專利名稱：用血管內(nèi)皮生長因子受體拮抗劑抑制腫瘤生長的聯(lián)合療法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及利用血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑與化療劑，放療，和/或其它生長因子受體拮抗劑聯(lián)合治療腫瘤的方法。
背景技術：
血管發(fā)生是指毛細血管從預先存在于胚胎和成體生物中的血管形成，已知血管發(fā)生是腫瘤生長，存活和轉移的重要因素。生長因子及其受體，包括表皮生長因子(EGF)，轉化生長因子-α(TGF-α)，轉化生長因子-β(TGF-β)，酸性和堿性成纖維細胞生長因子(aFGF和bFGF)，血小板衍生的生長因子(PDGF)，和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)在腫瘤的血管發(fā)生中發(fā)揮作用。見Klagsbrun & D’Amore，Annual Rev.Physiol.，53217-239(1991)。這些生長因子與其細胞表面受體的結合可誘導受體活化，引發(fā)并修飾信號轉導途徑，導致細胞增殖和分化。VEGF，一種內(nèi)皮細胞-特異性促有絲分裂劑，則與這些因子不同，這是因為它是通過特異性促進內(nèi)皮細胞增殖而作為血管發(fā)生誘導劑起作用的。
VEGF是一種由兩個23kD的亞單位組成的同種型二聚糖蛋白，而且它是一種較強的血管滲透性誘導劑，內(nèi)皮細胞遷移和增殖的刺激劑，對于新形成的血管而言是重要的存活因素。VEGF有4種不同的單體同種型，它們是從mRNA的可變剪接產(chǎn)生的。它們包括兩種膜結合形式(VEGF206和VEGF189)和兩種可溶形式(VEGF165和VEGF121)。在除胎盤外的所有人類組織中，VEGF165同種型的含量最高。
VEGF是血管發(fā)生的重要調(diào)節(jié)劑，血管發(fā)生是指新血管由于內(nèi)皮前體的原位分化(成血管細胞)而從頭發(fā)育，VEGF在胚胎組織(Breier等，Development(Camb.)，114521(1992))，巨噬細胞，以及傷口愈合過程中的增殖表皮角質(zhì)形成細胞(Brown等，J.Exp.Med.，1761375(1992))中表達，而且涉及與炎癥有關的組織水腫(Ferrara等，Endocr.Rev.，1318(1992))。原位雜交研究已經(jīng)證實，VEGF在很多人腫瘤系中高水平表達，包括多形性成膠質(zhì)細胞瘤，成血管細胞瘤，中樞神經(jīng)系統(tǒng)瘤和AIDS-相關性卡波濟氏肉瘤(Plate等，(1992)Nature 359845-848；Plate等(1993)CancerRes.535822-5827；Berkman等(1993)J.Clin.Invest.91153-159；Nakamura等(1992)AIDS Weekly，13(1))。高水平的VEGF也可在低氧誘導的血管發(fā)生中觀察到(Shweiki等，(1992)Nature359843-845)。
VEGF的生物反應是通過其高親和性受體介導的，它們在胚胎發(fā)生(Millauer，Cell，72835-846(1993))和腫瘤形成過程中的內(nèi)皮細胞上選擇性表達。VEGF受體(VEGFRs)通常是III類受體型酪氨酸激酶，其特征在于它們氨基末端的胞外受體配體結合域中有若干，通常是5或7個免疫球蛋白樣的環(huán)(Kaipainen等，J.Exp.Med.，1782077-2088(1993))。另外兩個區(qū)包括一個跨膜區(qū)和一個羧基末端胞內(nèi)催化域，其可被不同長度的親水性內(nèi)激酶(interkinase)序列的插入，也稱作激酶插入域斷開(Terman等，Oncogene，61677-1683(1991))。VEGFRs包括由Shibuya等，Oncogene，5519-524(1990)測序的fins樣酪氨酸激酶受體(flt-1)，或VEGFR-1，在1992年2月20日提交的WO92/14248，和Terman等，Oncogene，61677-1683(1991)中描述，并由Matthews等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，889026-9030(1991)測序的，含有激酶插入域的受體/胎兒肝激酶(KDR/flk-1)，或VEGFR-2，當然其它受體，如neuropilin-1和-2也能結合VEGF。其它酪氨酸激酶受體，VEGFR-3(flt-4)，可結合VEGF的同源物VEGF-C和VEGF-D，而且在淋巴管的發(fā)育中更為重要。
高水平的Flk-1是由漫潤神經(jīng)膠質(zhì)瘤的內(nèi)皮細胞表達的(Plate等，(1992)Nature 359845-848)。Flk-1的水平可被人成膠質(zhì)細胞瘤產(chǎn)生的VEGF特異性上調(diào)(Plate等，(1993)CancerRes.535822-5827)。Flk-1在與內(nèi)皮細胞(GAEC)有關的成膠質(zhì)細胞瘤中的高水平表達表明，受體活性很可能是在腫瘤形成過程中被誘導的，這是因為在正常的腦內(nèi)皮細胞中幾乎檢測不到Flk-1轉錄物。這種上調(diào)被限定在與腫瘤很近的血管內(nèi)皮細胞。用中和抗-VEGF單克隆抗體(mAbs)阻斷VEGF活性可抑制人腫瘤的異種移植物在裸鼠中生長(Kim等，(1993)Nature 362841-844)，從而表明VEGF在與腫瘤有關的血管發(fā)生中的直接作用。
雖然VEGF配體在腫瘤細胞中是上調(diào)的，而且其受體在浸潤腫瘤的血管內(nèi)皮細胞中也是上調(diào)的，但VEGF配體及其受體在與血管發(fā)生無關的正常細胞中的表達水平較低。因此，這種正常細胞不會由于阻斷VEGF及其受體間的相互作用而受到影響，從而抑制血管發(fā)生及腫瘤生長。
本發(fā)明的目的是提供VEGF受體的拮抗劑。本發(fā)明另一個目的是提供使用這種VEGF受體拮抗劑，特別是使用這種VEGF受體拮抗劑與放療，化療或其它受體拮抗劑聯(lián)合抑制血管發(fā)生，由此抑制或減輕哺乳動物腫瘤生長的方法。
發(fā)明簡述本發(fā)明提供通過給予治療有效量的VEGF受體拮抗劑和其它受體拮抗劑的聯(lián)合而減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。本發(fā)明還提供通過給予治療有效量的VEGF受體拮抗劑和放療的聯(lián)合而減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。此外，本發(fā)明提供通過給予治療有效量的VEGF受體拮抗劑和化療劑的聯(lián)合而減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。
附圖簡述

圖1用單克隆抗體DC-101使flk-1(VEGFR-2)/SEAPS免疫沉淀的蛋白質(zhì)印跡證實DC-101可使鼠flk-1SEAPS免疫沉淀，但不能使單獨的SEAPS免疫沉淀。
圖2a和2b圖2a競爭性抑制測定法，表示抗-flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體DC-101對VEGF165誘導的轉染3T3細胞中flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化的作用。圖2bVEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化對單克隆抗體DC-101所致抑制的敏感性。C441細胞是在最大刺激濃度的VEGF165(40ng/ml)及不同水平抗體的條件下測定的。
圖3a和3b圖3a在有mAb DC-101存在時，VEGF-誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化的滴定。C441細胞是在有(1-4道)或沒有(5-8道)5μg/ml mAb DC-101存在時，用指定濃度的VEGF刺激的。在有抗體(9道)存在時測定的未受刺激的細胞用作對照。圖3b是相對于各VEGF濃度繪制的，圖3a各道中磷酸化受體水平的光密度測定掃描圖，該圖顯示過量配體濃度對mAb的抑制程度。用于檢測的細胞溶解產(chǎn)物是按照下面實施例所述，通過抗-磷酸酪氨酸制備的。
圖4通過預結合的mAb DC-101抑制VEGF-flk-1(VEGFR-2)/fms的活化。C441細胞是在沒有(3道和4道)和有(5道和6道)DC-101時，用指定濃度的VEGF刺激的。未受刺激的細胞(1道和2道)用作對照。MAb是在兩組條件下測定的。對于P而言，細胞與mAb預結合，接著室溫用VEGF刺激15分鐘。對于C而言，同時加入mAb和配體，并按照上面所述進行測定。
圖5用不同濃度的單克隆抗體DC-101和成膠質(zhì)細胞瘤細胞的條件培養(yǎng)基(GB CM)處理VEGF-誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化。
圖6對抗-flk-1(VEGFR-2)mAb與flk-1(VEGFR-2)/fms轉染的3T3細胞(C441)的結合進行FACS分析。把轉染的flk-1(VEGFR-2)/fms3T3細胞與10μg/ml的抗-flk-1(VEGFR-2)mAb DC-101或同種型匹配的無關抗-flk-1mAb 23H7一起放在冰上溫育60分鐘。洗滌細胞，用5μg與FITC偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG再溫育，洗滌，并通過流式細胞術進行分析，確定抗體結合。數(shù)據(jù)表示與使用無關mAb 23H7檢測到的相比，DC-101對C441細胞的熒光水平。
圖7mAb DC-101與flk-1(VEGFR-2)/fms受體在轉染的3T3細胞系C441上的飽和結合。4℃時，使匯合的C441細胞與濃度逐漸增加的mAb DC-101(50ng/ml-2μg/ml)在24孔平板中溫育2小時。洗滌細胞，用5μg抗-大鼠IgG-生物素偶聯(lián)物溫育。為了檢測結合，洗滌細胞，用1∶1000稀釋的鏈霉抗生物素-HRP溫育，洗滌，并在比色檢測系統(tǒng)(TMB)中溫育。數(shù)據(jù)代表mAb DC-101的濃度逐漸增加時，540nm處的吸光度。除去每次測定中第二抗體與單獨細胞的結合是為了對非-特異性結合進行調(diào)整。數(shù)據(jù)代表三次獨立實驗的平均值。
圖8磷酸化flk-1(VEGFR-2)/fms從VEGF刺激的flk-1(VEGFR-2)/fms轉染的3T3細胞中的免疫沉淀。細胞是按照實驗過程所述用VEGF刺激的，溶解產(chǎn)物是用下列無關或相關抗體免疫沉淀的1.大鼠抗-FLK2 IgG2a(mAb 2A13)；2.大鼠抗-flk-1(VEGFR-2)IgG1(mAb DC-101)；3.大鼠抗-PLK2 IgG1(mAb 23H7)；4.兔抗-fms多克隆抗體。免疫沉淀蛋白經(jīng)過SDS PAGE，接著經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡分析。VEGF活化受體的免疫沉淀是通過用抗-磷酸酪氨酸抗體探測印跡而檢測的。
圖9VEGF-誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化對mAb DC-101抑制的敏感性。預結合及競爭性測定法是在指定抗體濃度下，用40ng/ml VEGF進行的。用于受體檢測的細胞溶解產(chǎn)物是按照下面實施例所述用抗磷酸酪氨酸制備的。
圖10mAb DC-101對CSF-1誘導的fms受體磷酸化的作用。在(B)中，fms/FLK-2轉染的3T 3細胞系，10A2，是在沒有(3道和4道)和有(5道和6道)5μg/ml的mAb DC-101時，用最優(yōu)刺激水平的CSF-1刺激的。在沒有(1道)或有(2道)抗體時測定的未受刺激的細胞用作對照。用于檢測的細胞溶解產(chǎn)物是按照下面實施例所述通過抗磷酸酪氨酸制備的。
圖11活化flk-1(VEGFR-2)/fms受體的mAb DC-101中和的特異性。C441細胞是在有DC-101(IgG1)或無關抗-FLK-2大鼠單克隆抗體2A13(IgG2a)或23H7(IgG1)存在時，用20或40ng/ml VEGF刺激的。測定法是在競爭性(4-8道)或預結合(9-11道)條件下，在沒有VEGF(1-3道)和有VEGF存在時，用各個抗體進行的。用于檢測的細胞溶解產(chǎn)物是按照下面實施例所述，通過抗磷酸酪氨酸制備的。分離印跡，并使用fms受體C-末端區(qū)的兔多克隆抗體對印跡進行再次探測，從而檢測flk-1(VEGFR-2)/fms受體。
圖12磷酸化受體帶從VEGF刺激的HUVEC細胞中的免疫沉淀。HUVEC細胞在內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(EGM)中生長3天，期間不更換培養(yǎng)基，直到細胞亞匯合。受體形式是利用mAb DC-101從未受刺激的細胞(1道)，VEGF刺激的細胞(2道)，以及在有1μg/ml肝素(3道)存在時，用VEGF刺激的細胞的溶解產(chǎn)物中免疫沉淀出來的。磷酸化受體形式的磷酸化測定法，免疫沉淀法，和檢測是按照實驗過程所述進行的。
圖13mAb DC-101對反應于VEGF的HUVEC細胞增殖的作用。細胞按照圖6的說明生長48小時。然后細胞經(jīng)過下列測定條件不向培養(yǎng)基中加入任何物質(zhì)(未處理過的)；更換新鮮的內(nèi)皮生長培養(yǎng)基(完全培養(yǎng)基)；在沒有或有1μg/ml肝素存在時，加入10ng/ml VEGF；在有1μg/ml DC-101存在時測定VEGF和VEGF-肝素處理過的細胞。用于進行增殖測定的細胞是使用細胞增殖測定試劑盒(Promega)，通過在550nm處進行比色檢測而測定的。
圖14a和14b圖14a用DC-101(大鼠抗-flk-1單克隆抗體)減輕個體動物的腫瘤生長。圖14b用對照的2A13組(大鼠抗-flk-2單克隆抗體)減輕個體動物的腫瘤生長。
圖15用人成膠質(zhì)細胞瘤的細胞系GBM-18給無胸腺裸鼠皮下注射，并把它們分成三組PBS對照組，無關大鼠IgG1對照23H7組，和DC-101。治療是用腫瘤異種移植物皮下給予的，并持續(xù)4周。
圖16表示不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6和p2A7)與固定化KDR(VEGFR-2)直接結合的曲線圖。
圖17表示通過不同的scFv抗體(p1C11，p1F12，p2A6和p2A7)抑制KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF165結合的曲線圖。
圖18表示通過scFv抗體(p2A6和p1C11)抑制VEGF-誘導的HUVEC增殖的曲線圖。
圖19c-p1C11的VH和VL鏈的核苷酸及推斷的氨基酸序列。
圖20表示抗體(c-p1C11，p1C11，p2A6)與固定化KDR(VEGFR-2)直接結合的曲線圖。
圖21表示c-p1C11與表達HUVEC的KDR-(VEGFR-2)結合的FACS分析曲線圖。
圖22表示通過不同的scFv抗體(c-p1C11，p1C11，和p2A6)抑制KDR(VEGFR-2)受體與固定化VEGF165結合的曲線圖。
圖23表示通過c-p1C11和冷VEGF165抑制放射性標記的VEGF165與固定化KDR(VEGFR-2)受體結合的曲線圖。
圖24表示通過抗-KDR(VEGFR-2)抗體(c-p1C11，p1C11)抑制VEGF-誘導的HUVEC增殖的曲線圖。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供用放療，化療，和/或其它受體拮抗劑與VEGF受體拮抗劑聯(lián)合減輕或抑制哺乳動物腫瘤生長的方法。
在優(yōu)選實施方案中，當用VEGF受體拮抗劑與化療劑，放療，或其它受體拮抗劑或其組合聯(lián)合治療腫瘤，包括人的腫瘤時，可產(chǎn)生協(xié)同效果。換句話說，當VEGF受體拮抗劑與化療劑，放療，或其它受體拮抗劑或其組合聯(lián)合抑制腫瘤生長時，可產(chǎn)生比所預期的還要好的治療效果。當使用聯(lián)合療法抑制腫瘤生長所產(chǎn)生的效果比使用VEGF受體拮抗劑和化療劑，放療，或其它受體拮抗劑所產(chǎn)生的效果之和還要大時，表現(xiàn)出協(xié)同效果。優(yōu)選，協(xié)同效果是通過癌癥的緩解加以證實的，其中這種緩解是使用VEGF受體拮抗劑和化療劑，放療，或其它受體拮抗劑進行聯(lián)合治療時所沒有預見到的。(見實施例VIII.)VEGF受體拮抗劑是在開始化療或放療之前，之中，或之后，及其任意組合，即，在開始化療和/或放療之前和之中，之前和之后，之中和之后，或之前，之中，和之后給予的。例如，當VEGF受體拮抗劑是抗體時，抗體通常在開始放療和/或化療之前的1-30天之間，優(yōu)選3-20天之間，更優(yōu)選5-12天給藥。
放療與VEGF受體拮抗劑聯(lián)合使用的放射源對于所治療的患者而言可以是外在的或內(nèi)在的。當放射源對患者是外在的時，該療法被稱為外在射線放療(EBRT)。當放射源對于患者是內(nèi)在的時，該療法被稱為近程放射治療(BT)。
放療是按照熟知的標準技術，使用為此目的制造的標準設備，如AECL Theratron和Varian Clinac給予的。放療的劑量取決于多種因素，這是本領域熟知的。這種因素包括所要治療的器官，放療途徑中的健康器官，因為這些健康器官可能會無意中受到不良影響，患者對放療的耐受性，和需要進行治療的機體面積。所述劑量通常為1-100Gy，更優(yōu)選2-80Gy。已經(jīng)報道過的某些劑量包括脊髓35Gy，腎15Gy，肝20Gy，前列腺65-80Gy。然而應當強調(diào)的是，本發(fā)明不限制于任何特定的劑量。劑量可由主治醫(yī)生根據(jù)已知情況中的特定因素，包括上述因素確定。
外在放射源與進入患者內(nèi)的點之間的距離可以是任意距離，它代表在殺死靶細胞和使副作用達到最小之間的可接受的平衡。通常，外在放射源距離進入患者內(nèi)的點70-100cm。
通常，近程放射治療是通過把放射源放在患者中進行的。通常，放射源被放置在距離所要治療的組織大約0-3cm處。已知的技術包括間質(zhì)，腔內(nèi)，和表面近程放射治療。放射源可永久或暫時植入。永久植入物中使用的某些典型的放射性原子包括碘-125和氡。臨時植入物中使用的某些典型的放射性原子包括鐳，銫-137，和銥-192。已經(jīng)用于近程放射治療的某些其它放射性原子包括镅-241和金-198。
近程放射治療的放療劑量可與上述外在射線放療相同。除了上面提到的，用于確定外在射線放療劑量的因素之外，在確定近程放射治療的劑量時，還要考慮到所用放射性原子的性質(zhì)。
化療化療劑包括可有效抑制腫瘤生長的所有化合物。
化療劑的給藥可以各種方式進行，包括通過腸胃外和腸內(nèi)途徑全身給藥。在其中一個實施方案中，VEGF受體拮抗劑和化療劑可作為獨立的分子分開給藥。在另一實施方案中，VEGF受體拮抗劑通過與化療劑偶聯(lián)而連接。
化療劑的例子包括烷基化劑，例如，氮芥類，乙烯亞胺化合物和烷基磺酸鹽；抗代謝物，例如，葉酸，嘌呤或嘧啶拮抗劑；有絲分裂分裂抑制劑，如，長春堿和鬼臼毒素衍生物；細胞毒性的抗生素；損害或干擾DNA表達的化合物。
此外，化療劑包括此處所述的抗體，生物分子和小分子。
