專(zhuān)利名稱(chēng)：含有plgf－1的藥物和化妝品組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及含有胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)的治療和化妝品組合物的制備，其能夠增加皮膚、皮下和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的血管生成。這樣的組合物適合用于通過(guò)皮膚層新血管的形成或再生而治療病理或自然狀態(tài)，例如各種表現(xiàn)形式的硬皮病、皮膚老化或脫發(fā)。
本領(lǐng)域狀況胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)是調(diào)節(jié)血管生成的同二聚體糖蛋白。Maglione和Persico在專(zhuān)利EP-B-0 550 519(WO-A-92/06194)中描述了編碼PLGF蛋白的完整多核苷酸序列。PGLF RNA的選擇性剪接產(chǎn)生三種同源形式，即PLGF-1、PLGF-2和PLGF-3，它們具有不同的多肽序列并都在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述。
在本領(lǐng)域現(xiàn)有技術(shù)中描述了或只是假設(shè)了PLGF-1的治療應(yīng)用。專(zhuān)利EP-B-0 550 519假設(shè)了PLGF用于治療一般性炎癥狀態(tài)、創(chuàng)傷、燒傷、潰瘍和手術(shù)后階段。國(guó)際申請(qǐng)WO-A-01/56593描述了在治療和預(yù)防腦、心肌和外周缺血中VEGF和PLGF因子的腸胃外全身性使用。在“I1Farmaco”(Vol.55，2000，165-167頁(yè)，Maglione等人)上發(fā)表的科學(xué)文章也描述了PLGF-1對(duì)于預(yù)防心肌缺血和降低梗死嚴(yán)重性的效用。最后，F(xiàn)aille等人在“Journal Invest.Dermatol.”(115(3)，Sep.2000，388-395頁(yè))中報(bào)道了在創(chuàng)傷組織修復(fù)過(guò)程所涉及的角膜細(xì)胞中引起PLGF的產(chǎn)生?？墒?，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)沒(méi)有使得能夠斷定PLGF-1在預(yù)防性或治愈性治療涉及皮膚、皮下和內(nèi)臟器官結(jié)締組織的疾病或者病理變化中是有效的。特別地，現(xiàn)有技術(shù)教導(dǎo)沒(méi)有使得能夠斷定局部施用外源性PLGF能夠在體內(nèi)影響與病理狀態(tài)以及與自然狀況相關(guān)的皮膚的血管形成。在根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行施用外源性PLGF之后所獲得的促進(jìn)血管生成(特別是促進(jìn)皮膚血管形成)的效用在處理病理或生理狀態(tài)中是特別有利的，這些病理或生理狀態(tài)由于得到更有效的血液供應(yīng)而易得到改善。
發(fā)明概述本發(fā)明是基于一個(gè)意外的發(fā)現(xiàn)，即在組成皮膚的組織中特別是在結(jié)締組織中增加PLGF-1的水平將伴隨出現(xiàn)皮膚血管形成的增加。同樣地，已經(jīng)觀察到該組織PLGF-1水平的增加可以有利地通過(guò)根據(jù)本發(fā)明腸胃外或局部使用組合物而施用外源性PLGF-1來(lái)獲得。血管生成刺激經(jīng)證實(shí)對(duì)于下列情況的處理是有用的，即皮膚、皮下和內(nèi)臟結(jié)締組織的典型病理狀態(tài)，例如具有不同表現(xiàn)形式的硬皮病如局部性硬皮病、漸進(jìn)性全身性硬皮病和全身性硬化癥，和修復(fù)皮膚損傷和潰瘍、自然和病理性脫發(fā)，或者只是生理狀態(tài)如皮膚老化，特別是由于暴露于日光或暴露于空氣/環(huán)境侵襲性試劑所產(chǎn)生的皮膚老化。
