專利名稱：治療乙型肝炎的藥物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及到一種由天然植物藥材中提取的單體成份，尤其是對乙型肝炎有治療作用的由該單體成份制成的藥物。
背景技術(shù)：
乙型肝炎是一種常見疾病，其對人類的危害是眾所周知的，許多研究者對治療乙型肝炎的藥物做了大量的研究，也有許多藥物及藥物組合物進(jìn)行了公開報道。但是用三七總皂甙提取單體作為有效活性成份用于治療乙型肝炎的藥物尚未見報道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的旨在提供一種用人參皂甙Rg1為唯一活性藥用成份輔以藥用輔料制成的治療乙型肝炎的藥物。
本發(fā)明所述的治療乙型肝炎的藥物由以下成分組成重量百分比為50-99％的人參皂甙Rg1和余量的藥用輔料。
上述人參皂甙Rg1的含量范圍還可為60-99％，Rg1的純度為90％以上。
本發(fā)明的藥物含有治療有效量的人參皂甙Rg1為活性成分，以及含有一種或多種藥學(xué)上可接受的載體。
上述的藥學(xué)上可接受的載體是指藥學(xué)領(lǐng)域常規(guī)的藥物載體。
本發(fā)明的藥物可按已知方法制成的口服片劑、軟膠囊、硬膠囊、顆粒劑或口服液體制劑、水針劑、緩釋、控釋劑等制劑。例如使活性成分與一種或多種載體混合，然后將其制成所需的劑型。
本發(fā)明藥物的施用量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴(yán)重程度等變化，其日劑量可以是50-500mg。
本發(fā)明藥物主要用于乙型肝炎的治療。
本發(fā)明所述藥物的動物急性試驗(yàn)小鼠在24小時內(nèi)灌胃給藥3次，每次0.8ml/20g(120ml/，7200mg/kg)，，按體重計算，相當(dāng)于人用劑量(每日90mg/60kg)的4800倍，無毒性反應(yīng)。小鼠在24小時內(nèi)腹腔注射給藥3次，每次0.4ml/20g(60ml/kg，3600mg/kg，按體重計算，相當(dāng)于人用劑量(每日90mg/60kg)r的2400倍，無毒性反應(yīng)。
本發(fā)明所述藥物的鴨乙型肝炎動物模型的藥物抑制試驗(yàn)一、實(shí)驗(yàn)動物實(shí)驗(yàn)動物為江浙地區(qū)特有的鴨禽種系麻鴨，經(jīng)篩選確認(rèn)為垂直傳播感染、DHBV DNA檢測陽性的麻鴨，本實(shí)驗(yàn)動物模型經(jīng)國家“六五”肝炎攻關(guān)課題確立、實(shí)驗(yàn)動物為上海市醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物委員會認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)選用十月齡雌性麻鴨，體重范圍為900-1100克。
二、受試藥物本發(fā)明所述藥物，每片含60mg，由云南特安吶制藥股份有限公司提供。
三、陽性對照藥物賀普丁片，每片含拉米夫定100mg，由英國葛蘭素威康藥業(yè)有限公司研制和生產(chǎn)。該品是目前國內(nèi)外公認(rèn)并得到美國FDA和我國衛(wèi)生部認(rèn)可的唯一抗乙肝病毒有效藥物，所以可以作為本發(fā)明所述藥物的陽性對照藥物。
四、受試藥的劑量選擇和給藥方法口服途徑給藥，用于觀察本發(fā)明所述藥物抗乙肝病毒作用及改善鴨肝病理炎癥的作用。
參考人和動物間體重和體表面積等效劑量比率折算，確定試驗(yàn)中本發(fā)明所述藥物的給藥劑量為20mg/kg、40mg/kg和80mg/kg，因給藥周期較長，故采用隔日給藥一次以減少喂飼操作的刺激。實(shí)際每次給藥量是60mg/kg、120mg/kg和240mg/kg。
五、試驗(yàn)分組本發(fā)明所述藥物分為低、中、高三個劑量組，劑量分別為60mg/kg、120mg/kg和240mg/kg。均為口服途徑給藥，每周三次給藥，連續(xù)給藥12周。
賀普丁陽性對照組，劑量100mg/kg，亦為口服途徑給藥，每周三次給藥，連續(xù)給藥12周。
此外，實(shí)驗(yàn)又設(shè)DHBV DNA(+)和(-)兩個對照組。
六、觀察指標(biāo)實(shí)驗(yàn)組和對照組的麻鴨分別在給藥前、給藥后第四周、第八周、第十二周和停藥后第二周時靜脈采血，作血清的DHBV DNA水平的定量PCR檢測。在停藥后兩周，各組麻鴨同時放血處死取肝臟，福爾馬林固定液固定和2.5％戊二醛固定液保存，分別作鴨肝常規(guī)病理和電鏡檢查。
