專利名稱：包括逆病毒表面糖蛋白的可溶復(fù)合物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及HIV感染的診斷。本發(fā)明特別講述了可溶逆病毒表面糖蛋白-(或跨膜糖蛋白-)陪伴分子(chaperone)復(fù)合物的生產(chǎn)，和陪伴分子-抗原復(fù)合物的有利用途，特別優(yōu)選根據(jù)雙抗原橋連的概念在免疫測試中檢測HIV抗體的用途，或作為免疫原的用途。本發(fā)明也公開了分別包括HIV-1 gp41的變異體或HIV-2 gp36的變異體的可溶復(fù)合物和選自陪伴分子的肽基-脯氨?；?異構(gòu)酶類的陪伴分子。同時(shí)敘述了分別在HIV-1 gp41或HIV-2 gp36的N螺旋區(qū)中包括特異氨基酸取代的變異體。
背景技術(shù)：
人免疫缺陷病毒(HIV)是獲得性免疫缺陷綜合癥(通常以它的首字母縮寫AIDS簡稱的病癥)的病因。這一病毒有兩個(gè)主要的毒株，稱為HIV-1和HIV-2。HIV現(xiàn)在已經(jīng)廣泛傳播，構(gòu)成了世界范圍的健康和財(cái)富的威脅，迫使公共健康系統(tǒng)花費(fèi)大量的經(jīng)費(fèi)診斷HIV和治療AIDS。
病毒傳播的一個(gè)途徑是感染的血液或血液產(chǎn)品的輸入。事實(shí)上，現(xiàn)在所有的工業(yè)化國家，以及許多發(fā)展中國家要求強(qiáng)制性地測試所有的血液供體防止這一病毒的進(jìn)一步傳播。盡可能可靠和快速地在感染后診斷血液中HIV感染是該領(lǐng)域中所有診斷方法的任務(wù)。
主要有三種不同的診斷方法(1)通過靈敏的核酸診斷方法如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)診斷來自血液的病毒基因組物質(zhì)，(2)檢測來自血液的病毒抗原，和(3)檢測來自體液的抗HIV的抗體。
在HIV感染的過程中，幾個(gè)診斷上獨(dú)特和診斷上相關(guān)的時(shí)期是已知的。在感染的早期，只有源于HIV的蛋白或肽是可以發(fā)現(xiàn)的(“病毒感染時(shí)期(viraemic phase)”)，還沒有抗HIV抗體存在。在隨后的時(shí)期(稱為血清轉(zhuǎn)變時(shí)期)，抗HIV抗原的抗體出現(xiàn)了，而病毒抗原的量(病毒負(fù)載)降低了。在血清轉(zhuǎn)變的早期中形成的抗體的大部分屬于免疫球蛋白M類(IgM)。后來抗HIV的免疫應(yīng)答轉(zhuǎn)到免疫球蛋白G類(IgG)，構(gòu)成了大部分的抗HIV的抗體。在進(jìn)一步的感染過程中，抗HIV抗體的水平可能降低，而體液中的病毒負(fù)載(病毒顆?；虿《究乖嬖?可以再次升高。篩選是否存在HIV感染優(yōu)選地可以利用檢測抗HIV抗原的抗體的血清學(xué)實(shí)驗(yàn)來進(jìn)行，有時(shí)也結(jié)合了HIV抗原的檢測。由于在患者中的免疫應(yīng)答在感染過程中有變化并且患者與患者之間是不同的，所以檢測屬于IgM和IgG亞類的抗HIV抗體的特別靈敏而可靠的免疫測試方法是重要的。檢測HIV感染的許多不同的途徑已經(jīng)敘述過。較早地、可靠地并且靈敏地檢測抗病毒蛋白的抗體是關(guān)鍵和十分重要的。
病毒蛋白(經(jīng)常稱為病毒抗原)可能僅僅在感染開始時(shí)和在疾病的非常晚的時(shí)期可以檢測到。所以檢測病毒抗原的實(shí)驗(yàn)如檢測p24(來自HIV-1)或p26(來自HIV-2)的實(shí)驗(yàn)(這兩個(gè)蛋白都是病毒的核心蛋白)，只能與能可靠檢測HIV感染的其他診斷方法結(jié)合使用。
三組病毒抗原在理論上是可得的，可以誘導(dǎo)宿主中抗體的形成，所以可以用作診斷方法中的抗原。它們是包被蛋白(envelope proteins，由env基因區(qū)編碼)，病毒酶或調(diào)節(jié)蛋白如逆轉(zhuǎn)錄酶或整合酶(由pol基因區(qū)編碼)和結(jié)構(gòu)核心蛋白(由gag基因區(qū)編碼)。在HIV-1和HIV-2中的病毒包被蛋白是作為多肽前體蛋白(對于HIV是gp160，對于HIV-2是gp140)合成的糖蛋白。這些高分子量前體，在合成后裂解產(chǎn)生gp120和gp41(HIV-1)或gp110和gp36(HIV-2)。更大的多肽(gp120或gp110)形成了表面亞單位，通過松弛的接觸與跨膜小多肽(gp41和gp36)結(jié)合。在許多宿主(患者)中，包被糖蛋白優(yōu)選地是抗病毒免疫應(yīng)答的靶。Ratner，L.等，Nature 313(1985)277-84已經(jīng)證明，特別是這些包被蛋白(即gp41或gp36)的跨膜在這些病毒蛋白中具有最大的免疫原潛力。
在診斷和篩選中已經(jīng)廣泛利用了HI病毒編碼的多肽的免疫測試方法如ELISA(酶聯(lián)免疫吸附測試)。病毒多肽可以直接從病毒物質(zhì)制備或利用重組DNA技術(shù)從體外或體內(nèi)表達(dá)系統(tǒng)中產(chǎn)生。這兩個(gè)抗原生產(chǎn)方法都受到幾個(gè)方面的限制。從病毒制劑產(chǎn)生的多肽可能受到活病毒或感染性遺傳物質(zhì)的污染，所以利用該物質(zhì)對人有危險(xiǎn)。重組產(chǎn)生的物質(zhì)可能受到非HIV宿主蛋白的污染，可能導(dǎo)致這樣的測試方法的特異性降低或靈敏性降低。
在抗致病原因子(如病毒致病原)的抗體的檢測中，頻繁并有利地利用了US 4,945,042中敘述的雙抗原橋連(bridge)形式的抗體檢測系統(tǒng)。根據(jù)這一橋連概念(bridge concept)的免疫測試需要利用直接或間接結(jié)合固相的抗原，和該抗原或直接或間接可檢測的容易產(chǎn)生交叉反應(yīng)的可溶抗原。被研究的抗體，如果存在，就在結(jié)合固相的抗原和已標(biāo)記的檢測抗原之間形成了橋。只有兩個(gè)抗原通過特異的抗體橋連，才產(chǎn)生陽性信號。
利用重組產(chǎn)生的gp41作為抗原檢測抗HIV抗體的幾個(gè)嘗試已被描述。重組產(chǎn)生的gp41在一些限制下可以用于檢測抗HIV抗體。這樣的gp41可以單獨(dú)利用或結(jié)合其他HIV抗原用于檢測抗HIV抗體。現(xiàn)在，獨(dú)立地可以檢測HIV抗原和/或抗HIV抗體的測試是已知的。在WO 93/21346中，敘述了同時(shí)檢測gp24抗原和HIV-1 gp41和HIV-2gp36的抗體的“組合實(shí)驗(yàn)”。在這一測試中，利用了直接包被重組產(chǎn)生的gp41的固相。
利用特別高或低的pH值在溶液中保持gp41(或gp36)的一個(gè)途徑。重組產(chǎn)生的gp41已知在pH3.0周圍和以下，或在pH11.0周圍或以上時(shí)是可溶的。
不幸的是，HIV-1 gp41和HIV-2 gp36在生理緩沖條件下基本上是不溶的。
一般來說，免疫測試是在生理pH下進(jìn)行的。由于在生理緩沖條件下它們的不溶性，在許多免疫測試中利用了直接包被到固相物質(zhì)上的逆病毒表面糖蛋白抗原。但是，在許多情況中，直接包被抗原到固相物質(zhì)上是有害的，并且導(dǎo)致一些缺點(diǎn)，如構(gòu)象變化、分子不折疊、抗原性變化、不穩(wěn)定并導(dǎo)致背景(background)問題(見Butler，J.E.等，J.Immunol.Methods 150(1992)77-90)。
雖然通過強(qiáng)離液試劑或適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┤芙饽娌《颈砻嫣堑鞍?rsgp)是可能的，以這樣的方法溶解的物質(zhì)作為診斷工具的用途是有限的。
在生理緩沖條件下，逆病毒表面糖蛋白的不溶性還使這些蛋白成為常規(guī)(生物)化學(xué)方法中非常困難的靶標(biāo)?！皹?biāo)記化學(xué)”的大部分，即用于結(jié)合標(biāo)記(例如結(jié)合多肽的標(biāo)記基團(tuán))的化學(xué)過程，是基于親核化學(xué)，所以限制于一個(gè)pH范圍，約pH6到約pH8，所以只能在生理緩沖條件附近進(jìn)行。這些常規(guī)方法例如Aslam，M.和Dent，A.，“生物結(jié)合(conjugation)”中的蛋白-蛋白結(jié)合物的制備(1998)216-363，Eds.M.Aslam和A.Dent，McMillan Reference，London中所述，不能在溶解逆病毒表面糖蛋白要求的極端pH值(或存在去污劑如SDS)時(shí)適當(dāng)?shù)仄鹱饔没螂y于進(jìn)行。
如上所述，根據(jù)橋連的概念的免疫測試已經(jīng)證明在目的是檢測與致病原有機(jī)體反應(yīng)的抗體的許多不同的實(shí)驗(yàn)中是有利的。但是，由于不溶性，在這樣的實(shí)驗(yàn)中，還不能利用HIV-1的e-gp41分子(即，“糖蛋白41的胞外域(ectodomain)”)或e-gp36。
為了彌補(bǔ)直接包被的缺點(diǎn)，已經(jīng)設(shè)計(jì)了不同測試方法，其中不利用e-gp41抗原，而是利用了它的或多或少跨越了免疫顯性的所謂環(huán)區(qū)的合成或重組產(chǎn)生的部分序列。這樣的測試方法的例子在下面所述的專利文獻(xiàn)中有敘述。
Gp41的細(xì)胞外部分中的環(huán)區(qū)是連接N末端螺旋區(qū)和同樣螺旋的C末端區(qū)的分子的非螺旋頂端發(fā)夾。與gp41的抗血清反應(yīng)的顯著部分包括了頂端環(huán)基序的抗體。所以，該二硫橋連的(disulfide bridged)發(fā)夾或環(huán)結(jié)構(gòu)代表了gp41的免疫顯性區(qū)。所以，克服與重組產(chǎn)生的gp41相關(guān)的問題的一個(gè)途徑是化學(xué)生產(chǎn)代表gp41的部分序列的肽。重要的是應(yīng)注意到，如本發(fā)明中所指的，gp41或gp36被定義為所謂的包括環(huán)連接的N-和C-螺旋但沒有N末端融合肽和C末端跨膜區(qū)段的胞外域。
各種HIV抗原的肽片段在相關(guān)的專利文獻(xiàn)中公開(澳大利亞專利申請597884(57733/86)，和美國專利4735896和4879212)。特別是，這三個(gè)說明書公開了gp41糖蛋白的保守的免疫顯性區(qū)，HIV-1的主要的包被蛋白的環(huán)區(qū)。HIV-2的gp36蛋白的類似的免疫顯性區(qū)也已經(jīng)合成。對應(yīng)于這些環(huán)區(qū)的肽構(gòu)成了胞外域的頂體(apex)，能夠早期診斷HIV-1和HIV-2，提供了有足夠的但不是最適當(dāng)?shù)撵`敏性和良好的特異性的測試方法。但是，在一些患者中的血清轉(zhuǎn)型的第一天中，相對于IgM抗體的檢測，它們的限制變得明顯了。
WO92/22573公開了具有免疫特性的肽，通常具有骨架，即具有各種哺乳動物免疫缺陷病毒的跨膜包被蛋白(例如，gp41或gp36)的免疫顯性區(qū)。進(jìn)一步證實(shí)，免疫顯性區(qū)域包括在從不同的哺乳動物種類產(chǎn)生的免疫缺陷病毒分離物中高度保守的二硫環(huán)。
EP396 559涉及含有對應(yīng)于HIV的天然存在的氨基酸序列的氨基酸序列的人工肽。表位也是產(chǎn)生于對應(yīng)于gp41或gp36的環(huán)結(jié)構(gòu)的序列。它們也已經(jīng)確定是含有通過化學(xué)氧化步驟在免疫顯性環(huán)的兩個(gè)半胱氨酸殘基之間形成的二硫橋連。
但是，如HIV感染的患者的抗HIV抗血清中含有的，比例較大的抗體不與從gp41或gp36的免疫顯性環(huán)產(chǎn)生的序列基序或它的變異體反應(yīng)。而這些肽抗原可以與優(yōu)勢橋連概念結(jié)合使用，不檢測與HIVgp41的環(huán)區(qū)域外的表位反應(yīng)的抗體。不僅HIV感染的非常早期的診斷是關(guān)鍵性的，而且特別重要的是檢測盡可能多的HIV-1和HIV-2的亞型。表位(特別是rsgp的正確折疊的構(gòu)象表位)越多，越不可能由于假陰性診斷而錯(cuò)過感染的樣品。
所以，已經(jīng)進(jìn)行了連續(xù)的努力提供大部分的逆病毒表面糖蛋白分子，特別是可溶形式的來自HIV-1的gp41。
gp41的生物物理以及生物化學(xué)特性已經(jīng)得到廣泛的研究。Lu，M.等，Nat.Struct.Biol.2(1995)1075-82)已經(jīng)部分闡明了gp41的三體結(jié)構(gòu)。由于在生理?xiàng)l件下gp41形成了不溶的聚合體，研究者局限于胞外域gp41的截短版本。
最近通過NMR波譜已經(jīng)證明(Caffrey，M.等，J Biol Chem275(2000)19877-82)，gp41的天然三聚體(trimer)形成了包括C末端螺旋包裝(pack)的反平行(anti-parallel)方向的三個(gè)平行N末端中心螺旋的6螺旋束(bundle)。
Gp41的高分子聚合體也已被描述。這樣的聚合體最有可能是通過所謂的gp41的頂端環(huán)區(qū)域的相互作用形成的。
通過蛋白設(shè)計(jì)，Root，M.J.等，Science 291(2001)884-8已經(jīng)開發(fā)了進(jìn)入靶細(xì)胞的HIV-1的抑制劑。這一抑制劑包括了從來自gp41的N末端螺旋區(qū)產(chǎn)生的三個(gè)延伸片段(stretch)和來自這一分子的C末端螺旋區(qū)的兩個(gè)延伸片段。但是，這一遺傳工程構(gòu)建體沒有天然分子的許多區(qū)域和許多抗原表位，特定地，它不含有所謂的已知錨定特別的免疫原表位的環(huán)基序(參見上面)。
所以，仍然存在巨大的需要，要求提供盡可能多的可溶形式的逆病毒表面糖蛋白表位。特別是，需要提供包括來自HIV-1的gp41或來自HIV-2的gp36的這樣的可溶抗原，用于各種治療以及診斷應(yīng)用。
本發(fā)明的一個(gè)任務(wù)是研究是否可能提供更多的可溶形式的逆病毒表面糖蛋白表位或甚至e-gp41分子或e-gp36。
本發(fā)明的另一個(gè)任務(wù)是研究是否可能分別提供這樣的gp41和gp36的變異體，它們更容易處理，并且/或者它們在進(jìn)行免疫測試或用于免疫所要求的緩沖條件下，在含有變異體和陪伴分子的復(fù)合物的形式下是可溶的，所述陪伴分子是肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的陪伴分子。
陪伴分子已知是經(jīng)典的“折疊輔助物”，是輔助其他蛋白折疊并維持結(jié)構(gòu)完整性的多肽。它們具有促進(jìn)體內(nèi)和體外的多肽的折疊的能力。通常，折疊輔助物再分成折疊催化劑和陪伴分子。由于它們的催化功能，折疊催化劑加速了在蛋白折疊中的速度限制步驟。催化劑的例子進(jìn)一步敘述如下。陪伴分子已知結(jié)合變性的或部分變性的多肽，所以輔助復(fù)性蛋白。所以，不象折疊催化劑，陪伴分子發(fā)揮了很小的結(jié)合功能(Buchner，J.，F(xiàn)aseb J 10(1986)10-19)。
陪伴分子是參與蛋白成熟、折疊、轉(zhuǎn)位和降解的遍在脅迫誘導(dǎo)的蛋白(Gething，M.J.和Sambrook，J.，Nature 355(1992)33-45)。雖然在正常的生長條件下同樣存在，它們在脅迫條件下被大量地誘導(dǎo)了。這另外也支持了這樣的想法，它們的生理功能是對付脅迫條件。
至今，陪伴分子的幾個(gè)不同的家族是已知的。所有這些陪伴分子的特征是它們有結(jié)合未折疊的或部分折疊的蛋白的能力，并且具有連接正確折疊的蛋白或除去變性或聚集的蛋白的生理功能。
陪伴分子的很好表征的例子是所謂的蛋白的熱休克家族，是根據(jù)它們的相對分子量來命名的，例如，hsp100、hsp90、hsp70和hsp60，以及所謂的shsps(小的熱休克蛋白)，如Buchner，J.，F(xiàn)aseb J10(1996)10-19，和Beissinger，M.和Buchner，J.，Biol.Chem.379(1998)245-59所述。
與陪伴分子不同，折疊催化劑通過加速限速步驟輔助折疊，從而降低了聚集趨向折疊中間產(chǎn)物的濃度。一類催化劑，蛋白二硫異構(gòu)酶(或者命名為硫醇(thiol)-二硫化物-氧基-還原酶)，催化分泌蛋白中的二硫橋連的形成或重排。在革蘭氏陰性菌中，在周質(zhì)中的分泌蛋白的氧化折疊是通過命名為DsbA、DsbB、DsbC和DsbD的蛋白二硫異構(gòu)酶的級聯(lián)來調(diào)整的(Bardwell，J.C.，Mol Microbiol14(1994)199-205和Missiakas，D.等，Embo J 14(1995)3415-24)。
另一重要的折疊催化劑類別稱為肽基脯氨?；樖?反式異構(gòu)酶(PPIs)，包括不同的成員如CypA、PpiD(Dartigalongue，C.和Raina，S.，Embo J 17(1998)3968-80，F(xiàn)kpA(Danese，P.N.等，Genes Dev9(1995)387-98)，引發(fā)因子(Grooke，E.和Wickner，W.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84(1987)5216-20和Stoller，G.等，Embo J 14(1995)4939-48)，和Sly D(Hottenrott，S.等，J Biol.Chem.272(1997)15697-701)。在這些中間，F(xiàn)kpA、SlyD和引發(fā)因子已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在序列排列的基礎(chǔ)上是相關(guān)的。
肽基脯氨?；悩?gòu)酶FkpA已經(jīng)定位在革蘭氏陰性菌的周質(zhì)中。已經(jīng)探明，這一陪伴分子對于細(xì)菌外膜的蛋白的運(yùn)輸和轉(zhuǎn)位是重要的。Ramm，K.和Pluckthun，A.，J.Biol.Chem.275(2000)17106-13)已經(jīng)顯示，F(xiàn)kpA對兩個(gè)不同方法正確折疊的蛋白具有好的效果。首先，F(xiàn)kpA與早期折疊的中間產(chǎn)物反應(yīng)，所以防止了聚集。其次，它具有使失活蛋白復(fù)活的能力，這可能也是通過結(jié)合與聚集形式的共存的部分未折疊物類而實(shí)現(xiàn)的。
一些折疊輔助物包括催化活性區(qū)以及陪伴分子(或多肽結(jié)合)區(qū)。代表性的例子是例如引發(fā)因子(Zarnt，T.等，J Mol Biol 271(1997)827-37)，Wang，C.C.和Tsou，C.L.，F(xiàn)aseb J 7(1993)1515-7)，SurA(Behrens等，EMBO J.(2001)20(1)，285-294)，DsbA(Frech，C.等，Embo J15(1996)392-98)。根據(jù)我們的觀察，相同的調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)似乎是在PPIasesFkpA和Sly D中實(shí)現(xiàn)的。