本申請(qǐng)的目標(biāo)是使用PLGF特別是1型PLGF(PLGF-1)來(lái)制備治療或化妝品組合物，該組合物可在預(yù)防性或治愈性治療涉及皮膚、皮下和內(nèi)臟結(jié)締組織和/或血管系統(tǒng)的疾病或者自然或病理變化，從而促進(jìn)血管生成。
特別地，本發(fā)明的目標(biāo)是使用PLGF-1來(lái)制備治療組合物以用于治療硬皮病，特別是局限性硬皮病、進(jìn)行性全身性硬皮病和全身性硬化癥，和治療由于暴露于空氣/環(huán)境侵襲劑或暴露于日光輻射而引起的病理性皮膚老化，以及治療病理原因的脫發(fā)。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)為在用于預(yù)防性或治愈性治療脫發(fā)和皮膚老化的化妝品中使用PLGF-1。
本發(fā)明的進(jìn)一步目標(biāo)也為用于局部和腸胃外使用的藥物組合物，以及用于局部使用的化妝品組合物，它們含有PLGF-1和在藥物與化妝品組合物領(lǐng)域中通常使用的賦形劑。
發(fā)明詳述在組成皮膚的組織中特別是在角質(zhì)形成細(xì)胞中增加PLGF-1的水平會(huì)伴隨出現(xiàn)皮膚血管形成的局部增加。這種組織中PLGF-1水平的增加可以通過(guò)全身性以及區(qū)域性施用外源性PLGF-1來(lái)獲得。
檢測(cè)PLGF-1的血管生成作用通過(guò)已知的在體內(nèi)或體外進(jìn)行的方法來(lái)測(cè)定，例如兔角膜血管形成檢測(cè)或雞尿囊絨膜血管形成檢測(cè)。根據(jù)本發(fā)明，按照Streit等人(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1999，Dec.21st，96(26)，14888-14893)的描述通過(guò)皮膚樣品的計(jì)算機(jī)化形態(tài)測(cè)量分析來(lái)檢查皮膚的血管形成。將從根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行處理或未處理的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中分離得到的皮膚切片使用所用動(dòng)物的抗CD31單克隆抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。經(jīng)這樣處理的切片用電子顯微鏡進(jìn)行分析，組織的形態(tài)測(cè)量分析用IP-LAB程序(Scanalytics公司)來(lái)進(jìn)行。按照Streit等人的描述來(lái)測(cè)定每mm2的血管數(shù)目、它們的平均大小和它們所占據(jù)的相關(guān)區(qū)域。
在經(jīng)處理的動(dòng)物中，用外源性PLGF-1進(jìn)行局部處理引起如實(shí)施例中舉例說(shuō)明的血管參數(shù)的顯著增加。
用于評(píng)測(cè)根據(jù)本發(fā)明的組合物的血管生成活性的第二種方法是體內(nèi)毛細(xì)管顯微鏡檢查和毛細(xì)管顯微鏡測(cè)量。該已知的技術(shù)涉及皮膚的直接顯微鏡觀察，優(yōu)選地用增加透明度的物質(zhì)如凡士林或植物油進(jìn)行預(yù)處理。優(yōu)選的分析區(qū)域?yàn)橹w指甲壁。通過(guò)毛細(xì)管顯微鏡檢查和毛細(xì)管顯微鏡測(cè)量所獲得的數(shù)據(jù)的分析可以合適地通過(guò)使用照相記錄系統(tǒng)和計(jì)算機(jī)化數(shù)據(jù)再處理系統(tǒng)來(lái)進(jìn)行。值得考慮的參數(shù)為血管形態(tài)學(xué)、血管周?chē)M織形態(tài)學(xué)和流變學(xué)狀況。形態(tài)學(xué)觀察記錄了任何血管形成的增加或減少、毛細(xì)管口徑和每mm2的毛細(xì)管密度。組織觀察評(píng)測(cè)了結(jié)締組織透明度以及毛細(xì)血管周?chē)鲅蛘咭后w或硬化膠原沉積的存在。特別地，血管周?chē)Y(jié)締組織的觀察強(qiáng)調(diào)了，在正常條件下，毛細(xì)血管袢由顏色較淺的暈所環(huán)繞，該暈稱(chēng)為毛細(xì)管暈，其是由富含葡糖胺聚糖的松弛組織所組成的。這種暈的消失或減少是結(jié)締組織的深度結(jié)構(gòu)變化的征兆。其他變化類(lèi)型為伴隨硬皮病出現(xiàn)的組織透明度的降低。流變學(xué)狀況評(píng)測(cè)了流速或紅細(xì)胞凝集或血栓形成的存在。
