專利名稱：藥學(xué)上穩(wěn)定的止血組合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及含血漿蛋白的新型止血組合物及其藥物制劑。更具體而言，本發(fā)明涉及治療藥物，其包含在單個(gè)容器中的活化凝血因子VII(下文也稱作“FVIIa”)和凝血因子X(jué)(下文也稱作“FX”)混合溶液。
背景技術(shù)：
通過(guò)采用活化凝血酶原復(fù)合體濃縮物(APCC)或重組的活化凝血因子VII(rFVIIa)，已可控制具有抑制劑的血友病患者的止血。但是，在這些試劑中，前一試劑就安全性而言不能令人滿意，而后一試劑就效力而言不能令人滿意。為了克服這些缺陷，本發(fā)明人在日本專利公開(kāi)No.2001-181204(日本專利申請(qǐng)No.368122/1999)公開(kāi)了包含F(xiàn)VIIa和FX的藥物組合物可用作止血?jiǎng)?br> 包含蛋白活性成分的止血處理用藥物組合物非常適宜以適合經(jīng)由含所述組合物的容器施用的劑型靜脈內(nèi)給藥，所述容器如為安瓿、注射器或小瓶。更普遍而言，使用一組兩個(gè)容器，其中一個(gè)含凍干蛋白，另一個(gè)含用于溶解所述凍干蛋白的溶液。凝血因子相關(guān)蛋白的濃縮物已被配制成藥物制劑，所述蛋白由血漿制得或使用遺傳重組技術(shù)制得，其中所述藥物制劑中大部分是以一凍干蛋白粉末和溶解用溶液組提供的。

發(fā)明內(nèi)容
有兩種方式可用于設(shè)計(jì)含F(xiàn)VIIa和FX的制劑劑型。一種方式是在分開(kāi)的容器中各自提供FVIIa和FX，而另一種方式是在單個(gè)容器中提供FVIIa和FX的混合物。按照后一方式，將使用單一的兩種蛋白質(zhì)凍干粉末混合物和溶解用溶液組，因此共需要兩個(gè)容器。另一方面，前一方式將需要為兩種蛋白質(zhì)中每一種提供獨(dú)立的蛋白凍干粉末和溶解用溶液組，因此共需要四個(gè)容器。此外，在前一方式中，需要額外的將溶解用溶液移入蛋白凍干粉末容器中的裝置或操作。在這點(diǎn)上，就方便性而言，前一方式是不利的。因此，如果可將FVIIa和FX混在一起容納在單個(gè)容器中，就可得到既具藥理有效性又具制藥便利性的藥物制劑。
如

圖1所示，F(xiàn)VIIa和FX作為酶和底物相互關(guān)聯(lián)。在生理?xiàng)l件下，在磷脂和Ca2+存在下，F(xiàn)VIIa與血管損傷處存在的組織因子形成復(fù)合體，以活化FX。所得活化FX(FXa)引發(fā)后續(xù)酶促反應(yīng)，通過(guò)形成不溶性血纖蛋白導(dǎo)致最終止血。當(dāng)在血管損傷處局部出血時(shí)產(chǎn)生FXa，F(xiàn)Xa實(shí)際是具有止血作用的有效因子。但是，據(jù)報(bào)道，當(dāng)過(guò)量FXa存在于循環(huán)系統(tǒng)中時(shí)，F(xiàn)Xa可能引致全身性高凝固性(British Journal ofHaematology 69491-497(1988))。有人提出FXa也可經(jīng)由活化血管內(nèi)皮細(xì)胞或系膜細(xì)胞(mesangial cell)參與引致炎癥(Proc.Natl.Sci.USA 975255-5260(2000)；J.Am.Soc.Nephrol.12891-899(2001))。
當(dāng)FX和FVIIa蛋白均以高濃度存在時(shí)，不能對(duì)FVIIa水解FX產(chǎn)生FXa進(jìn)行調(diào)節(jié)，由此產(chǎn)生大量FXa。此外，所得FXa可水解FVIIa作為底物，由此使FVIIa失活(Journal of Biological Chemistry 2487729-7741(1973))。因而，提供在穩(wěn)定溶液中的FX和FVIIa的混合物是極其困難的。在這樣一種不穩(wěn)定狀態(tài)下，所述混合物不能配制成藥物制劑，也不能對(duì)患者給藥。
迄今為止，由于沒(méi)有建立能克服上述問(wèn)題的技術(shù)，尚沒(méi)有任何已知的在單個(gè)容器中容納有酶和其底物混合物的制劑，其中所述酶和其底物均是經(jīng)純化和制備得到的。