已經(jīng)證明，在不同的獨(dú)立的系統(tǒng)中，陪伴分子的增強(qiáng)的表達(dá)可以簡化多肽的重組生產(chǎn)。其例子可以在WO94/08012中找到。
也已知，蛋白的生產(chǎn)的提高可以利用含有多肽編碼序列的基因構(gòu)建體以及陪伴序列來達(dá)到。這一融合概念例如已經(jīng)顯示，利用含有人前胰島素基因和DsbA的基因構(gòu)建體可以導(dǎo)致在大腸桿菌的周質(zhì)中的人前胰島素的生產(chǎn)明顯提高(Winter，J.等，Journal of Biotechnology84(2000)175-185)。
利用陪伴分子提高似天然(native-like)折疊多肽的生產(chǎn)的途徑主要?dú)w因于陪伴分子結(jié)合和增溶的功能。在重組生產(chǎn)陪伴分子和靶蛋白的融合多肽后，陪伴分子通?？梢詮牡玫降亩嚯牧呀?，產(chǎn)生需要的純凈形式的多肽。相反，本發(fā)明是基于當(dāng)結(jié)合逆病毒表面糖蛋白時(shí)適當(dāng)?shù)呐惆榉肿拥挠幸娴脑鋈苄Ч?br> 令人驚訝的是，我們發(fā)現(xiàn)折疊輔助物例如肽基脯氨?；悩?gòu)酶(PPI)類的許多成員，特別是來自FKBP家族的，不僅具有催化活性，而且對淀粉狀蛋白(或更一般地說是趨向于聚集的蛋白)的溶解性產(chǎn)生強(qiáng)烈的有利的效果。這是通過與在其他條件(即不陪伴的(unchaperoned)、分離的形式)下趨向于聚集的蛋白形成可溶的復(fù)合物來進(jìn)行的。這樣的蛋白在生理?xiàng)l件下是難于溶解或不溶的，一旦它們與適當(dāng)?shù)腜PI陪伴分子在復(fù)合物中結(jié)合，在溫和的生理?xiàng)l件(即，不需要溶解添加物如去污劑或離液劑)下變成是可溶的。因此，我們能夠生產(chǎn)例如可溶的蛋白-陪伴分子復(fù)合物，其中含有例如HIV-1的gp41蛋白作為趨向聚集的靶蛋白和FkpA或其他FKBP作為賦予可溶性的陪伴分子。
另外，我們發(fā)現(xiàn)一些充分確定的HIV-1 gp41或HIV-2 gp36的變異體特別適用于與PPI類的陪伴分子形成可溶的復(fù)合物。
例如，gp41和FkpA或gp36和FkpA的復(fù)合物在例如生理?xiàng)l件下是容易溶解的，它們可以容易地在常規(guī)pH范圍內(nèi)標(biāo)記，并且它們可以非常有利地用于檢測分別抗HIV(1或2)中的gp41或gp36的抗體的檢測中，所以可以用于HIV感染的診斷。
附圖簡述

圖1A和1B，HIV-1胞外域gp41(535-681)-His6的遠(yuǎn)(1A)和近(1B)紫外CD折疊的gp41(粗線)緩沖條件(30mM甲酸鈉，pH3.0)的設(shè)定能誘導(dǎo)類似天然的所有螺旋構(gòu)型的gp41；變性的gp41(細(xì)線)緩沖條件(50mM磷酸鈉，pH3.0，7.0M GuHCl)的設(shè)定完全變性(未折疊)gp41。由于高摩爾量的離液鹽，在圖1A中的參考二色信號(細(xì)線)不能可靠地在低于215nm的波長區(qū)域中檢測。在Jasco-720分光偏振儀上記錄光譜，并且9次平均以降低噪聲。光程對于遠(yuǎn)紫外CD是0.2cm(圖1A)，對于近紫外CD是0.5cm(圖1B)。各個(gè)蛋白濃度是1.5μM和29μM?？v坐標(biāo)的單位是平均殘基橢圓率并且具有尺度(dimension)deg×cm2×dmol-1。
圖2在生理緩沖液中“未陪伴”的gp41的聚集顯示的是1分鐘(下面的線)和10分鐘(上面的線)在pH從3.0升到7.5后gp41胞外域的紫外光譜。聚集的分子導(dǎo)致光散射效應(yīng)，并且引起表觀吸收(apparent absorption)在310nm以外。該圖僅僅證明了gp41的強(qiáng)的聚集趨勢；值得注意的是，聚集的過程不在上面的線表明的時(shí)期終止。
圖3A和3B FkpA在中性pH溶解gp41胞外域在低的pH下將gp41和成熟的FkpA共溫育，然后轉(zhuǎn)變到最后的緩沖條件20mM磷酸鈉，pH7.4；50mM NaCl，1mM EDTA。在1和10分鐘后(下面和上面的線)，記錄紫外光譜，評估樣品中的聚集程度。圖3A顯示了兩倍摩爾過量的陪伴分子對聚集的阻遏。圖3B顯示了四倍過量的效果。Gp41的最后濃度約是1μM。由于散射光(導(dǎo)致表觀吸收在300nm外)降低到最小，提供了強(qiáng)的光譜證據(jù)，即FkpA有效地以依賴劑量的方式溶解gp41胞外域。
圖4FkpA-gp41在pH2.5時(shí)的紫外光譜在對50mM磷酸鈉，pH2.5；50mM NaCl透析后融合多肽FkpA-gp41的紫外光譜。令人驚訝的是，兩個(gè)區(qū)域的構(gòu)建體在除去了可溶離液試劑GuHCl后仍然是完全可溶的。沒有證據(jù)表明存在光散射聚集體，可以預(yù)期引起基線漂移和在300nm處波長以外明顯的表觀吸收。
圖5在pH2.5時(shí)FkpA-gp41的近紫外CD光譜在20mM磷酸鈉，pH2.5，50mM NaCl在20℃，在Jasco 720分光偏振儀上記錄光譜，并且累積9次以降低噪聲。在光程0.5cm時(shí)蛋白濃度是22.5μM。芳香橢圓率顯示是gp41的典型的特征(見圖1B)。在pH2.5，F(xiàn)kpA是大的未結(jié)構(gòu)化的，不能產(chǎn)生近紫外-CD的信號。
圖6在pH2.5時(shí)FkpAp-gp41的遠(yuǎn)紫外CD光譜在20mM磷酸鈉，pH2.5；50mM NaCl，在20℃，在Jasco720分光偏振儀上記錄光譜，并且累積9次以提高信噪比。在光程0.2cm時(shí)蛋白濃度是2.25μM。在220和208nm處的最小值指向了融合蛋白中的gp41的主要螺旋結(jié)構(gòu)。低于197nm的波譜噪聲是由于高的酰胺吸收并且不報(bào)告任何融合蛋白的結(jié)構(gòu)特征。然而，可以猜測典型螺旋最大值位于193nm。
圖7在生理?xiàng)l件下的FkpA-gp41的近紫外CD。
在20mM磷酸鈉，pH7.4；50mM NaCl在20℃，在Jasco 720分光偏振儀上記錄光譜，并且累積9次以降低噪聲。在光程0.5cm時(shí)蛋白濃度是15.5μM。令人驚異的是，gp41和FkpA(實(shí)線)的共價(jià)連接的蛋白區(qū)的芳香橢圓率是pH3.0的似天然全螺旋gp41(下面的虛線)和pH7.4的FkpA(上面的虛線)貢獻(xiàn)而成的。這表明，當(dāng)在多肽融合蛋白中連接時(shí)，載體FkpA和靶g(shù)p41(即兩個(gè)不同的功能折疊單位)可逆地和準(zhǔn)獨(dú)立地再折疊。
圖8在生理緩沖條件下FkpA-gp41的遠(yuǎn)紫外CD在20mM的磷酸鈉，pH7.4；50mM NaCl，在20℃，在Jasco 720分光偏振儀上記錄了光譜，并且累計(jì)9次以提高信噪比。在光程0.2cm時(shí)蛋白濃度是1.55μM。在222nm和208nm處的強(qiáng)信號指向了融合構(gòu)建體中的gp41的主要螺旋結(jié)構(gòu)。低于198nm的噪聲是由于高的蛋白吸收，不反映FkpA-gp41的任何二級結(jié)構(gòu)特性。
圖9在HIV測試中FkpA-連接的gp41是可溶的和高免疫反應(yīng)性的FkpA-gp41是COBAS CORE HIV組合測試方法中的強(qiáng)競爭物。顯示的是在與gp41胞外域單獨(dú)比較(空圓)，在用稀釋緩沖液(含有Triton X-100作為輔助去污劑)預(yù)處理后的可溶FkpA-gp41多肽(實(shí)心圓)的抑制潛力。顯然，gp41胞外域(在融合蛋白的分子內(nèi)復(fù)合物內(nèi))甚至在存在去污劑時(shí)保留了它的高免疫反應(yīng)性，而裸露的胞外域差不多完全失去了免疫反應(yīng)性。測試的HIV陽性血清是稀釋倍數(shù)1∶3000的內(nèi)部血清號21284。
圖10在復(fù)性凝膠過濾后FF36的紫外光譜光譜提供了明確的證據(jù)，即gp36融合肽是可溶的并且當(dāng)根據(jù)如實(shí)施例部分所述的復(fù)性凝膠過濾方法在Sux 200柱上再折疊時(shí)不聚集。
圖11(1+2)FkpA-gp21是可溶的和免疫反應(yīng)性融合多肽在復(fù)性凝膠過濾后，再折疊FkpA-gp21融合蛋白高度可溶地洗脫，在紫外光譜下顯示沒有聚集趨勢(11/1)。當(dāng)在COBAS CORE與HTLV陽性血清858893-00(1∶10稀釋度)的競爭型免疫測試實(shí)驗(yàn)中評估時(shí)，F(xiàn)kpA-gp21具有良好的免疫特性(11/2)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明涉及生產(chǎn)包括基本不溶的靶蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶類陪伴分子的可溶復(fù)合物的方法，包括將所述蛋白和所述陪伴分子在緩沖液中混合，其中蛋白和陪伴分子都溶解于緩沖液中，將緩沖液調(diào)節(jié)到生理?xiàng)l件，形成的蛋白-陪伴分子復(fù)合物是可溶解的。
本發(fā)明的“靶蛋白”可以是在含有20mM磷酸鈉和150mM氯化鈉的pH7.4的緩沖溶液中基本不溶的任何蛋白。優(yōu)選的靶蛋白例如是成淀粉樣蛋白(amyloidogenic protein)，成淀粉樣病毒的表面糖蛋白，逆病毒表面糖蛋白，特別是HIV-1 gp41、HIV-2 gp36和HTLV gp21。
一組重要的靶多肽是所謂的成淀粉樣蛋白或多肽。在體液或腔室里已經(jīng)發(fā)現(xiàn)聚集形式的成淀粉樣蛋白。已知的例子是血清淀粉樣A(sAA)，所謂的β-A4或Aβ(已知在Alzheimer疾病的腦中形成特征性淀粉樣沉積物的42或43個(gè)氨基酸的多肽)，所謂的朊病毒蛋白(PrPsc在BSE或Creutzfeldt-Jacob疾病中積累成聚集體)，和逆病毒表面糖蛋白，如HIV-1 gp41，這是在患HAD(與癡呆相關(guān)的HIV)的患者的腦中的淀粉樣噬菌斑中發(fā)現(xiàn)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，陪伴分子優(yōu)選地PPI陪伴分子是用于形成包括成淀粉樣蛋白和陪伴分子的可溶復(fù)合物的。非常有利的是，這樣的復(fù)合物可以用于許多不同的免疫測試方法中。優(yōu)選地，這樣的復(fù)合物用于根據(jù)雙抗原橋連概念的免疫測試方法中。
HIV和其他包被病毒，如HTLV、流感病毒和Ebola病毒都表達(dá)介導(dǎo)細(xì)胞附著和膜融合的表面糖蛋白。為了這些功能，所有這些表面糖蛋白含有極其疏水的區(qū)段，使它們難于在體外操作，趨向于聚集，使它們由于體外再折疊而傾向攻擊靶。在其他的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及可溶的復(fù)合物，包括PPI陪伴分子和包被病毒的表面糖蛋白。特別涉及在檢測表面糖蛋白的抗體的免疫測試方法中利用包括PPI陪伴分子和包被病毒的表面糖蛋白的復(fù)合物。
HAD是已知的HIV感染的綜合癥。如Caffrey，M.等(出處同上)所述，在組織學(xué)現(xiàn)象上，HAD是非常相似于稱為Creutzfeldt-Jacob疾病的海綿樣腦病。Creutzfeldt-Jacob疾病的病因?qū)W通常認(rèn)為是從包括修飾的朊病毒蛋白的噬菌斑(plaque)的成淀粉樣積累產(chǎn)生(Prusiner，S.B.，Proc Natl Acad Sci USA 95(1998)13363-83)。HAD的類似致病機(jī)理包括高分子量的e-gp41的聚集體是很可能的。值得注意的是，HIV腦病中的神經(jīng)損傷具有Binswanger疾病的病理學(xué)和放射學(xué)特征。
本發(fā)明的優(yōu)選的成淀粉樣蛋白是從HIV-1產(chǎn)生的gp41，從HIV-2產(chǎn)生的gp36，或從HTLV產(chǎn)生的gp21。
如果在含有20mM的磷酸鈉pH7.4，150mM NaCl的緩沖液中，蛋白溶解的濃度為50nM或更少，則認(rèn)為蛋白“基本不溶”，。
如果在生理緩沖液條件下，例如在包括20mM磷酸鈉pH7.4，150mM NaCl的緩沖液中，包含在PPI-陪伴分子復(fù)合物中的靶蛋白的溶解濃度為100nM或更高，則本發(fā)明的包含PPI-陪伴分子和靶蛋白的復(fù)合物被認(rèn)為是“可溶的”。
我們開發(fā)了包括在緩沖液中混合靶蛋白和陪伴分子的步驟的方法，在緩沖液中溶解了蛋白和陪伴分子，將緩沖液調(diào)節(jié)到形成的蛋白-陪伴分子復(fù)合物仍然溶解的生理?xiàng)l件。
生產(chǎn)可溶的陪伴分子-靶蛋白復(fù)合物是從溶解緩沖條件，即從靶蛋白和陪伴分子可溶的緩沖液開始的?？梢苑Q為“非生理”或“可溶”緩沖液的適當(dāng)緩沖液不得不滿足靶蛋白和PPI陪伴分子不變性或至少不會不可逆地變性的要求。從這些緩沖條件開始，陪伴分子結(jié)合靶蛋白，從非生理到生理?xiàng)l件的緩沖液條件的變化在沒有靶蛋白的參與下是可能的。
適當(dāng)?shù)?非生理)緩沖液，即靶蛋白基本不溶，PPI陪伴分子可溶的緩沖液利用了高或低pH，或高離液鹽濃度或它們的結(jié)合。
在基本不溶的包括PPI陪伴分子和靶蛋白的分子間復(fù)合物的生產(chǎn)中，非生理緩沖液優(yōu)選地是高或低pH的緩沖液。優(yōu)選地，這樣的緩沖液具有的pH在高pH范圍是9到12，低pH范圍是2到4.5。
在基本不溶的包括PPI陪伴分子和靶蛋白的分子內(nèi)復(fù)合物的生產(chǎn)中，溶解緩沖液優(yōu)選地是高濃度離液鹽，例如6.0M鹽酸胍，pH約6時(shí)的緩沖液。在復(fù)性的基礎(chǔ)上，靶蛋白假定了它的類似天然的結(jié)構(gòu)和分子間的復(fù)合物形式。
在本發(fā)明中，生理緩沖液條件確定為pH值在5.0到8.5之間，總鹽濃度低于500mM，至于其他非鹽成分是否可以存在于緩沖液中(如糖，乙醇，去污劑)，只要這樣的添加物不妨礙包括靶蛋白和陪伴分子的復(fù)合物的可溶性。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)可溶的逆病毒表面糖蛋白陪伴分子的方法，包括在逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶溶解和形成復(fù)合物的緩沖液中混合逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶，調(diào)節(jié)緩沖液到復(fù)合物溶解的生理?xiàng)l件。
用于本發(fā)明的術(shù)語“逆病毒表面糖蛋白”或“rsgp”應(yīng)該包括HIV-1的gp41和HIV-2的gp36，以及從哺乳動物免疫缺陷病毒產(chǎn)生的包被糖蛋白。優(yōu)選的逆病毒表面糖蛋白是來自HIV-1的gp41和來自HIV-2的gp36和HTLV的gp21。特別優(yōu)選的rsgp是HIV-1的gp41和HIV-2的gp36。如本文所述的術(shù)語rsgp也不包括天然存在的以及合成工程的rsgp變異體。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，在gp41或gp36的N螺旋區(qū)內(nèi)的一些已經(jīng)確定的氨基酸取代進(jìn)一步產(chǎn)生了比gp41或gp39的野生型序列的多肽更多的分子的整體特性。這些變異體代表了本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案。特定地，HIV-1 gp41的變異體在選自Leu555、Leu566、Ile573和Ile580的位置的一個(gè)或多個(gè)位置有至少一個(gè)氨基酸取代和最多4個(gè)氨基酸取代，其中這些位置是HIV-1 gp41野生型序列(SEQ ID NO1)中的已知位置或?qū)?yīng)于其中的已知位置的，特征是取代氨基酸分別選自包括絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸、谷氨酸，或者，在選自包括位置Leu554、Leu565和Val579的位置有至少一個(gè)氨基酸取代和最多3個(gè)氨基酸取代的HIV-2 gp36的變異體，其中這些位置已知是來自HIV-2 gp36野生型序列(SEQ ID NO2)的位置，或?qū)?yīng)于已知的位置，特征是取代氨基酸分別選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸，這兩個(gè)變異體適用于至少部分地解決本領(lǐng)域已知的問題。
與野生型序列對應(yīng)的多肽相比，gp41或gp36的新變異體更少地趨向于聚集，更多地溶解，更容易操作。在提供生理緩沖條件下包括溶解形式的gp41或gp36的試劑，溶解度的提高變得特別明顯。已經(jīng)證明，新變異體的有利特性和選自肽基-脯氨?；悩?gòu)酶(PPI)類陪伴分子的陪伴分子給予的效果結(jié)合起來是特別有利的。所以，本發(fā)明進(jìn)一步涉及在包括變異體和肽基-脯氨酰基異構(gòu)酶類陪伴分子的陪伴分子的可溶復(fù)合物的生產(chǎn)中利用如本發(fā)明所述的gp41的變異體和/或gp36的變異體。
包括變異體HIV糖蛋白和PPI類陪伴分子的可溶復(fù)合物優(yōu)選地是從包括變異體HIV gp41或HIV-2 gp36和PPI類陪伴分子的單個(gè)重組蛋白中得到的。所以，優(yōu)選的實(shí)施方案是包括如本發(fā)明所述的HIV-1gp41或HIV-2 gp36的變異體和選自肽基-脯氨?；?異構(gòu)酶類陪伴分子的陪伴分子。
gp41或gp36的新變異體更容易作為野生型多肽進(jìn)行操作的事實(shí)使它們可用于理想的各種目的，如用作免疫原或用作抗原。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及本發(fā)明的gp41和/或gp36的變異體和包括PPI陪伴分子和這樣的變異體例如在免疫測試中作為單個(gè)重組蛋白的復(fù)合體的用途。最令人感興趣的是，包括逆病毒表面糖蛋白和PPI陪伴分子的融合蛋白是可溶的，并且在適當(dāng)?shù)臈l件下可以復(fù)性，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)可以形成能夠方便地標(biāo)記和在HIV免疫測試中能可靠地檢測的可溶分子間rsgp-陪伴分子復(fù)合物。
在逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子之間的可溶復(fù)合物可以極有利地用于檢測雙抗原橋連概念下檢測抗體的免疫測試中。