七、結(jié)果1、各組麻鴨血清DHBV DNA含量變化從表1中半定量數(shù)據(jù)可見，本發(fā)明所述藥物不同劑量組麻鴨血清DHBVDNA含量在用藥后均有5-9只麻鴨出現(xiàn)DHBV DNA水平下降，各組DHBV DNA平均含量分別下降32.65％(高劑量240mg/kg組)、20.71％(中劑量120mg/kg組)和51.56％(低劑量60mg/kg組)，實(shí)驗(yàn)觀察中本發(fā)明所述藥物低、中劑量組各有1只動物血清出現(xiàn)DHBV DNA轉(zhuǎn)陰，并且各有一只持續(xù)轉(zhuǎn)陰至停藥觀察結(jié)束。
以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示本發(fā)明所述藥物有較好的抗病毒作用，可抑制鴨乙肝病毒DNA的復(fù)制，降低血清DHBV DNA含量。
同時發(fā)現(xiàn)，血清DNA含量在本發(fā)明所述藥物停藥后第2周時仍能基本維持于停藥時水平，未見某些藥物(如膦甲酸鈉和阿昔洛韋)所常見的停藥后“反跳”或回升現(xiàn)象，表明本發(fā)明所述藥物有較好的持續(xù)抗病毒復(fù)制作用。
本實(shí)驗(yàn)中，DHBV DNA(+)組麻鴨的血清DHBV DNA含量雖略有變化，但與藥物組的變化相比有明顯差別，實(shí)驗(yàn)前后的變化經(jīng)統(tǒng)計學(xué)檢驗(yàn)無顯著性意義。在陽性藥物對照組可見賀普丁有明顯的抗病毒作用。
2、各組麻鴨病理檢查結(jié)果a、各組光鏡病理檢查結(jié)果見表2和表3。
光鏡下DHBV(+)實(shí)驗(yàn)對照組，麻鴨肝組織炎性變化介于“±～+++”之間，平均加權(quán)為1.1818，出現(xiàn)較明顯炎癥改變，類似慢性遷延性肝炎的變化，主要表現(xiàn)為肝組織匯管區(qū)炎癥和小葉實(shí)質(zhì)炎癥明顯，肝細(xì)胞腫脹顯著，竇細(xì)胞活躍，匯管區(qū)膽管增生，并有明顯脂肪性變。賀普丁陽性對照組與病毒陽性對照組有一定差異，其觀察數(shù)據(jù)比病毒陰性的對照組的還低，說明該有效藥物同時能改善一般炎癥，從表3結(jié)果對比中可見，藥物對病理炎癥改善的有效度由高到低依次為本藥物高劑量組、中劑量組、低劑量組。
相對而言，病理觀察發(fā)現(xiàn)，本藥物有較好的藥物療效，其中高劑量組比有效藥物賀普要對照組的稍好。
b、各組電鏡觀察結(jié)果DHBV DNA(-)對照組肝細(xì)胞排列整齊，核圓，有核仁。胞質(zhì)中有線粒體，個別有輕度腫脹。粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，糖元聚集大片，有較多脂滴。膽小管可見，結(jié)構(gòu)好，附近有髓樣小體。血竇結(jié)構(gòu)完整，竇壁有枯氏細(xì)胞，腔中有紅細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等。
DHBV DNA(+)對照組肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)尚好，排列整齊，核卵圓或有輕度變形，核仁明顯。胞質(zhì)中有線粒體，少數(shù)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輕度腫脹，糖元聚集，但有的切片也見糖元丟失，并見大量脂滴。膽小管結(jié)構(gòu)好，微絨毛豐富，附近有脂褐素顆粒，血竇壁完整，有枯氏細(xì)胞，其中含吞噬體，腔內(nèi)有紅細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，也可見淋巴細(xì)胞向肝細(xì)胞浸潤，并侵入肝細(xì)胞的現(xiàn)象，儲脂細(xì)胞可見，但不多。
陽性藥物賀布丁對照組肝細(xì)胞排列整齊，核圓，有核仁，胞質(zhì)中有線粒體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，糖元聚集成片但有掛失現(xiàn)象，脂滴多，有些很大，膽小管結(jié)構(gòu)好，其中一例有擴(kuò)張。血竇壁完整，有一例有儲脂細(xì)胞，竇上枯氏細(xì)胞較多，有吞噬體，腔內(nèi)有淋巴等細(xì)胞，并見淋巴細(xì)胞向肝細(xì)胞浸潤。