按照Yamamoto T.等人在Arch.Dermatol.Res.(Nov.2000，292(11)，535-541頁(yè))中的描述，在動(dòng)物模型上評(píng)測(cè)本發(fā)明的組合物在治療硬皮病中的活性。在C3H小鼠中通過(guò)用博來(lái)霉素(100mcg/ml)處理而誘導(dǎo)產(chǎn)生硬皮病狀態(tài)，博來(lái)霉素是通過(guò)每日進(jìn)行皮下注射并持續(xù)3星期而進(jìn)行施用的。在3星期之后，處死動(dòng)物并將經(jīng)處理的區(qū)域的皮膚樣品進(jìn)行組織學(xué)分析。治療的效用表現(xiàn)在歸因于博來(lái)霉素引起的皮膚硬化的組織學(xué)表現(xiàn)，特別是皮膚變厚和高的羥脯氨酸水平。
PLGF本發(fā)明中使用的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)可以是提取來(lái)源的，或者作為來(lái)自經(jīng)遺傳修飾的宿主細(xì)胞的表達(dá)產(chǎn)物而獲得。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，高度純化的因子以基本上同二聚體或多聚體形式進(jìn)行使用，這種形式是根據(jù)本發(fā)明者在國(guó)際申請(qǐng)PCT/IT 02/00065中所揭示的方法而獲得的。特別地，所使用的產(chǎn)物含有不低于98.5％的二聚體和多聚體活性形式、不低于70％的二聚體形式和無(wú)論如何不高于1.5％的單體形式。在功能上具有活性的PLGF-1片段同樣也可以在本發(fā)明的范圍內(nèi)使用。具有純化因子的至少30％的比活性或者優(yōu)選地至少50％或更好地至少90％的片段可以認(rèn)為其在功能上相當(dāng)于天然因子。
疾病硬皮病治療分別是本發(fā)明的一個(gè)方面和本發(fā)明的組合物的一個(gè)方面。
硬皮病是涉及微血管系統(tǒng)和皮膚、皮下與內(nèi)臟結(jié)締組織的疾病。該疾病引起成纖維細(xì)胞的活化和膠原的過(guò)多產(chǎn)生及在組織和血管周?chē)某练e，這在很大程度上影響著纖維化和鈣化區(qū)域的形成，因此影響著疾病引起的癥狀的表現(xiàn)。特別地，在毛細(xì)管顯微鏡檢查中觀察到大量的硬化膠原環(huán)繞在皮膚的血管周?chē)?，從而引起血管口徑的變窄?br> 皮膚參與的局限性硬皮病與進(jìn)行性全身性硬皮病是有區(qū)別的，前者的特征在于由于過(guò)多的和不適當(dāng)?shù)哪z原沉積所造成的皮膚變硬和變厚，而在后者中血管的參與和具有內(nèi)臟損傷的全身性硬化與皮膚纖維化有關(guān)。在手指和手上的皮膚都出現(xiàn)變硬、變厚和水腫。此外，疾病還表現(xiàn)在具有心機(jī)能不全的心肌水平上，和表現(xiàn)在肺、胃腸、腎和骨-肌肉系統(tǒng)水平上。此外，一些患者形成皮膚纖維化引起的給關(guān)節(jié)活動(dòng)性造成巨大困難的侵蝕性關(guān)節(jié)病。
關(guān)于其他的血管生成藥物，已經(jīng)報(bào)道了，由于用這些有益于疾病的病史的藥物進(jìn)行治療而促進(jìn)了血管生成，特別是促進(jìn)了皮膚的血管生成。特別地，用血管生成因子治療受全身性硬化癥影響的患者，這種患者的皮膚表面的體內(nèi)毛細(xì)管顯微鏡檢查證實(shí)了在密度以及平均血管口徑上有統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的血管形成的增加。此外，新血管沒(méi)有硬化的膠原，因此能夠改善組織的血液供應(yīng)。這一增加伴隨著病理表現(xiàn)的部分緩解。
