻-124、銻-125、砷-74、鋇-103、鋇-140、鈹-7、鉍-206、鉍-207、鉍-212、鉍-213、鎘-109、鎘-115m、鈣-45、鈰-139、鈰-141、鈰-144、銫-137、鉻-51、鈷-55、鈷-56、鈷-57、鈷-58、鈷-60、鈷-64、銅-60、銅-62、銅-64、銅-67、鉺-169、銪-152、鎵-64、鎵-67、鎵-68、釓-153、釓-157、金-195、金-199、鉿-175、鉿-175-181、鈥-166、銦-110、銦-111、銥-192、鐵-55、鐵-59、氪-85、鉛-203、鉛-210、镥-177、錳-54、汞-197、汞-203、鉬-99、釹-147、镎-237、鎳-63、鈮-95、鋨-185+191、鈀-103、鈀-109、鉑-195m、鐠-143、钷-147、钷-149、鏷-233、鐳-226、錸-186、錸-188、銣-86、釕-97、釕-103、釕-105、釕-106、釤-153、鈧-44、鈧-46、鈧-47、硒-75、銀-110m、銀-111、鈉-22、鍶-85、鍶-89、鍶-90、硫-35、鉭-182、锝-99m、碲-125、碲-132、鉈-204、釷-228、釷-232、鉈-170、錫-113、錫-114、錫-117m、鈦-44、鎢-185、釩-48、釩-49、鐿-169、釔-86、釔-88、釔-90、釔-91、鋅-65、鋯-89和鋯-95。
本文所用的“非金屬放射性同位素”是任意適合用在體內(nèi)或體外治療或診斷程序中的非金屬放射性同位素。適合的非金屬放射性同位素包括但不限于碘-131、碘-125、碘-123、磷-32、砹-211、氟-18、碳-11、氧-15、溴-76和氮-13。
鑒別最適合于放射療法的同位素要求衡量各種因素。這些因素包括腫瘤攝取與留存、血液廓清率、放射遞送速率、放射性同位素的半衰期與比活性和放射性同位素大規(guī)模生產(chǎn)在經(jīng)濟意義上的可行性。治療性放射藥物的關鍵點是向腫瘤細胞遞送必需量的放射劑量，以實現(xiàn)細胞毒性或殺腫瘤效果，同時不會導致難以控制的副作用。
優(yōu)選的是，在腫瘤部位治療性放射性同位素的物理半衰期與放射藥物的生物半衰期相似。例如，如果放射性同位素的半衰期過短，將在放射藥物達到最大靶/背景比之前發(fā)生大量衰變。另一方面，過長的半衰期導致對正常組織不必要的放射劑量。理想情況是，放射性同位素應當具有足夠長的半衰期，以在細胞周期的大多數(shù)放射敏感期內(nèi)達到最小劑量率和照射全部細胞。另外，放射性同位素的半衰期必須是足夠長的，以便有充分的時間制造、釋放和運輸。
在選擇用于腫瘤療法中既定應用的放射性同位素時，其他實際的考慮是可利用性和質(zhì)量。純度必須是充分的和可再現(xiàn)的，因為痕量雜質(zhì)可能影響放射藥物的放射性標記和放射化學純度。
腫瘤中的靶接受部位通常是數(shù)量有限的。因此優(yōu)選地，放射性同位素具有較高的比活性。比活性主要依賴于生產(chǎn)方法。痕量金屬污染物必須被減到最少，因為它們經(jīng)常與放射性同位素競爭螯合劑，它們的金屬絡合物與放射性標記的螯合試劑競爭受體結合。
適用于本發(fā)明方法的放射類型可以各不相同。例如，放射可以是電磁性的或微粒性的?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的電磁放射包括但不限于X-射線和γ射線?？捎糜趯嵤┍景l(fā)明的微粒放射包括但不限于電子束(β粒子)、質(zhì)子束、中子束、α粒子和負π介子。利用常規(guī)的放射學處理儀器與方法，借助操作內(nèi)和定向(intraoperative and stereotactic)方法，可以遞送放射。另外關于適用于實施本發(fā)明的放射處理的討論可以參見Steven A.Leibel等，Textbook of Radiation Oncology(1998)(publ.W.B.Saunders Company)，特別是第13和14章。還可以借助其他方法遞送放射，例如靶向遞送，例如借助放射性“種子”，或者借助靶向放射性綴合物的全身遞送。J.Padawer等，Combined Treatment withRadioestradiol lucanthone in Mouse C3HBA Mammary Adenocarcinomaand with Estradiol lucanthone in an Estrogen Bioassay，Int.J.Radiat.Oncol.Biol.Phys.7347-357(1981)。其他放射遞送方法也可以用于實施本發(fā)明。
就腫瘤療法而言，已經(jīng)研究了α和β粒子發(fā)射體。α粒子是特別好的細胞毒性劑，因為它們在一個或兩個細胞直徑內(nèi)散發(fā)大量能量。β粒子發(fā)射體具有相對長的穿透距離(組織中2-12mm)，這依賴于能量水平。長距穿透對具有異質(zhì)血流和/或受體表達的實體腫瘤而言是特別重要的。β粒子發(fā)射體產(chǎn)生更均勻的劑量分布，即使它們不均勻分布在靶組織內(nèi)也是如此。
給藥的方式和劑量本發(fā)明方法包含對需要治療的患者在第一治療程序中給以第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中給以第二量或劑量放射。第一與第二量一起構成治療有效量。
本文所用的術語“患者”表示治療的接受者。哺乳動物和非哺乳動物患者都包括在內(nèi)。在具體的實施方式中，患者是一種哺乳動物，例如人、犬、鼠、貓、牛、綿羊、豬或山羊。在特定的實施方式中，患者是人。