化療劑的具體例子包括順鉑，達卡巴嗪(DTIC)，更生霉素，雙氯乙基甲胺(氮芥)，鏈脲霉素，環(huán)磷酰胺，卡莫司汀(BCNU)，羅氮芥(CCNU)，阿霉素(亞德里亞霉素)，柔紅霉素，丙卡巴肼，絲裂霉素，阿糖孢苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，博萊霉素，紫杉醇(紫杉酚)，多西他賽(脫乙?；仙即?，阿地流津，天門冬酰胺酶，白消安，卡鉑，克拉屈濱，達卡巴嗪，氟尿苷，氟達拉濱，羥基脲，異環(huán)磷酰胺，干擾素α，利普安，甲地孕酮，美法侖，巰基嘌呤，普卡霉素，米托坦，培加帕酶，噴司他丁，哌泊溴烷，光輝霉素，鏈脲霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睪內(nèi)酯，硫鳥嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸氮芥，紫杉酚及其組合。
生長因子受體拮抗劑本發(fā)明所用的生長因子受體拮抗劑(除了VEGF受體拮抗劑)包括可抑制生長因子受體的配體對生長因子受體刺激的所有物質(zhì)。這種刺激的抑制可抑制表達生長因子受體的細胞生長。
涉及腫瘤發(fā)生的生長因子受體的某些例子是表皮生長因子(EGFR)，血小板衍生的生長因子(PDGFR)，胰島素樣生長因子(IGFR)，神經(jīng)生長因子(NGFR)，和成纖維細胞生長因子(FGF)的受體。
優(yōu)選，本發(fā)明所用的生長因子受體拮抗劑是EGFR拮抗劑。本發(fā)明的EGFR拮抗劑是生物分子，小分子，或任何其它物質(zhì)，它們可抑制EGFR活化，由此抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，并防止受體自磷酸化，以及涉及各種EGFR信號途徑的其它蛋白磷酸化。EGFR活化的抑制是指EGFR活化的任意降低，它無需完全阻止或終止EGFR的活化。
此外，本發(fā)明定義的EGFR活化的抑制是指由于EGFR拮抗劑與受體相互作用產(chǎn)生的EGFR抑制。相互作用是指EGFR拮抗劑與受體之間充分的物理或化學相互作用，如此才能抑制酪氨酸激酶的活性。本領域的技術人員應當了解這種化學相互作用的例子，它包括在EGFR拮抗劑和受體之間，本領域已知的締合或鍵合，還包括共價鍵合，離子鍵合，氫鍵鍵合等。與EGF拮抗劑形成對比，它與配體相互作用，由此抑制活化。
根據(jù)其它生長因子的具體情況，EGFR活化的增加可能是由于配體水平升高，EGFR基因擴增，受體轉錄增加或引起上調(diào)受體信號的突變增加而引起的。編碼EGFR基因的擴增導致與EGFR結合的配體數(shù)增加，從而進一步刺激細胞增殖。EGFR還可在沒有基因擴增的情況下過量表達，據(jù)推測是通過可增加EGFR轉錄，mRNA翻譯，或蛋白穩(wěn)定性的突變完成的。EGFR突變體已在神經(jīng)膠質(zhì)瘤，非小細胞肺癌，卵巢癌和前列腺癌中鑒定，它們具有組成型活性的酪氨酸激酶，表明高水平EGFR活性的作用，而不是EGFR在這些癌中過量表達的作用。見，例如，Pedersen等，Ann.Oncol.，12(6)745-60(2001)。(III型EGFR突變-各式命名的EGFRvIII，de2-7EGFR或AEGFR-缺少由外顯子2-7編碼的胞外配體結合域的一部分)；見Wikstrand等，Cancer Res.，553140-3148(1995)。
在本發(fā)明其中一個實施方案中，EGFR拮抗劑抑制EGFR與其配體結合。配體與EGFR外部的胞外域的結合可刺激受體二聚化，EGFR自磷酸化，受體的內(nèi)部胞質(zhì)酪氨酸激酶結構域的活化，和涉及DNA合成及細胞分裂調(diào)節(jié)的多個信號轉導途徑的引發(fā)。EGFR的配體包括，例如，EGF，TGF-α，雙調(diào)蛋白，肝素-結合EGF(HB-EGF)和betarecullulin。EGF和TGF-α是可導致EGFR-介導的刺激的主要內(nèi)源性配體，盡管TGF-α在促進血管發(fā)生方面更有效。
在本發(fā)明另一實施方案中，EGFR拮抗劑結合EGFR。應當了解EGFR拮抗劑可與EGFR的胞外部分外部結合，抑制或不抑制配體的結合，或與酪氨酸激酶結構域內(nèi)部結合。結合EGFR的EGFR拮抗劑的例子包括，但不限制于，生物分子，如對EGFR特異的抗體(及其功能等同物)，直接作用于EGFR胞質(zhì)域的合成激酶抑制劑，如小分子。
本發(fā)明的EGFR拮抗劑優(yōu)選對EGFR特異的生物分子，更優(yōu)選抗體，或其功能等同物。對本發(fā)明所用抗體的描述可在名為“抗體”的部分找到。此外，在抗體結合之后，優(yōu)選使EGFR-抗體復合物內(nèi)化并降解，防止受體被細胞再利用。
已知的生物分子EGFR拮抗劑是ERBITUXTM(IMC-C225)，它是對EGFR特異的嵌合(人/小鼠)單克隆抗體。見，例如，美國專利號4,943,533(Mendelsohn等)；美國專利號6,217,866(Schlessinger等)；美國申請?zhí)?8/973,065(Goldstein等)和09/635,974(Teufel)；WO99/60023(Waksal等)和WO00/69459(Waksal)。單克隆抗體ERBITUXTM特異性結合EGFR，并阻斷配體，例如EGF的結合。這種阻斷可抑制腫瘤生長，包括通過干擾EGFR活化作用而抑制腫瘤侵入，轉移，細胞修復和血管發(fā)生。此外，或可選擇性地，單克隆抗體ERBITUXTM可促進受體-抗體復合物的內(nèi)化，防止其配體或任何其它機理進一步刺激受體。
生物分子EGFR拮抗劑的其它例子是ABX-EGF，它是對EGFR特異的完全人IgG2單克隆抗體。ABX-EGF以較高的特異性結合EGFR，阻斷EGFR與其兩個配體，EGF和TGF-α的結合。見，例如，F(xiàn)iglin等，ASCO第37期年會的摘要1102，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。先前被稱作克隆E7.6.3的ABX-EGF的序列和描述在美國專利號6,235,883(Abgenix，Inc.)第28欄第62行-第29欄第36行和圖29-34中公開。見Yang等，Critical Rev.Oncol./Hematol.，38(1)17-23，2001。
在可選擇性，但也是優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的EGFR拮抗劑是小分子的酪氨酸激酶抑制劑。小分子的描述可在名為“小分子”的部分找到。已經(jīng)描述過使用很多小分子抑制EGFR。
例如，Spada等，美國專利5,656,655，公開了可抑制EGFR的苯乙烯基取代的雜芳基化合物。所述雜芳基是具有一個或兩個雜原子的單環(huán)，或具有1-約4個雜原子的雙環(huán)，該化合物可被任選取代或多取代。美國專利5,656,655公開的化合物引入此處作為參考。
Spada等，美國專利5,646,153公開了可抑制EGFR的雙單環(huán)和/或雙環(huán)的芳基雜芳基，碳環(huán)，和雜碳環(huán)化合物。美國專利5,646,153公開的化合物引入此處作為參考。
Bridges等，美國專利5,679,683公開了可抑制EGFR的三環(huán)嘧啶化合物。所述化合物是稠合的雜環(huán)嘧啶衍生物，在第3欄第35行-第5欄第6行描述。第3欄第35行-第5欄第6行描述的這些化合物引入此處作為參考。
Barker，美國專利5,616,582公開了具有受體酪氨酸激酶抑制活性的喹唑啉衍生物。美國專利5,616,582公開的化合物引入此處作為參考。
Fry等，Science，2651093-1095(1994)公開了具有抑制EGFR的結構的化合物。結構在圖1中給出。Fry等所著文章圖1中所示的化合物引入此處作為參考。
Osherov等，J.Biol.Chem.，268(15)11，134-42(1993)公開了可抑制EGFR/HER1和HER2的酪氨酸磷酸化抑制劑。Osherov等所著文章中公開的化合物，特別是表I，II，III，和IV中的那些引入此處作為參考。
Levitzki等，美國專利5,196,446公開了可抑制EGFR的雜芳基乙烯二基或雜芳基乙烯二基芳基化合物。美國專利5,196,446第2欄第42行-第3欄第40行公開的化合物引入此處作為參考。
Panek等，J.Pharma.Exp.Thera.，2831433-1444(1997)公開了被鑒定為PD166285的化合物，它可抑制受體的EGFR，PDGFR，和FGFR家族。PD166285被鑒定為6-(2，6-二氯苯基)-2-(4-(2-二乙氨基乙氧基)苯氨基)-8-甲基-8H-吡啶并(2，3-d)嘧啶-7-酮，它具有第1436頁圖1所示的結構。在Panek等所著文章第1436頁圖1中描述的化合物引入此處作為參考。
小分子EGFR拮抗劑的其中一個例子是IRESSATM(ZD1939)，它是quinozaline衍生物，可作為ATP-模擬物抑制EGFR。見，美國專利號5,616,582(Zeneca Limited)；WO 96/33980(Zeneca Limited)第4頁；見，Rowinsky等，ASCO第37期年會的摘要5，San Francisco，CA，2001年5月12-15日；Anido等，ASCO第37期年會的摘要1712，San Francisco，CA，2001年5月12-15日。
TARCEVATM是小分子EGFR拮抗劑的另一個例子。TARCEVATM(OSI-774)是4-取代的苯氨基quinozaline衍生物[6，7-雙(2-甲氧基-乙氧基)-喹唑啉-4-基]-(3-乙炔基-苯基)胺鹽酸鹽]EGFR抑制劑，它在WO 96/30347(Pfizer Inc.)第2頁第12行-第4頁第34行和第19頁第14-17行描述。也見Moyer等，Cancer Res.，574838-48(1997)；Pollack等，J.Pharmacol.，291739-48(1999)。TARCEVATM通過抑制EGFR及其下游PI3/Akt磷酸化和導致p27-介導的細胞周期停滯的MAP(促有絲分裂劑活化蛋白)激酶信號轉導途徑而發(fā)揮作用。見，Hidalgo等，ASCO第37期年會的摘要281，San Franscio，CA，2001年5月12-15日。
還有很多其它小分子也可抑制EGFR。小分子EGFR拮抗劑的一些例子在WO 91/116051，WO 96/30347，WO 96/33980，WO 97/27199(Zeneca Limited)，WO 97/30034(Zeneca Limited)，WO 97/42187(Zeneca Limited)，WO 97/49688(Pfizer Inc.)，WO 98/33798(Warner Lambert Company)，WO 00/18761(American CyanamidCompany)，和WO 00/31048(Warner Lambert Company)描述。小分子EGFR拮抗劑的具體例子包括C1-1033，它是酪氨酸激酶，特別是EGFR的quinozaline(N-[4-(3-氯-4-氟-苯氨基)-7-(3-嗎啉-4-基-丙氧基)-喹唑啉-6-基]-丙烯酰胺)抑制劑，在WO 00/31048(Warner-Lambert Company)第8頁第22-6行描述；PKI166，它是EGFR的吡咯并嘧啶抑制劑，在WO 97/27199(Novartis AG)第10-12頁描述；GW2016，它是EGFR和HER2的抑制劑；和EκB569。
其它EGFR拮抗劑可使用熟知的方法很容易地確定。本發(fā)明的EGFR拮抗劑可抑制EGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化測定法可用于確定本發(fā)明所用的拮抗劑。酪氨酸激酶活性的某些測定法在Panek等，(1997)和Batley等，Life Sci.，62143-50(1998)中描述。此外，可使用特異性檢測EGFR表達的方法。這些包括檢測蛋白表達的免疫組織化學(HIC)，檢測基因擴增的熒光原位雜交(FISH)，競爭性放射性配體結合測定法，固體基質(zhì)印跡技術，如RNA和DNA印跡，逆轉錄酶聚合酶鏈反應(RT-PCR)和ELISA。見，例如，Grandis等，Cancer，781284-1292(1996)；Shimizu等，Japan J.Cancer Res.，85567-571(1994)；Sauter等，Am.J.Path.，1481047-1053(1996)；Collins，Glia，15289-296(1995)；Radinsky等，Clin.Cancer.Res.，119-31(1995)；Petrides等，Cancer Res.，503934-3939(1990)；Hoffmann等，Anticancer Res.，174419-4426(1997)；Wikstrand等，Cancer Res.，553140-3148(1995)。
VEGF受體拮抗劑在其中一個實施方案中，VEGF受體拮抗劑特異性結合VEGF受體胞外域上的抗原決定部位。VEGF受體的胞外域是配體-結合域。配體-結合域可在受體任何一個末端找到，但通常位于氨基末端。
VEGF受體的一些例子包括蛋白酪氨酸激酶受體，如文獻中提到的flt-1(VEGFR-1)，KDR和flk-1(VEGFR-2)。除非另有說明或以其它方式清楚地說明，本說明書將遵循VEGF受體的常規(guī)文獻命名法。KDR(VEGFR-2)被稱作具有MW 180kD的VEGF受體的人類形式(Terman等，上述)。Flk-1(VEGFR-2)被稱作KDR的鼠同系物(Matthews等，上述)。Flt-1(VEGFR-1)被稱作VEGF受體的不同形式，但與KDR/flk-1(VEGFR-2)受體有關。見Shibuya等，上述。
其它VEGF受體包括用VEGF交聯(lián)標記的那些，或與KDR(VEGFR-2)共-免疫沉淀的那些。這些VEGF受體某些已知形式的分子量大約為170KD，150KD，130-135KD，120-125KD和85KD。見，例如，Quinn等，Proc.Nat’l Acad.Sci USA，907533-7537(1993)；Scher等，J.Biol.Chem.，2715761-5767(1996)。
VEGF受體通常與細胞，如內(nèi)皮細胞結合。VEGF受體還可與非-內(nèi)皮細胞，如腫瘤細胞結合。可選擇性地，VEGF受體可游離于細胞，優(yōu)選可溶性形式。
本發(fā)明的拮抗劑可中和VEGF受體。在本說明書中，中和受體是指使受體的內(nèi)在激酶活性滅活，從而轉導信號。VEGF受體中和的可靠測定法是抑制受體磷酸化。
本發(fā)明不受VEGF受體中和的任何特殊機理的限制。在申請這種應用時，還不了解通過抗體中和VEGF受體的機理，通過其中一種拮抗劑中和的機理無須與通過另一種拮抗劑中和的機理相同。某些可能的機理包括阻礙VEGF配體與VEGF受體的胞外結合域結合，并防止受體二聚或寡聚。然而，不能排除其它機理。
本發(fā)明的VEGF受體(或VEGFR)拮抗劑是生物分子，小分子，或抑制受體VEGFR亞家族的任何其它物質(zhì)。受體VEGFR亞家族活化的抑制是指VEGFR活化的任意降低。即，阻礙活化時，無需完全終止VEGFR活化。此外，本發(fā)明所定義的VEGFR活化的抑制是指VEGFR拮抗劑與VEGFR相互作用之后，VEGFR拮抗劑的抑制。締合是指VEGFR拮抗劑與VEGFR之間充分的物理或化學相互作用，從而抑制受體的酪氨酸激酶活性。本領域技術人員應當了解這種化學相互作用的例子，包括本領域已知的締合或鍵合，包括共價鍵合，離子鍵合，氫鍵鍵合等。因此，本發(fā)明的VEGFR拮抗劑可抑制受體的酪氨酸激酶活性，阻礙受體自磷酸化和涉及VEGFR信號途徑的各種其它蛋白磷酸化。這種涉及血管發(fā)生和血管形成的調(diào)節(jié)的途徑包括下列任何一種磷脂酶Cγ(PLCγ)途徑或磷脂酰肌醇3’激酶(PI3-K)/Akt和促有絲分裂劑激活的蛋白激酶(MAPK)途徑。見，例如，Larrivée等，Int’l J.Mol.Med.，5447-56(2000)。
受體VEGFR亞家族的特征在于胞外域中7個免疫球蛋白樣環(huán)，單一跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)中斷裂酪氨酸激酶結構域的存在(III類受體酪氨酸激酶)。受體VEGFR亞家族還有很多已知的成員，它的例子包括VEGFR-1，VEGFR-2，和VEGFR-3。據(jù)信KDR(VEGFR-2)是主要的VEGF信號轉導物，它可導致內(nèi)皮細胞的增殖，遷移，分化，管形成，血管滲透性的增加，和血管完整性的維持。VEGFR-1具有較弱的激酶活性，而且當受到VEGF刺激時，不能產(chǎn)生促有絲分裂反應，雖然它可以高于KDR(VEGFR-2)大約10倍的親和性與VEGF結合。VEGFR-1還涉及VEGF和胎盤生長因子(PIGF)誘導的單核細胞和巨噬細胞遷移以及組織因子的產(chǎn)生。
對于上述EGFR而言，VEGFR活化的增加可能是由高水平的配體，VEGFR基因的擴增，受體轉錄的增加或引起上調(diào)受體信號的突變而引起的。
在本發(fā)明其中一個實施方案中，VEGFR拮抗劑抑制VEGFR與其配體結合。配體與VEGFR外部的胞外域結合可刺激受體二聚化，VEGFR自磷酸化，受體內(nèi)部胞質(zhì)酪氨酸激酶結構域的活化，和涉及血管形成及血管發(fā)生的調(diào)節(jié)的多個信號轉導途徑的引發(fā)。
VEGFR的配體包括VEGF及其同源物PlGF，VEGF-B，VEGF-C，VEGF-D，和VEGF-E。例如，P1GF，它是只結合VEGFR-1的二聚分泌型因子，它通過絨毛細胞滋養(yǎng)層，合胞滋養(yǎng)層和絨毛外滋養(yǎng)層大量產(chǎn)生，其氨基酸序列與VEGF的同源性很高。人類有3種同種型，P1GF-1，P1GF-2，和P1GF-3。對缺乏P1GF小鼠的研究證實，這種生長因子本身與血管發(fā)生無關，但可特異性調(diào)節(jié)病理過程中的血管發(fā)生及VEGF的滲透作用。且，VEGF-D與VEGF-C緊密相關，這是因為在其它VEGF家族成員中是找不到N-和C-末端延伸的存在。在成人組織中，VEGF-D的mRNA在心臟，肺，骨胳肌，結腸，和小腸中的含量最豐富。對VEGF-D受體特異性進行的分析揭示，VEGF-D是VEGFR-2(Flk1)和VEGFR-3(Flt4)的配體，而且可激活這些受體；然而，VEGF-D不結合VEGFR-1。此外，VEGF-D是內(nèi)皮細胞的促有絲分裂劑。
在本發(fā)明另一實施方案中，VEGFR拮抗劑結合VEGFR。應當認識到，VEGFR拮抗劑可與VEGFR的胞外部分外部結合，抑制或不抑制配體的結合，VEGFR拮抗劑還可與酪氨酸激酶結構域內(nèi)部結合。結合VEGFR的VEGFR拮抗劑的例子包括，但不限制于，生物分子，如受體核酶及對VEGFR特異的抗體(或其功能等同物)，和直接作用于VEGFR胞質(zhì)結構域的合成激酶抑制劑，如小分子。優(yōu)選本發(fā)明的VEGFR拮抗劑是對VEGFR特異的生物分子，更優(yōu)選抗體或其功能等同物，下面將對它們作更詳細的描述?？蛇x擇性地，本發(fā)明的VEGFR拮抗劑是小分子激酶抑制劑，下面將對其作詳細描述。
在其中一個優(yōu)選實施方案中，VEGFR受體拮抗劑特異性結合VEGFR-1。特別優(yōu)選抗原結合蛋白，它可結合VEGFR-1的胞外結構域，并通過其一個或兩個配體，VEGF和P1GF阻斷結合，和/或中和VEGF-誘導的或P1GF誘導的VEGFR-1活化。例如，mAb 6.12是與可溶性，細胞表面表達的VEGFR-1結合的scFv。ScFv 6.12含有小鼠單克隆抗體mAb 6.12的VL和VH結構域。產(chǎn)生mAb 6.12的雜交瘤細胞系已經(jīng)保藏，ATCC號為PTA-3344。保藏是根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，在用于專利程序及其條例(布達佩斯條約)的微生物保藏機構進行的。這樣做可確?；钆囵B(yǎng)物自保藏之日起維持30年。根據(jù)布達佩斯條約，在申請人和ATCC之間達成協(xié)議的情況下，可從ATCC獲得生物體，這樣可確保在相關美國專利公開之后，不受限制地使用它。按照專利法的規(guī)定，在實行該發(fā)明時，無須在任何行政機構的授權下使用保藏菌株。