不是想將本發(fā)明束縛于或限制于科學(xué)理論，假設(shè)在治療全身性硬化癥中PLGF-1對(duì)于動(dòng)物模型所發(fā)揮的治療效用是由伴隨著體內(nèi)血管生成的血管舒張作用來(lái)介導(dǎo)的。事實(shí)上，已經(jīng)證實(shí)PLGF-1引起的一種效用為刺激了一氧化氮(NO)的產(chǎn)生，有許多科學(xué)證據(jù)表明NO是重要的血管舒張媒介物。
基于PLGF-1在治療硬皮病和其伴隨的表現(xiàn)中所引起的效用而假設(shè)的作用機(jī)制與到目前為止這些病理狀況的治療相一致。事實(shí)上，這種治療依賴(lài)于不同藥物的聯(lián)合使用，在這些藥物中有著具有血管(主要是血管舒張)作用的藥劑。
本發(fā)明的第二個(gè)方面涉及皮膚老化的典型表象的治療。這種治療雖然認(rèn)為本質(zhì)上是屬于化妝品的，但是當(dāng)考慮由于延長(zhǎng)暴露于日光輻射(光老化)、其他輻射或其他環(huán)境/空氣侵襲劑所造成的皮膚組織的過(guò)早退化現(xiàn)象時(shí)，其具有治療的含義。
對(duì)于光損傷皮膚樣品的電子顯微鏡觀察揭示了典型的微血管形態(tài)學(xué)，除了其他表現(xiàn)之外，其特征在于存在病理性擴(kuò)張的毛細(xì)管，這些毛細(xì)管順彈性蛋白排列或者被密集的無(wú)定形物質(zhì)包圍。也觀察到存在活化的內(nèi)皮細(xì)胞，這些細(xì)胞具有增加了數(shù)量的胞質(zhì)細(xì)胞器和胞飲泡。已經(jīng)觀察到，由根據(jù)本發(fā)明施用PLGF-1所引起的對(duì)新皮膚血管形成的刺激在自然以及過(guò)早老化的皮膚中產(chǎn)生了對(duì)于細(xì)胞外基質(zhì)的調(diào)節(jié)效用，這些細(xì)胞外基質(zhì)影響著皮膚張力和厚度。在用本發(fā)明的組合物進(jìn)行延長(zhǎng)的局部治療之后，毛細(xì)血管的形成增加了，這伴隨著成纖維細(xì)胞的增加和新膠原的產(chǎn)生，隨后總體改善了皮膚的外觀。
本發(fā)明的另一個(gè)方面涉及脫發(fā)。
改善的皮膚血管形成伴隨著進(jìn)一步的治療以及美容價(jià)值的表現(xiàn)，即皮膚附屬物(毛發(fā)等等)的生長(zhǎng)的調(diào)節(jié)，意指脫落預(yù)防和再生促進(jìn)。
生長(zhǎng)階段(即相當(dāng)于毛發(fā)生長(zhǎng)階段)伴隨著毛囊血管形成的自然增加。局部施用的PLGF-1的血管生成作用促進(jìn)了這種血管的增加和隨之發(fā)生的毛發(fā)的生長(zhǎng)。用本發(fā)明的組合物處理動(dòng)物，其靠近毛囊的皮膚切片的計(jì)算機(jī)化形態(tài)測(cè)量分析揭示了不只在毛細(xì)管口徑大小和毛細(xì)管密度上有增加(由此在毛囊周?chē)难苄纬缮嫌写篌w的增加)，而且在毛球的尺寸和毛發(fā)本身的直徑上有增加。
預(yù)防脫發(fā)或者促進(jìn)其再生長(zhǎng)的效用不僅可用于自然脫發(fā)的情況，而且可用于由于臨床相關(guān)狀態(tài)如脫發(fā)癥、激素紊亂、化療、放療或藥物施用所造成的脫發(fā)。
適合于治療藥劑的全身性或區(qū)域性施用的任何配劑可以根據(jù)本發(fā)明使用。用于區(qū)域性使用的配劑在化妝品應(yīng)用的領(lǐng)域中使用。
特別地，PLGF-1因子可以通過(guò)具有全身性或區(qū)域性(local)效應(yīng)的腸胃外途徑進(jìn)行施用，或者通過(guò)主要具有區(qū)域性效應(yīng)的局部途徑(topic)施用于皮膚或粘膜。雖然腹膜內(nèi)或肌肉內(nèi)施用也是合適的，但是全身性效用主要是通過(guò)靜脈內(nèi)施用來(lái)獲得的。區(qū)域性效用通過(guò)局部或者腸胃外的肌肉內(nèi)、皮下、關(guān)節(jié)間施用而獲得。同樣地，PLGF-1因子可以通過(guò)電轉(zhuǎn)運(yùn)或離子電泳進(jìn)行局部施用。當(dāng)希望延遲的釋放時(shí)，皮下植入物同樣是可用的。雖然因子的口服施用也是可行的，但是鑒于活性產(chǎn)物的易腐性其是較不合適的。