HDAC抑制劑的給藥本發(fā)明HDAC抑制劑可以按口服形式給藥，例如片劑、膠囊劑(它們各自包括持續(xù)釋放或定時釋放的制劑)、丸劑、粉劑、顆粒劑、酏劑、酊劑、混懸液、糖漿劑和乳劑。同樣，HDAC抑制劑可以按靜脈內(nèi)(快速注射劑(bolus)或輸注)、腹膜內(nèi)、皮下或肌內(nèi)方式給藥，所有這些方式都是藥學領域普通技術人員熟知的。
HDAC抑制劑可以按藥庫注射劑或植入制備物的劑型給藥，它們可以按照這樣一種方式配制，以便活性成分的持續(xù)釋放?？梢詫⒒钚猿煞謮褐瞥深w粒狀物或小型圓柱體，作為藥庫注射劑或植入劑皮下或肌內(nèi)植入。植入劑可以采用惰性材料，例如生物可降解的聚合物或合成的硅酮，例如硅橡膠、硅酮橡膠或其他由Dow-Corning Corporation制造的聚合物。
HDAC抑制劑還可以按脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的方式給藥，例如小型單層囊、大型單層囊和多層囊。脂質(zhì)體可以從各種磷脂生成，例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿。
HDAC抑制劑還可以利用單克隆抗體作為與化合物分子偶聯(lián)的單獨載體加以遞送。
HDAC抑制劑還可以利用可溶性聚合物作為可靶向藥物載體加以制備。這類聚合物可以包括聚乙烯吡咯烷酮、吡喃共聚物、聚羥基-丙基-異丁烯酰胺-苯酚、聚羥乙基-天冬酰胺-苯酚或被棕櫚酰殘基取代的聚氧乙烯-聚賴氨酸。此外，HDAC抑制劑還可以利用生物可降解的聚合物加以制備，可用于實現(xiàn)藥物的控制釋放，所述聚合物例如聚乳酸、聚乙醇酸、聚乳酸與聚乙醇酸的共聚物、聚ε-己內(nèi)酯、聚羥基丁酸、聚原酸酯、聚縮醛、聚二氫吡喃、聚氰基丙烯酸酯和交聯(lián)或兩親的水凝膠嵌段共聚物。
采用HDAC抑制劑的劑量方案可以根據(jù)各種因素加以選擇，包括類型、種類、年齡、體重、性別和所治療癌癥的類型；所治療癌癥的嚴重性(即階段)；給藥的途徑；患者的腎與肝功能；和所采用的特定化合物或其鹽。普通醫(yī)師或獸醫(yī)能夠容易地確定和指定治療所需藥物的量，例如以防止、抑制(完全或部分)或阻止疾病的進展。
在用于治療所需癌癥時，HDAC抑制劑的口服劑量可以在約2mg至約2000mg每天之間，例如約20mg至約2000mg每天，例如約200mg至約2000mg每天。例如，口服劑量可以是約2、約20、約200、約400、約800、約1200、約1600或約2000mg每天。可以理解，每天的總量可以在單劑中給予，或者可以分多次給予，例如每天兩次、三次或四次。
例如，患者可以接受約2mg/天至約2000mg/天，例如約20-2000mg/天，例如約200至約2000mg/天，例如約400mg/天至約1200mg/天。適當制成每天給藥一次的藥劑因而可以含有約2mg至約2000mg，例如約20mg至約2000mg，例如約200mg至約1200mg，例如約400mg/天至約1200mg/天。HDAC抑制劑可以在單劑中給藥，或者每日分兩次、三次或四次給藥。就每天給藥兩次而言，適當制成的藥劑因此將含有所需每日劑量的一半。
患者靜脈內(nèi)或皮下接受HDAC抑制劑的量將足以遞送約3-1500mg/m2每天，例如約3、30、60、90、180、300、600、900、1200或1500mg/m2每天。這類量可以按多種適合的方式給予，例如大體積低濃度HDAC抑制劑，每天一個較長的時間或者若干次。也可以每周(7天周期)給予連續(xù)一天或多天、間歇的數(shù)天或其組合?；蛘?，例如低體積高濃度HDAC抑制劑，在較短的時間內(nèi)，例如每天一次達一天或多天，每周(7天周期)連續(xù)、間歇或其組合。例如，可以給予300mg/2每天的劑量達連續(xù)5天，每次治療總計1500mg/m2。在另一種服藥方案中，連續(xù)天數(shù)也可以是5，治療持續(xù)連續(xù)2或3周，治療總計3000mg/m2和4500mg/m2。
通常，靜脈內(nèi)制劑可以被制成含有濃度在約1.0mg/mL至約10mg/mL之間的HDAC抑制劑，例如2.0mg/mL、3.0mg/mL、4.0mg/mL、5.0mg/mL、6.0mg/mL、7.0mg/mL、8.0mg/mL、9.0mg/mL和10mg/mL，給藥量達到上述劑量。在一種實施例中，可以在一天內(nèi)對患者給以足量體積的靜脈內(nèi)制劑，以便當天的總劑量在約300與約1500mg/m2之間。
可以使用葡萄糖醛酸、L-乳酸、乙酸、檸檬酸或任意藥學上可接受的酸/共軛堿作為緩沖劑，它們在HDAC抑制劑靜脈內(nèi)給藥可接受的pH范圍內(nèi)具有合理的緩沖能力。還可以采用氯化鈉溶液，其中已經(jīng)用酸或堿、例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至所需的范圍。通常，靜脈內(nèi)制劑的pH范圍可以在約5至約12的范圍內(nèi)。其中HDAC抑制劑具有異羥肟酸部分的靜脈內(nèi)制劑所優(yōu)選的pH范圍可以是約9至約12。在選擇適當?shù)馁x形劑時應當考慮HDAC抑制劑的溶解度和化學相容性。