包括來自HIV-1的gp41或來自HIV-2的gp36的rsgp陪伴分子復(fù)合物可特別有利的用于感染早期中抗HIV抗體的檢測中。利用可溶的陪伴分子gp41復(fù)合物或可溶的陪伴分子gp36復(fù)合物，優(yōu)選地根據(jù)橋連的概念進(jìn)行免疫測試是可能的，允許在體液樣品中靈敏和較早地檢測抗HIV的抗體。
陪伴分子可以與不溶蛋白形成復(fù)合物的事實(shí)也可以極有利地用于提高免疫測試，優(yōu)選地在橋連概念下的免疫測試方法中。橋連概念允許利用陪伴分子抗原復(fù)合物作為第一抗原(通常稱為固相側(cè)的捕獲抗原)和第二陪伴分子抗原復(fù)合物(通常是檢測方面的檢測抗原)。為了使結(jié)合陪伴分子反應(yīng)抗體引起的背景反應(yīng)問題最小，這樣的橋連的測試方法進(jìn)一步可以通過利用固相方面的第一陪伴分子和不同種類產(chǎn)生的檢測方面的第二陪伴分子來有利地修飾。
現(xiàn)在可以根據(jù)橋連概念利用標(biāo)記的陪伴分子-抗原復(fù)合物進(jìn)行免疫測試。也可以制備這樣的陪伴分子-抗原復(fù)合物，其中只有陪伴分子被標(biāo)記，以確保抗原不被修飾或被標(biāo)記不利地影響(例如在構(gòu)象方面)。
化學(xué)偶聯(lián)的方式和方案可以如需要來選擇。在多肽的情況中，靶向-SH，-NH2，或-COO-殘基以及酪氨酸的-OH基團(tuán)，組氨酸的咪唑基團(tuán)，或色氨酸的雜環(huán)亞胺基團(tuán)的偶聯(lián)化學(xué)正在著手進(jìn)行。這些功能基團(tuán)的幾個(gè)適當(dāng)?shù)呐悸?lián)化學(xué)是已知的(Aslam，M.和Dent，A.，出處同上)。常規(guī)蛋白偶聯(lián)化學(xué)需要蛋白在工作緩沖條件下，例如，在約5到8.5的pH范圍內(nèi)溶解，例如gp41在這一pH范圍中除非變性是不溶的，例如通過SDS，似天然折疊gp41是不能修復(fù)化學(xué)鍵的。本文敘述的gp41陪伴復(fù)合物提供了生產(chǎn)與利用的檢測方式相關(guān)的免疫測試中的可溶的標(biāo)記HIV包被蛋白的常規(guī)方法。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)可溶的rsgp陪伴分子復(fù)合物的方法，包括以下步驟在非生理緩沖條件下混合溶解的逆病毒表面糖蛋白和選自肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的陪伴分子，然后調(diào)節(jié)緩沖液到生理?xiàng)l件，形成分子間復(fù)合物。
陪伴分子和逆病毒表面糖蛋白不僅可以作為單獨(dú)的多肽使用。我們驚異地觀察到，共價(jià)地連接蛋白是有利的。這樣的共價(jià)鍵在常規(guī)的化學(xué)交聯(lián)方法中是可能的，但是優(yōu)選地，共價(jià)鍵是通過生產(chǎn)包括逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子的重組多肽來完成的。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及生產(chǎn)可溶的rsgp陪伴分子復(fù)合物的方法，包括以下步驟在適當(dāng)?shù)木彌_條件下溶解包括共價(jià)連接的逆病毒表面糖蛋白和選自肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的陪伴分子的蛋白，然后調(diào)節(jié)緩沖液到生理?xiàng)l件。在這一方法下得到了分子間復(fù)合物。
本發(fā)明涉及從命名為肽基脯氨?；樖?反式異構(gòu)酶(PPIs)的折疊輔助物類產(chǎn)生的陪伴分子的用途(見Dartigalongue，C.和Raina，出處同上)。這一家族的已知的例子是稱為CypA、PpiD的成員(Dartigalongue，C.和Raina，S.，Embo J 17(1998)3968-80；Schmid，F(xiàn).X.，在蛋白的生命循環(huán)中的分子陪伴分子(1998)361-389，Eds.A.L.Fink和Y.Goto，Marcel Decker In.，New York)，F(xiàn)kpA(Danese，P.N.等，GenesDev 9(1995)387-98)和引發(fā)因子(Crooke，E.和Wickner，W.，Proc NatlAcad Sci USA84(1987)5216-20；Stoller，G.等，Embo J 14(1995)4939-48)。
肽基脯氨酰基異構(gòu)酶分成3個(gè)家族，parvulines(Schmid，F(xiàn).X.，出處同上，Rahfeld，J.U.等，F(xiàn)EBS Lett 352(1994)180-4)，cyclophilines(Ficher，G.等，Nature337(1989)476-8)，和FKBP家族(Lane，W.S.等，J Protein Chem 10(1991)151-60)。FKBP家族具有有趣的生物化學(xué)特征，因?yàn)樗某蓡T最初已經(jīng)被它們結(jié)合大環(huán)內(nèi)酯例如FK506和雷帕霉素的能力所鑒定(Kay，J.E.，Biochem J 314(1996)361-85)。
脯氨?；悩?gòu)酶可以含有不同的亞單位或不同功能的單元，例如具有催化活性的單元和具有陪伴分子或結(jié)合活性的單元。這樣的FKBP家族的單位成員是FkpA(Ramm，K.和Pluckthum，A.，J Biol Chem275(2000)17106-13)，SlyD(Hottenrott，S.等，J.Biol.Chem272(1997)15697-701)和引發(fā)因子(Scholz，C.等，Embo J16(1997)54-8)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括逆病毒表面糖蛋白和選自肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的折疊催化劑的陪伴分子的可溶復(fù)合物。
當(dāng)然，本發(fā)明不局限于利用特別提到的肽基脯氨酰基異構(gòu)酶類成員，但可以利用來自同一類別但從細(xì)菌的不同種類產(chǎn)生的陪伴分子主體(stemming)進(jìn)行。優(yōu)選地，可以利用陪伴分子的PPI類的FKBP家族的成員。
在其他實(shí)施方案中，優(yōu)選地利用從真核生物產(chǎn)生的同源物，利用來源于人的PPIases是非常優(yōu)選的，因?yàn)檫@些PPIases應(yīng)該不是通過來自人血清的抗體識別的，所以應(yīng)該不干擾血清學(xué)實(shí)驗(yàn)(即，實(shí)驗(yàn)是基于人抗體的檢測的)。
同樣已知的和令人滿意的是，并不需要總是利用分子陪伴分子的完全序列。仍然具有需要的能力和功能的陪伴分子的功能片段(所謂的單元)也可以利用(見WO98/13496)。
例如，F(xiàn)kpA是在細(xì)菌胞質(zhì)中作為失活的前體分子合成并且跨細(xì)胞質(zhì)膜轉(zhuǎn)位的周質(zhì)PPI。FkpA的活性形式(成熟的FkpA或周質(zhì)FkpA)沒有信號序列(氨基酸1到25)，所以包括了前體分子的氨基酸26到270。涉及FkpA的相關(guān)序列的信息可以容易地從公共數(shù)據(jù)庫得到，例如從登記號P 45523的“SWISS-PROT”。
FkpA的一個(gè)近親，稱為SlyD，包括負(fù)責(zé)催化和陪伴分子功能的結(jié)構(gòu)N末端區(qū)域和大的無結(jié)構(gòu)的C末端，其中有特別豐富的組氨酸和半胱氨酸殘基(Hottenrott，S.等，J.Biol.Chem 272(1997)15697-701)。我們發(fā)現(xiàn)，包括氨基酸1-165的SlyD的C末端截短的變異體有效地在gp41和gp36上發(fā)揮了溶解功能。不象在野生型SlyD中，調(diào)整二硫化物shuffling的危險(xiǎn)成功地在利用的截短的SlyD變異體(1-165)中降低了。
上面討論的陪伴分子的變異體，含有一個(gè)或幾個(gè)氨基酸取代或缺失也可以用于進(jìn)行本發(fā)明的方法。
來自可選來源的適當(dāng)?shù)呐惆榉肿雍团惆榉肿拥倪m當(dāng)片段或突變體可以容易地利用實(shí)施例所述的方法來選擇。為了生產(chǎn)可溶的rsgp陪伴分子復(fù)合物，它們可以游離形式或與逆病毒表面糖蛋白共價(jià)連接的方式利用。在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，結(jié)合感應(yīng)PPIase陪伴分子是與逆病毒表面糖蛋白重組連接的，產(chǎn)生了在細(xì)菌胞質(zhì)中高度表達(dá)的基因產(chǎn)物。如本發(fā)明中所指的結(jié)合感應(yīng)PPIase至少包括了介導(dǎo)與擴(kuò)展的多肽底物結(jié)合的有關(guān)催化性PPIase活性的功能單位(即，底物結(jié)合或陪伴分子基序)。
我們也已經(jīng)觀察到一些不屬于PPI類折疊催化劑的陪伴分子可以與逆病毒表面糖蛋白形成可溶的復(fù)合物。所以，本發(fā)明的其他的優(yōu)選的實(shí)施方案是在Skp(也稱為OmpH；Missiakas，D.等，Mol Microbiol21(1996)871-84)和逆病毒表面糖蛋白之間的可溶復(fù)合物。仍然是其他的優(yōu)選的實(shí)施方案，是包括逆病毒表面糖蛋白和GcroEL或其部分的可溶復(fù)合物。也可以利用與Skp同源的陪伴分子。
已知(例如，Scholz等，出處同上)，單元PPI與變性或部分變性的蛋白優(yōu)先結(jié)合?，F(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)PPIases具有不僅催化折疊蛋白而且與這樣的蛋白形成穩(wěn)定復(fù)合物從而給予可溶性的令人驚異的特性。研究的PPIases(如TF，SlyD和FkpA)結(jié)合并且例如溶解似天然折疊逆病毒表面糖蛋白。本發(fā)明的“似天然”或“似天然折疊”的gp41的特征是如遠(yuǎn)紫外CD評估的二級結(jié)構(gòu)中的高螺旋內(nèi)容和近紫外CD評估的三級結(jié)構(gòu)內(nèi)容，這些分別在圖1B和5中所示的典型“gp41-簽名”中有反映。另外，本發(fā)明的“似天然”的gp41的紫外光譜在高于320nm的波長處不顯示有明顯的吸收(這是指光散射顆粒如聚集體)。
在模型生物分子例如在抗體和抗原之間形成復(fù)合物上有豐富的信息(綜述見Braden，B.C.和Poljak，R.J.，F(xiàn)aseb J 9(1995)9-16)。通常，復(fù)合物的形成和解離是平行發(fā)生的，復(fù)合物和結(jié)合伙伴是在游離平衡中共存的。同樣，如本發(fā)明所述的PPI陪伴分子和成淀粉樣蛋白之間的復(fù)合物似乎是真的。
如本發(fā)明所述，復(fù)合物的形成是特別重要的特性，因?yàn)樵赑PI陪伴分子和例如在生理緩沖條件下是基本不溶的蛋白之間的復(fù)合物已經(jīng)發(fā)現(xiàn)例如在生理緩沖條件下是容易溶解的。在生理?xiàng)l件下溶解的抗原在診斷中有巨大的優(yōu)點(diǎn)。它們可以直接作為標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)利用。另外，它們可以與適當(dāng)?shù)臉?biāo)記物或適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合基團(tuán)結(jié)合。
如上所述，來自HIV-2的gp36有相似的功能(即，膜融合和病毒進(jìn)入)，并且與來自HIV-1的gp41有相似的診斷相關(guān)性。利用HIV-1的gp41作為逆病毒表面糖蛋白的原型例子可以在本申請書中討論許多技術(shù)問題。只是為了說明的緣故，討論和敘述優(yōu)先集中到HIV-1的gp41上。但是，相同的考慮應(yīng)用于其他逆病毒表面糖蛋白，特別是來自HIV-2的gp36和來自HTLV的gp21。
已知HIV-1或HIV-2的天然存在的分離物可以包括原始分離和敘述的氨基酸序列的變異體。這樣天然存在以及合成工程化的哺乳動物免疫缺陷的rsgps的變異體也是在本發(fā)明的范圍內(nèi)的。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中的本發(fā)明涉及人免疫缺陷病毒(HIV)的rsgp或跨膜糖蛋白的變異體。公開了在HIV-1 gp41或HIV-2 gp36的N螺旋區(qū)中包括特異氨基酸取代的變異體。
參與螺旋連接螺旋的N螺旋以及C螺旋區(qū)的氨基酸位置可以從關(guān)于HIV-1 gp41的文獻(xiàn)中知道，并且可以外推HIV-1同源物gp36。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，突變這些位置影響了gp41或gp36的特性，特別是在包括這一變異體和PPI陪伴分子區(qū)域的融合蛋白的有關(guān)方面中。
在gp41亮氨酸拉鏈的螺旋輪投影(helical wheel projection)中的“a”和“d”氨基酸位置優(yōu)選地可用于生產(chǎn)本發(fā)明的變異體。在“a”位置中的氨基酸殘基(根據(jù)Chan，D.C.等，Cell 89(1997)263-73編號)是Q552、I559、L566、I573和I580；“d”位置是I548、L555、Q562、T569和L576。
為了在不調(diào)節(jié)拉鏈基序的螺旋整體性的情況下提高溶解度，優(yōu)選地將突變位置通過一個(gè)以上的螺旋相互分離。這一先決條件是例如通過取代連續(xù)的“a”殘基Q552、I559、L566和I573，以及通過取代連續(xù)的“d”殘基L548、L555、Q562和T569來滿足的。用另一句話來說，突變的殘基是通過至少6個(gè)野生型氨基酸殘基來相互分離的，所以正確地接著heptad基序。在前面提到的條件下下在變異體內(nèi)突變“a”和“d”殘基是可能的，使取代的位置通過一個(gè)以上的螺旋相互分離。
同樣，當(dāng)與SlyD或FkpA融合時(shí)，令人驚異地發(fā)現(xiàn)在HIV-2的gp36胞外區(qū)中的變化產(chǎn)生了容易溶解的重組蛋白。本文中，“a”位置是Q551、V558、L565、T572、V579，“d”位置是I547、I554、Q561、T568和L575。
優(yōu)選地，選自包括HIV-1 gp41的位置Q552、I559、L566、I573、I580、I548、L555、Q562、T569和L576或HIV-2 gp36的位置Q551、V558、L565、T572、V579、I547、I554、Q561、T568和L575的位置的1到6個(gè)氨基酸分別用更小的或更親水的氨基酸來取代。
優(yōu)選地，待取代的氨基酸位置選自HIV-1的Q552、I559、L566、I573和I580和HIV-2的L554、Q561、T568和L575。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及了在選自包括Leu555、Leu566、Ile573和Ile580的位置的(a)位置中包括至少一個(gè)和最多4個(gè)氨基酸取代的HIV-1 gp41的變異體，其中這些位置是已知來自SEQID NO1的gp41野生型序列的位置，或者對應(yīng)于其中的已知位置，特征是取代氨基酸分別或獨(dú)立地選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。
本發(fā)明的這一優(yōu)選的實(shí)施方案是基于可以提供野生型gp41的變異體的令人驚異的發(fā)現(xiàn)，代表了與gp41的野生型序列的對應(yīng)的多肽比較明顯的改進(jìn)。根據(jù)已知來自Chan，D.C.等，Cell 89(1997)263-73)并且是在SEQ ID NO1中給出的氨基酸組合物和gp41野生型序列的號，敘述了產(chǎn)生本發(fā)明的變異體的氨基酸取代。
很明顯，本發(fā)明敘述的氨基酸取代也可以用于在其他已知的和仍然未鑒定的HIV-1分離物內(nèi)的對應(yīng)的序列位置取代氨基酸。術(shù)語“對應(yīng)于一個(gè)位置”可用于表明，同時(shí)發(fā)現(xiàn)了或產(chǎn)生了包括其他氨基酸或缺乏一些氨基酸的HIV-1分離物和其變異體，在SEQ ID NO1的序列排列的基礎(chǔ)上產(chǎn)生了不同的絕對數(shù)目的對應(yīng)序列位置或序列基序。
利用GCG軟件包版本10.2的PileUp程序(Genetics ComputerGroup，Inc.)進(jìn)行g(shù)p41序列與SEQ ID NO1的野生型序列的多重排列和比較。利用Feng，D.F.Doolittle，R.F.，J Mol Evol 25(1987)351-60的改良的排列簡化方法，PileUp產(chǎn)生了多個(gè)序列排列，由此確定了同一相似或不同的氨基酸殘基的估分矩陣。這一方法是從產(chǎn)生兩個(gè)排列序列簇的兩個(gè)最相似的序列的對排列。然后，這一簇可以排列到次最大的相關(guān)序列或排列序列簇。兩簇序列可以通過簡單擴(kuò)展兩個(gè)個(gè)別序列的對排列來排列。通過一系列的改進(jìn)的，對排列可以完成最后的排列，逐步誘導(dǎo)不相似的序列和簇直到所有的序列包括在最后的對排列中。所以，對應(yīng)于野生型序列的位置555、566、573和580的新HIV-1分離物或工程化gp41分子的氨基酸位置可以容易地定位。
本發(fā)明的HIV-1 gp41多肽的優(yōu)選的變異體的特征是它包括了位置555的氨基酸取代，其中Leu555被天冬氨酸或谷氨酸取代了，谷氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。
本發(fā)明的HIV-1 gp41多肽的另外的優(yōu)選的變異體的特征是它包括了在位置566的氨基酸取代，其中Leu566被天冬氨酸或谷氨酸取代了，谷氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。
本發(fā)明的HIV-1 gp41多肽的其他的優(yōu)選的變異體的特征是它包括了在位置573的氨基酸取代，其中Ile573被絲氨酸或蘇氨酸取代，絲氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。
本發(fā)明的HIV-1 gp41多肽的其他優(yōu)選的變異體的特征是它包括了在位置580的氨基酸取代，其中Ile580被天冬氨酸或谷氨酸取代，谷氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。