用于腸胃外、全身性或區(qū)域性使用的組合物包括溶液、懸浮液、脂質(zhì)體懸浮液、W/O或O/W乳濁液。用于局部使用的組合物包括溶液、洗液、懸浮液、脂質(zhì)體懸浮液、W/O或O/W乳濁液、凝膠、軟膏、霜?jiǎng)?rùn)發(fā)油和糊劑。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，活性物質(zhì)以凍干的形式進(jìn)行配制，其混合了合適的凍干添加劑，并易于用治療上可用的稀釋劑進(jìn)行再溶解。可用的凍干添加劑為緩沖液、多糖、蔗糖、甘露醇、肌醇、多肽、氨基酸和其他任何與活性物質(zhì)可相容的添加劑。在本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案中，將活性物質(zhì)以這樣的數(shù)量溶解在磷酸緩沖液(NaH2PO4/H2O-Na2HPO4/2H2O)中，即在凍干之后PLGF-1/磷酸鹽的比例位于1∶1和1∶2之間。適合于腸胃外使用的稀釋劑為水、生理溶液、糖溶液、水醇溶液(hydroalcoholic solution)、油性稀釋劑、多元醇(如甘油、乙二醇或聚乙二醇)，或者任何可與施用方法例如無(wú)菌狀態(tài)、pH、離子強(qiáng)度和粘度相匹配的其他稀釋劑。
在乳濁液或懸浮液的情況下，組合物可以含有通常在藥物配劑中使用的合適的非離子、兩性離子、陰離子或陽(yáng)離子型表面活性劑。油/水(O/W)親水性乳濁液對(duì)于腸胃外全身性使用是優(yōu)選的，然而水/油(W/O)親脂性乳濁液對(duì)于區(qū)域性或局部使用是優(yōu)選的。
此外，本發(fā)明的組合物可以含有可選擇的添加劑如等滲試劑，例如糖或多元醇、緩沖液、螯合劑、抗氧化劑、抗菌劑。
用于局部使用的組合物具有液體形式或半固體形式。液體形式包括溶液或洗液。這些可以是含水的、水醇的如乙醇/水或者含醇的，并可以通過(guò)溶解凍干的物質(zhì)來(lái)獲得。
作為另一種選擇，活性物質(zhì)溶液可以通過(guò)添加已知的膠凝劑而以凝膠形式進(jìn)行配制，如淀粉、甘油、聚乙二醇或聚丙二醇、聚(甲基)丙烯酸酯、異丙醇、羥基硬脂酸酯。
用于局部使用的其他類(lèi)型的組合物為潤(rùn)發(fā)油、糊劑、霜?jiǎng)┬问降娜闈嵋夯驊腋∫?。W/O乳濁液是優(yōu)選的，其提供了更快的吸收。親脂性賦形劑的例子為液體石蠟、無(wú)水羊毛脂、白凡士林、鯨蠟醇、硬脂醇、植物油、礦物油。有利地可以使用增加皮膚滲透性并由此促進(jìn)吸收的試劑。這種試劑的例子為生理上可用添加劑如聚乙烯醇、聚乙二醇或二甲亞砜(DMSO)。
在局部組合物中使用的其他添加劑為等滲試劑，例如糖或多元醇、緩沖液、螯合劑、抗氧化劑、抗菌劑、增稠劑、分散劑。
同樣地，可以使用用于區(qū)域性或全身性使用的延遲釋放的組合物，其含有聚合物如聚乳酸酯、聚(甲基)丙烯酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、甲基纖維素、羧甲基纖維素和本領(lǐng)域中已知的其他物質(zhì)。以基于例如聚乳酸酯或其他生物可降解聚合物的皮下植入物的形式存在的延遲釋放組合物也可以使用。
雖然活性物質(zhì)優(yōu)選地以經(jīng)凍干因此穩(wěn)定的形式進(jìn)行包裝，但是藥物組合物有利地含有將PLGF-1穩(wěn)定于有活性的二聚體-多聚體形式的物質(zhì)。這種穩(wěn)定劑抑制了分子間二硫鍵的形成，因此防止了活性物質(zhì)的多聚化?？墒?，應(yīng)當(dāng)小心地調(diào)節(jié)穩(wěn)定劑的數(shù)量，從而預(yù)防活性物質(zhì)還原成無(wú)活性的單體形式。這樣的物質(zhì)的例子為半胱氨酸、半胱胺或還原形式的谷胱甘肽。