其它優(yōu)選抗體在實施例，特別是實施例XII，XIII，和XIV，及SEQ ID NO1-83中描述。此外，這些優(yōu)選VEGFR抗體拮抗劑的其中一部分在Lu等，Int’l J.Cancer，97393-399(2002)中描述。
還存在各種產(chǎn)生VEGFR-2抗體的雜交瘤。例如，產(chǎn)生大鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體的雜交瘤細胞系(DC101)的保藏號為ATCC HB11534；產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb 25的雜交瘤細胞系(M25.18A1)的保藏號為ATCC HB 12152；產(chǎn)生小鼠抗小鼠VEGFR-2單克隆抗體mAb 73的雜交瘤細胞系(M73.24)的保藏號為ATCC HB12153。
此外，產(chǎn)生抗VEGFR-1抗體的各種雜交瘤包括，但不限制于，雜交瘤KM1730(保藏號FERM BP-5697)，KM1731(保藏號FERM BP-5718)，雜交瘤KM1732(保藏號FERM BP-5698)，KM1748(保藏號FERMBP-5699)，雜交瘤KM1750(保藏號FERM BP-5700)，它們在WO98/22616，WO 99/59636，澳大利亞申請?zhí)朅U 1998 50666 B2，和加拿大申請?zhí)朇A 2328893中描述。
很多其它VEGFR拮抗劑也是本領域已知的。VEGFR拮抗劑的某些例子在美國申請?zhí)?7/813,593；07/906,397；07/946,507；07/977,451；08/055,269；08/252,517；08/601,891；09/021,324；09/208,786；和09/919,408(所有均屬于Lemischka等)；美國專利號5,840,301(Rockwell等)；美國申請?zhí)?8/706,804；08/866,969；08/967,113；09/047,807；09/401,163；和09/798,689(所有均屬于Rockwell等)；美國申請?zhí)?9/540,770(Witte等)；和PCT/US01/06966(Liao等)中描述。美國專利號5,861,301(Terman等)，Terman等，Oncogene 61677-1683(1991年9月)，WO 94/10202(Ferrara等)，和WO 95/21865(Ludwig)公開了VEGFR拮抗劑，特別是抗VEGFR-2抗體。此外，PCT/US95/01678(Kyowa Hakko)描述了抗VEGFR-2抗體?？筕EGFR抗體還在美國申請?zhí)?9/976,787(Zhu等)中描述。美國專利號6,177,401(Ullrich等)，5,712,395(App等)，和5,981,569(App等)描述的VEGFR拮抗劑是有機分子。此外，雙特異性抗體(BsAbs)是已知的，它是具有兩種不同的抗原-結合特異性或位點的抗體，針對KDR(VEGFR-2)和VEGFR-1。見，例如，美國申請?zhí)?9/865,198(Zhu)；60/301,299(Zhu)。
Hennequin等，在J.Med.Chem.42，5369-5389(1999)中公開了某些可用作VEGF受體拮抗劑的喹唑啉，喹啉和噌啉。見Annie等，Journal of Acquired Immune Deficiency Syndromes and HumanRetrovirology 17，A41(1998)。在Hennequin等所著的文章中公開的VEGF受體拮抗劑引入此處作為參考。
此外，App等(USPN5,849,742)公開了可作為酪氨酸激酶抑制劑起作用的喹唑啉，quinoxiline，取代苯胺，異噁唑，丙烯腈和苯基丙烯腈化合物。Hennequin等，Annie等和App等描述的小分子也可作為本發(fā)明的VEGF受體拮抗劑。
此外，確定VEGFR拮抗劑的測定法是本領域熟知的，因此，適用于本發(fā)明的侯選拮抗劑可很容易地鑒定。本發(fā)明的VEGFR拮抗劑可抑制VEGFR的酪氨酸激酶活性，其通常涉及磷酸化事件。因此，磷酸化測定法可用于確定本發(fā)明的VEGFR拮抗劑。酪氨酸激酶活性的某些測定法在Panek等，J.Pharmacol.Exp.Thera.，2831433-44(1997)和Batley等，Life Sci.，62143-50(1998)中描述。此外，還可使用特異性檢測VEGFR表達的方法。
抗體本發(fā)明的抗體可通過本領域已知的方法生產(chǎn)。這些方法包括免疫學方法，由Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)和Campbell，單克隆抗體技術，嚙齒動物和人類雜交瘤的生產(chǎn)和描述，Burdon等，Eds.，生物化學和分子生物學的實驗室技術，13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)描述；以及Huse等，Science，246，1275-1281(1989)描述的重組DNA方法。
本發(fā)明的抗體可以是單克隆抗體或多克隆抗體或任何其它適宜類型的抗體，如抗體的片段或衍生物，單鏈抗體(scFv)或抗體的合成同系物，只要抗體具有與那些完整抗體相同或相似的結合性。除非另有說明或可從上下文清楚地知道，此處所用的抗體的結構域，區(qū)和片段與本領域熟知的標準定義一致。見，例如，Abbas等，細胞和分子免疫學，W.B.Saunders Company，Philadelphia，PA(1991)。優(yōu)選本發(fā)明的抗體是單克隆抗體。
抗體片段可通過裂解完整抗體，或通過表達編碼該片段的DNA產(chǎn)生?？贵w片段可通過Lamoyi等，J.Immunol.Methods，56235-243(1983)和Parham，J.Immunol.1312895-2902(1983)所述的方法制備。這種片段可含有一個或兩個Fab片段或F(ab’)2片段。這種片段還可含有單鏈片段可變區(qū)抗體，即，scFv，雙抗體，或其它抗體片段。生產(chǎn)這種功能等同物的方法在PCT申請WO93/21319，歐洲專利申請?zhí)?39,400；PCT申請WO 89/09622；歐洲專利申請338,745；和歐洲專利申請EP 332,424中公開。
單鏈抗體(scFv)是由使用或不用互連接頭連接的抗體重鏈可變區(qū)和輕鏈可變區(qū)組成的。因此，scFv含有完整的抗體結合位點。這些鏈可在細菌，或真核細胞中產(chǎn)生。單鏈抗體的一個例子是p1C11。(見下面的實施例IX。)p1C11可阻斷VEGF-KDR(VEGF-VEGFR-2)的相互作用，抑制VEGF-刺激的受體磷酸化和HUVEC有絲分裂。這種scFv既可結合HUVEC上的可溶性KDR(VEGFR-2)，又可結合細胞表面表達的KDR(VEGFR-2)。p1C11的序列如SEQ ID No21所示。通過本領域已知的方法可把上述單鏈抗體構成嵌合抗體或人源化抗體，例如，見下面的實施例IX-3。嵌合scFv的其中一個例子是嵌合p1C11，即，c-p1C11。
優(yōu)選所述抗體片段含有完整抗體的全部6個互補決定區(qū)，盡管片段所含的這種區(qū)較少，如含有3個，4個或5個CDRs，但它也可以是功能性的。如果抗體太短以致不是免疫原性的，那么它可與載體分子偶聯(lián)。一些適宜的載體分子包括匙孔血藍蛋白和牛血清白蛋白。偶聯(lián)可通過本領域已知的方法進行。
本發(fā)明的抗體還包括可通過直接突變，親和力成熟，噬菌體展示，或鏈混排方法提高結合性的那些。通過使CDRs突變，并篩選具有所需特性的抗原結合位點，可修飾或改進親和性和特異性(見，例如，Yang等，J.Mol.Bio.，254392-403(1995))。CDRs是以各種方法突變的。其中一個方法是使單個殘基或殘基的組合隨機化，這樣在其它相同的抗原結合位點群中，就可在特定位置找到全部20種氨基酸。可選擇性地，突變可通過易錯PCR方法，在多種CDR殘基上誘導(見，例如，Hawkins等，J.Mol.Bio.，226889-896(1992))。含有重鏈和輕鏈可變區(qū)基因的噬菌體展示載體在大腸桿菌的增變菌株中繁殖(見，例如，Low等，J.Mol.Bio.，250359-368(1996))。這些誘變的方法只是本領域技術人員已知的多種方法的舉例說明。
本發(fā)明的抗體還可以是具有一類物種，例如小鼠的抗體可變區(qū)，和不同物種，例如人的抗體恒定區(qū)的嵌合抗體。可選擇性地，本發(fā)明的抗體可以是人源化抗體，它具有來源于其中一類物種，例如小鼠的抗體的高變或互補決定區(qū)(CDRs)，和人類抗體的構架可變區(qū)及恒定區(qū)。可選擇性地，本發(fā)明抗體可以是具有人類抗體恒定區(qū)和可變區(qū)的人類抗體。
抗體，特別是單克隆抗體，可通過本領域已知的方法生產(chǎn)。生產(chǎn)抗體的實例包括，但不限制于，在雜交瘤細胞中生產(chǎn)并用編碼受體拮抗劑的DNA轉化哺乳動物細胞。這些方法在各種出版物中公開，包括免疫學方法，由Kohler和Milstein，Nature，256495-497(1975)和Campbell，“單克隆抗體技術，嚙齒動物和人類雜交瘤的生產(chǎn)和描述”，Burdon等，Eds.，生物化學和分子生物學的實驗室技術，13卷，Elsevier Science Publishers，Amsterdam(1985)；和Huse等在Science，2461275-1281(1989)中描述的重組DNA方法。
抗體等同物也可通過本領域已知的方法制備。例如，抗體片段可從完整抗體酶促制備。優(yōu)選，抗體等同物是從編碼這種等同物的DNA制備的。編碼抗體片段的DNA是通過使除編碼全長抗體的DNA所需部分之外的部分缺失而制備的。編碼嵌合抗體的DNA可通過使編碼人恒定區(qū)的DNA重組而制備，它們基本上或僅僅來源于相應的人抗體區(qū)，還可通過使編碼可變區(qū)的DNA重組而制備，它們基本上或僅僅來源于除人之外的哺乳動物可變區(qū)序列。編碼人源化抗體的DNA可通過使編碼除互補決定區(qū)(CDRs)之外的恒定區(qū)和可變區(qū)的DNA重組而制備，它們基本上或僅僅來源于相應的人抗體區(qū)，還可通過使編碼CDRs的DNA重組而制備，它們基本上或僅僅來源于除人之外的哺乳動物。
編碼抗體片段的DNA分子的適宜來源包括細胞，如雜交瘤，它可表達全長抗體。該片段自身可被用作抗體等同物，或按照上面所述被重組成等同物。這部分描述的DNA缺失和重組可通過已知方法進行，如在名為“抗體的功能等同物”部分所列的專利申請中公開的那些，和/或其它標準重組DNA技術，如下面描述的那些。
用于進行載體轉化和本發(fā)明受體拮抗劑表達的優(yōu)選宿主細胞是哺乳動物細胞，例如，COS-7細胞，中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，和淋巴來源的細胞系，如淋巴瘤，骨髓瘤，或雜交瘤細胞。也可選擇性使用其它真核宿主，如酵母。例如，小鼠胎兒肝基質(zhì)細胞系2018可結合AP標記-flk1和Ap標記-flk-2融合蛋白，即，含有VEGFR-2和flk-2(ATCC，Manassas，VA，CRL 10907)的配體，人胎兒脾細胞系Fsp 62891含有flk-2配體(ATCC CRL 10935)，和人基質(zhì)胎兒胸腺細胞系，F(xiàn).thy62891含有VEGFR-2配體(ATCC CRL 10936)。
轉化的宿主細胞是利用本領域已知的方法在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)的，所述液體培養(yǎng)基含有可同化的碳源(碳水化合物，如葡萄糖或乳糖)，氮源(氨基酸，肽，蛋白或它們的降解產(chǎn)物，如胨，銨鹽等)，和無機鹽(鈉，鉀，鎂和鈣的硫酸鹽，磷酸鹽和/或碳酸鹽)。此外，培養(yǎng)基還含有，例如，促進生長的物質(zhì)，如微量元素，例如，鐵，鋅，錳等。
當需要在酵母中表達基因構建體時，用于酵母中的適宜選擇基因是存在于酵母質(zhì)粒YRp7中的trp1基因。Stinchcomb等，Nature，28239(1979)；Kingsman等，Gene，7141(1979)。trp1基因可為酵母突變株提供選擇標記，所述酵母缺乏在色氨酸中生長的能力，例如，ATCC No.44076或PEP4-1。Jones，Genetics，8512(1977)。酵母宿主細胞基因組中trp1的損害可為通過在色氨酸缺乏情況下的生長而檢測轉化提供有效的環(huán)境。同樣，Leu2-缺陷酵母株(ATCC 20，622或38，626)是由含有Leu2基因的已知質(zhì)粒補充的。
可選擇性地，編碼受體拮抗劑的DNA可被克隆到來源于病毒，如腺病毒腺伴隨病毒，皰疹病毒，逆轉錄病毒或慢病毒的載體中。基因表達可由誘導型或非誘導型調(diào)節(jié)序列控制。
簡單地說，選擇含有表達所需DNA，如抗體，抗體等同物或VEGF受體的核酸分子的適宜細胞來源?？俁NA是通過標準過程從適宜來源制備的。總RNA用于指導cDNA合成。分離RNA及合成cDNA的標準方法在分子生物學的標準手冊中提供，例如，上述那些。
cDNA可通過已知方法擴增。例如，cDNA可被用作通過聚合酶鏈反應(PCR)進行擴增的模板；見Saiki等，Science，239，487(1988)或Mullis等，美國專利4,683,195。進行PCR擴增的寡核苷酸引物序列來源于被擴增的已知序列。寡核苷酸是通過本領域已知的方法合成的。適宜的方法包括由Caruthers在Science230，281-285(1985)描述的那些。
PCR擴增使用上游和下游寡核苷酸的混合物。按照標準過程，根據(jù)每個特定的引物對優(yōu)化條件。利用電泳分析PCR產(chǎn)物的cDNA，所述cDNA具有與引物間序列相對應的適宜大小?？蛇x擇性地，編碼區(qū)可在兩個或多個重疊片段中擴增。重疊片段被設計成包括一個限制性位點，從而使片段的完整cDNA組裝。
為了分離VEGF受體完整的蛋白編碼區(qū)，例如，上游的PCR寡核苷酸引物與5’端的序列互補，優(yōu)選含有ATG起始密碼子和起始密碼子的至少5-10個上游核苷酸。下游的PCR寡核苷酸引物與所需DNA序列的3’端序列互補。所需DNA序列優(yōu)選編碼VEGF受體的整個胞外部分，且任選編碼跨膜區(qū)的全部或一部分，和/或胞內(nèi)區(qū)的全部或一部分，包括終止密碼子。
擴增的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的DNA可在各種宿主細胞中的各種克隆載體中復制。宿主細胞可以是原核細胞或真核細胞。
其中剪接DNA的載體可含有染色體，非-染色體及合成DNA序列的片段。一些適宜的原核克隆載體包括來源于大腸桿菌的質(zhì)粒，如colE1，pCR1，pBR 322，pMB9，pUC，pKSM，和RP4。原核載體還包括噬菌體DNA的衍生物，如M13和其它絲狀單鏈DNA噬菌體。用于克隆編碼VEGF受體的核酸的優(yōu)選載體是桿狀病毒載體。
把含有所要表達的DNA的載體轉染到適宜的宿主細胞中。宿主細胞在適宜的培養(yǎng)基中維持，并在細胞和載體復制的條件下生長。載體可從細胞回收。所要表達的DNA可從載體回收。
所要表達的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或受體的DNA被插入到適宜的表達載體中，并在適宜的原核或真核細胞中表達。
例如，插入到宿主細胞中的DNA可編碼VEGF受體的整個胞外部分，或編碼VEGF受體胞外部分的可溶性片段。DNA編碼的VEGF受體胞外部分任選在5’端或3’端或兩個末端與附加氨基酸序列連接。附加氨基酸序列可與VEGF受體的胞外區(qū)連接，如VEGF受體的前導序列，跨膜區(qū)和/或胞內(nèi)區(qū)。附加氨基酸序列也可以是不與VEGF受體連接的序列。優(yōu)選，這種附加氨基酸序列可發(fā)揮特殊的作用，如提高表達水平，分泌，溶解性，或免疫原性。
用于在細菌，特別是大腸桿菌中表達蛋白的載體是已知的。這種載體包括由Dieckmann和Tzagoloff在J.Biol.Chem.260，1513-1520(1985)中描述的PATH載體。這些載體含有編碼鄰氨基苯甲酸鹽合成酶(TrpE)的DNA序列，然后是羧基末端多接頭。其它表達載體系統(tǒng)是以β-半乳糖苷酶(pEX)；λPL；麥芽糖結合蛋白(pMAL)；和谷胱甘肽S-轉移酶(pGST)為基礎的，見Gene 67，31(1988)和PeptideResearch3，167(1990)。
在酵母中使用的載體也是可用的。適宜的例子是2μ質(zhì)粒。
用于在哺乳動物細胞中表達的適宜載體也是已知的。這種載體包括熟知的SV-40衍生物，腺病毒，逆轉錄病毒衍生的DNA序列和來源于功能性哺乳動物載體組合的穿梭載體，如上面描述的那些，和功能性質(zhì)粒及噬菌體DNA。
其它真核表達載體是本領域已知的(例如，P.J.Southern和P.Berg，J.Mol.Appl.Genet.，1，327-341(1982)；Subramani等，Mol.Cell.Biol.，1854-864(1981)；Kaufmann和Sharp，“用調(diào)節(jié)物二氫葉酸鹽還原酶互補DNA基因共轉染的序列的擴增和表達”，J.Mol.Biol.159，601-621(1982)；)Kaufmann和Sharp，Mol.Cell.Biol.159，601-664(1982)；Scahill等，“中國倉鼠卵巢細胞中人免疫干擾素DNA基因產(chǎn)物的表達和描述”，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA80，4654-4659(1983)；Urlaub和Chasin，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA77，4216-4220，(1980)。
本發(fā)明所用表達載體含有至少一個表達控制序列，它與所要表達的DNA序列或片段可操作性連接。把控制序列插入到載體中，從而控制并調(diào)節(jié)克隆DNA序列的表達。有效的表達控制序列的例子是lac系統(tǒng)，trp系統(tǒng)，tac系統(tǒng)，trc系統(tǒng)，噬菌體λ的主要操縱子和啟動子區(qū)，fd外被蛋白的控制區(qū)，酵母的糖酵解啟動子，例如，3-磷酸甘油酸激酶的啟動子，酵母酸磷酸酶的啟動子，例如，Pho5，酵母α-交配因子的啟動子，和來源于多形瘤，腺病毒，逆轉錄病毒，和猿猴病毒的啟動子，例如，早期和晚期啟動子或SV40，和其它序列，已知它們可控制原核或真核細胞和它們的病毒或其組合的基因表達。
把含有控制信號和所要表達的DNA，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的DNA的載體插入到宿主細胞中進行表達。一些有效的表達宿主細胞包括熟知的原核及真核細胞。某些適宜的原核宿主包括，例如，大腸桿菌，如大腸桿菌SG-936，大腸桿菌HB101，大腸桿菌W3110，大腸桿菌X1776，大腸桿菌X2282，大腸桿菌DHI，和大腸桿菌MRC1，假單胞菌屬，桿菌屬，如枯草桿菌，和鏈霉菌屬。適宜的真核細胞包括組織培養(yǎng)物中的酵母和其它真菌，昆蟲，動物細胞，如COS細胞和CHO細胞，人類細胞和植物細胞。
在維持于適宜培養(yǎng)基中的宿主細胞中表達之后，可從培養(yǎng)基中分離所要表達的多肽或肽，如編碼抗體，抗體等同物，或VEGF受體的多肽或肽，并利用本領域已知的方法進行純化。如果多肽或肽沒有分泌到培養(yǎng)基中，那么在分離和純化之前，要先溶解宿主細胞。
此外，本發(fā)明的抗體可通過使用可溶性受體給哺乳動物免疫接種而制備。所述可溶性受體自身可被用作免疫原，或與載體蛋白或其它物體，如珠子，即，瓊脂糖珠連接。在哺乳動物產(chǎn)生抗體之后，分離產(chǎn)生抗體的細胞混合物，如脾細胞。單克隆抗體可通過從混合物中分離產(chǎn)生抗體的各個細胞，并通過把細胞與腫瘤細胞，如骨髓瘤細胞融合使它們無限增殖而制備。所得雜交瘤保存在培養(yǎng)基中，并表達單克隆抗體，它們是從培養(yǎng)基中采集的。