皮下制劑優(yōu)選地按照本領域熟知的工藝制備，pH在約5與約12之間的范圍內(nèi)，還包括適合的緩沖劑和等滲劑。它們可以被配制成在一次或多次每日皮下給藥中遞送HDAC抑制劑的每日劑量，例如每天一次、兩次或三次。適當緩沖劑和制劑pH的選擇依賴于所要給藥的HDAC抑制劑的溶解度，本領域普通技術人員容易確定之。在皮下制劑中也可以采用氯化鈉溶液，其中已經(jīng)用酸或堿、例如鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至所需的范圍。通常，皮下制劑的pH范圍可以在約5至約12的范圍內(nèi)。其中HDAC抑制劑具有異羥肟酸部分的皮下制劑所優(yōu)選的pH范圍可以是約9至約12。在選擇適當?shù)馁x形劑時應當考慮HDAC抑制劑的溶解度和化學相容性。
HDAC抑制劑還可以以鼻內(nèi)方式給藥，經(jīng)由適合的鼻內(nèi)載體的局部應用，或者經(jīng)由透皮途徑，采用本領域普通技術人員熟知的透皮貼劑形式。為了以透皮遞送系統(tǒng)的形式給藥，劑量給藥在整個劑量方案中當然將是連續(xù)的，而非間歇的。
HDAC抑制劑可以作為活性成分與適合的藥物稀釋劑、賦形劑或載體(本文總稱為“載體”材料)混合給藥，所述載體材料根據(jù)預期給藥方式加以適當選擇，也就是口服片劑、膠囊劑、酏劑、糖漿劑等，并且與常規(guī)的藥學實踐相一致。
例如，就以片劑或膠囊劑形式口服給藥而言，HDAC抑制劑可以與口服無毒性的藥學上可接受的惰性載體混合，例如乳糖、淀粉、蔗糖、葡萄糖、甲基纖維素、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、硬脂酸鎂、磷酸二鈣、硫酸鈣、甘露糖醇、山梨糖醇等或其組合；就以液體形式口服給藥而言，口服藥物組分可以與任意口服無毒性的藥學上可接受的惰性載體混合，例如乙醇、甘油、水等。而且，如果需要或必要的話，還可以向混合物摻入適合的粘合劑、潤滑劑、崩解劑和著色劑。適合的粘合劑包括淀粉、明膠、天然糖(例如葡萄糖或β-乳糖)、玉米甜味劑、天然與合成的樹膠(例如阿拉伯膠、黃蓍膠或藻酸鈉)、羧甲基纖維素、微晶纖維素、交聯(lián)羧甲基纖維素鈉、聚乙二醇、蠟等。用在這些劑型中的潤滑劑包括油酸鈉、硬脂酸鈉、硬脂酸鎂、苯甲酸鈉、乙酸鈉、氯化鈉等。崩解劑非限制性地包括淀粉甲基纖維素、瓊脂、膨潤土、黃原膠等。
本文所述適用于本發(fā)明方法的組蛋白脫乙酰酶化合物的適合的藥學上可接受的鹽是常規(guī)的無毒性鹽，可以包括堿鹽或酸加成鹽，例如無機堿鹽，例如堿金屬鹽(例如鋰鹽、鈉鹽、鉀鹽等)、堿土金屬鹽(例如鈣鹽、鎂鹽等)、銨鹽；有機堿鹽，例如有機胺鹽(例如三乙胺鹽、吡啶鹽、甲基吡啶鹽、乙醇胺鹽、三乙醇胺鹽、二環(huán)己胺鹽、N，N’-二芐基乙二胺鹽等)等；無機酸加成鹽(例如鹽酸鹽、氫溴酸鹽、硫酸鹽、磷酸鹽等)；有機羧酸或磺酸加成鹽(例如甲酸鹽、乙酸鹽、三氟乙酸鹽、馬來酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酸鹽、苯磺酸鹽、對-甲苯磺酸鹽等)；堿性或酸性氨基酸鹽(氨基酸例如精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸等)等。
組蛋白脫乙酰酶抑制劑和放射還可以用在治療細胞癌癥的方法中，所述方法包含使該細胞與第一量能夠抑制組蛋白脫乙酰酶的化合物或其鹽接觸，和使該細胞與第二量放射療法接觸，以防止、抑制(完全或部分)或阻止癌癥的進展。細胞可以是轉基因的細胞。在另一種實施方式中，細胞可以是在患者中的，例如哺乳動物，例如人。
在某些實施方式中，治療細胞癌癥的第一量是HDAC抑制劑的約1pM至約50μM接觸濃度，例如約1pM至約5μM，例如約1pM至約500nM，例如約1pM至約50mM，例如1pM至約500pM。在特定的實施方式中，濃度小于約5.0μM。在另一種實施方式中，濃度是約500nM。
外束放射的給藥就外束放射的給藥而言，給藥量可以是至少約1戈瑞(Gy)，至少每隔一天一次至治療體積。在一個特定實施方式中，放射給予每天2戈瑞(Gy)，至少每天一次至治療體積。在另一特定的實施方式中，放射給予至少約2戈瑞(Gy)，至少每天一次至治療體積達每周連續(xù)五天。在另一種特定的實施方式中，放射給予10Gy每隔一天，每周三次至治療體積。在另一種特定的實施方式中，對需要的患者給予總計至少約20Gy。在另一種特定的實施方式中，對需要的患者給予至少約30Gy。在另一種特定的實施方式中，對需要的患者給予至少約40Gy。
通常，患者一周接受外束療法四或五次。完整的治療過程通常持續(xù)一至七周，這依賴于癌癥的類型和治療的目標。例如，患者可以接受2Gy/天的劑量達30天。
放射藥物試劑的給藥有大量方法供放射藥物試劑的給藥。例如，放射藥物試劑可以借助靶向放射性綴合物的靶向遞送或全身遞送進行給藥，例如放射性標記的抗體、放射性標記的肽和脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)。
在一個特定的靶向遞送實施方式中，放射性標記的藥物試劑可以是放射性標記的抗體。例如參見Ballangrud A.M.等，Cancer Res.，2001；612008-2014和Goldenber，D.M.J.Nucl.Med.，2002；43(5)693-713，其內(nèi)容結合在此作為參考。
在另一種特定的靶向遞送實施方式中，放射性藥物試劑可以以脂質(zhì)體遞送系統(tǒng)的形式給藥，例如小型單層囊、大型單層囊和多層囊。脂質(zhì)體可以是由各種磷脂生成的，例如膽固醇、硬脂胺或磷脂酰膽堿。例如參見Emfietzoglou D，Kostarelos K，Sgouros G.An analyticaldosimetry study for the use of radionuclide-liposome conjugatesin internal radiotherapy.J Nucl Med 2001；42499-504，其內(nèi)容結合在此作為參考。