劑量劑量取決于施用途徑和所選擇的配劑。對(duì)于腸胃外施用，數(shù)量從1mcg/此/天至500mcg/kg/天變化，優(yōu)選地從10mcg/kg/天至200mcg/kg/天變化。這種施用可用這樣數(shù)量的藥物組合物來(lái)獲得，即每個(gè)單個(gè)劑量單位含有大約50mcg-30mg，優(yōu)選地每個(gè)劑量單位含有大約500mcg-10mg。對(duì)于局部治療應(yīng)用，在每克組合物含有0.1-10mg的數(shù)量經(jīng)證明是有效的。用于治療皮膚老化或脫發(fā)的局部化妝品組合物優(yōu)選地在每克組合物中含有0.01-0.09mg的活性物質(zhì)。
治療的時(shí)間長(zhǎng)短依賴(lài)于病理狀態(tài)或所希望的效果而變化。在治療硬皮病的情況下，施用時(shí)間根據(jù)病理嚴(yán)重性而從1天至12個(gè)月變化。在抗自然或過(guò)早皮膚老化的治療的情況下，施用時(shí)間從1天至400天變化，優(yōu)選地持續(xù)至少30天。同樣地，在用于預(yù)防脫發(fā)或用于促進(jìn)毛發(fā)再生的處理的情況下，施用時(shí)間從1天至400天變化。
實(shí)施例1用于腸胃外使用的溶液將含有25mg純PLGF-1和33mg磷酸緩沖劑(10mg NaH2PO4/H2O和23mg Na2HPO4/2H2O)的58mg凍干物質(zhì)和大約125ml用于腸胃外使用的生理溶液分別裝入預(yù)置的燒瓶中，用于在使用之前快速混合凍干的產(chǎn)物和稀釋劑?；钚晕镔|(zhì)的溶解后濃度為大約0.2mg/ml。
實(shí)施例2用于局部應(yīng)用的W/O乳濁液將含有20mg活性物質(zhì)的一些凍干物質(zhì)置于含有10％DMSO的5ml10％乙醇水醇溶液中。將該溶液在用于皮膚應(yīng)用的無(wú)菌植物油中進(jìn)行乳化，這是通過(guò)使用具有＜10HLB系數(shù)的適合于W/O乳濁液的表面活性劑來(lái)進(jìn)行的。該乳濁液含有的活性物質(zhì)等于大約2mg/g r組合物。
實(shí)施例3O/W乳濁液將含有大約20mg活性物質(zhì)的一些凍干物質(zhì)溶解在含有30％DMSO的5ml水醇溶液中，并用合適的表面活性劑在基于植物油的親脂性溶劑中進(jìn)行乳化。結(jié)果所得的O/W乳濁液含有濃度為大約3mg/gr組合物的活性物質(zhì)。
實(shí)施例4凝膠形式的局部組合物將含有10mg活性物質(zhì)的一些凍干物質(zhì)置于含有20％DMSO的20ml10％乙醇水醇溶液中。然后，向溶液中添加聚乙二醇(400-4000)和聚丙二醇的混合物?；钚晕镔|(zhì)以等于2mg/gr組合物的數(shù)量存在。該凝膠適合于化妝品應(yīng)用。
實(shí)施例5將4只SKH-1無(wú)毛小鼠每天用50μl實(shí)施例1中所描述的溶液(0.2mg/ml)進(jìn)行處理并持續(xù)20天，該溶液是通過(guò)背部區(qū)域的一組皮膚表面(1cm2)進(jìn)行腸胃外皮下途徑來(lái)施用的。其他4只SKH-1小鼠用實(shí)施例2中所描述的組合物(2mg/gr)通過(guò)局部途徑處理30天。4只同樣種類(lèi)的小鼠只用用于腸胃外使用的賦形劑進(jìn)行處理，其他4只小鼠只用用于局部使用的賦形劑進(jìn)行處理，這都是依照同樣的施用規(guī)程來(lái)進(jìn)行的。被處死動(dòng)物的皮膚樣品通過(guò)Streit等人(如上)描述的計(jì)算機(jī)化形態(tài)測(cè)量分析來(lái)進(jìn)行檢查。詳細(xì)地說(shuō)，將皮膚切片(5微米)用單克隆抗鼠CD31抗體進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。經(jīng)這樣處理的切片用電子顯微鏡進(jìn)行分析，并用IP-LAB程序(Scanalytics公司)實(shí)施組織的形態(tài)測(cè)量分析。所考慮的參數(shù)為血管覆蓋區(qū)域(％/mm2)和平均血管大小(μm2)。結(jié)果報(bào)告在表1中。