本藥物低劑量組肝細(xì)胞核園有核仁，線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)豐富，糖元聚集，有的有丟失現(xiàn)象。脂滴特大、核呈新月形。肝細(xì)胞間膽小管有不同程度擴(kuò)張，有的結(jié)構(gòu)尚好。血竇壁完整，枯氏細(xì)胞可見成不同程度的活躍狀態(tài)。血竇中可見淋巴細(xì)胞，有向肝細(xì)胞浸潤。
本藥物中劑量組肝細(xì)胞園核有核仁，部分結(jié)構(gòu)好，線粒體有不同程度的腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和糖元豐富，糖元可見有丟失，脂滴較少。肝細(xì)胞間膽小管結(jié)構(gòu)好，血竇壁完整，少量枯氏細(xì)胞，不活躍，未見有淋巴細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤現(xiàn)象。
本藥物高劑量組肝細(xì)胞排列尚好，核園有核仁，胞質(zhì)中有線粒體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有不同程度腫脹和擴(kuò)張，糖元也有丟失，脂滴量少至中等。膽小管一般尚可。血竇壁完整，有少量枯氏細(xì)胞，其中有吞噬體，但不活躍，細(xì)胞間有淋巴浸潤，但數(shù)量不多。
本發(fā)明所述藥物對四氯化碳、脂多糖/D-半乳糖胺所致小鼠肝炎的影響一、試驗(yàn)藥物本發(fā)明所述藥物，含量為15mg/片。
陽性對照藥乙肝寧沖劑，長沙九芝堂生產(chǎn)。
二、試驗(yàn)動物，ICR小鼠22±4g，7-8周齡，雌雄兼用，購于云南省天然藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。
三、試驗(yàn)方法將小鼠隨機(jī)分為常水組，乙肝寧沖劑組及本發(fā)明所述藥物30mg/kg、90mg/kg、180mg/kg共五組。一天一次連續(xù)灌胃給藥7天，于灌胃第6天時ip0.1％CCl4(10ml/kg)和LPS(lug/kg)D-GalN(700mg/kg)，24小時后摘眼球取血，分離血清，分別用ALT和AST測定試劑盒測定血清中的ALT和AST活性；并處死小鼠取其肝臟進(jìn)行病理組織學(xué)觀察。計量資料采用成組t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。
四、結(jié)果1、本發(fā)明所述藥物對四氯化碳肝炎模型小鼠肝功能的影響由表4可見，與常水組相比，本發(fā)明所述藥物各劑量組和乙肝寧沖劑組小鼠血清ALT水平均明顯下降，本發(fā)明所述藥物90mg/kg，180mg/kg還明顯降低小鼠血清AST水平，其中以中劑量(90mg/kg)組的降酶作用最為顯著。病理組織切片發(fā)現(xiàn)，常水對照組的小鼠肝細(xì)胞出現(xiàn)出血性片狀、灶狀壞死，肝間質(zhì)充血明顯，而給藥組小鼠出血性壞死數(shù)目減少，出血性壞死程度明顯減輕，但仍可見到間質(zhì)充血。
2、本發(fā)明所述藥物對脂多糖D-半乳糖胺所致小鼠肝功能及小鼠死亡率的影響表5表明，本發(fā)明所述藥物各劑量組和乙肝寧沖劑組小鼠血清ALT水平明顯低于常水對照組，本發(fā)明所述藥物90mg/kg，180mg/kg還明顯降低小鼠血清AST活性。由表6可見，常水對照組小鼠的死亡率為54％，而乙肝寧沖劑組和本發(fā)明所述藥物低、中、高劑量組小鼠死亡率分別為28％，32％，25％和18％均較常水對照組死亡率低。病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組肝細(xì)胞片狀及灶狀壞死的數(shù)目，肝間質(zhì)充血、出血的程度較常水對照組輕。
五、結(jié)論本發(fā)明所述藥物30mg/kg，90mg/kg，180mg/kg均可明顯降低CCI4和LPS/GalN引起的兩種肝炎模型小鼠血清ALT活性升高；90mg/kg，180mg/kg還可明顯降低兩種肝炎模型小鼠AST血清含量；病理組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，給藥組小鼠肝損傷程度明顯降低。此外，本發(fā)明所述藥物各劑量組均使LPS/GalN所致小鼠死亡率降低。提示本藥物對CCI4和LPS/GalN所致肝炎有良好的防治作用。
表1為各給藥組麻鴨血清DHBV DNA含量測定結(jié)果。