在另外一種特定的靶向遞送實施方式中，放射性標記的藥物試劑可以是放射性標記的肽。例如參見Weiner RE，Thakur ML.Radiolabeledpeptides in the diagnos is and therapy of oncological diseases.Appl Radiat Isot 2002 Nov；57(5)749-63，其內(nèi)容結合在此作為參考。
除了靶向遞送以外，近程療法(Bracytherapy)可以用于向靶部位遞送放射性藥物試劑。近程療法是這樣一種技術，它將放射源置于盡可能接近腫瘤部位處。經(jīng)常將放射源直接插入腫瘤內(nèi)。放射源可以是絲、種子或桿的形式。一般使用銫、銥或碘。
近程療法有兩種類型腔間治療和間質(zhì)治療。在腔間治療中，將容納放射源的容器置于腫瘤中或附近。將放射源置于體腔內(nèi)。
在間質(zhì)治療中，將單獨的放射源置于腫瘤中。這些放射源可以永久留在患者中。經(jīng)常在若干天后從患者中除去放射源。放射源位于容器內(nèi)。
另外，利用任意一種上文關于HDAC抑制劑所述給藥方式可以將放射藥物試劑對患者給藥。
本領域技術人員基于關于特定癌癥類型的已知劑量可以確定所必需的放射量。例如參見Cancer Medicine 5th ed.，Edited by R.C.Bast等，July 2000，BC Decker，其完整內(nèi)容結合在此作為參考。
在特定的實施方式中，在與HDAC抑制劑聯(lián)合給藥時，放射的給藥量有效導致癌癥的終止或消退。
聯(lián)合給藥第一治療程序是組蛋白脫乙酰酶抑制劑的給藥，可以發(fā)生在第二治療程序放射之前、在放射治療之后、與放射同時或其組合。第一與第二量可以在給藥之前聯(lián)合，或者同時給以不同的部位。例如，可以根據(jù)組蛋白脫乙酰酶抑制劑決定總的治療周期。放射可以在抑制劑治療開始之前或者在抑制劑治療之后給予。另外，放射治療可以在抑制劑給藥期間給予，但是不必跨越整個抑制劑治療階段。
下列實施例更充分地闡述優(yōu)選的發(fā)明實施方式。不過，它們決不應當被解釋為限制本發(fā)明的寬泛范圍。
實驗方法材料和方法細胞培養(yǎng)從ATCC(Manassas，VA)購買人前列腺癌細胞系LNCaP(CRL 1740)。使儲備T-瓶培養(yǎng)物在37℃、95％相對濕度和5％CO2下繁殖，所用RPMI 1640(Invitrogen，Carlsbad，CA)補充有10％胎牛血清(Sigma，St.Louis，MO)、100單位/mL青霉素和100mg/mL鏈霉素(Gemini Bio-products，Woodland，CA)。通過用血細胞計數(shù)器計數(shù)經(jīng)過胰蛋白酶處理的細胞，測定細胞濃度。
球狀體引發(fā)按照Yuhas等的液體覆蓋技術引發(fā)腫瘤細胞簇或球狀體。參見Yuhas J.M.等，Cancer Res.，37.3639-3643，1977。關于LNCaP球狀體生成和鑒別的細節(jié)參見Ballangrud A.M.等，Clin.Cancer Res.，5.3171s-3176s，1999。上述文獻的完整內(nèi)容結合在此作為參考。
簡而言之，從100mm或35mm培養(yǎng)皿制備液體覆蓋平板(BectonDickinson Labware，F(xiàn)ranklin Lakes，NJ)，其中含有RPMI 1640培養(yǎng)基的薄層，所述培養(yǎng)基用1％瓊脂固化(Difco，Detroit，MI)。向培養(yǎng)基接種6.7×104細胞/mL經(jīng)過胰蛋白酶處理的儲備培養(yǎng)物。所得懸液用于向100mm平板接種大約106細胞。培育5-7天后，使用Eppendorf吸管在配有目鏡刻度的逆相-反差顯微鏡(Axiophot 2；Carl Zeiss Ltd.，Gttingen，Germany)下選擇直徑～200μm的球狀體。
處理方案每次處理后，將球狀體懸于新鮮培養(yǎng)基中洗滌三次。全部處理由SAHA培育、照射或暴露于SAHA與放射組成。每種條件使用最少12個球狀體，實驗一式兩份。
就SAHA培育而言，將10mM在DMSO中的儲備溶液系列稀釋在培養(yǎng)基中，得到1-5μM SAHA，最終DMSO濃度＜0.01％。將12-24個經(jīng)過洗滌的球狀體置于如上所述瓊脂-預備35mm培養(yǎng)皿，覆蓋含有充分SAHA的培養(yǎng)基，以覆蓋整個瓊脂表面。
就外束照射而言，利用銫輻射器使球狀體暴露于急性劑量的6Gy外束光子照射，劑量率為2.3Gy/min(Cs-137 Model 68；JL Shepherd andAssociates，Glendale，CA)。
就α-發(fā)射性放射而言，使球狀體暴露于放射性濃度為100nCi/mL的Ac225-HuM 195α-發(fā)射性放射達24小時。Ac225-HuM 195是一種重組人源化抗-CD33單克隆抗體，它已經(jīng)用錒225放射性標記過。從DavidScheinberg，M.D.，Ph.D.，Memorial Sloan-Kettering Cancer Center的實驗室獲得該抗體。
在全部處理之后，將經(jīng)過洗滌的球狀體置于單獨24孔平板的瓊脂-預備孔中。將未處理的球狀體洗滌，在初選之后立即分離。置換每孔中的培養(yǎng)基，進行體積測量，每周兩次。利用前述反轉顯微鏡和目鏡刻度，測定主直徑和次直徑，分別為dmax和dmin，根據(jù)V＝(1/6)πdmaxdmin2計算球狀體體積。一旦球狀體超出顯微鏡視野或者碎裂為個別的細胞或多個小細胞簇，即終止體積監(jiān)測。在每次實驗結束時，利用向外生長測定法(outgrowth assay)為沒有重新生長的球狀體的生存力評分——從含有沒有重新生長的球狀體的小孔中收集細胞或球狀體片段，置于單獨的無瓊脂(粘連)24孔平板的個別小孔中，培育2周，然后為集落評分。