本發(fā)明也涉及了在選自位置Leu554、Leu565和Val579的位置至少包括一個(gè)氨基酸取代最多包括三個(gè)氨基酸取代的HIV-2 gp36的變異體，其中這些位置已知來自HIV-2 gp36野生型序列(SEQ ID NO2)中的位點(diǎn)，或?qū)?yīng)于其中的已知位點(diǎn)，特征是取代氨基酸分別和獨(dú)立地選自絲氨酸、蘇氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、天冬氨酸和谷氨酸。
編號可以根據(jù)Guyader，M.等，Nature 326(1987)662-9公開的野生型序列(SEQ ID NO2)。對應(yīng)于這一序列中已知的位置的gp36的氨基酸位置是如上述關(guān)于gp41所述確定的。
本發(fā)明的HIV-2 gp36多肽的優(yōu)選的變異體的特征是它包括位置554的氨基酸取代，其中Leu554被天冬氨酸或谷氨酸取代，谷氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。
本發(fā)明的HIV-2 gp36多肽的優(yōu)選的變異體的特征是它包括了位置579的氨基酸取代，其中Val579是被天冬氨酸或谷氨酸取代，谷氨酸的取代是最優(yōu)選的取代。在變異體gp41或變異體gp36的優(yōu)選的實(shí)施方案中，分別包括了兩個(gè)氨基酸位點(diǎn)上的取代，如上所述。包括氨基酸取代的變異體也是優(yōu)選的。在其他的優(yōu)選的實(shí)施方案中，變異體gp41在上面詳細(xì)討論的四個(gè)氨基酸位點(diǎn)具有取代。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，gp41或gp36的完全的序列(即，沒有融合肽和跨膜區(qū)的胞外域)對應(yīng)的哺乳動物免疫缺陷病毒包被蛋白的完全序列(例如，來自HTLV的gp21)可以用于形成與PPI陪伴分子的復(fù)合物。同樣也可以利用逆病毒表面糖蛋白的片段，如Lu等(出處同上)敘述的HIV-1的gp41中的一個(gè)。這樣的片段優(yōu)選地包括gp41的細(xì)胞外部分的C末端螺旋以及N末端螺旋。
利用標(biāo)準(zhǔn)方法的重組技術(shù)可以生產(chǎn)包括位點(diǎn)535到681(名稱按照Chan，D.C.等，Cell 89(1997)263-73)的與診斷關(guān)聯(lián)的gp41。如Lu等(出處同上)的圖1所述，另一個(gè)有趣的gp41分子跨越了gp160前體分子的540-669。
作為逆病毒表面糖蛋白的典型例子，HIV的小的包被蛋白是極其難掌握的，具有非常特殊的特性。如已經(jīng)提到的，e-gp41分子的一個(gè)最關(guān)鍵的特征是它在生理緩沖條件下不溶。重組產(chǎn)生的gp41是可溶的，并且在pH3.0時(shí)具有似天然結(jié)構(gòu)，和低的離子強(qiáng)度。但是，甚至在這一pH，它仍然對緩沖液中的鹽濃度敏感。根據(jù)利用的鹽，在存在100到500mM以上的鹽時(shí)gp41沉淀了。如下面更詳細(xì)的討論，它再次可以在離液試劑中溶解(變性形式)。
生理緩沖條件通?？梢岳斫鉃閷?yīng)于鹽和動物的血漿或血清中發(fā)現(xiàn)的pH條件的，并且確定是pH7.4左右，鹽濃度約150mM。本發(fā)明的rsgp陪伴分子復(fù)合物容易在這些緩沖條件下溶解。其中存在的rsgp是有免疫活性的，所以可指向似天然結(jié)構(gòu)。當(dāng)有或沒有適當(dāng)?shù)娜ノ蹌┑念A(yù)處理時(shí)gp41在生理緩沖條件下(例如，20mM磷酸鈉pH7.4，150mM NaCl)基本不溶時(shí)，本發(fā)明的所述的復(fù)合物在根據(jù)適當(dāng)?shù)姆桨冈僬郫B后是容易溶解的。如包括在本發(fā)明的復(fù)合物中的gp41胞外域至少在100nM濃度下，優(yōu)選地在1μM和以上的濃度下，最優(yōu)選地在10μM或以上的濃度下是可溶的。所以，溶解度基本從亞納摩爾提高到約微摩爾濃度。
為了更好地理解本發(fā)明的范圍，必須強(qiáng)調(diào)，用于溶解和復(fù)性的緩沖條件可以如需要和適當(dāng)?shù)匦薷?，不一定要理解為是本發(fā)明的限制范圍，本發(fā)明可以在一個(gè)大的緩沖條件范圍內(nèi)成功地進(jìn)行。
生理緩沖液的總鹽濃度不是關(guān)鍵，只要陪伴分子-gp41復(fù)合物不解離，gp41保持在溶液中。優(yōu)選地，生理緩沖液至少含有10mM緩沖液系統(tǒng)，最多含有200mM的緩沖系統(tǒng)。其余的緩沖成分，如果可以，可以是鹽，沒有明顯的緩沖容量，例如氯化鈉。生理緩沖液優(yōu)選地具有20和500mM之間的鹽濃度，更優(yōu)選地是50和300mM之間的濃度，最優(yōu)選地是100和200mM之間的濃度。
在本發(fā)明的方法中，生理緩沖液可以變化，具有的pH范圍是5.0到8.5之間，更優(yōu)選地這樣的緩沖液的pH范圍是5.5到8.3。甚至更優(yōu)選地，這樣的生理緩沖液條件確定為上面給出的鹽濃度和6.0到8.0的pH值，最優(yōu)選地這樣的生理緩沖液的pH是在6.5到7.8之間。
根據(jù)本發(fā)明所述的方法，在非生理緩沖條件下溶解逆病毒表面糖蛋白，加入陪伴分子(或已經(jīng)作為共價(jià)連接另外的蛋白區(qū)存在)，然后，將含有溶解的逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子的混合物調(diào)節(jié)到生理緩沖液條件。當(dāng)這樣做的時(shí)候，逆病毒表面糖蛋白將自發(fā)地沉淀，令人驚異的是，它將在上面的過程中停留在溶液中。這一重要的發(fā)現(xiàn)最有可能是由于在逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子之間形成了復(fù)合物。
在大腸桿菌中重組生產(chǎn)gp41的情況中，得到了包含體形式的重組生產(chǎn)的gp41。利用高離液劑例如，7.0M硫氰酸胍溶解這一物質(zhì)。在這些條件下，gp41多肽還沒有構(gòu)成。通過在適當(dāng)?shù)牟襟E中，在pH3.0將緩沖液改變成30mM甲酸，溶液中的gp41假設(shè)是作為它的似天然全螺旋結(jié)構(gòu)觀察到的。檢測蛋白的正確或不正確折疊狀態(tài)的一個(gè)容易的方法是分析酰胺(185-250nm)和芳香基(260-320nm)區(qū)域中的CD光譜。另外，在光散射顆粒(如聚集體)上的信息可以容易地從標(biāo)準(zhǔn)的紫外光譜中得到。
重要的是，在本文中需要強(qiáng)調(diào)這樣的事實(shí)，本發(fā)明的逆病毒表面糖蛋白陪伴分子復(fù)合物內(nèi)的逆病毒表面糖蛋白采取了所謂的似天然折疊。相反，在中性pH已經(jīng)被離液劑溶解的逆病毒表面糖蛋白很大程度上未構(gòu)成，所以失去了有秩序的構(gòu)型表位?；蜻x地利用去污劑溶解逆病毒表面糖蛋白也是可能的。例如，已經(jīng)成功地利用十二烷基硫酸鈉(SDS)溶解gp41。但是，這樣的“SDS-溶解物質(zhì)”不是選擇的物質(zhì)，例如用于檢測gp41的抗體的免疫測試中。另外(如上討論)，這樣的免疫測試優(yōu)選地也檢測抗gp41的構(gòu)型表位的抗體，不能排除，去污劑確實(shí)部分地去除了構(gòu)型表位。
優(yōu)選地，本發(fā)明的rsgp-陪伴分子復(fù)合物的特征是rsgp是似天然折疊的。在這樣的復(fù)合物中的似天然rsgp例如具有需要的免疫學(xué)或物理特征。
似天然折疊優(yōu)選地是通過近紫外CD光譜評估，是在緊密球狀蛋白內(nèi)的四級結(jié)構(gòu)上報(bào)道的。已知gp41在約pH3.0和低離子強(qiáng)度的鹽濃度下容易溶解。近紫外CD數(shù)據(jù)證明，在這樣的緩沖條件下，gp41具有特征性橢圓率信號，具有典型的似天然折疊球狀蛋白的信號。如圖5所示，包括gp41和FkpA的融合肽的gp41部分在酸性緩沖液中具有這一典型的近紫外CD光譜。在生理緩沖液條件下，本發(fā)明的可溶復(fù)合物的近紫外CD光譜是正確折疊的陪伴分子和似天然折疊gp41的光譜組成。這在圖7中以FkpA-gp41融合蛋白表示。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，分析近紫外CD評估gp41陪伴分子復(fù)合物中的gp41的似天然折疊。優(yōu)選地，這一近紫外CD是用于證明分子gp41和陪伴分子是似天然折疊。
可溶陪伴分子gp41復(fù)合物的生產(chǎn)是從非生理緩沖液條件開始的。在陪伴分子和游離靶蛋白(例如來自HIV-1的gp41)之間的復(fù)合物形成的情況中，“非生理”緩沖液不得不符合兩個(gè)要求，(a)gp41以似天然酸性結(jié)構(gòu)存在，和(b)PPI陪伴分子至少具有部分功能(即結(jié)合感應(yīng))。從這樣的緩沖液條件開始，陪伴分子結(jié)合了成淀粉樣蛋白，從非生理到或多或少的生理?xiàng)l件地改變緩沖液條件在不沉淀成淀粉樣蛋白時(shí)是可能的。
雖然陪伴分子通常結(jié)合變性蛋白，并且作用于它們，從而有助于它們的正確(再)折疊，本發(fā)明所基于的情況是非常不同的。在適當(dāng)?shù)姆巧砭彌_條件下溶解的gp41似乎是以似天然形式存在的(例如圖1A和1B和圖5)。與陪伴分子功能的習(xí)慣觀點(diǎn)不同，在本發(fā)明的方法中，陪伴分子似乎似乎結(jié)合了似天然折疊蛋白，在gp41不溶和沉淀的緩沖條件下溶解這一蛋白。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，PPI陪伴分子選自FkpA、SlyD和引發(fā)因子。
已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，特別地，F(xiàn)kpA或SlyD能提高gp41的溶解度，形成穩(wěn)定的復(fù)合物。所以，其他優(yōu)選的實(shí)施方案的特征是陪伴分子選自FkpA和SlyD。最優(yōu)選的是陪伴分子FkpA。
如上所述，同樣的陪伴分子的片段可以用于產(chǎn)生需要的功能。在單元陪伴分子的情況中，如FKBP，包括了催化單元(module)和結(jié)合單元，優(yōu)選的是這樣的片段至少包括了結(jié)合區(qū)，或者這些片段至少基本具有與結(jié)合區(qū)可比較的功能。
FKBP12是FKBP家族的人類成員，基本包括PPIase的催化異構(gòu)酶區(qū)域。由于缺乏其他的多肽結(jié)合區(qū)域，它與其他FKBP家族的成員相比與未折疊或部分折疊的蛋白具有的結(jié)合親和力明顯下降。已經(jīng)表明，F(xiàn)KBP12去折疊和再折疊是可逆的過程(Egan，D.A.等，Biochemistry 32(1993)1920-7；Scholz，C.等，J Biol Chem271(1996)12703-7)。我們發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)kpA(25-270)和SlyD(1-165)的再折疊和去折疊是可逆的，所以可以滿足本文所述的過程的要求。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括gp41和選自FKBP家族的陪伴分子的可溶復(fù)合物。
如上所述，通過混合PPI陪伴分子(例如，通過重組技術(shù)生產(chǎn))和重組生產(chǎn)的gp41可以容易地制備包括來自HIV-1的gp41的可溶復(fù)合物或從另一個(gè)哺乳動物免疫缺陷病毒產(chǎn)生的同源物。然后，在兩個(gè)獨(dú)立的分子之間，即分子間形成了復(fù)合物。
復(fù)合物的形成是動態(tài)過程，其中解離和再結(jié)合的發(fā)生是并行的。對于分子內(nèi)和分子間(例如，在融合構(gòu)建體中)結(jié)合，例如FkpA和gp41之間，這是真實(shí)的。由于gp41可以立即和定量地從生理緩沖溶液中沉淀出來，不得不選擇兩個(gè)伴侶的濃度，保證只有非關(guān)鍵或非聚集濃度的游離形式的gp41存在，所以，大量的gp41是以gp41陪伴分子復(fù)合物的形式結(jié)合和溶解的。
根據(jù)利用的陪伴分子，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，與gp41分子比較，需要混合至少2倍摩爾數(shù)的陪伴分子。所以，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括gp41和陪伴分子，優(yōu)選的FkpA的混合物的試劑。優(yōu)選地，這樣的混合物含有比gp41更多的摩爾數(shù)的FkpA。優(yōu)選地，含有3到10倍多的FkpA。FkpA與gp41最優(yōu)選的摩爾比例是在4到6之間。
也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，例如，在包括至少共價(jià)結(jié)合一個(gè)rsgp區(qū)域和至少一個(gè)PPI陪伴分子區(qū)域的蛋白的不同區(qū)域之間形成分子中復(fù)合物導(dǎo)致了其他的有利的效果，例如關(guān)于穩(wěn)定性和生產(chǎn)的難易。例如，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，如果兩個(gè)區(qū)域是共價(jià)連接的，1∶1的比例(rsgp與陪伴分子)足以形成可溶的復(fù)合物。
重組連接形式的包括逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子的可溶復(fù)合物代表了本發(fā)明的另外的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。包括在這樣的重組多肽中的最優(yōu)選的rsgp是來自HIV-1的gp41和來自HIV-2的gp36。
對于至少包括一個(gè)rsgp區(qū)域和至少一個(gè)PPI陪伴分子區(qū)域的重組蛋白，從非生理到生理緩沖條件的轉(zhuǎn)變可以不同的方法來完成。通過透析，快速稀釋或基質(zhì)輔助再折疊將非生理緩沖條件調(diào)節(jié)到生理緩沖條件可以容易地得到gp41和FkpA之間的可溶分子中復(fù)合物。包括可溶的gp41陪伴分子復(fù)合物的混合物可以直接用于修飾。
包括例如本發(fā)明的gp41和PPI陪伴分子的可溶復(fù)合物也可以從包括重組技術(shù)得到的兩個(gè)蛋白區(qū)域(gp41和陪伴分子)的一個(gè)多肽開始生產(chǎn)。其中的gp41陪伴分子復(fù)合物是天然的分子中的。優(yōu)選地，本發(fā)明的重組多肽包括gp41和陪伴分子或gp36和陪伴分子。仍然在本發(fā)明的其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及了至少包括一個(gè)rsgp區(qū)域和至少兩個(gè)PPI陪伴分子區(qū)域的重組蛋白。包括一個(gè)rsgp區(qū)域和兩個(gè)PPI陪伴分子的重組多肽也是優(yōu)選的。
利用了標(biāo)準(zhǔn)生物學(xué)技術(shù)表達(dá)了本發(fā)明的用于得到可溶gp41-陪伴分子復(fù)合物的重組多肽。優(yōu)選地，陪伴分子基因放置于靶蛋白基因上游框架中的包括gp41的遺傳信息或者同時(shí)包括適當(dāng)?shù)碾慕宇^序列的遺傳信息的表達(dá)載體中。這樣的重組融合蛋白的優(yōu)選的大規(guī)模生產(chǎn)的宿主是大腸桿菌。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括gp41或gp36和來自陪伴分子的肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的陪伴分子的可溶復(fù)合物。仍然優(yōu)選的是，可溶復(fù)合物是分子間復(fù)合物，優(yōu)選地是包括gp41或gp36和PPI陪伴分子的重組多肽內(nèi)的分子間復(fù)合物。最優(yōu)選地，重組多肽的PPI陪伴分子部分沒有任何輸出信號肽(對應(yīng)于前體分子)和對應(yīng)于成熟的PPI陪伴分子。由于在這一優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組蛋白沒有功能信號序列，基因產(chǎn)物在細(xì)菌胞質(zhì)中積累。
包括在重組產(chǎn)生的FkpA-gp41中的gp41的令人驚異的特征是它與“沒有陪伴分子”的gp41的胞外區(qū)相比的突出的可溶性。有趣的是，“離液物質(zhì)“(即，在6.0-7.0M GuHCl中的FkpA-gp41)可以不同的方式再折疊，導(dǎo)致產(chǎn)生了熱動力學(xué)穩(wěn)定的和可溶的似天然形式。再折疊通過透析和通過快速稀釋，以及通過復(fù)性大小排除層析或基質(zhì)輔助再折疊可以高產(chǎn)量得到。這些發(fā)現(xiàn)表明，以這一共價(jià)連接形式，gp41-FkpA融合多肽是比可轉(zhuǎn)移蛋白更加熱動力學(xué)穩(wěn)定。
重組FkpA-gp41多肽包括兩個(gè)具有不同折疊要求的蛋白區(qū)域。由于純化方案包括最初的變性步驟，陪伴分子的折疊必須是可逆的。確實(shí)，存在共價(jià)連接的蛋白復(fù)合物中FkpA和gp41的可逆的和獨(dú)立的再折疊的競爭性光譜證據(jù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，C末端截短的SlyD的再折疊是可逆的。
同樣優(yōu)選的是，包括逆病毒表面糖蛋白和陪伴分子的重組多肽另外包括這兩個(gè)多肽區(qū)域之間的適當(dāng)?shù)碾慕宇^序列。選擇這樣的肽接頭序列保證了利用的rsgp和陪伴分子區(qū)域的最佳分子中結(jié)合。優(yōu)選地，這樣的接頭序列是約20個(gè)氨基酸長，并且包括有靈活性和溶解性的氨基酸，例如甘氨酸和絲氨酸。優(yōu)選地，接頭是10到50個(gè)氨基酸長度。更優(yōu)選地，長度是12到40個(gè)氨基酸。最優(yōu)選地，接頭包括15到35個(gè)氨基酸。Rsgp和陪伴分子總是最接近的(在一起，例如通過適當(dāng)?shù)慕宇^)。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，重組多肽包括與它的靶蛋白通過靈活的接頭連接的成熟FkpA。如數(shù)據(jù)表明的，這產(chǎn)生了其他的穩(wěn)定的效果。