在這種情況下，本發(fā)明人進(jìn)行了認(rèn)真的研究以開(kāi)發(fā)一種劑型，其中在單個(gè)容器中酶FVIIa和其底物FX混在一起。結(jié)果，本發(fā)明人出乎意料地發(fā)現(xiàn)了穩(wěn)定包含所述酶和其底物混合物的混合組合物及其藥物組合物的制備方法，并且基于該發(fā)現(xiàn)完成了本發(fā)明。
也就是說(shuō)，本發(fā)明提供了包含在單個(gè)容器中的FVIIa和FX的液態(tài)組合物，其中FVIIa與FX在5.0-6.5的酸性pH值下混合，該pH值處于FVIIa的最佳pH范圍6.5-10.0之外，本發(fā)明還提供了用作止血藥物的所述組合物的凍干制劑。
本發(fā)明涉及包含F(xiàn)VIIa和FX混合物的液態(tài)組合物，以及所述組合物的凍干制劑。本發(fā)明的主要技術(shù)特征在于將所述液態(tài)組合物控制在特定的酸性pH范圍。為此目的，可在本發(fā)明中使用任何緩沖劑溶液，使之能夠?qū)⑺鲆簯B(tài)組合物控制在特定的酸性pH范圍?？刹捎玫氖纠跃彌_劑溶液包括如乙酸鹽緩沖劑、酒石酸鹽緩沖劑、檸檬酸鹽緩沖劑等。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示由內(nèi)部和外部?jī)煞N路徑構(gòu)成的凝血級(jí)聯(lián)。
圖2顯示在幾種pH值下包含F(xiàn)VIIa和FX混合物的本發(fā)明液態(tài)組合物中(如果有的話)產(chǎn)生的FXa水平。
圖3顯示在凍干前和后，在幾種pH值下包含F(xiàn)VIIa和FX混合物的本發(fā)明凍干制劑中(如果有的話)產(chǎn)生的FXa水平。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在pH為5.0-10.0下，可適當(dāng)?shù)刂苽渚彌_劑。在較此范圍更加酸性的pH下，溶液中FVIIa和/或FX的穩(wěn)定性受損，其中FVIIa和/或FX逐漸失活。在較此范圍更加堿性的pH下，溶液中FVIIa和/或FX的穩(wěn)定性也是不足的，因而蛋白質(zhì)逐漸失活。而在6.5-10.0的pH下，由FVIIa將底物FX轉(zhuǎn)化成FXa。因此，可以使用5.0-6.5、優(yōu)選5.4-6.1的pH，由此不會(huì)損害各組分的活性或者將FX轉(zhuǎn)化成FXa。
用于本發(fā)明的FVIIa和FX可通過(guò)任何已知方法制備，例如，通過(guò)從人血中分離得到，或通過(guò)遺傳重組技術(shù)得到。
FVIIa可通過(guò)文獻(xiàn)中公開(kāi)的已知方法由血制備得到，這些文獻(xiàn)包括如日本專利公開(kāi)No.155797/1991、日本專利公開(kāi)No.059866/1998和日本專利公開(kāi)No.059867/1998。或者，F(xiàn)VIIa也可通過(guò)如下方式制備通過(guò)冷融人新鮮冷凍血漿并離心除去冷沉淀物(cryoprecipitate)制得貧含冷沉淀物血漿(cryo-poor plasma)，將貧含冷沉淀物血漿采用陰離子交換層析得到粗制FVII，將粗制FVII經(jīng)固定化抗FVII單克隆抗體親合柱層析純化，然后用其他血漿蛋白如活化凝血因子X(jué)II或者FXa活化FVII。為確保安全，所得FVIIa優(yōu)選含有盡可能少的凝血酶原、凝血酶、FIX和FIXa。
FX可通過(guò)如下方式制備通過(guò)冷融人新鮮冷凍血漿并離心除去冷沉淀物制得貧含冷沉淀物血漿，將貧含冷沉淀物血漿采用陰離子交換層析得到粗制FX，然后將粗制FX經(jīng)固定化抗FX單克隆抗體親合柱層析純化。類似于FVIIa的情況，為確保安全，所得FX優(yōu)選含有盡可能少的凝血酶原、凝血酶、FIX和FIXa。
本發(fā)明的液態(tài)組合物可適宜包含1-20μM的FVIIa和5-400μM的FX。在優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的液態(tài)組合物可另外包含0.001-1重量％的非離子表面活性劑和不低于0.01重量％的一種或多種選自白蛋白、糖和氨基酸的化合物，以便使所述組合物具有儲(chǔ)存穩(wěn)定性以及萬(wàn)一所述液態(tài)組合物被凍干，在復(fù)原時(shí)易于溶解。