抗體還可從與細胞表面結合的受體制備，所述細胞可表達目標特異性受體。與受體結合的細胞可以是天然表達受體的細胞，如用于表達VEGFR的血管內(nèi)皮細胞?？蛇x擇性地，與受體結合的細胞可以是其中已經(jīng)轉染了編碼受體的DNA的細胞，如3T3細胞，它已經(jīng)用VEGFR轉染。
受體可被用作免疫原，從而得到本發(fā)明的抗體。受體肽可從天然來源獲得，如從表達受體的細胞獲得。例如，VEGF受體肽可從血管內(nèi)皮細胞獲得。可選擇性地，合成的受體肽可使用市售的機器制備。在這種實施方案中，flt-1(VEGFR-1)的VEGF受體氨基酸序列例如由Shibuya等在Oncogene 5，519-524(1990)中提供；KDR(VEGFR-2)的VEGF受體氨基酸序列由PCT/US92/01300和Terman等，Oncogene61677-1683(1991)提供；flk-1的VEGF受體氨基酸序列由Mattews等，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA，889026-9030(1991)提供。
作為又一個選擇，編碼受體的DNA，如cDNA或其片段可被克隆并表達，回收所得多肽，將其用作免疫原，從而得到本發(fā)明的抗體。例如，為了制備針對抗體的VEGF受體，可使用標準重組DNA技術，如下面描述的那些，把編碼本發(fā)明VEGF受體的核酸分子，或其一部分，特別是其胞外部分插入到用于在宿主細胞中表達的已知受體中。這種核酸分子的適宜來源包括表達VEGF受體的細胞，即，血管內(nèi)皮細胞。
抗體可在任何哺乳動物中制備；除人之外的適宜哺乳動物包括，例如，兔，大鼠，小鼠，馬，山羊，或靈長類動物。優(yōu)選小鼠?？贵w可以是下列其中一類免疫球蛋白的成員IgG，IgM，IgA，IgE，及其亞類，優(yōu)選IgG1抗體。本發(fā)明的抗體及其等同物可以是任何一類免疫球蛋白的成員或其組合。
非抗體VEGFR拮抗劑除了上面討論的抗體，或抗體的功能等同物之外，本發(fā)明所用受體拮抗劑還可以是其它生物分子和小分子，特別是與上述療法聯(lián)合。
生物分子包括所有脂類和單糖聚合物，氨基酸及分子量大于450的核苷酸。因此，生物分子包括，例如，寡糖和多糖；寡肽，多肽，肽，和蛋白；及寡核苷酸和多核苷酸。寡核苷酸和多核苷酸包括，例如，DNA和RNA。
生物分子還包括上述任何一種分子的衍生物。例如，生物分子的衍生物包括脂類和寡肽，多肽，肽及蛋白的糖基化衍生物。生物分子的衍生物還包括寡糖和多糖的脂類衍生物，例如，脂多糖類。
在本說明書中，不是生物分子的任何分子都被認為是小分子。本發(fā)明的小分子是具有碳和氫原子，及雜原子的物質(zhì)，其中雜原子包括，但不限制于，氮，硫，氧和磷。小分子中的原子經(jīng)由共價鍵和離子鍵連接；前者通常用于小的有機化合物，例如，小分子酪氨酸激酶抑制劑，如IressaTM和TarcevaTM，后者通常用于小的無機化合物。小的有機分子中的原子排列可以是一個鏈，例如，碳-碳鏈或碳-雜原子鏈，或含有碳原子的環(huán)，例如，苯，或碳與雜原子的組合，即，雜環(huán)，例如，嘧啶或喹唑啉。與環(huán)系統(tǒng)連接的小的有機分子中一個或多個鏈的結合構成取代的環(huán)系統(tǒng)，兩個環(huán)的稠合構成稠合的多環(huán)系統(tǒng)，它們可被簡單稱作多環(huán)系統(tǒng)，其中一個例子是IressaTM的母體構架。小分子包括天然存在的化合物，如激素，神經(jīng)遞質(zhì)，核苷酸，氨基酸，糖，脂類，及其衍生物，和通過常規(guī)的有機合成，生物合成，或其組合合成的那些化合物。見，例如，Ganesan，Drug Discov.Today，7(1)47-55(2002年1月)；Lou，Drug Discov.Today，6(24)1288-1294(2001年12月)。
小分子的某些例子包括有機化合物，有機金屬化合物，有機化合物和有機金屬化合物的鹽，糖，氨基酸，核苷及核苷酸。應當強調(diào)的是，小分子可具有任何分子量。它們被稱作小分子僅僅是因為它們的分子量通常小于450。小分子包括天然存在的化合物及合成的化合物。
小分子和生物藥對人類患者的給藥是通過本領域已知的方法進行的。對于小分子而言，這種方法的例子在Spada，美國專利5,646,153第57欄第47行-第59欄第67行描述。給予小分子的描述引入此處作為參考。
中和VEGF受體的VEGF活化內(nèi)皮或非內(nèi)皮細胞，如腫瘤細胞樣品中VEGF受體活化的中和可在體外或體內(nèi)進行。中和VEGF-受體表達細胞樣品中VEGF受體的VEGF活化包括使細胞與本發(fā)明的拮抗劑，例如抗體接觸。細胞是在把VEGF加入到細胞樣品中之前，同時，或之后，在體外與拮抗劑，例如抗體接觸的。
本發(fā)明的拮抗劑，例如抗體與VEGF受體的體內(nèi)接觸是通過把它給予哺乳動物而實現(xiàn)的。給予哺乳動物的方法包括，例如，口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌內(nèi)給藥。
這種體內(nèi)中和法可用于抑制哺乳動物血管發(fā)生。血管發(fā)生的抑制是一種有效的治療方法，如用于預防或抑制與病理狀況，如腫瘤生長有關的血管發(fā)生。因此，本發(fā)明的拮抗劑，例如抗體是抗-血管發(fā)生并抗腫瘤的免疫治療劑。
術語哺乳動物是指任何哺乳動物。哺乳動物的一些例子包括寵物，如狗和貓；飼養(yǎng)動物，如豬，牛，綿羊和山羊；實驗室動物，如小鼠和大鼠；靈長類動物，如猴，無尾猿，黑猩猩；及人類。
VEGF受體可在某非-內(nèi)皮細胞，如腫瘤細胞上找到，表明自分泌和/或旁分泌環(huán)在這些細胞中的意外存在。本發(fā)明的拮抗劑，例如，抗體可中和這種細胞上VEGF受體的活性，由此阻斷自分泌和/或旁分泌環(huán)，并抑制腫瘤生長。
抑制哺乳動物血管發(fā)生及病理狀況，如腫瘤生長的方法包括全身給予哺乳動物，或直接給予哺乳動物內(nèi)的腫瘤有效量的本發(fā)明任何一種拮抗劑，例如抗體，包括其任何一種功能等同物。哺乳動物優(yōu)選人。該方法可有效治療患有實體瘤，優(yōu)選血管瘤，和非實體瘤的患者。
腫瘤生長的抑制或減輕包括阻止或抑制腫瘤，如癌性腫瘤或非癌性腫瘤的進展。腫瘤的進展包括侵入，轉移，復發(fā)和腫瘤大小的增加。腫瘤生長的抑制或減輕還包括破壞腫瘤。
所有類型的腫瘤都可通過本發(fā)明的方法進行治療。腫瘤可以是實體瘤或非實體瘤。
可用本發(fā)明拮抗劑治療的實體瘤的一些例子包括癌，肉瘤，胚細胞瘤或神經(jīng)膠質(zhì)瘤。這種腫瘤的一些例子包括表皮樣腫瘤，鱗狀細胞腫瘤，如頭和頸部腫瘤，結腸直腸腫瘤，前列腺腫瘤，乳腺腫瘤，肺腫瘤，包括小細胞和非-小細胞肺腫瘤，胰腺腫瘤，甲狀腺腫瘤，卵巢腫瘤，和肝腫瘤。其它例子包括卡波濟氏肉瘤，CNS腫瘤，成神經(jīng)細胞瘤，毛細血管成血管細胞瘤，腦膜瘤和腦轉移瘤，黑素瘤，胃腸癌和腎癌，及肉瘤，橫紋肌肉瘤，成膠質(zhì)細胞瘤，優(yōu)選多形性成膠質(zhì)細胞瘤，和平滑肌肉瘤。可使用本發(fā)明拮抗劑有效治療的血管化皮膚癌的例子包括鱗狀上皮細胞癌，基底細胞癌，和皮膚癌，它們通過抑制惡性角質(zhì)形成細胞，如人惡性角質(zhì)形成細胞治療。
非實體瘤的一些例子包括白血病，多發(fā)性骨髓瘤和淋巴瘤。白血病的一些例子包括急性髓細胞性白血病(AML)，慢性髓細胞性白血病(CML)，急性淋巴細胞性白血病(ALL)，慢性淋巴細胞性白血病(CLL)，紅細胞性白血病或單核細胞性白血病。淋巴瘤的一些例子包括與何杰金氏病和非何杰金氏病有關的淋巴瘤。
隨后描述的實驗結果證實，本發(fā)明的抗體可特異性阻斷VEGF誘導的，在轉染的3T3細胞中表達的，小鼠胞外flk-1(VEGFR-2)(VEGFR-2)/胞內(nèi)fms嵌合受體的磷酸化。所述抗體對CSF-1完全刺激的嵌合胞外fms/胞內(nèi)FLK-2受體沒有作用。下面所述的體內(nèi)研究表明，所述抗體可顯著抑制裸鼠的腫瘤生長。
VEGF受體拮抗劑，例如，單克隆抗體的混合物可為抑制腫瘤細胞生長提供一種特別有效的方法。該混合物可含有少至2，3或4種抗體，多至6，8或10種抗體。
預防或抑制血管發(fā)生還可用于治療特征在于過量血管發(fā)生的非瘤性病理疾病，如新血管性青光眼，增生性視網(wǎng)膜病，包括增生性糖尿病性視網(wǎng)膜病，關節(jié)炎，黃斑變性，血管瘤，血管纖維瘤，和牛皮癬。
使用本發(fā)明的拮抗劑分離并純化VEGF受體使用常規(guī)方法，如親和色譜法，本發(fā)明的拮抗劑可用于分離并純化VEGF受體(Dean等，Affinity ChromatographyA PracticalApproach，IRL Press，Arlington，VA(1985))。本領域熟知的其它方法包括使用抗體包被的磁珠的磁性分離技術，使用與固體基質(zhì)連接的抗體的“淘選”技術，和流式細胞術。
VEGF受體的來源通常是血管細胞，特別是血管內(nèi)皮細胞，它可表達VEGF受體。血管內(nèi)皮細胞的適宜來源是血管，如臍帶血細胞，特別是人臍帶血管內(nèi)皮細胞(HUVEC)。
VEGF受體可用作生產(chǎn)其它物質(zhì)的起始材料，如用于制造其它單克隆和多克隆抗體的抗原，所述抗體可識別并結合VEGF受體或表達VEGF的細胞表面上的其它抗原。
使用本發(fā)明的拮抗劑分離并純化flk-1(VEGFR-2)陽性腫瘤細胞使用常規(guī)方法，如親和色譜法，本發(fā)明的拮抗劑可用于分離并純化flk-1(VEGFR-2)(VEGFR-2)陽性腫瘤細胞，即，表達flk-1(VEGFR-2)受體的腫瘤細胞(Dean等，Affinity ChromatographyAPractical Approach，IRL Press，Arlington，VA(1985))。本領域熟知的其它方法包括使用抗體包被的磁珠的磁性分離技術，細胞毒性劑，如與抗體偶聯(lián)的補體，使用與固體基質(zhì)連接的抗體的“淘選”技術，和流式細胞術。
體外或體內(nèi)監(jiān)測VEGF和VEGF受體的水平使用標準測定法和本領域已知的方法，本發(fā)明的拮抗劑，例如抗體可用于在體外或體內(nèi)監(jiān)測生物樣品中VEGF或VEGF受體的水平。生物樣品的一些例子包括體液，如血液。標準測定法包括，例如，標記抗體并進行標準免疫測定法，如本領域熟知的放射性免疫測定法。
用于進行本發(fā)明的標準重組DNA技術由Sambrook等，在“分子克隆”，第二版，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1987)中和Ausubel等(Eds.)在“分子生物學的當前方案”，Green PublishingAssociates/Wiley-Interscience，New York(1990)中描述。
給藥為進行治療，可把本發(fā)明的受體拮抗劑給予腫瘤患者，給藥量足以預防，抑制，或減輕腫瘤的進展，例如，腫瘤的生長，侵入，轉移和/或復發(fā)。足以達到這一目的的量被定義為治療有效量。用于這種用途的有效量取決于疾病的嚴重程度和患者自身免疫系統(tǒng)的一般狀況。給藥方案還可根據(jù)疾病狀況和患者的狀態(tài)而改變，通常每天給藥一次或連續(xù)輸注多次給藥(例如，每隔4-6小時)，或由主治醫(yī)生根據(jù)患者的情況決定。然而，應當注意，本發(fā)明不限于任何特定的劑量。
本發(fā)明可用于治療任何適宜的腫瘤，包括，例如，乳腺，心臟，肺，小腸，結腸，脾，腎，膀胱，頭和頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸或肝的腫瘤。優(yōu)選，當腫瘤是結腸腫瘤或非小細胞肺癌(NSCLC)時，使用本發(fā)明的方法。
此外，本發(fā)明的腫瘤優(yōu)選過量表達EGFR。在很多人類腫瘤中，都能檢測到升高的EGFR表達；例如，頭和頸(80-100％)，結直腸(25-77％)，胰腺(30-50％)，肺(40-80％)，食管(43-89％)，腎細胞(50-90％)，前列腺(65％)，膀胱(31-48％)，子宮頸/子宮(90％)，卵巢(35-70％)和乳腺(14-91％)。EGFR的表達已被證實是預后不良，存活率降低，和某些腫瘤類型轉移增加的指標。
此外，本發(fā)明的腫瘤優(yōu)選具有VEGFR的異常表達或信號傳遞。VEGFR信號傳遞的提高可在多種不同的人類癌癥中觀察到。高水平VEGFR-2是由浸潤神經(jīng)膠質(zhì)瘤的內(nèi)皮細胞表達的(Plate等，(1992)Nature 359845-848)。VEGFR-2的水平可由人成膠質(zhì)細胞瘤產(chǎn)生的VEGF特異性上調(diào)(Plate等，(1993)Cancer Res.535822-5827)。VEGFR-2在成膠質(zhì)細胞瘤相關性內(nèi)皮細胞(GAEC)中的高水平表達表明，受體活性很可能是在腫瘤形成過程中被誘導的，這是因為在正常的腦內(nèi)皮細胞中，幾乎檢測不到VEGFR-2的轉錄物。這種上調(diào)被限定在與腫瘤鄰近的血管內(nèi)皮細胞。
本發(fā)明可用于抑制或減輕腫瘤生長。腫瘤生長的抑制或減輕是指預防，抑制，或減輕腫瘤的發(fā)展，例如腫瘤的生長，侵入，轉移和/或復發(fā)。此外，本發(fā)明還可用于治療血管發(fā)生狀況，如動脈粥樣硬化，關節(jié)炎，黃斑變性和牛皮癬。對于所患狀況可用本發(fā)明進行治療的那些患者的鑒定是本領域技術人員能力和知識范圍之內(nèi)的事情。
在本發(fā)明中，任何適宜的方法或途徑都可用于給予EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗劑，例如，口服，靜脈內(nèi)，腹膜內(nèi)，皮下，或肌內(nèi)給藥。拮抗劑的給藥劑量取決于多種因素，包括，例如，拮抗劑的類型，所治療腫瘤的類型和嚴重程度，以及拮抗劑的給藥途徑。然而，應當強調(diào)的是，本發(fā)明不限于任何一種特定的給藥方法或途徑。
在其中一個選擇性實施方案中，EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑可與一種或多種抗腫瘤劑聯(lián)合給藥。見，例如，美國專利號6,217,866(Schlessinger等)(抗EGFR抗體與抗腫瘤劑聯(lián)合給藥)；美國申請?zhí)?9/312,286(Waksal等)(抗EGFR抗體與放療聯(lián)合治療)。任何適宜的抗腫瘤劑都可使用，如化療劑或放療。化療劑的例子包括，但不限制于，順鉑，阿霉素，紫杉醇，伊立替康(CPT-11)，拓撲替康或其組合。當抗腫瘤劑是指進行放療時，放射源對于所治療的患者而言，可以是外在的(外在光束放療-EBRT)或內(nèi)在的(近程放射治療-BT)。抗腫瘤劑的給藥劑量取決于多種因素，包括，例如，藥劑的類型，所治療腫瘤的類型和嚴重程度，及藥劑的給藥途徑。然而，應當強調(diào)的是，本發(fā)明不限制于任何特定的劑量。
在其它選擇性實施方案中，EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑可與一種或多種適宜的佐劑，例如，細胞因子(例如，IL-10和IL-13)或其它免疫刺激劑聯(lián)合給藥。見，例如，Larrivée等，supra。然而，應當理解，僅給予EGFR拮抗劑和VEGFR拮抗劑的治療有效方式就足以預防，抑制，或減輕腫瘤的進展。
此外，EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗劑可作為配體偶聯(lián)物給藥，它特異性結合受體，并在配體-毒素內(nèi)化后，傳遞中毒性致死負荷量。毒素和受體間的偶聯(lián)物是為了研究對EGFR-或VEGFR-過量表達的腫瘤細胞特異的毒劑，同時使非特異性毒性達到最小而設計的。例如，由EGF和假單胞菌內(nèi)毒素(PE)組成的偶聯(lián)物在體外對表達EGFR的HeLa細胞是毒性的。各種藥劑，包括硫利達嗪和腺病毒，都可提高細胞對偶聯(lián)物的攝取，并增加偶聯(lián)物的細胞毒性。
應當理解，為預防或治療目的而用于哺乳動物中的本發(fā)明的EGFR和/或VEGFR拮抗劑可以組合物的形式給藥，所述組合物還含有藥學上可接受的載體。適宜的藥學上可接受的載體包括，例如，水，生理鹽水，磷酸鹽緩沖的鹽水，葡萄糖，甘油，乙醇等的一種或多種，及其組合。藥學上可接受的載體還可包括微量的輔助物質(zhì)，如濕潤劑或乳化劑，防腐劑或緩沖劑，它們可提高結合蛋白的保存期或有效性。正如本領域熟知的，可把組合物配制成注射液，從而在給予哺乳動物后，快速，持續(xù)或延遲釋放活性成分。
本發(fā)明的EGFR拮抗劑和/或VEGFR拮抗劑可以是各種形式。這些形式包括，例如，固體，半-固體和液體劑型，如片劑，丸劑，粉劑，液體溶液，分散液或混懸液，脂質(zhì)體，栓劑，可注射和可輸注的溶液。優(yōu)選形式取決于目標給藥模式和治療應用。
這種拮抗劑可按照制藥領域熟知的方法制備。在制造組合物時，活性成分通常與載體混合，或用載體稀釋，和/或封在載體內(nèi)，例如，封入膠囊，藥袋，紙或其它容器中。當載體作為稀釋劑使用時，它可以是固體，半-固體，或液體材料，它還可作為活性成分的載體，賦形劑或介質(zhì)。因此，組合物可以是片劑，錠劑，藥袋，扁囊劑，酏劑，混懸液，氣溶膠(固體或液體基質(zhì))，含有10重量％活性化合物的軟膏劑，軟明膠膠囊和硬明膠膠囊，栓劑，注射液，懸浮液，無菌包裝的粉劑和局部用藥膏。
抑制腫瘤生長的試劑盒本發(fā)明還包括抑制腫瘤生長的試劑盒，試劑盒中含有治療有效量的EGFR拮抗劑和治療有效量的VEGFR拮抗劑。本發(fā)明試劑盒的EGFR或VEGFR拮抗劑可以是任何適宜的拮抗劑，它們的例子已經(jīng)在上面描述。優(yōu)選，試劑盒的EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的抗體，或其功能等同物?？蛇x擇性地，還優(yōu)選試劑盒的EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的小分子。試劑盒的VEGFR拮抗劑優(yōu)選包含對VEGFR特異的抗體，或其功能等同物?？蛇x擇性地，試劑盒的VEGFR拮抗劑優(yōu)選包含對VEGFR特異的小分子。此外，本發(fā)明的試劑盒還可含有抗腫瘤劑。本發(fā)明適宜的抗腫瘤劑的例子已經(jīng)在這里描述。本發(fā)明的試劑盒還可含有佐劑，它們的例子也已經(jīng)在上面描述。
因此，本發(fā)明的受體拮抗劑可用于體內(nèi)體外的研究，診斷，預防或治療方法，它們是本領域熟知的。當然，應當了解并預期本領域的技術人員可根據(jù)這里公開的本發(fā)明原理進行改變，這種改變也落在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
這里提到的所有參考文獻全部引入此處作為參考。
實施例提出下列實施例的目的是為了幫助理解本發(fā)明，而不是，也不應被解釋為以任何方式限制本發(fā)明的范圍。實施例中不包括常規(guī)方法的詳細描述，例如在構建載體和質(zhì)粒，把編碼多肽的基因插入到這種載體和質(zhì)粒中，或把質(zhì)粒引入到宿主細胞中時所用的那些方法。這種方法是本領域那些普通技術人員熟知的，而且已經(jīng)在很多公開出版物中描述，包括Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.(1989)分子克隆實驗室指南，第二版，Cold Spring Harbor LaboratoryPress。
實施例1.細胞系和培養(yǎng)基NIH 3T3細胞是從美國典型培養(yǎng)物保藏中心(Rockville MD)獲得的。C441細胞系是用嵌合受體小鼠flk-1(VEGFR-2)/人fms轉染3T3細胞構建的。10A2是含有嵌合受體人fms/小鼠FLK-2的3T3轉染子，它的分離和特性已經(jīng)描述過(Dosil等，Mol.Cell.Biol.136572-6585(1993))。細胞通常維持在Dulbecco’s改良Eagle’s培養(yǎng)基(DME)中，其中補充了10％小牛血清(CS)，1mML-谷氨酰胺，抗生素，和600μg/ml G418(Geneticin；Sigma，St LouisMO)。