令人驚異地發(fā)現(xiàn)了，作為PPI陪伴分子和gp41之間的分子中復(fù)合物的一部分的gp41是可溶和穩(wěn)定的。包括來自HTLV的PPI陪伴分子和gp36或PPI陪伴分子和gp21的分子中復(fù)合物是相同的。在這樣的復(fù)合物中的gp41的穩(wěn)定性的提高帶來了其他的優(yōu)點(diǎn)。例如，可能非常容易地得到完全復(fù)性的重組gp41陪伴分子分子。重組蛋白最初是通過用離液劑(例如，鹽酸胍)處理來溶解的。在凝膠過濾柱上簡單地通過溶解物質(zhì)，可以得到用適當(dāng)?shù)纳砭彌_液平衡的包括共價(jià)連接的蛋白區(qū)域的完全復(fù)性的蛋白(例如，實(shí)施例2.3和圖7和8)。
可溶的分子中g(shù)p41陪伴分子復(fù)合物仍然具有其他令人吃驚的優(yōu)點(diǎn)。它對于去污劑的變性作用是相當(dāng)穩(wěn)定的。如果融合蛋白含有兩個(gè)陪伴分子和一個(gè)gp41或一個(gè)gp36，這一效果更加明顯。為了降低，至少部分避免非特異結(jié)合引起的問題，大多數(shù)免疫測試是在存在去污劑的情況下進(jìn)行的。因?yàn)榍懊嫣岬降脑?，在HIV診斷中，利用了更強(qiáng)的去污劑，同時(shí)分解了病毒顆粒，所以簡化了病毒抗原如gp24的檢測。
在常規(guī)利用的測試緩沖液中，例如在檢測抗HIV抗體或gp24抗原中，SDS(十二烷基硫酸鈉)溶解的重組生產(chǎn)的gp41胞外區(qū)不是免疫反應(yīng)的(見圖9)。但是，在相同的緩沖液條件下，作為本發(fā)明的PPI陪伴分子的分子中復(fù)合物的一部分的gp41是強(qiáng)烈地不發(fā)生免疫反應(yīng)的。正如可以從圖9看到的，在相同的測試條件下，和在相同的患者血清中，這一物質(zhì)產(chǎn)生了良好的競爭曲線，這只有用在存在測試去污劑時(shí)穩(wěn)定的似天然可溶gp41的存在來解釋。
本發(fā)明的復(fù)合物的一個(gè)非常重要的特征是在生理緩沖條件下(例如，在pH7.4，在20mM磷酸150mM氯化鈉緩沖液下，可溶的rsgp陪伴分子復(fù)合物中的rsgp是似天然折疊的。這在治療以及診斷應(yīng)用中是有巨大的優(yōu)點(diǎn)的。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了在生理緩沖條件下可溶的試劑的組合物，包括了逆病毒表面糖蛋白和選自肽基脯氨酰基異構(gòu)酶類陪伴分子的分子中和分子間復(fù)合物。
所以，包括來自HIV-1的似天然折疊gp41和選自肽基脯氨酰基異構(gòu)酶類陪伴分子的可溶復(fù)合物代表了本發(fā)明的非常優(yōu)選的實(shí)施方案。
所以包括來自HIV-2的似天然折疊gp36和選自肽基脯氨?；悩?gòu)酶類的陪伴分子的可溶復(fù)合物也代表了本發(fā)明的非常優(yōu)選的實(shí)施方案。
對治療而言，提供“可溶的和似天然折疊”的gp41或gp36帶來的進(jìn)步是十分明顯的。第一次，可以在生理緩沖條件下注射例如gp41。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，如上所述的可溶復(fù)合物用于生產(chǎn)用作藥物的藥劑的組合物。試劑的組合物包括gp41陪伴分子復(fù)合物和生理可接受賦形劑，如果適當(dāng)?shù)兀ㄟm當(dāng)?shù)奶砑觿┖?或常規(guī)的輔助物質(zhì)。
已知，從gp41 heptad重復(fù)或從gp41C末端螺旋產(chǎn)生的肽具有抗病毒活性(Wild，C.等，Proc Natl Acad Sci USA 89(1992)10537-41)。通過與所謂的gp41的“發(fā)夾-中間產(chǎn)物”的相互作用它們阻礙了病毒的進(jìn)入(綜述見Doms，R.W.和Moore，J.P.，J Cell Biol 151(2000)F9-14)。我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的rsgp-陪伴分子復(fù)合物具有抗病毒活性。在第一優(yōu)選的治療應(yīng)用中含有治療有效量的gp41-陪伴分子復(fù)合物或gp36陪伴分子復(fù)合物的試劑的組合物是用于在宿主有機(jī)體中防止HIV的進(jìn)入和HIV的傳播的(“病毒進(jìn)入抑制”)。
它代表了包括gp41陪伴分子復(fù)合物的試劑的組合物的另外的優(yōu)選的治療應(yīng)用，其中利用了這樣的組合物在哺乳動物中引發(fā)了免疫應(yīng)答。所述的復(fù)合物可以有比其他任何HIV免疫原更多的gp41表位(例如Root等，出處同上)。所以，新的免疫原可以預(yù)期誘導(dǎo)更廣泛的免疫應(yīng)答。
關(guān)于診斷方法，本發(fā)明的可溶的rsgp-陪伴分子復(fù)合物的明顯的優(yōu)點(diǎn)是例如逆病毒表面糖蛋白例如gp41在生理緩沖條件下穩(wěn)定性提高，和/或診斷的靈敏性提高，和/或存在的構(gòu)象表位的數(shù)目增加，和/或更有可能容易地標(biāo)記正確折疊的rsgp，如gp41。
已知的標(biāo)記物是標(biāo)記基團(tuán)或效應(yīng)基團(tuán)，如固相結(jié)合基團(tuán)。被標(biāo)記的可溶rsgp-陪伴分子復(fù)合物代表了本發(fā)明的進(jìn)一步優(yōu)選的實(shí)施方案。
標(biāo)記基團(tuán)可以選自任何已知的可檢測標(biāo)記基團(tuán)，如染料，發(fā)光標(biāo)記基團(tuán)，如化學(xué)發(fā)光基團(tuán)，例如丫啶酯或dioxetanes，或熒光染料，例如，熒光素、香豆素、羅丹明、噁嗪、試鹵靈、花青和它們的衍生物。標(biāo)記基團(tuán)的其他例子是發(fā)光金屬復(fù)合物，如釕或銪復(fù)合物，酶，例如ELISA或CEDIA中利用的(克隆酶供體免疫測試，例如，EP-A-0 061 888)，和放射性同位素。
效應(yīng)基團(tuán)包括例如，生物親和結(jié)合對的一個(gè)伴侶(partner)。在進(jìn)行測試時(shí)，效應(yīng)物基團(tuán)特異地和優(yōu)選地與生物親和結(jié)合對非共價(jià)地相互作用。適當(dāng)?shù)慕Y(jié)合對的例子是半抗原或/抗原/抗體，生物素或生物素類似物如氨基生物素，亞胺生物素或脫硫生物素/抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白，糖/植物凝集素，核酸或核酸類似物/互補(bǔ)核酸和受體/配體，例如固醇類激素受體/固醇類激素。優(yōu)選的結(jié)合對成員包括半抗原，抗原和激素。特別優(yōu)選的是半抗原，如地高辛和生物素和其類似物。
包括rsgp和PPI陪伴分子的可溶的復(fù)合物優(yōu)選地用于檢測rsgp的抗體的檢測的免疫測試。優(yōu)選地，利用了gp41-和/或gp36-陪伴分子復(fù)合物。在非常優(yōu)選的實(shí)施方案中，在檢測gp41的抗體免疫測試中利用了包括gp41和PPI陪伴分子的標(biāo)記可溶復(fù)合物。最優(yōu)選地，標(biāo)記復(fù)合物是包括PPI陪伴分子和gp41的重組多肽中的分子間復(fù)合物。
免疫測試是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。進(jìn)行這樣的測試以及實(shí)踐應(yīng)用和方法中的方法在相關(guān)的書本中有概括。相關(guān)的書本的例子是Tijssen，P.，在“酶免疫測試的實(shí)踐和理論”中的酶抗體或其他酶大分子共軛物的制備(1990)221-278，Eds.R.H.Burdon和v.P.H.Knippenberg，Elsevier，Amsterdam)和Tijssen的不同卷中，“酶學(xué)方法”(1980)，Eds，S.P.Colowick，N.O.Calplan和S.P.，Academic Press)，關(guān)于免疫檢測方法，特別地可以在70，73，74，84，92和121卷中找到。
新的可溶rsgp-PPI陪伴分子復(fù)合物可以用于改良與檢測方式無關(guān)的抗HIV抗體的檢測的測試中(例如，放射性同位素測試、酶免疫測試、電化學(xué)發(fā)光測試等等)或測試原理中(例如，測試條測試、三明治測試或同源測試，等等)。
對于HIV感染的可靠而靈敏的早期檢測，必須測量體液樣品中的病毒抗原以及抗病毒抗體。本發(fā)明的可溶的復(fù)合物能在生理緩沖條件下檢測抗gp41和/或抗gp36抗體。抗gp41和/或抗gp36抗體的檢測在這樣的結(jié)合HIV檢測系統(tǒng)中是有價(jià)值的。所以在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及包括根據(jù)gp41和/或gp36陪伴分子的用途檢測抗gp41/或抗gp36抗體的檢測的HIV檢測系統(tǒng)。最優(yōu)選地，基于這樣的復(fù)合物的抗gp41和/或抗gp36抗體的檢測是與HIV抗原優(yōu)選地p24抗原一起檢測的。
如本領(lǐng)域已知，抗感染因子如細(xì)菌，真菌或病毒的抗體優(yōu)選地通過雙抗原橋連概念進(jìn)行的測試來進(jìn)行檢測(有時(shí)，測試概念也稱為雙抗原橋連概念，因?yàn)閮蓚€(gè)抗原是通過抗體連接的)。在這樣的一個(gè)測試中，至少結(jié)合給定抗原的兩個(gè)不同分子與它的兩個(gè)(IgG，IgA，IgE)或10(IgM)的互補(bǔ)位的抗體的能力是要求的和可利用的。
根據(jù)橋連概念檢測來自體液的抗體的檢測可以在不同的測試步驟中進(jìn)行。簡單的步驟包括直接將抗原包被到固相上，和利用標(biāo)記形式的相同抗原。在適當(dāng)?shù)臏y試條件下，樣品中的抗體形成了固相結(jié)合抗原和標(biāo)記抗原之間的橋連。所以，只有當(dāng)在研究中的抗體是存在在樣品中的，是形成橋連的，才可以檢測信號。
“固相抗原”和“檢測抗原”的基本結(jié)構(gòu)優(yōu)選地是相同的。例如，包括一個(gè)或幾個(gè)表位的多肽可以直接或間接地包被到固相上，但是同樣的合成多肽結(jié)合到標(biāo)記和標(biāo)記物上可以用作檢測抗原。同樣可以利用相似但不同的抗原，可以在雙抗原橋連測試中免疫交叉反應(yīng)。進(jìn)行這樣的測試的基本要求是在兩個(gè)抗原上存在相關(guān)的表位或相關(guān)的幾個(gè)表位。很明顯，雙抗原橋連測試形式中有許多變體。這樣的變體包括例如，直接包被到固相的抗原。優(yōu)選地，特異的結(jié)合對，最優(yōu)選地生物素-鏈霉抗生物素蛋白(或抗生物素蛋白)系統(tǒng)用于間接結(jié)合抗原到固相上。用另一句話說，在這樣的系統(tǒng)中用于檢測的抗原可以不直接攜帶標(biāo)記(例如，放射性同位素，酶，熒光分子等等)，但可以間接通過例如攜帶半抗原(例如，地高辛)來檢測。然后，間接的檢測可以通過標(biāo)記的抗地高辛抗體進(jìn)行。
在本發(fā)明的優(yōu)選的實(shí)施方案中，涉及了雙抗原橋連概念的免疫測試，包括第一抗原，其中包括了第一陪伴分子抗原復(fù)合物，和第二抗原，其中包括了第二陪伴分子抗原復(fù)合物。
在其他優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及了雙抗原橋連概念下的免疫測試，特征是第一抗原復(fù)合物用作捕獲抗原，第二陪伴分子抗原復(fù)合物用作檢測抗原。
如本發(fā)明所述的陪伴分子抗原復(fù)合物不僅帶來在其他條件下難于掌握的各種多肽的可溶性，而且也允許雙抗原橋連概念下的非常有利的免疫測試。
雙抗原橋連概念下的這樣的免疫測試的一個(gè)特別吸引人的特征是，現(xiàn)在可以利用不同的陪伴分子用于與固相結(jié)合抗原的復(fù)合物的形成和與檢測抗原的復(fù)合物的形成。這樣的一個(gè)測試的改進(jìn)進(jìn)一步在非特異結(jié)合的問題上提高了。如果不同的陪伴分子用于復(fù)合固相抗原和檢測抗原，與陪伴分子反應(yīng)并且所以引起了假陽性信號的樣品中的抗體將不會形成橋。所以，在這一發(fā)明方式中，由于非特異結(jié)合的陽性信號的類似可能性大大地降低了。所以，在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及雙抗原橋連概念下的免疫測試，特征是第一和第二陪伴分子-抗原復(fù)合物的第一陪伴分子和第二陪伴分子相互不同。
已經(jīng)從廣泛用于生物技術(shù)研究中的大腸桿菌中分離了已經(jīng)很好表征的大多數(shù)陪伴分子。由于大腸桿菌是廣泛分布的細(xì)菌種類，許多哺乳動物已經(jīng)發(fā)展了抗這一細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白的抗體。為了降低這樣的抗體引起的假陽性反應(yīng)的可能性，優(yōu)選地至少利用一個(gè)從不同細(xì)菌種類優(yōu)選地是嗜熱細(xì)菌產(chǎn)生的PPI陪伴分子。優(yōu)選地，陪伴分子是從嗜極(extremophilic)細(xì)菌(特別是Thermatoga maritima，Aquifex aeolicus和棲熱菌)產(chǎn)生的。
一般在免疫測試中，優(yōu)選地在橋連概念的免疫測試中利用陪伴分子-抗原復(fù)合物同樣提供了產(chǎn)生這樣的復(fù)合物的陪伴分子的可能性，并且不要求抗原本身的修飾。通常接受的是，第二化學(xué)成分對多肽的修飾，例如標(biāo)記到該分子的偶聯(lián)包括有負(fù)面影響多肽的危險(xiǎn)。例如，在研究中的表位可以調(diào)節(jié)，或者可以通過這樣的標(biāo)記來導(dǎo)致非特異結(jié)合。根據(jù)本發(fā)明，現(xiàn)在已有可能在陪伴分子抗原復(fù)合物中特異地產(chǎn)生陪伴分子。
在優(yōu)選的實(shí)施方案中，雙抗原橋連概念下的免疫測試另外的特征是用作捕獲抗原的第一陪伴分子抗原復(fù)合物包括了固相結(jié)合組。
在另外的優(yōu)選的實(shí)施方案，進(jìn)行了橋連概念下的免疫測試，其另外的特征是用作檢測抗原的第二陪伴分子抗原復(fù)合物包括了標(biāo)記基團(tuán)。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，包括rsgp和PPI陪伴分子的可溶復(fù)合物，如gp41-和/或gp36-陪伴分子復(fù)合物也可以用于引發(fā)受試者中如人或非人動物中的免疫應(yīng)答?？梢詫κ茉囌呤┯冒诮M合物中的可溶復(fù)合物，如那些可能含有賦形劑或載體的那些。這樣的組合物也可以包括佐劑。常規(guī)佐劑的例子包括但不限于，F(xiàn)reund不完全佐劑，F(xiàn)reund完全佐劑，Merck 65，AS-2，鋁，磷酸鋁，礦質(zhì)凝膠，如氫氧化鋁，和表面活性物質(zhì)，如溶血卵磷脂，pluronic多元醇，聚陰離子，肽，油乳膠，鑰孔血藍(lán)蛋白和二硝基苯酚。其他有用的佐劑包括但不限于，細(xì)菌莢膜多糖，葡聚糖，IL-12，GM-CSF，CD40配體，IFN-γ，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-10，IL-13，IL-18或任何細(xì)胞因子或細(xì)菌DNA片段。
可以給予一個(gè)劑量(給藥)的可溶復(fù)合物組合物。但是，第一次給藥后可以給予加強(qiáng)劑量，如一次，兩次，三次或更多。施用給受試者的劑量的數(shù)目部分地依據(jù)受試者對可溶復(fù)合物組合物的應(yīng)答。在本發(fā)明的范圍內(nèi)，適當(dāng)?shù)膭┝繑?shù)目包括免疫動物要求的任何可溶復(fù)合物的量。
第二次給藥(加強(qiáng)給藥)可溶復(fù)合物組合物可以在第一次給藥后7天到1年之間給予。第一次和第二次給藥之間的時(shí)間可以是最初給藥后14天到6個(gè)月，21天到3個(gè)月，經(jīng)常在28天到2個(gè)月之間。第3次給藥(第二次加強(qiáng)給藥)可以在第一次給藥后約14天到10年之間給予，例如在14天到3年，經(jīng)常在約21天到1年，更經(jīng)常在第一次給藥后28天到6個(gè)月。隨后的加強(qiáng)給藥可以間隔2星期，或1個(gè)月，3個(gè)月或6個(gè)月到10年的間隔。
通常，對受試者施用的可溶復(fù)合物的量是足以免疫動物抗抗原的量(即“免疫有效量”或“治療有效量”)。完成“免疫有效量”的適當(dāng)?shù)牧繉⑷Q于受試者的體重，和一般的健康狀況，和醫(yī)生或其他質(zhì)量人員的判斷。
可以在動物模型中配制可溶復(fù)合物的有效劑量來完成免疫應(yīng)答的誘導(dǎo)，這樣的數(shù)據(jù)可以用于在動物數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上容易地使對人的給藥最佳化。劑量典型地是在約1fg到約100μg之間，經(jīng)常在約1pg到約100μg之間，更經(jīng)常地在約1ng到約50μg之間，通常在約100ng到約5Oμg之間。在一些實(shí)施方案中，劑量在每kg受試者體重約1fg到約100μg之間，經(jīng)常在約1pg到約100μg，更經(jīng)常在約1ng到約50μg之間，通常在約100ng到約50μg之間每kg受試者體重。
本發(fā)明的含有可溶復(fù)合物的組合物可以各種方式和各種形式給藥?？扇軓?fù)合物組合物可以包括載體和賦形劑，如緩沖液，碳水化合物，甘露醇，蛋白，多肽或氨基酸，如甘氨酸，抗氧化劑，抑細(xì)菌劑，螯合劑，懸浮劑，增稠劑，和/或防腐劑；水，油，鹽溶液，葡聚糖，和甘油溶液，其他藥物可接受輔助物質(zhì)如適當(dāng)?shù)纳項(xiàng)l件所要求，如緩沖試劑，張力調(diào)節(jié)試劑，增濕劑等等。常規(guī)的佐劑也可以摻入組合物中。
適當(dāng)?shù)妮d體可以用于施用本發(fā)明的組合物，載體的類型將取決于給藥的方式?；衔镆部梢园以谥|(zhì)體中?？缮锝到馕⑶蝮w在一些情況中常規(guī)的是載體，例如在(Tice等，US專利5,942,252，1999)中所述。
組合物的滅菌是需要的，如常規(guī)技術(shù)完成的，如無菌過濾。得到的水溶液可以包裝使用或凍干。
本發(fā)明的組合物的可溶復(fù)合物可以各種方式來給藥，包括注射(例如，在皮內(nèi)、皮下、肌肉內(nèi)、腹膜內(nèi)等等)，通過吸入，通過局部給藥，通過栓劑，通過經(jīng)皮的膏藥，或通過口腔。