免疫組織化學分別借助Ki67或TdT-介導的dUTP-生物素缺口端標記(TUNEL)染色評估球狀體內(nèi)腫瘤細胞的增殖或細胞凋亡。在處理后0、6、24或48小時，將球狀體在冷培養(yǎng)基中洗滌，在4％低聚甲醛中固定4小時，置于石蠟塊中。利用切片機切制系列5μm石蠟塊切片，固定在包被聚-L-賴氨酸的玻片上，在冰冷的丙酮中固定10分鐘。
利用針對Ki67的單克隆小鼠抗體和MOM試劑盒(Vector Labs，Burlingame，CA)進行Ki67染色。
將細胞凋亡的細胞用改自Gavrieli等的TUNEL染色(J Cell Biol.119493-501.，1992)。最后在蘇木精中溫育2分鐘，用于使切片復染色。使用未處理的球狀體作為對照；使用DNA酶I創(chuàng)建陽性對照(Boehringer，Ingelheim，Germany)。利用所連接的Pixera專業(yè)照相機和有關軟件(Pixera Visual Communication Suite，Pixera，LosGatos，CA)，從逆相-反差顯微鏡捕獲數(shù)碼圖象。為圖象的陽性染色評分，為球狀體切片內(nèi)反應性細胞的百分比。
統(tǒng)計學分析為了評估SAHA與放射之間的協(xié)同性，測量每一球狀體的腫瘤體積曲線下面積(AUC)。對腫瘤生長的協(xié)同抑制作用被定義為聯(lián)合治療組平均產(chǎn)生比加和模型預期更小的log AUC，所述模型單獨包括每種治療組。我們把這種關系描述為下列不等式avg(V|S＝5M，R＝6Gy)＜C+{avg(V|S＝5μM，R＝0)-C}+{avg(V|S＝0，R＝6Gy)-C}其中V是log AUC，S＝5μM和R＝6Gy代表用在實驗中的SAHA和放射的劑量，C是對照組中的平均log AUC[C＝avg(V|S＝0，R＝0)]。為了測試協(xié)同性，我們計算了平均log AUC的2000個引導副本(bootstrap replicate)，就四組中的每組而言，還計算了其中沒有得到該不等式的副本比例。這種比例被稱為所達到的顯著性水平(p值)。所達到的顯著性水平小說明由于聯(lián)合治療已經(jīng)發(fā)生對腫瘤生長的協(xié)同抑制作用。
利用雙尾T檢驗測試陽性染色細胞百分比的顯著性差異。
結果實施例SAHA對球狀體生長的影響在對化療劑和放射的響應已經(jīng)顯示大約好于體內(nèi)腫瘤中所見到的響應的球狀體中進行研究(Stuschke，M.等，Int J Radiat Oncol BiolPhys.24119-26，1992；Santini，M.T.等，Int J Radiat Biol.75787-99，1999；Dertinger，H.等，Radiat Environ Biophys.19101-7，1981)。
SAHA對球狀體生長的影響是這樣檢查的，將球狀體用0、1.25、2.5和5μM SAHA溫育120小時或者連續(xù)培養(yǎng)(圖1A-D)。在用SAHA溫育120小時或40天連續(xù)處理之后監(jiān)測球狀體生長達至少40天。在1.25μMSAHA的濃度下，球狀體的生長被延遲，但是就120小時和連續(xù)暴露條件而言都沒有被阻止。在2.5μM下，在120小時培育階段觀察到完全的生長阻止。在藥物暴露結束后，生長抑制持續(xù)另外4至5天。這種恢復的延遲之后是指數(shù)生長，之后是平臺期(即Gompertzian生長(Bassukas，I.D.Cancer Res.544385-92.，19949))，與未處理球狀體所得相似。用5μM SAHA培育120小時后五天，見到中位體積減少2.4倍，然后球狀體生長恢復至Gompertzian動力學。在0(沒有SAHA暴露)、1.25、2.5和5μM SAHA(5天培育)之后球狀體體積達到1000倍于起始體積所需時間(大約10個體積加倍時間)分別為16、20、23和29天；分別產(chǎn)生4、7和13天的生長延遲，就SAHA處理過的球狀體而言。
2.5μM下球狀體的連續(xù)暴露導致完全的生長抑制；在5μM下，觀察到球狀體體積迅速下降，大部分球狀體在第20天之前解聚。受阻或解聚的球狀體的典型形態(tài)如圖2A(5μM)和圖2B(2.5μM)所示。
為了評價SAHA作為抗腫瘤細胞劑的活性，有益的是對比利用球狀體與單層培養(yǎng)物實驗所得結果。在LNCaP單層細胞培養(yǎng)物中，2.5μM SAHA導致完全的生長抑制，在4天階段內(nèi)有很少至沒有細胞殺死，5μM SAHA導致進行性細胞殺死，開始于SAHA培育48小時后(Butler，L.M.等，Cancer Res.605165-70，2000)。
在這些實驗中，LNCaP球狀體對這些濃度的體積響應一般與單層培養(yǎng)物結果是一致的(圖1A-D)。不過，圖象(圖2A-B)揭示這些效果的時標和病因?qū)W不同于單層培養(yǎng)物所見到的。在5μM下，直到用SAHA培育13至16天后才發(fā)生完全的球狀體破壞；2.5μM下的表觀生長抑制似乎主要引起球狀體表面上細胞的連續(xù)喪失。正如TUNEL染色(見下和圖5A-C)所顯示的和形態(tài)學與球狀體中細胞的迅速消除(圖2A)所提示的，暴露于SAHA之后的細胞死亡主要是細胞凋亡。