成膠質(zhì)細胞瘤細胞系，GBM-18維持在補充了5％小牛血清，1mM L-谷氨酰胺，和抗生素的DME中。
生產(chǎn)分泌可溶性嵌合蛋白，小鼠flk-1(VEGFR-2)SEAPs(分泌型堿性磷酸酶)的穩(wěn)定3T3系，并把它維持在DMEM和10％小牛血清中。收集條件培養(yǎng)基。從條件培養(yǎng)基中分離出可溶性flk-1(VEGFR-2)SEAP。
實施例II.單克隆抗體的分離實施例II-1.大鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體DC-101(IgG1)用免疫復合物使Lewis大鼠(Charles River Labs)超免疫，所述免疫復合物含有小鼠flk-1SEAPs可溶性受體，兔抗-堿性磷酸酶多克隆抗體和G蛋白瓊脂糖珠。動物在3個月內(nèi)，腹膜內(nèi)注射7次這種復合物(第0，14，21，28，49，63，77天)。在不同的時間，從動物尾靜脈采集血液，并通過ELISA篩選與mflk-1(VEGFR-2)SEAPs高滴定度結合的免疫血清。最后一次注射5天后，殺死大鼠，無菌除去脾臟。洗滌脾細胞，計數(shù)，并與鼠骨髓瘤細胞系NS1以2∶1的比例融合。在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤，并通過ELISA篩選特異性結合mflk-1(VEGFR-2)SEAPs而不結合SEAPs蛋白的集落。許多陽性雜交瘤進一步擴增并通過限制稀釋而被克隆三次。下面研究其中一個被稱為DC-101的亞克隆。
實施例II-2小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體Mab25和Mab73鼠抗flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體(Mabs)是按照與DC-101所用類似的方法生產(chǎn)的。簡單地說，使用結合抗SEAP-蛋白/A瓊脂糖復合物或來源于轉染NIH 3T3細胞條件培養(yǎng)基的小麥胚凝集素瓊脂糖的flk-1(VEGFR-2)/SEAP可溶性受體給小鼠注射。6個月內(nèi)，定期使小鼠超免疫。收集免疫脾細胞，與鼠骨髓瘤細胞系NSI融合。在HAT培養(yǎng)基中選擇雜交瘤，溫育之后，篩選產(chǎn)生小鼠Mab的集落。與DC-101所用的方法不同，首先篩選結合flk-1(VEGFR-2)/fms受體的陽性上清液，所述受體捕獲自ELISA平板上的C441細胞溶解產(chǎn)物，所述ELISA平板包被有針對fms C-末端區(qū)的肽產(chǎn)生的多克隆抗體。然后通過ELISA測定與完整C441細胞，和純化flk-1(VEGFR-2)/SEAP及單獨的SEAP結合的活性Mabs。使結合C441，與flk-1(VEGFR-2)/SEAP反應，而不與SEAP反應的雜交瘤上清液擴增，在腹水中生長，并純化(EZ-PREP，Pharmacia)。在C441細胞上對純化的Mabs進行測定，通過FACS測定它們的細胞表面結合能力，并在磷酸化測定法中測定它們抑制VEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms活化的能力。這些研究的結果得到了Mabs 25和73的克隆(同種型IgG1)，用于根據(jù)它們特異性結合flk-1(VEGFR-2)，以及以與DC-101相似的水平阻斷受體活化的能力而進一步進行表征。
實施例III測定法實施例III-1.ELISA方法抗體是通過固態(tài)ELISA篩選的，其中比較了各種mAbs與flk-1(VEGFR-2)SEAP和SEAP蛋白的結合特征。以50-100ng/孔，用pH9.6碳酸鹽緩沖液中的flk-1SEAP或AP包被微量滴定板，4℃過夜。37℃時，用補充有10％新生小牛血清(NB10)的磷酸鹽緩沖鹽水封閉平板1小時。37℃時，把雜交瘤上清液或純化抗體加入到平板中溫育2小時，然后加入與辣根過氧化物酶(Tago)偶聯(lián)的山羊抗-大鼠IgG溫育1小時。充分洗滌后，加入TMB(Kirkegaard和Perry，GaithersburgMD)和過氧化氫作為色原，在ELISA閱讀器的450nm處對平板讀數(shù)。
實施例III-2同種型分析各單克隆抗體的同種型分析是按照先前所述(Songsakphisarn，R.和Goldstein，N.I.，Hybridoma 12343-348，1993)使用大鼠同種型特異性試劑(Zymed Labs，South San Francisco CA)進行的。
實施例III-3磷酸化，免疫沉淀和免疫印跡測定法對前述方法(Tessler等)進行改進后，使用C441和10A2細胞進行磷酸化測定和蛋白質(zhì)印跡分析。簡單地說，細胞在DME-10％CS中生長至90％匯合，然后在實驗前，使血清在DME-0.5％CS中饑餓24小時。HUVEC細胞在EGM基礎培養(yǎng)基中生長至亞匯合。對于中和測定法而言，在有和沒有mAb DC-101存在時，在沒有血清的條件下(DME-0.1％BSA)，用各種濃度的適宜配體室溫刺激細胞15分鐘。配體VEGF和CSF-1分別以10-80ng/ml和20-40ng/ml的濃度進行測定。單克隆抗體以0.5μg/ml-10μg/ml的濃度測定。為了評估m(xù)Ab DC-101對VEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)-fms受體活化的作用，同時加入抗體(競爭性抑制)或在加入配體之前，使抗體與細胞預結合15分鐘。沒有和有DC-101存在時，在沒有血清的培養(yǎng)基中溫育的細胞分別用作沒有和有抗體存在時的受體自磷酸化的對照。使表達fms/FLK-2嵌合受體(10A2)的對照細胞系饑餓，用20和40ng/ml CSF-1刺激，在有和沒有5μg/ml DC-101存在的情況下測定。
刺激后，用含有1mM原釩酸鈉的冰冷PBS洗滌細胞單層。然后，把細胞溶解在溶解緩沖液(20mM Tris-HCl，pH7.4，1％ Triton X-100，137mM NaCl，10％甘油，10mM EDTA，2mM原釩酸鈉，100mM NaF，100mM焦磷酸鈉，5mM Pefabloc(Boehringer Mannheim Biochemicals，Indianapolis IN))，100μg抑肽酶和100μg/ml亮抑蛋白酶肽)中，14000xg離心10分鐘。利用多克隆抗體，使蛋白從轉染細胞的澄清溶解產(chǎn)物中免疫沉淀出來，其中所述多克隆抗體是由與人fms受體C-末端區(qū)(Tessler等，J.Biol.Chem.269，12456-12461，1994)或與A蛋白瓊脂糖珠偶聯(lián)的鼠FLK-2內(nèi)激酶結構域(Small等，Proc.Nat’lAcad.Sci.USA，91，459-463，1994)相對應的肽產(chǎn)生的。與DC-101或無關大鼠IgG的免疫沉淀是用10μg與G蛋白珠偶聯(lián)的抗體進行的。然后用0.2％ Triton X-100，10mM Tris-HCl pH8.0，150mM NaCl，2mM EDTA(緩沖液A)洗滌珠子一次，用含有500mM NaCl的緩沖液A洗滌珠子兩次，用Tris-HCl，pH8.0洗滌珠子兩次。把滴干的珠子與30μl 2x SDS加樣緩沖液混合，并在4-12％梯度凝膠(Novex，San DiegoCA)中經(jīng)過SDS PAGE。進行電泳后，把蛋白印在硝酸纖維素濾膜上進行分析。使濾膜在含有5％牛血清白蛋白和10％脫脂奶粉(Biorad，CA)的封閉緩沖液(50mM Tris-HCl，pH7.4，150mM NaCl(TBS))中封閉過夜。為了檢測磷酸化受體，用封閉緩沖液中，針對磷酸酪氨酸的單克隆抗體(UBI，Lake Placid，NY)室溫探測印跡1小時。然后用含有0.1％吐溫-20(TBS-T)的0.5 x TBS洗滌印跡，并用與辣根過氧化物酶(Amersham)偶聯(lián)的山羊抗-小鼠Ig溫育。用TBS洗滌印跡，并用化學發(fā)光試劑(ECL，Amersham)溫育1分鐘。與磷酸化蛋白反應的抗磷酸酪氨酸是通過曝光高效發(fā)光檢測膠片(Hyperfilm-ECL，Amersham)0.5-10分鐘檢測的。
為了檢測C441細胞中flk-1(VEGFR-2)/fms的受體水平，按照制造商(Amersham)提供的方法分離印跡，并用抗-fms兔多克隆抗體再次探測。
實施例III-4流式細胞計結合測定法C441細胞在10cm平板中生長至近匯合。用非-酶促解離緩沖液(Sigma)把細胞移出，在沒有血清的冷培養(yǎng)基中洗滌，并重懸浮在補充了1％BSA(HBS S-BSA)的Hanks平衡鹽溶液中，濃度為每只試管1百萬個細胞。在每只試管中加入10μg單克隆Ab DC-101或同種型匹配的無關抗體抗FLK-223H7，在冰上再保持60分鐘。洗滌后，加入5μl與FITC(TAGO)偶聯(lián)的山羊抗-小鼠IgG，在冰上保持30分鐘。洗滌細胞3次，在1ml HBSS-BSA中重懸浮，并在Coulter Epics Elite細胞計數(shù)器上進行分析。熒光第二抗體的非特異性結合是根據(jù)缺少第一抗體的樣品測定的。
實施例III-5完整細胞的結合測定法使用在24孔培養(yǎng)皿中生長至匯合的細胞對C441細胞進行測定。HUVEC細胞在6孔培養(yǎng)皿中生長至匯合。用結合緩沖液(DMEM，50mMHEPES pH7.0，0.5％牛血清白蛋白)中不同量的mAb DC-101 4℃溫育細胞單層2小時。然后用冷的磷酸鹽緩沖生理鹽水(PBS)洗滌細胞，用終濃度為2.5μg/ml，與生物素偶聯(lián)的第二抗-大鼠IgG抗體溫育。4℃溫育1小時后，洗滌細胞，并用鏈霉抗生物素-辣根過氧化物酶復合物4℃溫育30分鐘。洗滌后，通過用比色檢測系統(tǒng)(TMB，Kirkeggard和Perry)測量540nm處的吸光度而測定細胞結合抗體。單獨的第二抗體的OD 540nm用作非特異性結合的對照。
實施例III-6細胞增殖測定法促有絲分裂測定法是用Cell Titer 96非放射性細胞增殖測定試劑盒(Promega Corp.，Madison，WI)進行的。在該測定法中，根據(jù)活細胞把四唑鹽還原成甲產(chǎn)物所獲得的值比色測量增殖。簡單地說，HUVEC細胞以1000個細胞/孔的密度，在EGM基礎培養(yǎng)基中的24孔明膠包被的平板中生長。溫育48小時后，向孔中加入各種成分。在有和沒有1μg/ml mAb DC-101存在時，向培養(yǎng)基中加入10ng/ml VEGF。加入肝素(Sigma)至最終濃度為1μg/ml。然后再溫育該細胞3天。為測量細胞生長，向各孔中加入20μl四唑染料的等分試樣，37℃溫育該細胞3小時。溶解細胞，測量甲產(chǎn)物的吸光度(OD570)，從而量化增殖。
實施例IV.體外活性測定法實施例IV-1.鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 25和73引起VEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體活化的特異性中和測定法是用從等濃度flk-1(VEGFR-2)/fms轉染的3T3細胞系C441中免疫沉淀出來的FLK/fms和PDGF受體進行的，而人EGFR是從腫瘤細胞系KB中免疫沉淀出來的。細胞在有和沒有10μg/ml鼠抗-flk-1 Mabs 25和37存在時，用含有20ng/ml VEGF(flk-1/fms)，DMEM-10％小牛血清(PDGFR)，或10ng/ml EGF(EGFR)的RPMI-0.5％BSA刺激。刺激后，用PBS-1mM原釩酸鈉洗滌細胞并溶解。Flk-1/fms和PDGFR是從溶解產(chǎn)物中免疫沉淀的，所述溶解產(chǎn)物具有分別針對c-fms(IM 133)C-末端區(qū)和PDGF(UBI)受體的肽產(chǎn)生的多克隆抗體。EGFR用針對人受體N-末端區(qū)溫育的Mab(C225)免疫沉淀。免疫沉淀的溶解產(chǎn)物經(jīng)過SDS聚丙稀酰胺電泳，接著進行蛋白質(zhì)印跡分析。用抗-PTyr Mab(UBI)探測印跡，以檢測受體活化。相對于無關Mab和未受刺激的對照組評估受刺激細胞的受體中和。
實施例IV-2使用Mab25和Mab73作為探針，通過蛋白質(zhì)印跡檢測flk-1(VEGFR-2)/fms受體受體是用鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs在flk-1(VEGFR-2)/fms受體的蛋白質(zhì)印跡上檢測的，所述flk-1(VEGFR-2)/fms受體是由針對c-fms受體C-末端區(qū)的肽產(chǎn)生的多克隆抗體免疫沉淀的，而c-fms受體則來源于等濃度轉染的3T3細胞系C441的溶解產(chǎn)物。通過SDS凝膠電泳和蛋白質(zhì)印跡分析后，把印跡分成四部分，每部分都用50μg/ml的抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs 25和73探測。然后分離印跡，并用抗-fms多克隆抗體再次探測，以證實由各Mab檢測的帶代表flk-1(VEGFR-2)fms受體。
實施例IV-3通過用抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs免疫沉淀而檢測來源于VEGF刺激的HUVEC和OVCAR-3細胞的活化KDR(VEGFR-2)蛋白是用來源于新鮮分離的HUVEC溶解產(chǎn)物的不同抗體免疫沉淀的。在溶解前，用RPMI-0.5％BSA中的20ng/ml VEGF室溫刺激細胞10分鐘，并用含1mM原釩酸鈉的PBS洗滌。各次免疫沉淀是用等體積溶解產(chǎn)物進行的，然后經(jīng)過SDS聚丙烯酰胺電泳，接著進行蛋白質(zhì)印跡。最初用抗-PTyr Mab(UBI)探測印跡，隨后分離，并用針對flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2，IM 142)內(nèi)激酶的肽產(chǎn)生的多克隆抗體再次探測，接著用針對flk-1(VEGFR-2)C-末端區(qū)的多克隆抗體(Santa CruzBiotechnology，Inc.)探測。免疫沉淀是用無關大鼠Mab，23H7，無關小鼠Mab，DAB8，和抗flk-1(VEGFR-2)Mabs，DC-101，73，25，和抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)多克隆抗體，IM142進行的。在某些情況下，分離印跡，并用抗flk-1 Mabs 73和25再次探測，以檢測交叉反應帶。
類似方法用于檢測卵巢癌細胞系OVCAR-3的KDR(VEGFR-2)受體形式。
實施例V抗體的活性實施例V-1 ELISA和用DC-101免疫沉淀人們發(fā)現(xiàn)大鼠IgG1單克隆抗體DC-101對鼠酪氨酸激酶受體flk-1(VEGFR-2)特異。ELISA數(shù)據(jù)表明，抗體與純化的flk-1(VEGFR-2)SEAP結合，但不與堿性磷酸酶或其它受體酪氨酸激酶如FLK-2結合。如圖1所示，DC-101可使鼠flk-1(VEGFR-2)SEAPS免疫沉淀，而不能使單獨的SEAPS免疫沉淀。
實施例V-2用DC-101抑制Flk-1(VEGFR-2)受體磷酸化進行實驗以便確定DC-101是否能通過其關聯(lián)配體VEGF165中和C441細胞中flk-1(VEGFR-2)的磷酸化。在這些研究中，單克隆抗體和VEGF在室溫同時加入到細胞單層中15分鐘。這些條件被設計成測定抗體對受體/配體結合的競爭性作用(競爭性抑制)。圖2a所示的這些測定結果表明，當在有DC-101存在的情況下測定細胞時，VEGF165誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體磷酸化顯著降低。此外，這些數(shù)據(jù)表明，Mab與VEGF165競爭阻止配體導致的受體完全活化。為了測定VEGF-flk-1(VEGFR-2)相互作用對DC-101所致抑制的敏感性，C441細胞是以最大刺激濃度的VEGF165(40ng/ml)結合各種水平的抗體測定的。這些Mab滴定的結果在圖2b中給出。當DC-101的濃度大于0.5μg/ml時，VEGF165所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化顯著降低。這些數(shù)據(jù)表明，相對較低濃度的抗體(＜1μg/ml)足以抑制配體所致的受體活化。在80ng/ml的配體過量存在時，5μg/ml抗體就能夠中和VEGF165對flk-1(VEGFR-2)的刺激。作為對照，使用CSF-1在完全刺激的fms/FLK-2受體(10A2細胞系)上測試DC-101的作用。在這些條件下，DC-101對受體活化沒有影響。
實施例V-3利用DC-101進行抑制研究通過研究進一步評估Mab抑制的程度和特異性，其中在加入配體之前，用細胞預溫育DC-101，以便使抗體與受體充分作用。在這些實驗中，用5μg/ml DC-101，通過常規(guī)方法(ImClone，NY)制備的大鼠抗-FLK-2 Mab(2A13)，和對照組大鼠IgG1(Zymed Labs)室溫溫育細胞單層15分鐘，然后加入40ng/ml VEGF165再溫育15分鐘。為了比較而進行測定，其中同時加入DC-101和VEGF165(競爭性抑制)。這些研究的結果(圖4)表明，用flk-1(VEGFR-2)/fms轉染的細胞預溫育的抗-flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體可完全消除VEGF165所致的受體活化。類似結果是用VEGF121進行刺激觀察到的。當加入無關同種型匹配的大鼠抗體不會影響VEGF所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化時，用抗-fms多克隆抗體探測的相同印跡的活性顯示，每道受體蛋白的水平相同。這些數(shù)據(jù)表明，使用DC-101觀察到的磷酸化抑制是由于受體活化的阻斷，而不是試驗樣品中缺少受體蛋白。
實施例V-4通過FACS分析DC-101與C441細胞的結合通過FACS分析測定mAb與flk-1(VEGFR-2)/fms受體(C441細胞)轉染的3T3細胞的結合。圖6所示結果證明，在C441細胞表面上表達的嵌合flk-1(VEGFR-2)/fms可被mAb DC-101特異性識別，而不能被針對相關酪氨酸激酶受體，F(xiàn)LK-2溫育的同種型抗體識別。mAb-受體在細胞表面相互作用的效率是根據(jù)測定法確定的，其中在完整的C441細胞上測量mAb結合的不同水平。圖7所示的這些結果表明，mAb以大約500ng/ml相對較顯著親和性與flk-1(VEGFR-2)/fms受體結合。這些結果表明，mAb對細胞表面表達的flk-1(vEGFR-2)具有較強的親和性。