表1
在表中所報(bào)告的值表明，腸胃外處理和局部處理都顯示出統(tǒng)計(jì)學(xué)上顯著的增加，雖然局部處理的增加的顯著性較小。
實(shí)施例6在該實(shí)施例中，使用Yamamoto等人(如上)所描述的博來(lái)霉素誘導(dǎo)的硬皮病的動(dòng)物模型。
第一組C3H小鼠用博來(lái)霉素(100mcg/ml)通過(guò)每天皮下注射并持續(xù)3星期而進(jìn)行處理。其他3組C3H小鼠像第一組一樣進(jìn)行處理，但是對(duì)于它們的每日注射分別以0.1、1和10mcg/ml的劑量加入PLGF-1。在處理3星期之后處死動(dòng)物，然后收集經(jīng)處理區(qū)域的皮膚并進(jìn)行組織學(xué)分析。用1和10mcg/ml但不是0.1mcg/ml的PLGF-1進(jìn)行處理的效果強(qiáng)調(diào)出歸因于博來(lái)霉素誘導(dǎo)的皮膚硬化的組織學(xué)表現(xiàn)的顯著減少。特別地，相對(duì)于用單獨(dú)博來(lái)霉素處理的小鼠，皮膚變厚和羥脯氨酸水平顯著減少了。
實(shí)施例7一些年齡在50-60歲的健康成年個(gè)體常常明顯地暴露于環(huán)境侵襲劑和日光輻射，將這樣的個(gè)體的左手背用實(shí)施例4中所描述的以凝膠形式存在的組合物通過(guò)皮膚局部應(yīng)用進(jìn)行處理。所使用的數(shù)量為每天1gr凝膠，相當(dāng)于0.2mg活性物質(zhì)，并在夏季持續(xù)60天。處理的效果照如下進(jìn)行評(píng)估，即進(jìn)行毛細(xì)管顯微鏡檢查和毛細(xì)管顯微鏡測(cè)量分析，以及進(jìn)行觀察得到的數(shù)據(jù)的存儲(chǔ)和計(jì)算機(jī)化再處理。未處理的表面的分析強(qiáng)調(diào)出皮膚過(guò)早光老化的典型圖像，其特征在于存在病理性擴(kuò)張的毛細(xì)管，這些毛細(xì)管順彈性蛋白排列或者被密集的無(wú)定形物質(zhì)包圍。
在宏觀水平上，處理產(chǎn)生了皮膚張力和外觀的總體改善。
特別地，毛細(xì)管顯微鏡檢查分析強(qiáng)調(diào)出毛細(xì)血管形成的增加在毛發(fā)毛囊周?chē)鷧^(qū)域是特別明顯的。通過(guò)毛細(xì)管顯微鏡測(cè)量來(lái)比較用正在研究的組合物處理或未用正在研究的組合物處理的表面的毛囊周?chē)鷧^(qū)域，其結(jié)果強(qiáng)調(diào)出每mm2的血管數(shù)量有大約35.0％的增加。由于知道毛囊血管形成的增加刺激其生長(zhǎng)，因此此處所報(bào)告的數(shù)據(jù)證明用PLGF-1進(jìn)行局部處理不只對(duì)于抗皮膚老化有效，而且也促進(jìn)毛細(xì)管/毛發(fā)的生長(zhǎng)。
權(quán)利要求
1.1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)在制備藥物中的應(yīng)用，該藥物在預(yù)防性或治愈性治療涉及皮膚、皮下或內(nèi)臟結(jié)締組織和/或血管系統(tǒng)的疾病或病理變化中可促進(jìn)血管生成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)的應(yīng)用，其中所述疾病為硬皮病。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)的應(yīng)用，其中所述疾病為局限性硬皮病或進(jìn)行性全身性硬皮病。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)的應(yīng)用，其中局限性硬皮病為皮膚硬皮病，和進(jìn)行性全身性硬皮病為心肌硬皮病。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)的應(yīng)用，其中病理變化為由于暴露于空氣侵襲性試劑或延長(zhǎng)的日光輻射而造成的過(guò)早皮膚老化。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)的應(yīng)用，其中病理變化為由于脫發(fā)癥、激素紊亂、化療、放療或藥物施用所造成的脫發(fā)。