當(dāng)通過注射給藥時(shí)，組合物可以配制成水溶液，優(yōu)選地是在生理相容緩沖液中，如Hanks溶液，Ring溶液，20mM磷酸150mM氯化鈉緩沖液(pH7.4)，或生理鹽緩沖液中。溶液可以含有配制試劑，如懸浮液，穩(wěn)定和/或分散試劑?；蛘撸M合物可以是粉末形式，用于在使用之前與適當(dāng)?shù)妮d體的構(gòu)成，例如無菌的無致熱原的水。吸入遞送組合物可以是來自利用適當(dāng)?shù)耐七M(jìn)劑的壓力包或氣霧器的氣霧噴灑，推進(jìn)劑如二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氧化碳或其他適當(dāng)?shù)臍怏w。在壓力氣霧的情況中，劑量單位可以通過一個(gè)閥來確定遞送量。膠囊和柱體例如用于吸入器的明膠可以配制成含有蛋白的粉末混合物或適當(dāng)?shù)姆勰┗|(zhì)如乳糖或淀粉。對于局部給藥，組合物可以配制成溶液、凝膠、油膏、乳液、懸浮液，等等，如本領(lǐng)域已知的。在一些實(shí)施方案中，給藥是通過經(jīng)皮的膏藥的。栓劑組合物也可以配制成含有常規(guī)栓劑基質(zhì)的。
當(dāng)給藥是口服時(shí)，組合物可以通過將組合物與藥物可接受載體結(jié)合容易地配制。固體載體包括甘露醇，乳糖，硬脂酸鎂等等；這樣的載體能配制成片劑，丸劑，糖丸，膠囊，液體，凝膠，糖漿，糖液，懸浮液等等用于口服攝入。這樣的制劑可以是粉末，膠囊和片劑；適當(dāng)?shù)馁x形劑包括填充劑如糖，纖維素制劑，顆粒劑和結(jié)合試劑。
生產(chǎn)包括結(jié)合片段(例如，F(xiàn)(ab)2)和單鏈形式的多克隆和單克隆抗體的方法是已知的。但是，許多抗原是不能引發(fā)適當(dāng)?shù)目贵w應(yīng)答的。在一個(gè)實(shí)施方案中，包括本發(fā)明的可溶復(fù)合物的組合物和抗體是對動物給藥的，因此引發(fā)了動物中的免疫應(yīng)答。多克隆和單克隆抗體隨后通過標(biāo)準(zhǔn)的技術(shù)制備。
包括rsgp和PPI陪伴分子的可溶復(fù)合物，如gp41-和/或gp36陪伴分子復(fù)合物也可以用于抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞，如通過抑制膜融合。細(xì)胞可以是體外，體內(nèi)或間接體內(nèi)(ex vivo)。給藥的組合物和方法相似于用于引發(fā)免疫應(yīng)答的組合物和方法所述的那些。如果抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞是利用接種來完成的，則可以利用佐劑。對于體外和來自體內(nèi)的給藥，本領(lǐng)域的一個(gè)技術(shù)人員將部分地根據(jù)細(xì)胞培養(yǎng)條件和時(shí)間的限制來選擇適當(dāng)?shù)姆椒ā＠?，一個(gè)這樣的有用的方法將配制攜帶可溶復(fù)合物的脂質(zhì)體。
下面的實(shí)施例，參考文獻(xiàn)和附圖是提供用于輔助理解本發(fā)明的，真正的范圍在附加的權(quán)利要求中給出?？梢岳斫?，在不脫離本發(fā)明的精神范圍的情況下可以在所述方法中進(jìn)行各種修改。
實(shí)施例實(shí)施例1包括gp41和PPI陪伴分子的可溶的分子間復(fù)合物的生產(chǎn)1.1大腸桿菌FkpA的生產(chǎn)根據(jù)Bothmann，H.和Pluckthun，A.，J Bio Chem 275(2000)17100-5，進(jìn)行一些小的修改后克隆、表達(dá)、純化FkpA。為了存儲，用20mMNaH2PO4/NaOH(pH6.0)，100mM NaCl透析蛋白溶液，濃縮到26mg/ml(1mM)。
對于胞質(zhì)表達(dá)，修改上面的表達(dá)載體的FkpA編碼序列，使缺失編碼信號肽序列部分，只包括成熟FkpA的編碼區(qū)。
1.2gp41(535-681)-His6的生產(chǎn)在T7啟動子基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)中表達(dá)gp41(535-681)-His6，并且在宿主細(xì)胞的內(nèi)含體中積累。在6M鹽酸胍中溶解分離的內(nèi)含體。在Ni-螯合柱上純化His-標(biāo)記的蛋白，接著在Sephacryl 100上在6M胍中凝膠過濾。如Wingfield，P.T.等，Protein Sci 6(1997)1653-60所述的快速修飾再折疊蛋白。最后的緩沖液條件是30mM甲酸鈉，pH3.0。對兩個(gè)緩沖液條件，利用近和遠(yuǎn)紫外CD評估折疊的狀態(tài)。如圖1A和1B可以看到的，遠(yuǎn)和近紫外CD光譜表明，gp41只在pH3.0和在沒有離液劑的情況下采取似天然折疊。
1.3在存在大腸桿菌FkpA時(shí)，從pH3.0到生理pH，gp41胞外域(HIV)的pH改變1.3.1對照實(shí)驗(yàn)在對照實(shí)驗(yàn)中，在最后緩沖條件為20mM磷酸鈉(pH7.5)，50mMNaCl，1mM EDTA中將可溶e-gp41(在30mM甲酸，pH3.0)稀釋100倍。最后的蛋白濃度約為1μM。在1分鐘和10分鐘后記錄紫外光譜。來自圖2的紫外光譜很明顯，在pH轉(zhuǎn)變到中性時(shí)非陪伴分子的胞外域自發(fā)聚集。圖2指強(qiáng)調(diào)了gp41的特別的聚集趨勢；分子的自發(fā)聚集進(jìn)行到上面的線表明的時(shí)期以外。
1.3.2在pH3.0用FkpA預(yù)溫育gp41能轉(zhuǎn)變到中性pH為了測試分子陪伴分子FkpA的溶解潛力，以摩爾比1∶2和1∶4(在30mM的甲酸，在pH約3.5)時(shí)混合gp41和FkpA，共溫育1分鐘。然后，通過在20mM磷酸鈉pH(7.4)，50mM NaCl，1mM EDTA的緩沖液條件中稀釋12倍，將得到的復(fù)合物轉(zhuǎn)變到中性pH。在試管中的結(jié)合伴侶的最后濃度是1μM gp41，2μM和4μM FkpA。所有反應(yīng)是在室溫下進(jìn)行的。在1和10分鐘后，記錄紫外光譜，測試gp41樣品的聚集。從圖3A和3B可知，有跡象FkpA基本降低了依賴劑量的方式下gp41的聚集。利用來自Thermatoga maritima的引發(fā)因子和利用來自大腸桿菌的C末端截短的SlyD已經(jīng)得到比較數(shù)據(jù)。
實(shí)施例2共價(jià)連接的gp41-FkpA的重組生產(chǎn)2.1包括FkpA和gp41的表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建在第一步，利用Stratagene(La Jolla，CA；USA)的QuikChange定點(diǎn)誘變試劑盒刪除實(shí)施例1.1質(zhì)粒中的成熟大腸桿菌FkpA的編碼區(qū)中的限制位點(diǎn)BamHI。引物如下5’-gcgggtgttccgggtatcccaccgaattc-3’(SEQ ID NO3)5’-gaattcggtgggatacccggaacacccgc-3’(SEQ ID NO4)構(gòu)建體命名為EcFkpA(ΔBamHI)[GGGS]3。
在第二步中，通過PCR，從實(shí)施例1.2擴(kuò)增編碼來自HIV-1包被蛋白的氨基酸535-681的基因片段，其中利用了如下的引物
5’-cgggatccggtggcggttcaggcggtggctctggtggcggtacgctgacggtacaggccag-3’(SEQ ID NO5)5’-ccgctcgaggtaccacagccaatttgttat-3’(SEQ ID NO6)利用BamHI和XhoI限制位點(diǎn)，在EcFkpA(ΔBamHI)[GGGS]3中插入片段。
用逆引物插入FkpA和e-gp41之間的甘氨酸-絲氨酸接頭的密碼子，用于克隆FkpA，用正向引物克隆e-gp41。
將得到的構(gòu)建體測序，發(fā)現(xiàn)編碼需要的蛋白。
2.2融合蛋白的純化將含有表達(dá)質(zhì)粒的大腸桿菌BL21細(xì)胞生長到OD6000.7，胞質(zhì)過度表達(dá)是通過在生長溫度37℃時(shí)加入1mM IPTG誘導(dǎo)的。離心收獲細(xì)胞(在5000g 20分鐘)。在50mM磷酸鈉pH7.8，6.0M GuHCl(鹽酸胍)，5mM咪唑中再懸浮細(xì)菌沉淀，在室溫下攪拌(10分鐘)，完全溶解。在重復(fù)離心后(Sorvall SS534，2000rpm，4℃)，過濾(0.8/0.2μm)上清液，應(yīng)用到Ni-NTA柱(NTA硝基三乙酸Qiagen；Germantown，MD)，在溶菌緩沖液中預(yù)平衡。加10柱體積的溶解緩沖液，在洗滌步驟中除去非特異的結(jié)合蛋白。最后，用50mM磷酸鈉，pH2.5，6.0MGuHCl洗脫結(jié)合的靶蛋白，以4ml一部分回收。在280nm記錄吸光值。
可以在4℃存儲得到的酸和離液溶液，用于進(jìn)一步純化，或進(jìn)行體外的再折疊實(shí)驗(yàn)。
從這一非折疊的物質(zhì)開始，可以利用不同的再折疊方法，如透析，快速稀釋，復(fù)性大小排除層析或基質(zhì)輔助再折疊。成功地進(jìn)行，所有步驟都能產(chǎn)生最終的相同的似天然折疊和可溶蛋白。
2.3透析和快速稀釋的復(fù)性將如上所述溶解的物質(zhì)通過透析轉(zhuǎn)移到生理緩沖條件下。選擇的透析試管的切出值是4000-6000道爾頓。
為了誘導(dǎo)胞外域(共價(jià)連接的gp41的gp41部分和FkpA蛋白區(qū)域)，通過對50mM磷酸鈉，pH2.5，50mM NaCl(氯化鈉)透析從洗脫的蛋白中除去GuHCl。已知分離的胞外域是全螺旋并且在這一極端pH形成四級接觸。當(dāng)分析通過近紫外CD重組分析產(chǎn)生的FkpA時(shí)，F(xiàn)kpA在相同的條件下基本是未構(gòu)成。令人驚異的是，通過透析再折疊gp41-FkpA產(chǎn)生了包括共價(jià)連接的gp41和FkpA蛋白區(qū)域的容易溶解的蛋白復(fù)合物。紫外光譜(圖4)沒有散射光，即在300nm有明顯的吸收。散射光表明發(fā)生了聚集，所以圖4顯示的光譜表明，再折疊物質(zhì)不含有明顯量的聚集體。
圓二色光譜(CD)是評估蛋白中的二級和三級結(jié)構(gòu)的選擇。在芳香區(qū)域(260-320nm)的橢圓率報(bào)道了在蛋白中有三級接觸(即，調(diào)節(jié)折疊的蛋白的球體結(jié)構(gòu))，而在酰胺區(qū)的橢圓率反映了在蛋白骨架中有調(diào)節(jié)重復(fù)元素，即二級結(jié)構(gòu)。
在圖5中顯示了近紫外CD光譜提供了有說服力的證據(jù)，胞外域(在融合蛋白的情況中)在pH2.5具有似天然的四級接觸。共價(jià)連接的gp41/FkpA蛋白區(qū)的光譜差不多與相同條件下的分離的胞外域的光譜相同(數(shù)據(jù)未顯示)。Gp41的典型的信號發(fā)現(xiàn)橢圓率的最大值是290nm，特征肩在285nm，另一個(gè)最大值是260nm，反映了最適的活性二硫橋連。重要的是，注意到FkpA在完全的獨(dú)立的條件下對近紫外信號沒有作用。事實(shí)上，F(xiàn)kpA，在pH2.5時(shí)的芳香橢圓率最終等于基線(數(shù)據(jù)未顯示)。
與來自近紫外區(qū)的結(jié)果一致，在pH2.5的融合構(gòu)建體的遠(yuǎn)紫外CD指向了大部分結(jié)構(gòu)化的gp41分子。在220nm和208nm的兩個(gè)最大值構(gòu)成了，并對應(yīng)于全螺旋胞外域(圖6)的典型信號。從指示的條件(50mM磷酸鈉，pH2.5，50mM NaCl)，通過快速稀釋，F(xiàn)kpA-gp41融合多肽可以容易地轉(zhuǎn)移到生理緩沖條件。結(jié)論是，近和遠(yuǎn)紫外CD都強(qiáng)調(diào)了似天然結(jié)構(gòu)的gp41以非常方便的形式是可得的(在融合蛋白的內(nèi)容中也含有了FkpA)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)SlyD(1-165)-gp41的似天然融合多肽可以更簡單地通過對50mM磷酸鈉，pH7.4，150mMNaCl，室溫下透析離液物質(zhì)來得到。特別好地完成本發(fā)明的兩個(gè)陪伴分子-gp41融合構(gòu)建體的核苷酸序列描述在SEQ ID NO7和SEQID NO8。
2.4通過大小排除層析(SEC)復(fù)性用20mM磷酸鈉，pH7.4，50mM NaCl，1mM EDTA平衡Superdex200凝膠過濾柱，將未折疊的gp41-FkpA多肽(溶解在50mM磷酸鈉中，pH7.8，7.0M GuHCl)加到其上。在三個(gè)主要的級分基本洗脫了FkpA-gp41高分子結(jié)合，表觀六聚體種類和表觀三聚體種類。濃縮表觀三聚體級分，在近紫外CD測量中評估它的三級結(jié)構(gòu)(圖7)。
得到的圖是載體蛋白FkpA和靶蛋白gp41的比例為1∶1的交迭的曲線。最幸運(yùn)的是，gp41在中性pH具有四級結(jié)構(gòu)，并且明顯地被共價(jià)結(jié)合的陪伴分子所溶解。換句話說，陪伴分子FkpA似乎是接受了作為底物的似天然結(jié)構(gòu)胞外域，并且在中性工作pH下溶解了難于折疊的蛋白。所以，生產(chǎn)大量的可溶gp41抗原用于診斷目的的關(guān)鍵的要求是滿足了。
在pH7.4(圖8)FkpA-gp41的遠(yuǎn)紫外CD證明了近紫外CD導(dǎo)致了，它顯示FkpA和gp41的信號作用的增加。如期望的，光譜中主要的是高螺旋gp41胞外域(最大的橢圓率分別為220nm和208nm)。
在上面提到的條件下，在pH7.4溶解的共價(jià)連接的gp41/FkpA蛋白區(qū)域得到的數(shù)據(jù)表明，F(xiàn)kpA和gp41在多肽構(gòu)建體中是作為獨(dú)立折疊的單位起作用的。
實(shí)施例3不同的去污劑對在免疫測試中用作抗原的重組gp41和重組FkpA-gp41復(fù)合物的效果3.1競爭型免疫測試COBAS CORE HIV Combi測試(Roche Diagnostics GmbH，Germany)提供了測試重組gp41的免疫反應(yīng)性的常規(guī)方法。原則上來說，這一測試也根據(jù)雙抗原橋連概念工作，檢測抗HIV的gp41的抗體。固相抗原被直接包被。但是，檢測抗原是含有SDS溶解的gp41物質(zhì)的過氧化物酶標(biāo)記的gp41。
在檢測HIV的免疫測試中，非常需要的是在含有相當(dāng)高濃度的去污劑的溫育緩沖液中容易溶解和穩(wěn)定的試劑。這樣的去污劑例如，Triton X-100或Nonidet P-40，在0.1到0.2％的濃度下用于裂解病毒顆粒。
如實(shí)施例1所述產(chǎn)生的SDS溶解的gp41以及FkpA-gp41已經(jīng)測試作為COBAS CORE HIV Combi測試中的競爭抗原。為了這樣做，沒有利用商業(yè)溫育緩沖液，而是利用在無人血清的緩沖基質(zhì)中含有0.1％Triton X 100的溫育緩沖液。待測試的抗原是與已知與gp41反應(yīng)的人血清共溫育的。
以依賴劑量的方式，gp41-FkpA抗原強(qiáng)烈地淬滅了競爭類型測試中的信號，而SDS溶解的gp41基本上是無反應(yīng)性的(圖9)。在0.1μg/ml的FkpA-gp41抗原濃度得到了50％的抑制，對應(yīng)于2.2nM的摩爾濃度。
明顯，在用含有0.1％Triton X-100作為去污劑(輔助去污劑)的稀釋緩沖液預(yù)處理后，F(xiàn)kpA-gp41保留了它的良好的免疫反應(yīng)性，并且在測試中分解了完整的病毒膜。這與單獨(dú)存在gp41胞外域(在SDS中的gp41)明顯相反，因?yàn)樗诖嬖谳o助去污劑下幾乎完全失去了免疫反應(yīng)性(圖9)。
在共價(jià)連接的gp41-FkpA構(gòu)建體的開發(fā)中主要的問題是由于結(jié)合動力不夠，F(xiàn)kpA將覆蓋關(guān)鍵的表位，或者實(shí)驗(yàn)固有(test-inherent)的去污劑Triton X-100通過誘導(dǎo)gp41抗原的聚集而破壞實(shí)驗(yàn)的表現(xiàn)。對COBAS CORE平臺上許多競爭性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果提供了在共價(jià)連接的蛋白區(qū)域中很容易得到關(guān)鍵的gp41表位的強(qiáng)制性證據(jù)。另外，在分子內(nèi)的陪伴分子-gp41復(fù)合物內(nèi)的gp41的免疫反應(yīng)性在存在輔助去污劑如Triton X-100時(shí)保留了。
3.2電化學(xué)發(fā)光實(shí)驗(yàn)雙抗原橋連形式下的免疫測試在感染因子的血清學(xué)診斷中有巨大的優(yōu)點(diǎn)。由于本發(fā)明的FkpA-gp41在生理緩沖條件下是可溶的，因此可以研究是否該物質(zhì)適用于利用電化學(xué)發(fā)光進(jìn)行檢測的雙抗原橋連實(shí)驗(yàn)中。
試圖偶聯(lián)SDS溶解的gp41與釕標(biāo)記還沒有成功。但是，由于FkpA-gp41在生理緩沖條件下是容易溶解的，這一物質(zhì)與疏水的釕標(biāo)記結(jié)合被證明是簡單的(straightforward)。值得注意的是，甚至以所述方式修飾的靶陪伴分子復(fù)合物仍然是可溶的。為了進(jìn)行對Elecsys實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(Roche Diagnostics GmbH，Germany)的實(shí)驗(yàn)，分別將FkpA-gp41生物素化和釕化，并且測試雙抗原橋連實(shí)驗(yàn)中的免疫反應(yīng)性。
測試了主要含有IgG(免疫球蛋白G)類抗體的幾個(gè)代表性的抗HIV血清與共價(jià)連接的FkpA-gp41蛋白區(qū)域的高度陽性。同時(shí)也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，背景信號甚至在高達(dá)500ng/ml的抗原濃度時(shí)也能達(dá)到內(nèi)在的gadget背景。信噪比變得特別好。另外，沒有證據(jù)表明，載體蛋白，來自大腸桿菌的分子陪伴分子FkpA導(dǎo)致這些人血清中含有的抗體的非特異結(jié)合。
如上所述，血清轉(zhuǎn)變的早期的檢測對于可靠的HIV診斷是關(guān)鍵。在感染過程中，IgM類抗體首先出現(xiàn)。為了盡早地可靠地檢測HIV感染，可以因此設(shè)計(jì)用于IgM識別和結(jié)合的高表位密度的抗原單元。確實(shí)，通過典型的抗HIV，IgM型血清可以很好地識別FkpA-gp41。甚至更重要的是，難于測試陽性的樣品，如來自NABI(Miami，F(xiàn)lorida)供應(yīng)的9003和4009血清轉(zhuǎn)變組的B和C血清，用本發(fā)明的融合構(gòu)建體測試是陽性的。這是重要的收獲，因?yàn)樵陔幕A(chǔ)上的gp41抗原當(dāng)用這些IgM血清測試時(shí)是完全不反應(yīng)的。