實施例V-5通過免疫沉淀測定DC-101的反應性DC-101與flk-1(VEGFR-2)/fms受體的反應程度是在被VEGF活化后，測定抗體使受體免疫沉淀的能力而進一步評估的。圖8表示VEGF刺激的C441細胞磷酸化flk-1(VEGFR-2)/fms受體的mAb DC-101所致的免疫沉淀。結果表明DC-101單克隆抗體和抗fms多克隆抗體具有相似的受體作用水平，而大鼠抗FLK-2抗體2H37(IgG1)和2A13(IgG2a)則沒有反應性。然后進行實驗，確定mAb DC-101是否能夠在配體的最大刺激濃度(40ng/ml)中和VEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms磷酸化。在這些研究中，把單克隆抗體與配體同時加入到細胞單層中，或在配體刺激之前加入，室溫測定15分鐘。對這些條件進行研究，以確定抗體對受體/配體結合的競爭性作用(競爭性抑制)和預結合抗體阻止受體活化效果。圖4所示的這些測定結果表明，flk-1(VEGFR-2)/fms的磷酸化是通過同時加入mAb和VEGF降低的，并可被與受體預結合的抗體明顯抑制。這些數(shù)據(jù)的光密度掃描揭示，mAbDC-101與flk-1(VEGFR-2)/fms相互作用，抑制磷酸化至完全刺激的受體對照組(4道)的6％(5道，P)和40％(6道，C)。根據(jù)這些數(shù)據(jù)我們可推斷mAb DC-101與配體-受體相互作用激烈競爭，中和flk-1受體的活化。為了確定VEGF-flk-1(VEGFR-2)相互作用對mAb DC-101所致抑制的敏感性，在抗體濃度逐漸增加時，用最大的VEGF水平測定C441細胞。測定是在競爭和預結合條件下，用mAb進行的。這些mAb滴定的結果在圖9中給出。當mAb DC-101與濃度大于0.5μg/ml的VEGF抗體競爭時，可觀察到flk-1(VEGFR-2)磷酸化的顯著降低。這些數(shù)據(jù)還表明，相對較低濃度的預結合抗體(＜1μg/ml)足以完全抑制配體所致的受體活化。
實施例V-6通過磷酸化測定法測定DC-101的活性為進一步評估m(xù)Ab DC-101對受體活化的拮抗作用，進行磷酸化測定，其中把固定量的抗體(5μg/ml)加入到用量逐漸增加的配體所刺激的C441細胞中(圖3a)。通過光密度測定法的讀數(shù)量化有和沒有mAb DC-101時各配體濃度誘導的磷酸化水平。圖3b給出的這些數(shù)據(jù)的圖表明，即使有過量VEGF存在，抗體也能部分中和受體磷酸化。為了評估m(xù)Ab DC-101對受體活化的特異性，測試了抗體競爭性抑制3T3轉染細胞系10A2中，CSF-1誘導的fms/FLK-2受體活化的能力。在這些實驗中，測試了5μg/ml的mAb DC-101和已知導致受體完全活化的CSF-1濃度(20-40ng/ml)。圖10所示的這些結果表明，mAb DC-101對CSF-1介導的fms/FLK-2受體磷酸化沒有作用。
實施例V-7通過預溫育研究DC-101的抑制作用通過研究進一步評估抗體抑制的程度和特異性，其中DC-101或無關抗體是在加入配體前用細胞預溫育的，以確保抗體與受體充分作用。在這些實驗中，細胞單層是在加入40ng/ml VEGF前，用5μg/mlDC-101，大鼠抗FLK-2mAb(2A13)或?qū)φ沾笫驣gG1(Zymed Labs)預溫育的。為了進行對比，還進行了競爭性測定，其中同時加入抗體和VEGF。這些研究的結果表明，只有把抗flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體與flk-1(VEGFR-2)/fms轉染的細胞預溫育才能夠完全消除VEGF所致的受體活化，而加入無關同種型匹配的大鼠抗體則不能影響VEGF所致的flk-1(VEGFR-2)磷酸化。用抗-fms多克隆探測同一印跡的活性(圖11)顯示，每道的受體蛋白水平相等。這些數(shù)據(jù)表明，用mAb DC-101處理過的細胞觀察到的磷酸化不足是由于阻斷了VEGF-誘導的等量表達受體的磷酸化。
實施例V-8抗體與同源受體形式的相互作用然后進行實驗，確定抗flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體是否與人內(nèi)皮細胞上的同源受體形式相互作用。在克隆的HUVEC細胞(ATCC)上，對濃度逐漸增加的DC-101進行的滴定表明，抗體具有復雜的結合行為。數(shù)據(jù)表示不同抗體與存在于內(nèi)皮細胞上的VEGF受體的相互作用(Vaisman等，J.Biol.Chem.265，19461-19466，1990)。然后在與圖8報道的那些相似的條件下，利用磷酸化測定法描述DC-101與VEGF刺激的HUVEC細胞相互作用的特異性。在這些研究中，當扣除配體成分時，DC-101可使HUVEC細胞的蛋白帶免疫沉淀，所述蛋白帶分子量與交聯(lián)VEGF-受體帶的那些相似(圖12)。當VEGF刺激細胞時(比較圖12中的1道和2道)，這些帶顯示磷酸化的增加。此外，VEGF誘導的受體帶磷酸化是通過在測定時加入1μg/ml肝素而加強(圖12中的3道)。這些發(fā)現(xiàn)與先前報道過的，存在低濃度肝素時，VEGF與內(nèi)皮細胞結合的增加相一致(Gitay-Goren等，J.Biol.Chem.267，6093-6098.1992)。
很難確定免疫沉淀蛋白與DC-101相互作用可產(chǎn)生圖12觀察到的復雜的磷酸化帶，圖12給出了各種受體形式與HUVEC上VEGF的結合，及刺激后它們締合的可能性。據(jù)報道，分子量約為180(KDR(VEGFR-2))，155，130-135，120-125和85的細胞表面表達的受體形式可結合HUVEC上的VEGF。這種發(fā)現(xiàn)強調(diào)了若干不同受體形式在配體刺激后異二聚的可能性，其異二聚的方式與KDR-flk-1(VEGFR-2/VEGFR-1)相似。然而，除了KDR(VEGFR-2)外，這些受體形式的準確特性和作用還不明確。所以，抗體反應性可能是因為與其中不依賴于KDR(VEGFR-2)的VEGF受體中之一相互作用而引起的。
通過FACS分析可知，DC-101既不與ELISA形式的人KDR(VEGFR-2)反應，也不與新鮮分離的HUVEC結合。這些結果表明，DC-101與人KDR(VEGFR-2)直接作用是不大可能的。
通過FACS分析可知，與DC-101不同，Mab 25和Mab 73都與ELISA形式的人KDR(VEGFR-2)反應，并結合新鮮分離的HUVEC。
實施例V-9HUVEC的促有絲分裂測定法有和沒有抗體存在時，在用VEGF刺激的HUVEC細胞(ATCC)的促有絲分裂測定法中對抗體進行試驗，可觀察到DC-101對內(nèi)皮細胞的抑制作用。這些結果表明，VEGF所致的細胞增殖的顯著增加可被DC-101大約減少35％。在這些測定法使用的生長條件下，肝素對細胞生長沒有不同的作用。
因為DC-101可對VEGF誘導的增殖和HUVEC的受體磷酸化起作用，因此可以想得到這些結果是由于Mab與不定受體形式相互作用，其中不定受體形式很難接近細胞表面，但可對HUVEC生長發(fā)揮某些作用，盡管這種作用很小。且，DC-101可把分子量合適的磷酸化帶從VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出來的事實表明，DC-101可與和活化受體有關的不定flk-1(VEGFR-2)樣蛋白相互作用。
實施例V-10Mab 25和Mab 73與C441細胞和HUVEC的結合通過FACS分析可知，Mabs 25和73可結合C441和HUVEC，并可在兩個細胞系中內(nèi)化。蛋白質(zhì)印跡的結果表明，兩種抗flk-1Mabs都可檢測由抗fms多克隆抗體從C441細胞中免疫沉淀出來的FLK/fms受體帶。(見上面實施例IV-2的方法)。這些抗體可引起VEGF誘導的flk-1(VEGFR-2)/fms受體的特異性中和，而且對PDGF所致的小鼠PDGF受體磷酸化或EGF所致的人EGF受體磷酸化沒有作用。(見上述實施例IV-1的方法)。由增殖測定法可知，它們具有抑制VEGF刺激的HUVEC至50％的能力，而DC-101則影響生長至很小的程度。
實施例V-11 KDR(VEGFR-2)與Mab25和Mab73的免疫沉淀
KDR(VEGFR-2)代表一類可利用Mab 25和Mab 73從活化HUVEC中免疫沉淀出來的磷蛋白。KDR(VEGFR-2)是在蛋白質(zhì)印跡中檢測的，并使用抗flk-1/KDR(VEGFR-1/VEGFR-2)多克隆抗體(IM142)從VEGF-刺激的早期傳代HUVEC進行免疫沉淀分析。相反，利用這些抗體從VEGF-刺激的HUVEC中免疫沉淀出來的帶與IM142交叉反應，而不與抗-flt-1(抗-VEGFR-1)多克隆抗體交叉反應。以實驗證據(jù)為基礎，根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)推斷出，Mabs可影響HUVEC中KDR(VEGFR-2)的活性，并且暗示作為VEGF受體的KDR(VEGFR-2)與活化內(nèi)皮細胞中的增殖反應有關。(見上面實施例IV-3的方法)實施例VI非內(nèi)皮(腫瘤)細胞上VEGF受體形式的存在通過免疫沉淀對若干腫瘤系進行篩選，以確定它們與DC-101的蛋白反應性，并用抗磷酸酪氨酸檢測。細胞系8161(黑素瘤)和A431(表皮樣癌)的免疫印跡可產(chǎn)生分子量約為170和120kd的磷酸化帶。這些結果表明，人VEGF受體形式在非內(nèi)皮細胞，如腫瘤細胞中表達。
類似的實驗顯示，KDR(VEGFR-2)樣受體在卵巢癌細胞系，OVCAR-3中表達。這些細胞似乎也分泌VEGF。磷酸化帶是利用抗-KDR(VEGFR-2)多克隆抗體從VEGF-刺激的OVCAR-3細胞中免疫沉淀出來的，通過蛋白質(zhì)印跡分析可知，它可與抗flk-1(VEGFR-2)Mabs反應。且，利用鼠Mabs從這些細胞中免疫沉淀出來的帶可與同一多克隆抗體交叉反應。此外，由增殖測定法可知，某些鼠抗-flk-1(VEGFR-2)Mabs可引起對這些細胞的抑制作用。這些結果證實了人VEGF受體形式的非內(nèi)皮表達(即，在腫瘤細胞上表達)。磷酸化和增殖測定的數(shù)據(jù)還表明，VEGF可調(diào)節(jié)腫瘤發(fā)生過程中，自分泌和旁分泌方式的受體活性。(見上述實施例IV-3的方法)實施例VII使用DC-101進行體內(nèi)研究實施例VII-1利用DC-101體內(nèi)抑制血管發(fā)生設計進行體內(nèi)研究是為了確定抗flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體能否阻斷表達VEGF的腫瘤細胞生長。在這些實驗中，使用了人多形性成膠質(zhì)細胞瘤細胞系，它具有高水平的VEGF信息，而且可在沒有血清的培養(yǎng)基中處理24小時后，分泌大約5ng/ml的VEGF生長因子(圖5)。
第0天，給無胸腺裸鼠(nu/nu；Charles River Labs)側腹注射1-2百萬個成膠質(zhì)細胞瘤細胞。在同一天開始，給動物腹膜內(nèi)注射DC-101或?qū)φ湛贵w(100μg/動物)。隨后，在第3，5，7，10，12，14，17，19，和21天，小鼠接受抗體治療。在第0，3，5，7，10，12，14，17，19，和21天，給動物注射100μg DC-101或鼠FLK-2(2A13)受體的對照大鼠抗體，每只動物共接種1mg。腫瘤在第5天開始出現(xiàn)，一直持續(xù)50天。每天用測徑規(guī)測量腫瘤大小，并利用下列公式計算腫瘤體積p/6x較大直徑x(較小直徑)2(Baselga J.Nat’l CancerInst.851327-1333)。每周至少測量3次，并按照上面所述計算腫瘤體積。DC-101組中，有一只患有腫瘤的動物在研究的早期死亡，不能用于測定兩組之間的統(tǒng)計學顯著差異。
圖14a和14b表示38天后，DC-101和2A13對照組之間，各動物腫瘤生長減輕的比較。雖然在研究過程中，所有動物腫瘤的大小和數(shù)量都發(fā)生了變化，但用DC-101治療過的小鼠在腫瘤進展過程中表現(xiàn)出全面的延遲。DC-101組的其中一只小鼠保持沒有腫瘤一直到第49天才發(fā)現(xiàn)較小的生長。盡管那樣，腫瘤生長還是被顯著抑制。對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析，以便評估兩組之間腫瘤大小的差異。對數(shù)據(jù)進行協(xié)方差的標準分析，其中腫瘤大小隨治療時間而減小。結果表明，在腫瘤大小隨時間而減小的方面，DC-101組與注射2A13的小鼠明顯不同(p＜0.0001)。
圖15表示DC-101對無胸腺裸鼠的治療效果，所述無胸腺裸鼠中移植了分泌VEGF的人成膠質(zhì)細胞瘤細胞系GBM-18。給裸鼠皮下注射GBM-18細胞，并把它們分成3個治療組PBS對照組，無關大鼠IgG1對照組，和DC-101。治療與腫瘤的異種移植同時進行，并持續(xù)4周。結果表明，與對照組相比，用DC-101治療過的裸鼠中的GBM-18腫瘤生長顯著降低。該實驗表明，DC-101通過阻斷腫瘤相關性血管內(nèi)皮細胞上flk-1(VEGFR-2)的VEGF活化而抑制腫瘤生長，且DC-101作為針對分泌VEGF的血管化腫瘤的抗-血管發(fā)生劑具有治療價值。
flk-1(VEGFR-2)受體酪氨酸激酶的單克隆抗體可通過消除血管發(fā)生而抑制腫瘤侵入。侵入性生長和血管發(fā)生是惡性腫瘤的重要特征。兩個現(xiàn)象都被證實適于在表面移植測定法中區(qū)分良性和惡性的角質(zhì)形成細胞。把與膠原凝膠結合的細胞單層移植到裸鼠背肌上后，最初形成的所有腫瘤細胞構成鱗狀上皮，但只有惡性角質(zhì)形成細胞在2-3周內(nèi)侵入性生長。良性及惡性細胞都可誘導血管發(fā)生。然而，惡性細胞的血管發(fā)生反應發(fā)生較早，更強，且毛細血管向著惡性上皮生長。此外，在良性腫瘤細胞的移植物中，毛細血管在2-3周后消退，而惡性角質(zhì)形成細胞則維持不間斷的血管發(fā)生水平。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)及其關聯(lián)配體在腫瘤血管發(fā)生中起著關鍵的作用。DC-101的給藥可破壞不間斷的血管發(fā)生，從而抑制腫瘤侵入。抗體可阻止新形成的血管網(wǎng)的成熟及進一步擴展，但不能顯著干擾最初的血管發(fā)生誘導。這些結果證實腫瘤侵入需要在先的血管發(fā)生，VEGF受體在維持這種模型系統(tǒng)的血管發(fā)生中至關重要。
實施例VII-2不同濃度的DC-101對所確立的成膠質(zhì)細胞瘤(gbm-18)的作用給無胸腺小鼠(nu/nu)皮下接種GBM-18(人多形性成膠質(zhì)細胞瘤)。當腫瘤的平均體積達到100-200mm3時，開始抗體治療。治療包括下列6次注射(每周2次，注射3周)(i)每次注射200，400或800μg的DC-101；(ii)無關同種型匹配的大鼠IgG(每次注射400μg)；或(iii)PBS。用測徑規(guī)測量腫瘤體積。與PBS和無關單克隆抗體組相比，DC-101組的腫瘤抑制比較顯著(*)。
其它實驗可證實大鼠抗flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體DC-101對裸鼠GBM-18腫瘤生長的作用。第0天，給動物(nu/nu；Charles RiverLabs；10只動物/組)皮下注射GBM-18細胞(人成膠質(zhì)細胞瘤[100]；1百萬/只動物)。第7天開始用PBS或DC-101(每次注射200μg)治療，每周兩次，持續(xù)3周(6x)。曲線圖表示各組隨時間改變的平均腫瘤體積和消退數(shù)據(jù)，圖中還給出了它們各自的腫瘤生長速度(斜率以λ表示；實線)和99％置信限(虛線)。用DC-101處理過的動物的曲線斜率與PBS的明顯不同(p＜0.01)。值得注意的是，無關大鼠IgG1單克隆抗體(抗小鼠IgA；Pharmigen)對GBM-18異種移植物的生長沒有影響，其結果與使用PBS觀察到的相似(沒有給出數(shù)據(jù))。
實施例VIII抗flk-1(VEGFR-2)抗體可選擇性增加放療誘導的裸鼠中人腫瘤異種移植物的治愈率該實施例是為了評估可阻斷鼠腫瘤血管內(nèi)皮細胞上的重要VEGF受體-2，flk-1(VEGFR-2)的單克隆抗體DC-101能否增加分次放療(RT)導致的腫瘤異種移植物的治愈可能性，以及該抗體能否同時調(diào)節(jié)正常組織(小鼠皮膚)的放療反應。
材料&方法把人小細胞肺癌54A和多形性成膠質(zhì)細胞瘤U87皮下植入到裸鼠的后腿中。當腫瘤直徑達到8mm時(第0天)開始治療。每3天腹膜內(nèi)注射20或40mg/kg體重的DC-101，共注射6次。連續(xù)5天，每天給予相等的分次放療總劑量。第0天，小鼠第一次注射抗體，或開始RT。對于聯(lián)合療法而言，DC-101給藥在第0天開始，RT在第1天開始。治療后，每周測量腫瘤大小2-3次。在任一組中觀察到腫瘤復發(fā)后，跟蹤有局部對照腫瘤的小鼠90天。在開始RT后的前30天內(nèi)，使用記分量表評估腫瘤放療區(qū)域的急性皮膚反應。
結果單獨使用的抗體可以劑量依賴性的方式抑制兩種腫瘤的生長(但不會消退)。這種作用在54A中比在U87異種移植物中更顯著。在任一模型中，與單獨進行RT相比，把最低劑量(共25-30Gy)的放療與DC-101聯(lián)合可進一步延遲腫瘤的生長?？贵w也是以劑量依賴性的方式增加RT的治愈效果。例如，較高劑量的DC-101可使局部控制50％腫瘤所需的放療劑量降低在54A異種移植物中為1.7倍(從單獨進行RT時的67.6Gy降至聯(lián)合療法的39.1Gy)；在U87中為1.3倍(從97.8-74.8Gy)。還有一點特別重要，那就是DC-101的這種作用對腫瘤是選擇性的。即，沒有檢測到抗體對皮膚放療反應的平行改變。正如在其它實驗中評估的，DC-101誘導的腫瘤放療反應的提高與它們的輻射敏化或氧化的改變無關，而與抗體顯著降低腫瘤間質(zhì)液壓有關。
結論結果共同表明，針對這些生長因子分子主要受體的抗體對VEGF-信號傳遞途徑的阻斷可選擇性加強分次RT的腫瘤治愈反應；并因此提供一種治療法。
實施例IX.生產(chǎn)單鏈抗體實施例IX-1材料實施例IX-1(a)細胞系和蛋白原代培養(yǎng)的HUVEC維持在37℃，5％CO2的EBM-2培養(yǎng)基中。使用2-5代的細胞進行所有測定。VEGF165蛋白在桿狀病毒中表達并純化。通過RT-PCR從人類胎兒腎臟的mRNA中分離編碼KDR(VEGFR-2)胞外域的互補DNA，并把它亞克隆到載體AP-Tag的BglII和BspEI位點中。在該質(zhì)粒中，KDR(VEGFR-2)胞外域的cDNA在讀框中與人胎盤AP的cDNA融合。所述質(zhì)粒與新霉素表達載體pSV-Neo一起被電穿孔到NIH3T3細胞中，并用G418選擇穩(wěn)定的細胞克隆。使用AP的固定化單克隆抗體，通過親和色譜法從細胞培養(yǎng)物上清液中純化出可溶性融合蛋白KDR-AP。
實施例IX-1(b)小鼠免疫法和單鏈抗體噬菌體展示文庫的構建給雌性BALB/C小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射200μl RIBI佐劑系統(tǒng)中的10μg KDR-AP兩次，接著在2個月內(nèi)，在沒有RIBI佐劑系統(tǒng)的條件下，腹膜內(nèi)注射1次。在第一次免疫接種時，給小鼠皮下(s.c.)注射200μl RIBI中的10μg KDR-AP。實行安樂死前，給小鼠腹膜內(nèi)加強20μg KDR-AP三天。除去供體小鼠的脾臟，并分離細胞。提取RNA并從脾細胞的總RNA中純化出mRNA。使用mRNA構建scFv噬菌體展示文庫，它是在絲狀噬菌體M13的表面展示的。
scFv在絲狀噬菌體表面展示時，抗體的VH和VL結構域是通過15個氨基酸長的接頭(GGGGS)3連接在一起的，并與噬菌體蛋白III的N-末端融合。為了進行檢測和分析，把15個氨基酸長的E標記(其后面是琥珀密碼子(TAG))插入到VL的C-末端和蛋白III之間。位于E標記和蛋白III間的琥珀密碼子可使該構建體在轉移到抑制宿主(如TGI細胞)中時，構成表面-展示形式的scFv，并在轉移到非抑制宿主(如HB2151細胞)中時，構成可溶性形式的scFv。
把組裝的scFv DNA連接到pCANTAB 5E載體中。把轉化的TG1細胞鋪于2YTAG平板上并進行溫育。把集落刮在10ml 2YT培養(yǎng)基中，與5ml 50％甘油混合，-70℃貯存，作為文庫的原液。
實施例IX-1(c)生物淘選文庫原液生長至對數(shù)期時，把它引入到M13K07輔助噬菌體中，并于30℃時，在2YTAK培養(yǎng)基(2YT含有100μg/ml氨芐西林和50μg/ml卡那霉素)中過夜擴增。噬菌體制品在4％PEG/0.5M NaCl中沉淀，在3％脫脂奶/含500μg/ml AP蛋白的PBS中重懸浮，37℃溫育1小時，以捕獲展示抗AP scFv的噬菌體并阻斷其它非特異性結合。