實施例2SAHA和外束放射對球狀體生長的影響以前已經(jīng)報道過LNCaP球狀體對外束、低LET、高劑量率照射的劑量響應(Ballangrud，A.M.，等，Cancer Res.612008-14.，2001；Enmon，R.M.，等，Cancer Res.submitted)?；谶@些數(shù)據(jù)，在聯(lián)合研究中選擇3和6Gy的吸收劑量，因為這些劑量的單獨放射產(chǎn)生這樣的生長曲線，形狀上匹配未處理曲線，但是延遲4至10天達到1000倍于原始球狀體體積?；赟AHA劑量響應數(shù)據(jù)(圖1A-D)，選擇用5μM SAHA培育96小時供聯(lián)合研究。聯(lián)合治療是這樣進行的，使球狀體暴露于SAHA達48小時，照射，然后培育另外48或72小時，再洗滌和監(jiān)測生長。
在本研究中使用生長成為球狀體的LNCaP。采用下列處理方案A沒有處理B用5μM SAHA處理96小時C利用Cs-137輻射器進行6Gy急性照射處理，劑量率為2.3Gy/min(Cs-137 Model 68JL Shepherd and Associated，Glendale，CA)。處理均勻跨越球狀體，采用0.2keV/μm的低LET。
D用5μM SAHA處理總計96小時，在總計96小時的SAHA暴露的48小時后利用Cs-137輻射器(如上所述)進行6Gy急性照射。
3Gy(與120小時SAHA)聯(lián)合研究使球狀體生長產(chǎn)生適度的SAHA-劑量依賴性延遲；在5μM濃度下觀察到7天延遲(數(shù)據(jù)沒有顯示)。
6Gy與用5μM SAHA培育96小時的聯(lián)合研究導致完全的生長抑制，在向外生長測定法中12個球狀體無一形成集落(圖3D)。相反，單獨的放射(圖3C)或單獨暴露于5μM SAHA達96小時(圖3B)分別產(chǎn)生5和15天延遲，就原始體積增加1000倍而言。這些結果的統(tǒng)計學分析表明聯(lián)合治療產(chǎn)生對腫瘤生長的協(xié)同抑制作用(p＜0.01)。圖4描繪在聯(lián)合療法后不同時間的典型球狀體形態(tài)。在治療結束后不久(第4和9天)，球狀體的外觀與僅用SAHA處理所見到的相似。在晚些時候，球狀體形態(tài)發(fā)生可觀的改變；球狀體似乎由少量腫脹的、可能壞死的細胞組成。
實施例3SAHA和外束放射對細胞凋亡的影響為了檢查SAHA是否增加放射-誘導的細胞凋亡，在單一或聯(lián)合療法結束后不同時間進行球狀體切片的TUNEL染色。在96小時SAHA培育結束后不久，球狀體表面上的大多數(shù)細胞經(jīng)歷細胞凋亡，在球狀體內(nèi)部很少有細胞凋亡的跡象(圖5A)。這種發(fā)現(xiàn)與SAHA處理3天和6天的球狀體形態(tài)學外觀也是一致的(圖2A)。SAHA培育結束后48小時，在球狀體表面上沒有檢測到細胞凋亡細胞，可能由于脫落，發(fā)現(xiàn)細胞凋亡細胞遍及球狀體。在內(nèi)部，細胞碎屑袋也很明顯。這些在SAHA培育結束后不久都很明顯，但是在6和24小時后變?yōu)楦油怀觥Ｓ肧AHA和放射處理過的球狀體的TUNEL染色產(chǎn)生幾乎相同的圖案，提示了盡管SAHA誘導實質(zhì)性細胞凋亡，不過組合處理所見到的協(xié)同性球狀體響應不能由細胞凋亡增強來解釋(圖7A)。
實施例4SAHA和外束放射對增殖的影響與實施例3所示TUNEL染色結果相反，對應的免疫組織化學研究借助Ki67染色檢查增殖活性，顯示單獨每種處理與組合對細胞增殖的實質(zhì)性差異(圖6A-C和7B)。在用SAHA培育96小時結束時，事實上構成球狀體的全部細胞都已經(jīng)停止細胞周期。這與SAHA的已知細胞周期抑制效果是一致的。抑制效果是短暫的，在6至24小時內(nèi)可以見到微弱的陽性Ki67染色。48小時時，遍及切片的很多細胞顯示在僅用SAHA處理的球狀體中有強烈的Ki67染色。在用組合處理的球狀體中見到?jīng)]有這樣的染色(p＜0.01)。
實施例5SAHA和α-放射對球狀體生長的影響為了測試SAHA與發(fā)射α-粒子的放射性同位素的組合的影響，如下進行聯(lián)合處理使球狀體暴露于100nCi/mL Ac-225達24小時，然后暴露于SAHA達96小時。
LNCaP細胞如上生長成球狀體。采用下列處理方案A沒有處理B用5μM SAHA處理96小時C用100nCi/mL Ac225-HuM 195處理24小時D用5μM SAHA處理總計96小時，在SAHA處理之前用100nCi/mLAc225-Hum 195處理24小時。
24小時暴露于Ac225-Hum 195繼之以用5μM SAHA培育96小時的聯(lián)合研究導致完全的生長抑制，這維持50天的時間(圖8)。相反，單獨的Ac225-Hum 195處理沒有導致球狀體的生長抑制，單獨的96小時暴露于5μM SAHA產(chǎn)生最初的10天延遲，繼之以球狀體生長至幾乎為未處理對照球狀體體積在30天后的水平。在這些實驗中選擇抗-CD33抗體，因為已知它不與前列腺癌細胞或球狀體結合，從而能夠控制培育時間和由Ac225放射性核素遞送的α-粒子劑量。“無關”抗體的使用更容易計算遞送至球狀體的吸收劑量，因為在培育期后沒有放射性保留。在建立劑量-響應關系中和在確保所觀察到的協(xié)同效果主要由于SAHA與放射的組合而非抗體介導的效應中，這一點尤為重要。在實踐中，可以使用識別腫瘤細胞上抗原位點的特異性抗體來遞送放射性核素。