表2為光鏡下肝炎病理分級標(biāo)準(zhǔn)。
表3為光鏡下實(shí)驗(yàn)組和對照組鴨肝并理炎癥變化比較。
表4為本發(fā)明所述藥物對四氯化碳所致小鼠肝炎血清ALT和AST的影響。
表5為本發(fā)明所述藥物對脂多糖/D-半乳糖胺所致小鼠肝炎血清ALT和AST的影響。
表6為本發(fā)明所述藥物對脂多糖/D-半乳糖胺所致壞死性肝炎小鼠死亡率的影響。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1取重量百分比為90％、純度為90％的人參皂甙Rg1和余量的常用口服片劑藥用輔料，按照片劑常規(guī)制造工藝制得人參皂甙Rg1口服片劑。
實(shí)施例2取重量百分比為70％、純度為90％的人參皂甙Rg1和余量的基質(zhì)PEG-6000，將人參皂甙Rg1和基質(zhì)混合置于容器中，加熱至80-95℃，攪拌混合均勻，保溫80-90℃過濾，溶液置于滴丸機(jī)中，根據(jù)丸重大小要求，裝好尺寸相應(yīng)的滴頭，控制冷卻液溫度在15℃以下，滴距4-8cm滴制，得到滴丸。
本藥物 采血時間片劑劑量P值**(mg/KG)給藥前 給藥后第4周 第8周 第12周 停藥后2周A1+++ +++ +++ ++++++A2+++ ++ +++++A3+++++++ ++++ ++++ ++++A4+++++++ ++++ ++++ ++++A5++++++++++ 死亡P＜0.0560mg/kg A6+++++++ ++ +++++A7+++++-+++++A8++++++ ++ +++++++A9+++ +++ ++ +A10 + --- -A11 ++++++ +++ ++++ ++A12 +++++++ +++ ++ +B1++++++++ +++ ++++ ++++B2++ ++ +++ ++++ ++++B3+++ +++ ++ ++++++B4+++ ++++ +B5+++ ++ -- + P＜0.05120mg/kg B6+++ +++ ++++++++B7++++++++ ++++++B8+++ ++ ++ ++ ++B9+++ +++ +++ + +B10 +++ +++ +++++++B11 ++++++ ++++ ++++++B12 ++ --- -表1
本藥物 采血時間片劑劑量 P值**(mg/kg)給藥前 給藥后第4周 第8周 第12周 停藥后2周C1++++++++ +++ +++C2+++ +++ +++ +++C3+++ +++ +++ +++ +++C4+++++++ ++++++++++++C5+++++++ ++ ++ ++240mg/kg C6+++ ++ ++ ++P＜0.05C7+++ +++ ++ + +C8+ ++ ++ +C9+++ +++ +++ +++ +++C10 +++ ++ +++ +++ +++C11 ++++++ ++ + +++C12 ++ +++ ++ ++D1++++++++ ++++++++++++D2++++++++ +++++++ ++++D3++++++++ +++ +++ +++D4+++ +++ +++ +++ +++DHBV(+) D5++++++++ +++ ++++++++ P＞0.05對照組 D6++++++++ +++ +++ +++D7+++ +++ +++ +++ +++D8++++++++ ++++++++++++D9++++++++ ++++死亡D10 ++ ++ ++ ++ ++++D11 ++++++++ ++++++++++++D12 ++++++ +++ +++++++*表中++++相當(dāng)于DHBV DNA含量為100pg；+++為50pg；++為25pg；+為10pg。
**表列數(shù)據(jù)經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后作自身前后比較的方差分析，用藥前后有顯著性差異表1
采血時間組別 P值**給藥前 給藥后第4周 第8周 第12周 停藥后2周E1 - -- - -E2 - -- - -E3 - -- - -E4 - -- - -DHBV(-) E5 - -- - - P＞0.05對照組 E6 - -- - -E7 - -- - -E8 - -- - -E9 - -- - -E10 - -- - -E11 - -- - -E12 - -- - -F1 +++ ++ + + ++F2 +++ +++ + +++F3 +++ ++ + + +++F4 +++++++ +++ +++賀普丁 F5 ++ +++ ++ +++P＜0.01陽 性 F6 ++ +++ + +++對照組 F7 +++ ++ + +++ ++++100mg/kg F8 ++++-+| + +F9 ++ -- + ++F10 +++++++ ++ ++F11 ++++-+ ++ ++++F12 ++++++ ++ +++*表中++++相當(dāng)于DHBV DNA含量為100pg；+++為50pg；++為25pg；+為10pg。