首先于37℃時用3％奶/PBS封閉包被有KDR-AP(10μg/ml)的Maxisorp Star試管(Nunc，Denmark)1小時，然后用噬菌體制品室溫溫育1小時。用PBST洗滌試管10次，然后用PBS(PBS含0.1％吐溫20)洗滌10次。用1ml新鮮制備的100mM三乙胺溶液室溫洗脫結合噬菌體10分鐘。37℃用10ml對數(shù)中期的TG1細胞溫育洗脫的噬菌體30分鐘，靜置30分鐘，振搖。然后把感染的TG1細胞鋪于2YTAG平板上，30℃過夜溫育。
在第三輪淘選后篩選出來的克隆有99％(185/186)是特異性的KDR(VEGFR-2)結合劑。然而，在這些結合劑中，只有15(8％)個能阻斷KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結合。這15個克隆的DNA BstN I指紋表明存在2種不同的消化模式；而21個隨機抽取的VEGF非阻斷劑產(chǎn)生了4種不同的模式。第二輪淘選之后，可在已經(jīng)鑒定的克隆中見到所有的消化模式。各消化模式的代表克隆是從第二輪淘選后回收的克隆中挑選的，并進行DNA測序。在15個測過序的克隆中，鑒定了2個獨特的VEGF阻斷劑和3個非阻斷劑。其中一個scFv，p2A7既不結合KDR(VEGFR-2)，又不阻斷VEGF與KDR(VEGFR-2)的結合，因此被選作所有研究的陰性對照。
實施例IX-1(d)噬菌體的ELISA各TG1克隆37℃時在96孔平板中生長，并按照上面所述把它引入到M13K07輔助噬菌體中。用1/6體積的18％奶/PBS室溫阻斷擴增的噬菌體制品1小時，然后加入到包被有KDR-AP或AP(1μg/ml×100μl)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室溫溫育1小時后，用PBST洗滌該平板3次，并用兔抗M13噬菌體Ab-HRP偶聯(lián)物溫育。洗滌平板5次，加入TMB過氧化物酶底物，使用微量平板讀數(shù)器讀出450nm處的OD，鑒定并對scFv抗體測序。
實施例IX-1(e)可溶性scFv的制備各個克隆的噬菌體用于感染非抑制大腸桿菌宿主HB2151和在2YTAG-N平板上選擇的感染物。scFv在HB2151細胞中的表達是通過30℃時，在含有1mM異丙基-1-硫代-B-D-吡喃半乳糖苷的2YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞誘導的。細胞的胞質(zhì)提取物是通過把細胞沉淀重懸浮在25mM Tris(pH 7.5)中，并于4℃時，輕輕振搖溫育1小時制備的，其中25mM Tris(pH 7.5)含有20％(w/v)蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mM PMSF。15,000rpm離心15分鐘后，使用RPAS PurificationModule(Pharmacia Biotech)通過親和色譜法從上清液中純化出可溶性scFv。
實施例IX-2測定法實施例IX-2(a)定量KDR(VEGFR-2)結合測定法使用兩種測定法定量檢測純化的可溶性scFv與KDR(VEGFR-2)的結合。
4個不同的克隆，包括兩個VEGF阻斷劑，p1C11和p1F12，一個非阻斷劑，優(yōu)勢克隆p2A6和非結合劑p2A7是利用非抑制宿主大腸桿菌HB2151細胞在搖瓶中表達的?？扇苄詓cFv是通過抗-E標記親和色譜法從大腸桿菌的胞質(zhì)提取物中純化出來的。這些克隆的純化scFv的產(chǎn)率為100-400μg/l培養(yǎng)物。
在直接結合測定法中，把不同量的可溶性scFv加入到KDR(VEGFR-2)包被的96孔Maxi-sorp微量滴定平板中，室溫溫育1小時，用PBST洗滌平板3次。然后用100μl小鼠抗E標記抗體室溫溫育該平板1小時，接著用100pl兔抗-小鼠抗體-HRP偶聯(lián)物培養(yǎng)。在進行上述噬菌體ELISA過程后，洗滌平板并顯影。
在另一測定法，即競爭性VEGF阻斷測定法中，把不同量的可溶性scFv與固定量的KDR-AP(50ng)混合，室溫溫育1小時。然后把混合物轉移到包被有VEGF165(200ng/孔)的96孔微量滴定平板中，室溫溫育2小時，之后洗滌平板5次，加入AP的底物，從而量化結合的KDR-AP分子。然后計算IC50，即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的scFv濃度。
圖16表示通過直接結合ELISA測定的，scFv與固定化KDR(VEGFR-2)的劑量依賴性結合。如圖17所示，克隆p1C11和p1F12也可阻斷KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結合，但p2A6不能。圖17所示的數(shù)據(jù)是三次測量的平均值±SD。陰性對照克隆p2A7，既不結合KDR(VEGFR-2)，也不阻斷KDR(VEGFR-2)與VEGF的結合(圖16和17)?？寺1C11，即每輪淘選后的優(yōu)勢克隆，顯示出最高的KDR(VEGFR-2)結合能力和阻斷VEGF與KDR(VEGFR-2)結合的最高效力(表1)。使克隆p1C11與KDR(VEGFR-2)結合最大的50％所需的抗體濃度和抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的濃度分別為0.3nM和3nM(圖17)。FACS分析證實，p1C11，p1F12和p2A6也能結合在HUVEC細胞表面表達的受體。
實施例IX-2(b)可溶性scFv的BIAcore分析可溶性scFv與KDR(VEGFR-2)的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)測量的。把KDR-AP融合蛋白固定在傳感器芯片上，注射62.5nM-1000nM濃度的可溶性scFv。獲得各濃度的傳感圖，并使用BIA Evaluation 2.0程序評估，以測定速率常數(shù)kon和koff。Kd是根據(jù)速率常數(shù)koff/kon的比值計算的。
表1表示BIAcore儀器上表面等離子共振的結果。阻斷VEGF的scFv，p1C11和p1F12分別以2.1和5.9nM的Kd與固定化的KDR(VEGFR-2)結合。非阻斷性scFv，p2A6與KDR(VEGFR-2)結合時，其親和性比最好的結合劑p1C11弱6倍，這主要是由于其更快的解離速率。正如所預期的，p2A7不與BIAcore上的固定化KDR(VEGFR-2)結合。
實施例IX-2(c)磷酸化測定法磷酸化測定法是按照前述方法，用早期傳代HUVEC進行的。簡單地說，在有或沒有5μg/ml scFv抗體存在時，在補充了0.5％牛血清白蛋白，沒有血清的EBM-2基礎培養(yǎng)基中室溫溫育HUVEC 10分鐘，接著用20ng/ml VEGF165室溫刺激15分鐘。溶解細胞，使用與兔抗-KDR(抗VEGFR-2)多克隆抗體(ImClone Systems Incorporated)偶聯(lián)的蛋白A瓊脂糖珠把KDR(VEGFR-2)受體從細胞溶解產(chǎn)物中免疫沉淀出來。洗滌珠子，與SDS加樣緩沖液混合，對上清液進行蛋白質(zhì)印跡分析。為了檢測KDR(VEGFR-2)的磷酸化，用抗-磷酸酪氨酸Mab，4G10探測印跡。對于MAP激酶活性測定法而言，用SDS-PAGE分辨細胞溶解產(chǎn)物，接著使用磷酸-特異性MAP激酶抗體進行蛋白質(zhì)印跡分析。所有信號都是用ECL檢測的。
結果表明，阻斷VEGF的scFv p1C11能夠抑制VEGF刺激的KDR(VEGFR-2)受體磷酸化，而非阻斷性scFv p2A6則不能。此外，p1C11還可有效抑制VEGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。相反，p1C11和p2A6都不能抑制FGF-刺激的MAP激酶p44/p42活化。
實施例IX-2(d)抗有絲分裂測定法把HUVEC(5×103個細胞/孔)鋪于96孔組織培養(yǎng)平板上的200μl沒有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養(yǎng)基中，37℃溫育72小時。把不同量的抗體一式兩份加到孔中，37℃預溫育1小時，之后加入VEGF165至16ng/ml的終濃度。溫育18小時后，向各孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR(Amersham)，再溫育4小時。把細胞放在冰上，用含血清的培養(yǎng)基洗滌兩次，然后用10％TCA在4℃時溫育10分鐘。然后用水洗滌細胞1次，并在25μl的2％SDS中溶解。加入閃爍液(150μl/孔)，在閃爍計數(shù)器(Wallach，Model 1450 Microbeta ScintillationCounter)上測定已摻入DNA的放射性。
scFv抗體阻斷HUVEC上VEGF-刺激的促有絲分裂活性的能力在圖18中表示。阻斷VEGF的scFv p1C11可有力抑制HUVEC上VEGF誘導的DNA合成，其EC50，即抑制50％ VEGF-刺激的HUVEC促有絲分裂的抗體濃度約為5nM。非阻斷性scFv p2A6對VEGF所致的促有絲分裂活性沒有抑制作用。p1C11和p2A6都不能抑制HUVEC中bFGF誘導的DNA合成(沒有標出)。圖18所示數(shù)據(jù)表示至少3次獨立的實驗。(！)僅有VEGF；(A)沒有VEGF。
實施例IX-3從p1C11生產(chǎn)嵌合抗體實施例IX-3(a)細胞系和蛋白原代培養(yǎng)的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVEC)在37℃，5％CO2的EBM-2培養(yǎng)基中維持。用2-5代的細胞進行全部測定。VEGF165和KDR(VEGFR-2)堿性磷酸酶融合蛋白(KDR-AP)分別在桿狀病毒和NIH 3T3細胞中表達，并按上述過程純化?？?KDR(抗-VEGFR-2)scFv p1C11和scFvp2A6，一種結合KDR(VEGFR-2)，但不阻斷KDR(VEGFR-2)-VEGF相互作用的抗體，是從噬菌體展示文庫中分離出來的，噬菌體展示文庫是按上面所述，從使用KDR(VEGFR-2)免疫的小鼠構建的。C225是一種針對表皮生長因子(EGF)受體的嵌合IgG1抗體。見上文。
實施例IX-3(b)scFv p1C11可變結構域的克隆p1C11的輕鏈(VL)(SEQ ID NO8和SEQ ID NO16)和重鏈(VH)(SEQ ID NO7和SEQ ID NO15)的可變結構域是分別使用引物1和2，引物3和4，通過PCR從scFv表達載體克隆的。然后分別使用引物5和2，引物5和4，通過PCR把哺乳動物細胞分泌的蛋白前導肽序列加到VL和VH的5’端。
引物15’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA GAC ATC GAGCTC 3’[SEQ ID No37]引物25’TCG ATC TAG AAG GAT CCA CTC ACG TTT TAT TTC CAG 3’BamHI[SEQ ID No38]引物35’CTA GTA GCA ACT GCA ACT GGA GTA CAT TCA CAG GTC AAGCTG 3’[SEQ ID No39]引物45’TCG AAG GAT CCA CTC ACC TGA GGA GAC GGT 3’BamHI[SEQ ID No40]引物55’GGT CAAAAG CTTATG GGA TGG TCA TGT ATC ATC CTT TTTHind III CTA GTA GCA ACT 3’[SEQ ID No41]實施例IX-3(c)嵌合p1C11 IgG表達載體的構建構建用于表達嵌合IgG輕鏈和重鏈的獨立載體?？寺L基因是用Hind III和BamH I消化的，并連接到含人κ輕鏈恒定區(qū)(CL)的載體pKN100中，從而制造嵌合p1C11輕鏈，c-p1C11-L的表達載體?？寺H基因是用Hind III和BamH I消化的，并連接到含人IgG1(γ)重鏈恒定區(qū)(CH)的載體pGID105中，從而制造嵌合p1C11重鏈，c-p1C11-H的表達載體。兩個構建都是通過限制酶消化檢驗的，并通過雙脫氧核苷酸測序加以證實。
如圖19所示，VH和VL結構域在它們的5’端與編碼所標前導肽序列(SEQ ID NO23和SEQ ID NO24)的基因片段準確融合。VH和VL結構域分別經(jīng)由Hind III/BamH I位點連接到表達載體pG1D105中，含有人γ1恒定區(qū)基因的cDNA形式，和表達pKN100中，含有人κ鏈恒定區(qū)基因的cDNA形式。在兩種情況下，表達都是在HCMVi啟動子的控制下進行的，并由人工終止序列終止。根據(jù)Kabat等在高變序列定義中的規(guī)定，輕鏈和重鏈互補決定區(qū)(CDR)殘基是下面劃線的部分，并分別標出了CDR-H1至H3，CDR-L1至L3。CDR-H1(SEQ ID NO1和SEQID NO9)；CDR-H2(SEQ ID NO2和SEQ ID NO10)；CDR-H3(SEQ IDNO3和SEQ ID NO11)；CDR-L1(SEQ ID NO4和SEQ ID NO12)；CDR-L2(SEQ ID NO5和SEQ ID NO13)；CDR-L3(SEQ ID NO6和SEQID NO14)。
實施例IX-3(d)IgG的表達和純化COS細胞與等量c-p1C11-L和c-p1C11-H質(zhì)粒共轉染，進行瞬時IgG表達。把在150mm培養(yǎng)皿的DMEM/10％ FCS中生長的亞匯合COS細胞用20ml含40mM Tris(pH 7.4)的DMEM沖洗一次，然后用4mlDMEM/DEAE-葡聚糖/DNA混合物(DMEM含有40mM Tris，0.4mg/ml DEAE-葡聚糖(Sigma)，和20μg c-p1C11-L和c-p1C11-H質(zhì)粒)37℃溫育4.5小時。把細胞用4ml DMEM/含100nM氯喹(Sigma)的2％FCS在37℃時培養(yǎng)1小時，接著用1.5ml 20％甘油/PBS室溫溫育1分鐘。用DMEM/5％FCS洗滌細胞兩次，在20ml相同的培養(yǎng)基中37℃過夜溫育。然后用純DMEM洗滌細胞兩次后，把細胞培養(yǎng)基更換成沒有血清的DMEM/HEPES。在轉染后的第48和120小時，收集細胞培養(yǎng)物的上清液。按照制造商(Pharmacia Biotech)描述的方法，使用G蛋白柱通過親和色譜法從合并的上清液純化嵌合IgG。收集含IgG的部分，把緩沖液更換成PBS，并用Centricon 10濃縮器(Amicon Corp.，Beverly，MA)濃縮。IgG純度是通過SDS-PAGE分析的。純化抗體的濃度是使用山羊抗-人y鏈特異性抗體作為捕獲劑，使用HRP-偶聯(lián)的山羊抗-人k鏈抗體作為檢測劑，利用ELISA測定的。使用臨床級抗體C225校準標準曲線。
用G蛋白進行親和純化后，在SDS-PAGE中見到一個約150kD的單一蛋白帶。使用HRP-偶聯(lián)的抗人IgG1 Fc特異性抗體進行的蛋白質(zhì)印跡分析證實，純化蛋白中存在人IgG的Fc部分(沒有標出)。
ELISA的結果表明，與親代scFv相比，c-p1C11可更有效地結合固定化的KDR(VEGFR-2)(圖20)。
實施例IX-4測定和分析實施例IX-4(a)FACS分析早期世代的HUVEC細胞在缺失生長因子的EBM-2培養(yǎng)基中生長過夜，從而誘導KDR(VEGFR-2)的表達。采集細胞，并用PBS洗滌3次，用c-p1C11 IgG(5μg/ml)4℃溫育1小時，接著用FITC標記的兔抗人Fc抗體(Capper，Organon Teknika Corp.，West Chester，PA)再溫育60分鐘。洗滌細胞，利用流式細胞計(Model EPICS，CoulterCorp.，Edison，NJ)進行分析。
圖21是表示c-p1C11與表達KDR(VEGFR-2)的HUVEC結合的FACS分析曲線圖。正如先前使用親代scFv p1C11所見，c-p1C11特異性結合在早期世代的HUVEC上表達的KDR(VEGFR-2)。
實施例IX-4(b)定量的KDR(VEGFR-2)結合測定法把不同量抗體加入到包被有KDR(VEGFR-2)的96孔Maxi-sorp微量滴定平板(Nunc.Danmark)中，室溫溫育1小時，然后用含0.1％吐溫20的PBS洗滌平板3次。室溫使該平板用100μl scFv的小鼠抗E標記抗體-HRP偶聯(lián)物(Phannacia Biotech)，或嵌合IgG的兔抗人IgG Fc特異性抗體-HRP偶聯(lián)物(Cappel，Organon Teknika Corp.)溫育1小時。洗滌平板5次，加入TMB過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，利用微量平板讀數(shù)器(Molecular Device，Sunnyvale，CA)讀出450nm處的OD。
圖20是表示抗體與固定化KDR(VEGFR-2)直接結合的曲線圖。與親代scFv相比，c-p1C11可更有效地結合固定化的KDR(VEGFR-2)受體。
實施例IX-4(c)BIAcore分析抗體與KDR(VEGFR-2)的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)測量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在傳感器芯片上，注射25nM-200nM濃度的抗體或VEGF。獲得各濃度的傳感圖，并用BIA Evaluation 2.0程序評估，從而測定速率常數(shù)kon和koff。Kd是用速率常數(shù)koff/kon的比值計算的。
BIAcore分析揭示，與親代scFv相比，c-p1C11與KDR(VEGFR-2)的結合親和性更高(表2)。c-p1C11的Kd為0.82nM，而scFv的Kd為2.1nM。c-p1C11親和性的增加主要是由于二價嵌合IgG的解離速率(koff)較低。值得注意的是，c-p1C11與KDR(VEGFR-2)的結合親和性與天然配體VEGF與KDR(VEGFR-2)的結合親和性類似，在BIAcore分析中測定為0.93nM(表2)。
實施例IX-4(d)競爭性VEGF結合測定法在第一個測定法中，把不同量抗體與固定量的KDR(VEGFR-2)-AP(50ng)混合，室溫溫育1小時。然后把混合物轉移到包被有VEGF165(200ng/孔)的96-孔微量滴定板中，室溫溫育2小時，然后洗滌平板5次，加入AP的底物(對-硝基苯基磷酸，Sigma)，從而量化結合的KDR(VEGFR-2)-AP分子。然后計算EC50，即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的抗體濃度。
圖22表示c-p1C11可阻斷KDR(VEGFR-2)受體與固定化VEGF的劑量依賴性結合。與scFv 2.0nM的IC50值相比，嵌合抗體可更有效地阻斷VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用，其IC50值(即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的抗體濃度)為0.8nM。對照scFv p2A6也可結合KDR(VEGFR-2)(圖20)，但不阻斷VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用(圖22)。
在第二個測定法中，把不同量的c-p1C11抗體或冷的VEGF165蛋白與固定量125I標記的VEGF165混合，加入到包被有KDR(VEGFR-2)受體的96孔微量滴定板中。室溫溫育該平板2小時，洗滌5次，計算結合固定化KDR(VEGFR-2)受體的放射性標記的VEGF165量。測定阻斷放射性標記的VEGF與固定化KDR(VEGFR-2)受體結合的50％所需的c-p1C11和冷VEGF165的濃度。