實(shí)施例4可溶的陪伴分子-gp41復(fù)合物抑制病毒的進(jìn)入評估不同的gp41-陪伴分子融合蛋白抑制體外實(shí)驗(yàn)中HIV-1介導(dǎo)的膜融合的能力。簡要地說，用HIV-1毒株NL4-3感染表達(dá)CD4，CCR5和CXCR4的MAGI P4-CCR5報(bào)道因子細(xì)胞系，根據(jù)Meister等，Virology(2001)284(2)287-296評估依賴Tat的β-半乳糖苷酶活性。確實(shí)，我們觀察到了在nM范圍內(nèi)IC50值的基本的感染的抑制。例如(參見SEQ ID NO6)SlyD-gp41明顯抑制了病毒的進(jìn)入，IC50＜70nM。
總之，分別包括HIV-1 gp41或HIV-2 gp36的可溶分子內(nèi)復(fù)合物和肽基脯氨?；悩?gòu)酶陪伴分子在可溶性和構(gòu)象完整性上具有突出的特性，使得可以設(shè)計(jì)改進(jìn)的抗HIV抗體實(shí)驗(yàn)和其他商業(yè)應(yīng)用。
實(shí)施例5陪伴分子FkpA與gp36胞外域的融合產(chǎn)生了可以容易地在體外再折疊的胞質(zhì)多肽為了得到可溶的和免疫活性形式的gp36(gp41的HIV-2同源物)，我們克隆了命名為FF36的構(gòu)建體。這一融合多肽包括了兩個(gè)FkpA單位和一個(gè)gp36單位，每個(gè)都通過靈活的富甘氨酸片段伸展。為了便于純化，融合構(gòu)建體是用His6C末端標(biāo)記的。蛋白基本上是根據(jù)前面提到的方案純化的在離液裂解后，蛋白結(jié)合到了Ni-NTA柱上，并且在用50mM磷酸鈉，pH7.8，7.0M GuHCl-過量洗滌后，通過降低pH洗脫。然后，將它通過用50mM磷酸鈉，pH7.8，100mM氯化鈉，1mM EDTA平衡的凝膠過濾柱進(jìn)行再折疊。從這一“復(fù)性凝膠過濾”方法得到的天然蛋白具有對應(yīng)于gp41部分如F41或FF41的免疫學(xué)和光譜特性(參見圖10)。如本文所述的純化和再折疊方案是用在gp36的N末端heptad重復(fù)區(qū)含有三個(gè)點(diǎn)突變的FF36來進(jìn)行的(對于序列參見SEQ ID NO9)。相同的方案也成功地用于含有wt gp36胞外域的融合構(gòu)建體，盡管可溶蛋白的產(chǎn)量較低。
實(shí)施例6可以以方便的和可再生產(chǎn)的方式得到可溶的，免疫反應(yīng)性的FkpA-gp21生長可以過量生產(chǎn)FkpA-gp21大腸桿菌細(xì)胞(包括，SEQ ID NO10)，和如前所述誘導(dǎo)收獲。為了完全裂解，在50mM磷酸鈉，pH7.8，7.0M GuHCl，在室溫下攪拌細(xì)胞沉淀1小時(shí)。在裂解緩沖液中預(yù)平衡的Ni-NTA柱上應(yīng)用離液細(xì)胞裂解物。在洗滌步驟后，通過降低pH洗脫靶蛋白(含有C末端Hexa-His-Tag)。為了再折疊，在50mM磷酸鈉pH7.8，100mM氯化鈉中預(yù)平衡的Superdex 200凝膠過濾柱上通過FkpA-gp21(存儲于50mM磷酸鈉，pH6.0，7.0M GuHCl，4℃)。紫外光譜證明，F(xiàn)kpA-gp21作為可溶蛋白洗脫，與無伴侶的gp21相反，不趨向于聚集(圖11/1)。另外，當(dāng)在競爭型COBAS CORE實(shí)驗(yàn)中評估時(shí)，F(xiàn)kpA-gp21具有良好的免疫學(xué)活性(圖11/2)。
實(shí)施例7其他FkpA亞單位與FkpA-gp41的融合提高了gp41胞外域的免疫學(xué)特性我們針對的問題是，在融合多肽的有關(guān)方面內(nèi)的其他PPIase亞單位是否可以提高gp41胞外域-陪伴分子復(fù)合物的整體特性。為此，我們根據(jù)上述方案制備了F41(定位于gp41變異體上游的一個(gè)FkpA區(qū))和FF41(定位于gp41變異體上游的兩個(gè)FkpA區(qū)域)。然后，在ElecsysE2010系統(tǒng)中評估生物素化和釕化的融合蛋白。結(jié)果強(qiáng)烈表明了含有其他陪伴分子區(qū)域的FF41構(gòu)建體的特性加強(qiáng)。
當(dāng)FF41(約1600計(jì)數(shù))與F41(約3800計(jì)數(shù))比較時(shí)，發(fā)現(xiàn)決定信噪比和低效價(jià)血清的可靠測量的陰性血清背景信號降低了50％以上。
表1F41和FF41的比較

用SS41融合蛋白，即含有陪伴分子區(qū)域C末端的兩個(gè)SlyD區(qū)域和一個(gè)gp41區(qū)域已經(jīng)得到相似的陽性結(jié)果。
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序列表<110>Roche Diagnostics GmbHF.Hoffmann-La Roche AG<120>包括逆病毒表面糖蛋白的可溶復(fù)合物<130>19290WO-WN<140>
<141>
<150>EP01115225.3<151>2001-06-22<150>EP01120939.2<151>2001-08-31<160>10<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>147<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述相應(yīng)于HIV-1包被蛋白的第535-681位<400>1Met Thr Leu Thr Val Gln Ala Arg Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln1 5 10 15Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu20 25 30Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Arg Ile Leu Ala35 40 45Val Glu Arg Tyr Leu Lys Asp Gln Gln Leu Leu Gly Ile Trp Gly Cys50 55 60Ser Gly Lys Leu Ile Cys Thr Thr Ala Val Pro Trp Asn Ala Ser Trp
65 70 75 80Ser Asn Lys Ser Leu Glu Gln Ile Trp Asn Asn Met Thr Trp Met Glu85 90 95Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile100 105 110Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Glu115 120 125Leu Asp Lys Trp Ala Ser Leu Trp Asn Trp Phe Asn Ile Thr Asn Trp130 135 140Leu Trp Tyr145<210>2<211>143<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述相應(yīng)于HIV-1包被蛋白的第534-676位<400>2Leu Thr Val Ser Ala Gln Ser Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile Val Gln1 5 10 15Gln Gln Gln Gln Leu Leu Asp Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Leu Leu20 25 30Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr Lys Asn Leu Gln Ala Arg Val Thr Ala35 40 45Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys50 55 60Ala Phe Arg Gln Val Cys His Thr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser65 70 75 80Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Lys Gln85 90 95
Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gln Ala Gln100 105 110Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp115 120 125Asp Ile Phe Gly Asn Trp Phe Asp Leu Thr Ser Trp Val Lys Tyr130 135 140<210>3<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物1<400>3gcgggtgttc cgggtatccc accgaattc 29<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物2<400>4gaattcggtg ggatacccgg aacacccgc 29<210>5<211>61<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物3<400>5
cgggatccgg tggcggttca ggcggtggct ctggtggcgg tacgctgacg gtacaggcca 60g 61<210>6<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述引物4<400>6ccgctcgagg taccacagcc aatttgttat 30<210>7<211>1269<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述∷編碼FkpA-gp41融合蛋白<400>7atggctgaag ctgcaaaacc tgctacaact gctgacagca aagcagcgtt caaaaatgac 60gatcagaaat cagcttatgc actgggtgct tcgctgggtc gttacatgga aaactctctt 120aaagaacaag aaaaactggg catcaaactg gataaagatc agctgatcgc tggtgttcag 180gatgcatttg ctgataagag caaactctcc gaccaagaga tcgaacagac tctgcaagca 240ttcgaagctc gcgtgaagtc ttctgctcag gcgaagatgg aaaaagacgc ggctgataac 300gaagcaaaag gtaaagagta ccgcgagaaa tttgccaaag agaaaggtgt gaaaacctct 360tcaactggtc tggtttatca ggtagtagaa gccggtaaag gcgaagcacc gaaagacagc 420gatactgttg tagtgaacta caaaggtacg ctgatcgacg gtaaagagtt cgacaactct 480tacacccgtg gtgaaccgct ctctttccgt ctggacggtg ttatcccggg ttggacagaa 540ggtctgaaga acatcaagaa aggcggtaag atcaaactgg ttattccacc agaactggct 600tacggcaaag cgggtgttcc gggtatccca ccgaattcta ccctggtgtt tgacgtagag 660ctgctggatg tgaaaccagc gccgaaggct gatgcaaagc cggaagctga tgcgaaagcc 720gcagattctg ctaaaaaagg tggcggttcc ggcggtggct ctggtggcgg atccggtggc 780ggttccggcg gtggctctgg tggcggtacg ctgacggtac aggccagaca attattgtct 840ggtatagtgc agcagcagaa caatgagctg agggctattg aggcgcaaca gcatctggag 900caactcacag tctggggcac caagcagctc caggcaagag aactggctgt ggaaagatac 960ctaaaggatc aacagctcct ggggatttgg ggttgctctg gaaaactcat ttgcaccact 1020gctgtgcctt ggaatgctag ttggagtaat aaatctctgg aacagatttg gaataacatg 1080acctggatgg agtgggacag agaaattaac aattacacaa gcttaataca ttccttaatt 1140
gaagaatcgc aaaaccagca agaaaagaat gaacaagaat tattggaatt agataaatgg 1200gcaagtttgt ggaattggtt taacataaca aattggctgt ggtacctcga gcaccaccac 1260caccaccac 1269<210>8<211>1026<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述編碼SlyD-gp41融合蛋白<400>8atgaaagtag caaaagacct ggtggtcagc ctggcctatc aggtacgtac agaagacggt 60gtgttggttg atgagtctcc ggtgagtgcg ccgctggact acctgcatgg tcacggttcc 120ctgatctctg gcctggaaac ggcgctggaa ggtcatgaag ttggcgacaa atttgatgtc 180gctgttggcg cgaacgacgc ttacggtcag tacgacgaaa acctggtgca acgtgttcct 240aaagacgtat ttatgggcgt tgatgaactg caggtaggta tgcgtttcct ggctgaaacc 300gaccagggtc cggtaccggt tgaaatcact gcggttgaag acgatcacgt cgtggttgat 360ggtaaccaca tgctggccgg tcagaacctg aaattcaacg ttgaagttgt ggcgattcgc 420gaagcgactg aagaagaact ggctcatggt cacgttcacg gcgcgcacga tcaccaccac 480gatcacgacc acgacggtgg cggttccggc ggtggctctg gtggcggatc cggtggcggt 540tccggcggtg gctctggtgg cggtacgctg acggtacagg ccagacaatt attgtctggt 600atagtgcagc agcagaacaa tgagctgagg gctattgagg cgcaacagca tctggagcaa 660ctcacagtct ggggcaccaa gcagctccag gcaagagaac tggctgtgga aagataccta 720aaggatcaac agctcctggg gatttggggt tgctctggaa aactcatttg caccactgct 780gtgccttgga atgctagttg gagtaataaa tctctggaac agatttggaa taacatgacc 840tggatggagt gggacagaga aattaacaat tacacaagct taatacattc cttaattgaa 900gaatcgcaaa accagcaaga aaagaatgaa caagaattat tggaattaga taaatgggca 960agtttgtgga attggtttaa cataacaaat tggctgtggt acctcgagca ccaccaccac 1020caccac1026<210>9<211>688<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述FkpAFkpAgp36(3mut)融合蛋白<400>9
Met Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala1 5 10 15Phe Lys Asn Asp Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu20 25 30Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gln Glu Lys Leu Gly lle35 40 45Lys Leu Asp Lys Asp Gln Leu Ile Ala Gly Val Gln Asp Ala Phe Ala50 55 60Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gln Glu Ile Glu Gln Thr Leu Gln Ala65 70 75 80Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gln Ala Lys Met Glu Lys Asp85 90 95Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala100 105 110Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gln Val115 120 125Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val130 135 140Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Ile Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser145 150 155 160Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro165 170 175Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys180 185 190Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly195 200 205Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val210 215 220Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala225 230 235 240