**表列數(shù)據(jù)經(jīng)自然對數(shù)轉(zhuǎn)換后作自身前后比較的方差分析，用藥前后有顯著性差異表1
分匯 管 區(qū)肝細(xì)胞小葉實(shí)質(zhì) 界板破壞 纖維及小 肝細(xì)胞 肝細(xì)胞級炎細(xì)胞浸潤胞 漿炎癥碎屑樣壞死膽管增生 脂肪變性 空泡變0+/- 少量 略疏松少量個別小灶+中等 疏松 偶有點(diǎn)狀壞死 輕微 25％以下少量嗜酸性小體++多量，擴(kuò)展疏松 巨灶性壞死 局限性 增生，向小葉 50％以下中等空泡 伴炎性浸潤內(nèi)伸展+++ 大量，擴(kuò)大疏松 散在多量灶 多處 向小葉放射伸 75％以下大量延伸 大量空泡 性壞死 展，微膽總管顯增多表2各組病理炎癥變化分級 總 加權(quán)脂肪變組 別 0.25 0.5 0.75 1.0 1.50 2.0 2.50例 平均 (例)0～+ +- +-～+ + +～++ ++ ++～+++病毒(-)對照組 5 4 3 12 0.70838病毒(+)對照組 2 4 1 1 21 12 1.18187陽性藥物對照組7 4 1 12 0.62508七生力片劑(低)5 2 211 12 0.95457七生力片劑(中) 2 7 2 2 1 12 0.79178七生力片劑(高)8 412 0.58336表3
(X±SD，n＝10)組 別ALT AST(U/L) (U/L)低劑量組(30mg/kg) 576.55±130.03*542.21±76.36中劑量組(90mg/kg) 367.08±152.77***377.91±126.40**高劑量組(180mg/kg) 397.52±156.01**360.78±129.92**常水對照組 729.23±173.12 677.07±246.68乙肝寧沖劑組(17g/kg) 380.82±159.87***398.74±145.24***P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，vs常水對照組表4(X±SD，n＝10)組別 ALT AST(U/L) (U/L)低劑量組(30mg/kg) 535.85±368.11*671.62±279.69中劑量組(90mg/kg) 441.22±183.97***495.28±125.50***高劑量組(180mg/kg)488.68±297.64**538.28±346.39*常水對照組862.99±248.04 903.14±298.78乙肝寧沖劑組(17g/kg) 511.55±286.35**597.50±231.43**P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001，vs常水對照組表5組 別 死亡只數(shù) 死亡率％低劑量組(30mg/kg) 9 32％中劑量組(90mg/kg) 7 25％高劑量組(180mg/kg) 5 18％常水對照組 15 54％乙肝寧沖劑組(17g/kg)18 28％表權(quán)利要求
1.一種治療乙型肝炎的藥物，其特征在于由以下成分組成重量百分比為50-99％的人參皂甙Rg1和余量的藥用輔料。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療乙型肝炎的藥物，其特征在于所述的人參皂甙Rg1的含量范圍為60-99％。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療乙型肝炎的藥物，其特征在于所述的人參皂甙Rg1的純度為90％以上。
全文摘要
本發(fā)明涉及到一種由天然植物藥材中提取的單體成分，尤其是對乙型肝炎有治療作用的由該單體成分制成的藥物。一種治療乙型肝炎的藥物，由以下成分組成重量百分比為50－99％的人參皂甙Rg
文檔編號A61K31/704GK1565463SQ0314880
公開日2005年1月19日 申請日期2003年6月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年6月12日
發(fā)明者唐修文 申請人:唐修文