發(fā)現(xiàn)的總結放射與SAHA的組合產(chǎn)生生長抑制，引起球狀體體積相對于每種單獨的用藥程式而言存在一萬至十萬倍的差異(圖3A-D)。僅用SAHA處理與聯(lián)合處理過的球狀體的TUNEL染色結果提示了功效的協(xié)同性增加似乎不是細胞凋亡增強的結果(圖5A與圖5B和圖7A)。這種觀察結果與聯(lián)合處理結束后不久和若干周至一個多月以后的球狀體形態(tài)學特征是一致的。在用6Gy照射過的球狀體的SAHA暴露結束后(圖4，4天)，球狀體的形態(tài)學外觀與僅用SAHA處理過的球狀體相似，與SAHA-誘導的細胞凋亡是一致的。相比之下，14至42天的形態(tài)學顯示有細胞腫脹和溶解，與壞死性死亡是一致的。
在僅用SAHA處理與聯(lián)合處理之間球狀體命運分歧的最早證據(jù)是在Ki67染色中觀察到的(圖6A-C和7B)。單獨用5μM SAHA培育結束后48小時，觀察到增殖中的細胞，而在用SAHA和放射處理過的球狀體中見到?jīng)]有這類恢復；在所用劑量下，單獨的放射沒有改變細胞增殖，正如Ki67染色所評價的(圖6C，H欄)?？傊?，增殖和細胞凋亡數(shù)據(jù)提示了SAHA與放射的增強效應主要由于隨后細胞在用SAHA培育后增殖的減少，而非放射-誘導的細胞凋亡增加。
細胞在暴露于SAHA與放射聯(lián)合療法后不能重新開始細胞周期，這可能由于放射誘導損傷的修復的破壞或者其他可修復DNA損傷的增強。
盡管已經(jīng)參照優(yōu)選的實施方式確切地顯示和描述了本發(fā)明，不過將為本領域技術人員所理解的是，可以進行各種形式和細節(jié)上的變化，而不背離由權利要求書所涵蓋的發(fā)明范圍。
權利要求
1.治療需要治療的患者癌癥的方法，包含對所述患者在第一治療程序中給以第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中給以第二量放射，其中第一與第二量一起構成治療有效量。
2.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種異羥肟酸衍生物、短鏈脂肪酸(SCFA)、環(huán)狀四肽、苯甲酰胺衍生物或親電性酮衍生物。
3.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種異羥肟酸衍生物，選自由SAHA、Pyroxamide、CBHA、制滴菌素A(TSA)、制滴菌素C、水楊異羥肟酸(SBHA)、壬二酸雙異羥肟酸(ABHA)、壬二酸-1-異羥肟酸-9-?；桨?AAHA)、6-(3-氯苯基脲基)己酸異羥肟酸(3Cl-UCHA)、Oxamflatin、A-161906、Scriptaid、PXD-101、LAQ-824、CHAP、MW2796和MW2996組成的組。
4.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種環(huán)狀四肽，選自由Trapoxin A、FR901228(FK 228，Depsipeptide)、FR225497、Apicidin、CHAP、HC-Toxin、WF27082和Chlamydocin組成的組。
5.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種短鏈脂肪酸(SCFA)，選自由鈉的丁酸鹽、異戊酸鹽、戊酸鹽、4-苯基丁酸鹽(4-PBA)、苯基丁酸鹽(PB)、丙酸鹽、丁酰胺、異丁酰胺、苯基乙酸鹽、3-溴丙酸鹽、甘油三丁酸酯、丙戊酸和丙戊酸鹽組成的組。
6.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種苯甲酰胺衍生物，選自由CI-994、MS-27-275(MS-275)和MS-27-275的3′-氨基衍生物組成的組。
7.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是一種親電性酮衍生物，選自由三氟甲基酮和一種α-酮基酰胺組成的組。
8.根據(jù)權利要求2的方法，其中所述HDAC抑制劑是Depudecin。
9.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的 或其藥學上可接受的鹽。
10.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的pyroxamide 或其藥學上可接受的鹽。
11.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的 或其藥學上可接受的鹽。
12.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的 或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或水化物，其中R1和R2可以是相同或不同的；當R1與R2相同時，各自是取代或未取代的芳基氨基環(huán)烷基氨基或哌啶子基；當R1與R2不同時，R1＝R3-N-R4，其中每個R3和R4獨立地是彼此相同或不同的，是氫原子、羥基、取代或未取代的直鏈或支鏈烷基、鏈烯基、環(huán)烷基、芳基、烷氧基、芳氧基、芳基烷氧基，或者R3和R4一起鍵合構成哌啶基；R2是羥氨基、羥基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基或烷氧基；并且n是約4至約8的整數(shù)。