7.1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)在預(yù)防和美容性治療自然皮膚老化中作為皮膚或皮下血管生成促進(jìn)劑的應(yīng)用。
8.1型胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF-1)在預(yù)防和美容性治療自然脫發(fā)中作為毛囊周?chē)苌纱龠M(jìn)劑的應(yīng)用。
9.根據(jù)權(quán)利要求1-6中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中藥物以適合于產(chǎn)生區(qū)域性或全身性效用的形式存在。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中藥物配制為用于腸胃外、局部施用或者用于皮下植入物。
11.根據(jù)權(quán)利要求9所述的應(yīng)用，其中全身性效用是通過(guò)靜脈內(nèi)施用而獲得的，區(qū)域性效用是通過(guò)肌肉內(nèi)、關(guān)節(jié)內(nèi)、皮下、局部施用或者通過(guò)皮下植入物或離子電泳而獲得的。
12.根據(jù)權(quán)利要求7或8中任何一項(xiàng)所述的應(yīng)用，其中將PLGF-1配制成用于局部施用的化妝品組合物。
13.含有PLGF-1作為主要活性成分以及藥物或化妝品上可用的賦形劑的藥物或化妝品組合物，其特征在于至少98.5％的PLGF-1以活性二聚體和多聚體形式存在、至少70％以二聚體形式存在和不多于1.5％以單體形式存在。
14.根據(jù)權(quán)利要求13所述的藥物組合物，其特征在于該藥物組合物用于局部使用并以溶液、洗液、W/O乳濁液、O/W乳濁液、懸浮液、脂質(zhì)體懸浮液、凝膠、霜?jiǎng)⒑齽?、軟膏或皮下植入物形式存在?br> 15.根據(jù)權(quán)利要求13所述的化妝品組合物，其特征在于該化妝品組合物用于局部使用并以溶液、洗液、W/O乳濁液、O/W乳濁液、懸浮液、脂質(zhì)體懸浮液、凝膠、軟膏、霜?jiǎng)┗蚝齽┬问酱嬖凇?br> 16.根據(jù)權(quán)利要求13-15中任何一項(xiàng)所述的組合物，其含有一種或多種能夠使活性二聚體-多聚體形式的PLGF-1穩(wěn)定的物質(zhì)。
17.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項(xiàng)所述的組合物，其含有一定數(shù)量的PLGF-1，該數(shù)量適合于1mcg/kg/天-500mcg/kg/天的施用，優(yōu)選為10mcg/kg/天-200mcg/kg/天。
18.根據(jù)權(quán)利要求13-16中任何一項(xiàng)所述的組合物，其含有一定數(shù)量的PLGF-1，該數(shù)量適合于1mcg/kg/天-500mcg/kg/天的施用，優(yōu)選為10mcg/kg/天-200mcg/kg/天。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有胎盤(pán)生長(zhǎng)因子(PLGF)的治療和化妝品組合物的制備，其能夠增加皮膚、皮下和內(nèi)臟結(jié)締組織的血管生成。這樣的組合物適合用于通過(guò)皮膚層新血管的形成或再生而治療病理或自然狀態(tài)，例如硬皮病、其各種征候、皮膚老化或脫發(fā)。
文檔編號(hào)A61K38/00GK1638793SQ03805153
公開(kāi)日2005年7月13日 申請(qǐng)日期2003年3月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月5日
發(fā)明者D·瑪格萊恩, M·巴緹斯特, E·坎緹, G·薩爾維亞, M·圖茨 申請(qǐng)人:蓋莫納股份公司