Ala Asp Ser Ala Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly245 250 255Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ala Glu Ala260 265 270Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala Phe Lys Asn Asp275 280 285Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu Gly Arg Tyr Met290 295 300Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gln Glu Lys Leu Gly Ile Lys Leu Asp Lys305 310 315 320Asp Gln Leu Ile Ala Gly Val Gln Asp Ala Phe Ala Asp Lys Ser Lys325 330 335Leu Ser Asp Gln Glu Ile Glu Gln Thr Leu Gln Ala Phe Glu Ala Arg340 345 350Val Lys Ser Ser Ala Gln Ala Lys Met Glu Lys Asp Ala Ala Asp Asn355 360 365Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala Lys Glu Lys Gly370 375 380Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gln Val Val Glu Ala Gly385 390 395 400Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val Val Asn Tyr Lys405 410 415Gly Thr Leu Ile Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser Tyr Thr Arg Gly420 425 430Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro Gly Trp Thr Glu435 440 445Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys Leu Val Ile Pro450 455 460Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala GlyVal Pro Gly Ile Pro Pro Asn
465 470 475 480Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val Lys Pro Ala Pro485 490 495Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala Ala Asp Ser Ala500 505 510Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly515 520 525Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Leu Thr Val Ser Ala Gln Ser530 535 540Arg Thr Leu Leu Ala Gly Ile Val Gln Gln Gln Gln Gln Glu Leu Asp545 550 555 560Val Val Lys Arg Gln Gln Glu Leu Glu Arg Leu Thr Val Trp Gly Thr565 570 575Lys Asn Leu Gln Ala Arg Glu Thr Ala Ile Glu Lys Tyr Leu Gln Asp580 585 590Gln Ala Arg Leu Asn Ser Trp Gly Cys Ala Phe Arg Gln Val Cys His595 600 605Thr Thr Val Pro Trp Val Asn Asp Ser Leu Ala Pro Asp Trp Asp Asn610 615 620Met Thr Trp Gln Glu Trp Glu Lys Gln Val Arg Tyr Leu Glu Ala Asn625 630 635 640Ile Ser Lys Ser Leu Glu Gln Ala Gln Ile Gln Gln Glu Lys Asn Met645 650 655Tyr Glu Leu Gln Lys Leu Asn Ser Trp Asp Ile Phe Gly Asn Trp Phe660 665 670Asp Leu Thr Ser Trp Val Lys Tyr Leu Glu His His His His His His675 680 685
<210>10<211>385<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>人工序列的描述FkpA-gp21融合蛋白<400>10Met Ala Glu Ala Ala Lys Pro Ala Thr Thr Ala Asp Ser Lys Ala Ala1 5 10 15Phe Lys Asn Asp Asp Gln Lys Ser Ala Tyr Ala Leu Gly Ala Ser Leu20 25 30Gly Arg Tyr Met Glu Asn Ser Leu Lys Glu Gln Glu Lys Leu Gly Ile35 40 45Lys Leu Asp Lys Asp Gln Leu Ile Ala Gly Val Gln Asp Ala Phe Ala50 55 60Asp Lys Ser Lys Leu Ser Asp Gln Glu Ile Glu Gln Thr Leu Gln Ala65 70 75 80Phe Glu Ala Arg Val Lys Ser Ser Ala Gln Ala Lys Met Glu Lys Asp85 90 95Ala Ala Asp Asn Glu Ala Lys Gly Lys Glu Tyr Arg Glu Lys Phe Ala100 105 110Lys Glu Lys Gly Val Lys Thr Ser Ser Thr Gly Leu Val Tyr Gln Val115 120 125Val Glu Ala Gly Lys Gly Glu Ala Pro Lys Asp Ser Asp Thr Val Val130 135 140Val Asn Tyr Lys Gly Thr Leu Ile Asp Gly Lys Glu Phe Asp Asn Ser145 150 155 160Tyr Thr Arg Gly Glu Pro Leu Ser Phe Arg Leu Asp Gly Val Ile Pro165 170 175Gly Trp Thr Glu Gly Leu Lys Asn Ile Lys Lys Gly Gly Lys Ile Lys
180 185 190Leu Val Ile Pro Pro Glu Leu Ala Tyr Gly Lys Ala Gly Val Pro Gly195 200 205Ile Pro Pro Asn Ser Thr Leu Val Phe Asp Val Glu Leu Leu Asp Val210 215 220Lys Pro Ala Pro Lys Ala Asp Ala Lys Pro Glu Ala Asp Ala Lys Ala225 230 235 240Ala Asp Ser Ala Lys Lys Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly245 250 255Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Leu Ala260 265 270Ser Gly Lys Ser Leu Leu His Glu Val Asp Lys Asp Ile Ser Gln Leu275 280 285Thr Gln Ala Ile Val Lys Asn His Lys Asn Leu Leu Lys Ile Ala Gln290 295 300Tyr Ala Ala Gln Asn Arg Arg Gly Leu Asp Leu Leu Phe Trp Glu Gln305 310 315 320Gly Gly Leu Cys Lys Ala Leu Gln Glu Gln Cys Cys Phe Leu Asn Ile325 330 335Thr Asn Ser His Val Ser Ile Leu Gln Glu Arg Pro Pro Leu Glu Asn340 345 350Arg Val Leu Thr Gly Trp Gly Leu Asn Trp Asp Leu Gly Leu Ser Gln355 360 365Trp Ala Arg Glu Ala Leu Gln Thr Gly Leu Glu His His His His His370 375 380His38權(quán)利要求
1.生產(chǎn)包括基本不溶的靶蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶類陪伴分子的可溶復(fù)合物的方法，包括將所述的蛋白與所述的陪伴分子在蛋白和陪伴分子都溶解的緩沖液中混合，和將緩沖液調(diào)節(jié)到形成的蛋白-陪伴分子復(fù)合物溶解的生理?xiàng)l件。
2.權(quán)利要求1所述的方法，其中生理緩沖液包含濃度為10到200mM的緩沖化合物和總濃度為20-500mM的鹽。
3.權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白是重組產(chǎn)生的。
4.權(quán)利要求1所述的方法，其中肽基脯氨酰基異構(gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
5.權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
6.權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白是成淀粉樣蛋白。
7.權(quán)利要求6所述的方法，其中成淀粉樣蛋白是逆病毒表面糖蛋白。
8.權(quán)利要求1所述的方法，其中蛋白是HIV-2gp36或HIV-1gp41。
9.權(quán)利要求1所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶是肽基脯氨?；悩?gòu)酶的結(jié)合感應(yīng)(binding-competent)片段。
10.生產(chǎn)可溶逆病毒表面糖蛋白-陪伴分子復(fù)合物的方法，包括在逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶都溶解的緩沖液中混合逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶，形成復(fù)合物，將緩沖液調(diào)節(jié)到復(fù)合物溶解的生理?xiàng)l件。
11.權(quán)利要求10所述的方法，其中逆病毒表面糖蛋白是重組產(chǎn)生的。
12.權(quán)利要求10所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
13.權(quán)利要求10所述的方法，其中逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
14.權(quán)利要求10所述的方法，其中逆病毒表面糖蛋白是HIVgp36或gp41。
15.權(quán)利要求10所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶包括肽基脯氨酰基異構(gòu)酶的結(jié)合感應(yīng)片段。
16.生產(chǎn)可溶逆病毒表面糖蛋白-陪伴分子復(fù)合物的方法，包括在逆病毒表面糖蛋白溶解的緩沖液中使與肽基脯氨?；悩?gòu)酶共價(jià)連接的逆病毒表面糖蛋白溶解，將緩沖液調(diào)節(jié)到逆病毒表面糖蛋白-陪伴分子復(fù)合物溶解的生理?xiàng)l件。
17.權(quán)利要求1、10或16所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶是FKBP陪伴分子。
18.權(quán)利要求17所述的方法，其中FKBP陪伴分子選自SlyD、FkpA和引發(fā)因子。
19.一種可溶復(fù)合物，其包含逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨酰基異構(gòu)酶。
20.一種可溶復(fù)合物，其包含逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶，其中逆病毒表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶陪伴分子是共價(jià)連接的。
21.權(quán)利要求20所述的復(fù)合物，其中共價(jià)連接包括化學(xué)偶聯(lián)。
22.權(quán)利要求21所述的復(fù)合物，其中共價(jià)連接包括重組連接。
23.權(quán)利要求22所述的復(fù)合物，其中重組連接包括肽接頭。
24.權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其中肽接頭包括至少10個(gè)氨基酸。
25.權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其中肽接頭包括至少15個(gè)氨基酸。
26.權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其中肽接頭包括至多50個(gè)氨基酸。
27.權(quán)利要求23所述的復(fù)合物，其中肽接頭包括至多40個(gè)氨基酸。
28.一種藥劑組合物，其包含權(quán)利要求19到27的任一項(xiàng)的可溶復(fù)合物。
29.在樣品中檢測至少一個(gè)包被病毒表面糖蛋白的抗體的方法，包括將樣品與包含復(fù)合物的組合物接觸，其中復(fù)合物包含表面糖蛋白和肽基脯氨?；悩?gòu)酶陪伴分子，檢測結(jié)合的抗體。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中接觸是在適于結(jié)合抗體與表面糖蛋白的條件下進(jìn)行的。
31.權(quán)利要求30所述的方法，其中檢測結(jié)合的抗體指示了樣品中抗病毒抗體的存在。
32.一種根據(jù)雙抗原橋連概念的免疫測試，包括包含第一陪伴分子-抗原復(fù)合物的第一抗原，和包含第二陪伴分子-抗原復(fù)合物的第二抗原。
33.權(quán)利要求32所述的免疫測試，其中第一陪伴分子和第二陪伴分子是來源于一個(gè)物種的不同分子。
34.權(quán)利要求32所述的免疫測試，其中第一陪伴分子和第二陪伴分子來源于不同物種。
35.權(quán)利要求32到34任一項(xiàng)所述的免疫測試，其中第一陪伴分子來源于嗜熱細(xì)菌。
36.權(quán)利要求32到34任一項(xiàng)所述的免疫測試，其中第二陪伴分子來源于嗜熱細(xì)菌。
37.權(quán)利要求32或34所述的免疫測試，其中第一陪伴分子和第二陪伴分子來源于嗜熱細(xì)菌。
38.權(quán)利要求32所述的免疫測試，其中第一抗原復(fù)合物包括固相結(jié)合基團(tuán)。
39.權(quán)利要求32所述的免疫測試，其中第二抗原復(fù)合物包括標(biāo)記基團(tuán)。
40.一種引發(fā)免疫應(yīng)答的方法，包括向受試者注射包含可溶的逆病毒表面糖蛋白-陪伴分子復(fù)合物的疫苗，由此在受試者中引發(fā)結(jié)合逆病毒表面糖蛋白的抗體。
41.一種抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的方法，包括對細(xì)胞施用權(quán)利要求10所述的可溶復(fù)合物。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中抑制病毒進(jìn)入包括抑制膜融合。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中生理緩沖液包含濃度為10到200mM的緩沖化合物和總濃度為20-500mM的鹽。
44.權(quán)利要求41所述的方法，其中蛋白是重組產(chǎn)生的。
45.權(quán)利要求41所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
46.權(quán)利要求41所述的方法，其中蛋白和肽基脯氨酰基異構(gòu)酶是重組產(chǎn)生的。
47.權(quán)利要求41所述的方法，其中蛋白是成淀粉樣蛋白。
48.權(quán)利要求41所述的方法，其中蛋白是逆病毒表面成淀粉樣糖蛋白。
49.權(quán)利要求41所述的方法，其中蛋白是HIV-2gp36或HIV-1gp41。
50.權(quán)利要求41所述的方法，其中肽基脯氨?；悩?gòu)酶是肽基脯氨酰基異構(gòu)酶的結(jié)合感應(yīng)片段。
全文摘要
本發(fā)明涉及HIV感染的診斷。特別講述了可溶逆病毒表面糖蛋白(或跨膜糖蛋白)－陪伴分子復(fù)合物的生產(chǎn)，以及陪伴分子－抗原復(fù)合物在免疫測試中檢測抗HIV抗體或作為免疫原的有利應(yīng)用，所述檢測優(yōu)選地根據(jù)雙抗原橋連概念。本發(fā)明也公開了分別包括HIV－1gp41變異體或HIV－2 gp36變異體的可溶復(fù)合物，和選自陪伴分子的肽基－脯氨酰基－異構(gòu)酶類的陪伴分子。本發(fā)明也描述了分別在HIV－1－gp41或HIV－2－gp36的N螺旋區(qū)中包括特異性氨基酸取代的變異體。
文檔編號A61P31/18GK1524123SQ02812471
公開日2004年8月25日 申請日期2002年6月24日 優(yōu)先權(quán)日2001年6月22日
發(fā)明者C·肖爾茨, H·安德雷斯, E·法爾茨, A·恩格爾, D·西茨曼, C 肖爾茨, 呂姿, 穆, 穸 申請人:霍夫曼-拉羅奇有限公司