13.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的 或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或水化物，其中R是取代或未取代的苯基、哌啶子基、噻唑基、2-吡啶基、3-吡啶基或4-吡啶基；并且n是約4至約8的整數(shù)。
14.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑是由下列結構所代表的 或其藥學上可接受的鹽、溶劑化物或水化物，其中A是酰胺部分；R1和R2各自選自取代或未取代的芳基、芳基氨基、芳基烷基氨基、芳基烷基、芳氧基或芳基烷氧基；R4是氫、鹵素、苯基或環(huán)烷基；并且n是約3至約10的整數(shù)。
15.根據(jù)權利要求1的方法，其中該第二治療程序的放射是外束放射。
16.根據(jù)權利要求1的方法，其中該第二治療程序的放射是一種放射藥物試劑。
17.根據(jù)權利要求16的方法，其中該放射藥物是一種放射性綴合物。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其中所述放射性綴合物是一種放射性標記的抗體。
19.根據(jù)權利要求1的方法，其中該放射選自由電磁放射和微粒放射組成的組。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中該電磁放射選自由X-射線、γ射線和其任意組合組成的組。
21.根據(jù)權利要求19的方法，其中該微粒放射選自由電子束(β粒子)、質(zhì)子束、中子束、α粒子和負π介子組成的組。
22.權利要求21的方法，其中該微粒放射是α粒子。
23.根據(jù)權利要求1的方法，其中向該患者給以總計至少約1Gy的放射。
24.根據(jù)權利要求1的方法，其中向該患者給以總計至少約10Gy的放射。
25.根據(jù)權利要求1的方法，其中向該患者給以總計至少約20Gy的放射。
26.根據(jù)權利要求1的方法，其中向該患者給以總計至少約40Gy的放射。
27.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑和所述放射的治療效果是協(xié)同性的。
28.根據(jù)權利要求26的方法，其中所述HDAC抑制劑使該患者中的癌細胞敏感于放射。
29.根據(jù)權利要求1的方法，其中放射使該患者中的癌細胞敏感于所述HDAC抑制劑。
30.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑和放射是同時給予的。
31.根據(jù)權利要求1的方法，其中所述HDAC抑制劑和所述放射是先后給予的。
32.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述HDAC抑制劑是在給以所述放射之前給藥的。
33.根據(jù)權利要求31的方法，其中所述HDAC抑制劑是在給以所述放射之后給藥的。
34.權利要求1的方法，其中該HDAC抑制劑是口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、經(jīng)頰、鼻內(nèi)、經(jīng)由吸入、陰道、眼內(nèi)、局部、皮下、脂肪內(nèi)、關節(jié)內(nèi)、鞘內(nèi)給藥的。
35.權利要求1的方法，其中該HDAC抑制劑是一種緩釋劑型。
36.權利要求16的方法，其中該放射藥物試劑是口服、腸胃外、腹膜內(nèi)、靜脈內(nèi)、動脈內(nèi)、透皮、舌下、肌內(nèi)、直腸、經(jīng)頰、鼻內(nèi)、經(jīng)由吸入、陰道、眼內(nèi)、局部、皮下、脂肪內(nèi)、關節(jié)內(nèi)或鞘內(nèi)給藥的。
37.權利要求16的方法，其中該放射藥物試劑是一種緩釋劑型。
38.測定癌細胞對HDAC抑制劑與放射聯(lián)合療法敏感性的方法，所述方法包含下列步驟使所述癌細胞在第一治療程序中與第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑接觸，在第二治療程序中與第二量放射接觸，其中第一與第二治療一起構成治療有效量，再評估該細胞對治療的敏感性。
39.測定HDAC抑制劑與放射的組合治療癌癥的治療有效量的方法，包含下列步驟使癌細胞在第一治療程序中暴露于第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中暴露于第二量放射，其中第一與第二治療一起構成治療有效量，再評估抗癌效果。
40.藥物組合物，包含第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑和第二量放射，其中第一與第二量一起構成治療有效量。
41.權利要求40的組合物，其中該放射是一種放射藥物試劑。
42.第一量HDAC抑制劑與第二量放射在制備用于治療癌癥的藥物中的用途。
43.權利要求42的用途，其中該放射是一種放射藥物試劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及治療需要治療的患者癌癥的方法。該方法包含對需要治療的患者在第一治療程序中給以第一量組蛋白脫乙酰酶抑制劑，在第二治療程序中給以第二量或劑量放射。第一與第二治療一起構成治療有效量。HDAC抑制劑與放射療法的組合在治療上是有協(xié)同性的。
文檔編號A61K31/44GK1728991SQ03813849
公開日2006年2月1日 申請日期2003年4月15日 優(yōu)先權日2002年4月15日
發(fā)明者G·斯格羅斯, V·M·利馳昂, P·A·馬克斯, R·A·利?？驳?申請人:斯隆-凱特林癌癥研究院