本發(fā)明的組合物或止血制劑可對(duì)任何患有各種止血障礙和顯示出血傾向的患者給藥。
本發(fā)明提供了具有改善的安全性、有效性和便利性的新型止血制劑。
通過(guò)下面的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更詳細(xì)描述，但這些實(shí)施例在任何情況下都不意在限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1為研究緩沖溶液中FVIIa/FX混合物的穩(wěn)定性，在規(guī)定pH的緩沖溶液(不含CaCl2的MES緩沖劑100mM MES，100mM NaCl)中將0.4mg/mLFVIIa和1.0mg/mL FX混在一起，混合物在37℃溫育。在每一規(guī)定時(shí)間測(cè)量樣品中FVIIa、FX和FXa各自的活性，該測(cè)量在其中上述各因子不彼此影響的系統(tǒng)中進(jìn)行。此處所用FVIIa是如日本專利公開(kāi)155797/1991所述方式制得的血液制品。
作為結(jié)果，在測(cè)試的緩沖劑每一pH值下溫育24小時(shí)后，F(xiàn)VIIa和FX都保留大于90％的活性。FXa含量基于其對(duì)一合成底物(S2222)的特異性水解活性來(lái)計(jì)算，F(xiàn)Xa含量對(duì)FX的摩爾比如圖2所示。在pH5.6和6.0的緩沖劑中沒(méi)有觀察到FXa含量增加，而在pH7.0和8.0的緩沖劑中測(cè)出FXa含量顯著增加。
實(shí)施例2為研究?jī)龈芍缶彌_溶液中FVIIa/FX混合物的穩(wěn)定性，在規(guī)定pH的緩沖溶液(不含CaCl2的檸檬酸鹽緩沖劑10mM檸檬酸鈉、120mMNaCl、0.5％甘氨酸、2％白蛋白和50ppm Tween 80)中將0.4mg/mLFVIIa和1.0mg/mL FX混在一起，以便制備凍干的母料。如實(shí)施例1所述，此處所用FVIIa是如日本專利公開(kāi)155797/1991所述方式制得的血液制品。
在凍干前后，如實(shí)施例1所述測(cè)量各因子的活性，F(xiàn)Xa含量如圖3所示。作為結(jié)果，在測(cè)試的緩沖劑每一pH值下，在凍干之前和之后，F(xiàn)VIIa和FX均保留大于80％的活性。在pH5.5和6.0的緩沖劑中沒(méi)有觀察到FXa含量增加，而在pH7.0的緩沖劑中測(cè)出FXa含量顯著增加。
權(quán)利要求
1.藥學(xué)上穩(wěn)定的止血液態(tài)組合物，其包含在單個(gè)容器中的活化的凝血因子VII(FVIIa)和凝血因子X(jué)(FX)的混合溶液。
2.權(quán)利要求1的止血組合物，其中所述混合溶液具有5.0-6.5的pH值。
3.權(quán)利要求1或2的止血液態(tài)組合物，其中所述組合物包含1-20μM的FVIIa和5-400μM的FX。
4.凍干的止血藥物制劑，其通過(guò)凍干權(quán)利要求1-3任一項(xiàng)所述的止血液態(tài)組合物而制得。
5.穩(wěn)定液態(tài)組合物的方法，所述液態(tài)組合物包含在單個(gè)容器中的FVIIa和FX的混合溶液，所述方法包括將所述液態(tài)組合物維持在5.0-6.5的pH值。
全文摘要
本申請(qǐng)?zhí)峁┝诵滦椭寡M合物或止血制劑。提供了藥學(xué)上穩(wěn)定的溶液形式止血組合物，其特征在于包含在單個(gè)容器中的混合在一起的活化凝血因子VII(FVIIa)和凝血因子X(jué)(FX)。所述混合溶液pH值維持在5.0－6.5。
文檔編號(hào)A61K9/19GK1525867SQ02813939
公開(kāi)日2004年9月1日 申請(qǐng)日期2002年7月10日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月10日
發(fā)明者荒木辰也, 友清和彥, 中富靖, K·手島, 中垣智弘, 弘, 彥 申請(qǐng)人:財(cái)團(tuán)法人化學(xué)及血清療法研究所