放射性標記的VEGF165的結合抑制結果在圖23中表示。所示數(shù)據(jù)為三次測量的平均值。c-p1C11可以劑量依賴性方式與125I標記的VEGF有效地競爭結合固定化KDR(VEGFR-2)受體。正如所預期的，C225，一種針對EGF受體的嵌合抗體既不結合KDR(VEGFR-2)受體，也不阻斷VEGF-KDR(VEGFR-2)的相互作用(沒有表示)。
實施例IX-4(e)磷酸化測定法在進行實驗前，使亞匯合的HUVEC細胞在缺失生長因子的EBM-2培養(yǎng)基中生長24-48小時。用50nM原釩酸鈉預處理30分鐘后，在有或沒有抗體存在時，溫育該細胞15分鐘，接著用20ng/ml的VEGF165或10ng/ml的FGF室溫刺激15分鐘。然后在溶解緩沖液(50nM Tris，150mM NaCl，1％NP-40，2mM EDTA，0.25％脫氧膽酸鈉，1mM PMSF，1μg/ml亮抑蛋白酶肽，1μg/ml胃蛋白酶抑制劑，10μg/ml抑肽酶，pH7.5)中溶解該細胞，細胞溶解產(chǎn)物用于KDR(VEGFR-2)和MAP激酶磷酸化測定。KDR(VEGFR-2)受體是用與抗KDR(VEGFR-2)抗體，Mab4.13(ImClone Systems)偶聯(lián)的A蛋白瓊脂糖珠(Santa CruzBiotechnology，Inc.，CA)從細胞溶解產(chǎn)物中免疫沉淀出來的。蛋白用SDS-PAGE分辨，并經(jīng)過蛋白質(zhì)印跡分析。為了檢測KDR(VEGFR-2)磷酸化，用抗磷酸酪氨酸Mab，PY20(ICN Biomedicals，Inc.Aurora，OH)探測印跡。對于MAP激酶活性測定而言，細胞溶解產(chǎn)物是用SDS-PAGE分辨的，接著使用磷酸特異性MAP激酶抗體(NewEngland BioLabs，Beverly，MA)進行蛋白質(zhì)印跡分析。所有信號都是用ECL(Amersham，Arlington Heights，IL.)檢測的。在兩個測定法中，用多克隆抗KDR(VEGFR-2)抗體(ImClone Systems)再次探測該印跡，從而確保在SDS-PAGE凝膠各道中加樣等量的蛋白。
c-p1C11可有效抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受體磷酸化和p44/p42MAP激酶的活化。相反，C225則對VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受體活化和MAP激酶沒有任何抑制作用。單獨的c-p1C11和C225對KDR(VEGFR-2)受體和p44/p42 MAP激酶的活性沒有任何作用。正如前面使用scFv p1C11所見到的，c-p1C11不能抑制FGF-刺激的p44/p42MAP激酶活化(沒有表示)。此外，scFv p2A6和p2A6的嵌合IgG形式(c-p2A6)都不能抑制VEGF-刺激的KDR(VEGFR-2)受體和MAP激酶的活化(沒有表示)。
實施例IX-4(f)抗有絲分裂測定抗KDR(VEGFR-2)抗體對VEGF-刺激的人內(nèi)皮細胞有絲分裂的作用是用HUVEC，通過[3H]-TdR DNA摻入測定法測定的。把HUVEC(5×103個細胞/孔)鋪板于96-孔組織培養(yǎng)平板上200μl沒有VEGF，bFGF或EGF的EBM-2培養(yǎng)基中，37℃溫育72小時。把不同量抗體一式兩份加入到孔中，37℃預溫育1小時，然后加入VEGF165至16ng/ml的終濃度。溫育18小時后，向各孔中加入0.25μCi的[3H]-TdR，再溫育4小時。用閃爍計數(shù)器測定已摻入DNA的放射性。圖24所示數(shù)據(jù)表示至少3次的獨立實驗。
c-p1C11和scFv p1C11可有效抑制VEGF刺激的HUVEC有絲分裂(圖24)。與親代scFv相比，c-p1C11對VEGF-誘導的HUVEC有絲分裂而言，是一種更強的抑制劑。抑制VEGF-誘導的HUVEC有絲分裂的50％所需的抗體濃度分別是c-p1C11為0.8nM，scFV為6nM。正如所預期的，scFv p2A6對VEGF-刺激的內(nèi)皮細胞增殖沒有任何抑制作用。
根據(jù)上述說明以及很容易獲得的參考文獻和起始材料，本發(fā)明是可行的。然而，申請人已經(jīng)在美國典型培養(yǎng)物保藏中心，12301Parklawn Drive，Rockville，Md.，20852 USA(ATCC)中，保藏了下列產(chǎn)生單克隆抗體的雜交瘤細胞系1994年1月26日保藏的，產(chǎn)生大鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體的雜交瘤細胞系DC-101(ATCC保藏號HB11534)。
1996年7月19日保藏的，產(chǎn)生小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體Mab 25的雜交瘤細胞系M25.18A1(ATCC登記號HB12152)。
1996年7月19日保藏的，產(chǎn)生小鼠抗小鼠flk-1(VEGFR-2)單克隆抗體Mab 73的雜交瘤細胞系M73.24(ATCC保藏號HB12153)。
保藏是根據(jù)布達佩斯條約的規(guī)定，在用于專利程序及其條例(布達佩斯條約)的國際微生物保藏機構進行的。這樣做可確?；钆囵B(yǎng)物自保藏之日起維持30年。根據(jù)布達佩斯條約，在申請人和ATCC之間達成協(xié)議的情況下，可從ATCC獲得生物體，這樣可確保在相關美國專利公開之后，不受限制地使用它。按照專利法的規(guī)定，在實行該發(fā)明時，無須在任何行政機構的授權下使用保藏菌株。
表1 抗-KDR(VEGFR-2)scFv抗體的KDR(VEGFR-2)結合分析
1.通過直接結合ELISA測定，括號中的數(shù)字代表產(chǎn)生50％最大結合的scFv濃度；2.通過競爭性VEGF阻斷ELISA測定，括號中的數(shù)字代表抑制KDR與固定化VEGF結合的50％所需的scFv濃度；3.通過BIAcore分析測定。N/A＝不可應用。
表2 p1C11 scFv和c-p1C11與KDR(VEGFR-2)受體的結合動力學*
*所有比值都是使用BIAcore系統(tǒng)，通過表面等離子共振測定的，是至少3次獨立測量的平均值實施例X本實施例可證實VEGFR拮抗劑，即，抗-flt-1(抗-VEGFR-1)單克隆抗體，MF-1的生產(chǎn)。
大鼠抗VEGFR-1單克隆抗體是通過標準雜交瘤技術研制的。給8周齡的大鼠腹膜內(nèi)(i.p.)灌注與弗氏完全佐劑混合的100μg VEGFR-1Fc(恒定區(qū))重組蛋白(R&D Systems，Minneapolis，MN)進行激發(fā)。然后，在與混合了弗氏不完全佐劑的相同蛋白融合前，給大鼠加強注射3次。
雜交瘤細胞是通過把骨髓瘤細胞P3x63Ag8.653與免疫大鼠的脾細胞和骨髓細胞融合而產(chǎn)生的。在基于ELISA的結合與阻斷測定法中，使用VEGFR-1堿性磷酸酶(AP)重組蛋白選擇抗VEGFR-1的特異性克隆。陽性克隆是通過限制稀釋而亞克隆的。
來源于雜交瘤的抗-VEGFR-1單克隆抗體(mAbs)是通過在沒有血清的培養(yǎng)基中連續(xù)飼養(yǎng)發(fā)酵而獲得的。使用γ-結合G蛋白瓊脂糖，通過親和色譜法從沒有血清的條件培養(yǎng)基中純化mAbs。使用Pyrogentplus Limulus Amebocyte Lysate試劑盒(Bio Whittaker，Walkersville，MD)試驗體內(nèi)研究所用mAbs的內(nèi)毒素。動物研究所用的所有抗體制品都含有≤1.25EU/ml的內(nèi)毒素?？?VEGFR-1多克隆抗體是從重組VEGFR-1 AP蛋白免疫接種的兔子生產(chǎn)的，并通過γ-結合G蛋白柱(Amersham Pharmacia Biotech，Uppsala，Sweden)純化。
抗-VEGFR-1 mAbs的免疫化學性是在基于ELISA的結合及阻斷測定法，以及親和性的BIAcore分析中鑒定的。結合測定法是4℃時，用50ng/孔的VEGFR-1AP或VEGFR-2AP蛋白過夜包被96孔微量滴定板(Falcon Flexible plate，Becton Dickinson，Bedford，MA)進行的。加入200μl含5％牛血清，0.05％吐溫20的磷酸鹽緩沖鹽水(封閉緩沖液)把孔封閉，室溫(RT)溫育2小時。洗滌該孔(5x)，室溫時，用50μl在封閉緩沖液中稀釋的不同濃度mAbs溫育1小時。再次洗滌該孔(5x)，室溫用50μl山羊抗大鼠IgG-HRP(BioSourceInternational，Camarillo，CA)溫育1小時。最后洗滌該孔(5x)，室溫用50μl 3，3’，5，5’-四甲基聯(lián)苯胺(TMB)底物(Kirkegaard andPerry Lab Inc.，Gaithersburg，MD)溫育15分鐘。加入50μl 1M磷酸(H3PO4)終止反應，在微量滴定板讀數(shù)器的450nm處對該孔讀數(shù)。
對于VEGFR-1/VEGF或P1GF阻斷測定而言，孔是4℃時，用100ngVEGF或P1GF(R & D Systems，Minneapolis，MN)包被過夜的。按照上面所述封閉該孔，然后用100ng VEGFR-1AP室溫溫育1小時，其中所述VEGFR-1 AP已經(jīng)用不同濃度的mAb預溫育了1個小時。洗滌該孔，并用對-硝基苯基磷酸(PNPP，Sigma，St.Louis，MO)溫育。室溫顯色30分鐘，在微量滴定板讀數(shù)器的405nm處讀數(shù)。
抗VEGFR-1 mAbs與VEGFR-1的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)測定的。把VEGFR-1 Fc融合蛋白固定在傳感器的芯片上，注射3.125nM-50nM濃度的mAbs。獲得各濃度的傳感圖，用BIA Evaluation 2.0程序評估，從而測定作為速率常數(shù)kon/koff之比的Kd值。
實施例XI本實施例證實了在給予表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑，單克隆抗體ERBITUXTM(也稱為IMC-C225或C225)，和治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子受體(VEGFR)拮抗劑，抗VEGFR-1單克隆抗體DC101后，可抑制腫瘤生長。
進行免疫組織化學分析和抗血管發(fā)生療法的抗體如下來源于Pharmingen(SanDiego，CA)的大鼠抗-小鼠CD31/PECAM-1抗體；來源于DAKO Corp.(Carpinteria，CA)的小鼠抗-增殖細胞核抗原(PCNA)克隆PC10 DAKO A/S；來源于Jackson Research Laboratories(WestGrove，PA)的過氧化物酶-偶聯(lián)的山羊抗-大鼠免疫球蛋白(IgG)(H+L)和德克薩斯紅偶聯(lián)的山羊抗大鼠IgG；來源于Serotec HarlanBioproducts for Science，Inc.(Indianapolis，IN)的過氧化物酶偶聯(lián)的大鼠抗小鼠IgG2a；和來源于ImClone Systems，Inc.(NewYork，NY)(Prewett等，1999；Witte等，1998)的大鼠抗小鼠VEGF受體-2單克隆抗體(Prewett等，1999；Witte等，1998)和嵌合的抗人EGF受體單克隆抗體(Goldstein等，1995)。
使用與1ml注射器連接的30號針給8周齡的雄性無胸腺裸鼠(National Cancer Institute，Animal Production Area，F(xiàn)rederick，MD)腹膜內(nèi)注射500μl HBSS中的1.0×106個KM12L4結腸癌細胞。然后把小鼠隨機分為4組(每組10只小鼠)對照組，DC101，C225，或DC101和C225。所有動物研究都是在Animal Care andUse Committee of MD Anderson Cancer Center and UKCCCR，1998的批準下進行的。
從注射腫瘤細胞后3天開始，使用與1ml注射器連接的27號針每3天給小鼠腹膜內(nèi)(i.p.)注射對照賦形劑(磷酸鹽緩沖的鹽水[PBS])，DC101(0.8mg)，C225(1.0mg)，或DC101(0.8mg)和C225(1.0mg)(每次注射700μl的總體積)。每周給小鼠稱重。當對照組瀕死時(大約治療開始后30天)殺死小鼠，進行完全的尸檢，量化腫瘤負荷，采集腫瘤，按照下面所述進行分析。
對每只小鼠都要進行尸檢，用測徑規(guī)測量腹膜腫瘤的大小，確定腫瘤平均大小，切除有代表性的病變。由不知道治療組分配方案的研究人員評估腹水的程度，標準如下0級，沒有腹水；1級，輕度腹水；2級，中度腹水；3級，重度腹水；4級，腹部繃緊的嚴重腹水(Aparicio等，1999)。把腫瘤切片包埋在OCT化合物中，-70℃冷凍，或把它固定在福爾馬林中，然后包埋在石蠟中。
組織切片是通過進行標準脫蠟(對于福爾馬林固定和石蠟包埋的組織而言)或把它固定在丙酮和氯仿(對于冷凍在OCT中的組織而言)中進行處理的，按照前面所述進行免疫組織化學分析(Shaheen等，1999)。簡單地說，用甲醇中的3％H2O2封閉內(nèi)源性過氧化物酶，用PBS洗滌載玻片，在蛋白封閉溶液(補充了1％正常山羊血清和5％正常馬血清的PBS)中溫育20分鐘，與針對CD31或PCNA的第一抗體4℃溫育過夜。然后，洗滌載玻片，用蛋白-封閉溶液溫育，室溫用過氧化物酶-偶聯(lián)的第二抗體培養(yǎng)1小時，洗滌，用DAB溫育，洗滌，用蘇木精負染，洗滌，并用Universal Mount封固，在56℃的熱平板上干燥。使用與德克薩斯紅(紅色熒光)偶聯(lián)的第二抗體代替過氧化物酶-偶聯(lián)的抗體溫育對CD31染色的冷凍切片。第一抗體的省略可作為陰性對照。
末端脫氧核苷酸轉移酶(TdT)-介導的dUTP切口-末端標記(TUNEL)染色是按照制造商提供的方法進行的。簡單地說，用4％沒有甲醇的低聚甲醛固定切片，洗滌，用0.2％Triton X-100滲透，洗滌，用試劑盒的平衡緩沖液溫育，用含有平衡緩沖液，核苷酸混合物，及TdT酶的反應混合物37℃溫育1小時，用2x標準檸檬酸鹽水室溫溫育15分鐘而終止TdT反應，洗滌，用DAPI封固染色(以觀察細胞核)，蓋上蓋玻片。
一些腫瘤血管和PCNA-陽性細胞是利用光學顯微鏡(以100倍的放大率，在5個隨機的0.159-mm2區(qū)域中計數(shù))評估的，并用Optimas圖像分析軟件(Biscan，Edmond，WA)進行數(shù)字成像并處理。編程性死亡的細胞是按照下面所述用免疫熒光觀察的。用Adobe Photoshop軟件(Adobe Systems，Mountain View，CA)對切片進行數(shù)字成像并處理。CD311-陽性內(nèi)皮細胞(ECs)是用羅丹明濾光器，由局部紅色熒光檢測的。編程性細胞死亡是使用熒光濾器，由腫瘤細胞(TCs)的局部綠色熒光或Ecs帶有紅色的綠色熒光測定的。細胞核是用濾器由DAPI的藍色熒光檢測的。以400倍的放大率，在載玻片中5個連續(xù)的0.011-mm2非-重疊區(qū)域?qū)毎嫈?shù)，第一個區(qū)域是在腫瘤的立刻壞死部分中隨機選擇的。然后計算每個區(qū)域中編程性死亡的ECs和TCs的百分比，[編程性死亡的細胞％＝(編程性死亡的細胞數(shù)/總細胞數(shù))×100]。
治療30天后，測量腹膜病變的直徑，評估總的腫瘤負荷。與對照組相比，DC101組(小55.3％)和DC101+C225組(小66.7％)的平均腹膜腫瘤大小要小一些。雖然對照組為100％，而C225小鼠在研究結束時患有腹膜疾病，但10％的DC101小鼠和30％進行聯(lián)合治療的小鼠沒患疾病。最終，與對照組小鼠相比，DC101(低66.7％)和聯(lián)合治療組(低100％)的平均腹水等級要低。此外，DC101+C225組與DC101組相比，腹水明顯更少；在聯(lián)合治療組中幾乎沒有見到腹水。
對PCNA給腫瘤細胞染色，然后通過免疫組織化學分析評估腫瘤細胞的增殖。與對照組相比，DC101(小50.3％)組和DC101+C225組(小66.7％)的腹膜腫瘤要小。
對CD31給小鼠腹膜病變的切片染色，利用免疫熒光檢測ECs數(shù)，作為編程性細胞死亡的測量值。與對照組相比，在DC101和DC101+C225組中可觀察到明顯更少的ECs。
在有和沒有對CD31同時進行染色的情況下，在腹膜轉移瘤的切片上進行免疫熒光TUNEL染色，從而量化TC和EC的編程性細胞死亡。與對照組比，可在DC101組(TCs為多14.3倍，Ecs為多226倍)和DC101+C225組(TCs為多23.6倍，Ecs為多331倍)見到更多編程性死亡的TCs和ECs，而與單獨的DC101組比，DC101+C225組編程性死亡的TCs和ECs(TCs為1.7倍，ECs為1.46倍)更多。
實施例XII人Fab的生產(chǎn)實施例XII(a)蛋白和細胞系原代培養(yǎng)的HUVEC是從Dr.S.Rafii，Cornell Medical Center，New York獲得的，并在37℃，5％CO2的EBM-2培養(yǎng)基(Clonetics，Walkersville，MD)中維持。可溶性融合蛋白KDR(VEGFR-2)-AP，其缺失免疫球蛋白(Ig)結構域的變體，和Flk-1-AP是在穩(wěn)定轉染的NIH 3T3中表達的，并按照Lu等在J.Biol.Chem.27514321-30(2000)中所述，使用AP的固定化單克隆抗體，通過親和色譜法從細胞培養(yǎng)物上清液純化。VEGF165蛋白是在桿狀病毒中表達的，并按照Zhu等在Cancer Res.583209-14(1998)中描述的過程純化。白血病細胞系HL60和HEL都維持在含10％胎牛血清的RPMI中。
實施例XII(b)噬菌體ELISA挑選各個TG1克隆，37℃時在96孔平板中生長，并按照上面所述把它引入到M13K07輔助噬菌體中。用1/6體積的18％奶/PBS室溫封閉擴增的噬菌體制品1小時，然后加入到包被KDR(VEGFR-2)-AP或AP(1μg/ml×100μl)的Maxi-sorp 96孔微量滴定板(Nunc)中。室溫溫育1小時后，用PBST洗滌該平板3次，并用兔抗-M13噬菌體-HRP偶聯(lián)物(Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)溫育。洗滌該平板5次，加入TMB過氧化物酶底物(KPL，Gaithersburg，MD)，使用微量平板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvate，CA)測量450nm處的吸光度。
實施例XII(c)DNA BstN I模式的分析及核苷酸測序每輪選擇后，通過限制酶消化模式(即，DNA指紋)分析抗-KDR(VEGFR-2)Fab克隆的多樣性。各克隆的Fab基因插入物是用引物PCR擴增的，所述引物為反向PUC19，即5’AGCGGATAACAATTTC ACACAGG3’；和fdtet序列，即5’GTCGTCTTTCCAGACGTTAGT 3’。擴增產(chǎn)物是用常見的切割酶BstN I消化的，并在3％瓊脂糖凝膠上進行分析。通過雙脫氧核苷酸測序測定各消化模式代表性克隆的DNA序列。
實施例XII(d)可溶性Fab片段的表達和純化各克隆的質(zhì)粒用于轉化非抑制大腸桿菌宿主HB2151。Fab片段在HB2151中的表達是30℃時，通過在含有1mM異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷(IPTG，Sigma)的2YTA培養(yǎng)基中培養(yǎng)細胞誘導的。細胞的周質(zhì)提取物是通過把細胞顆粒狀物重懸浮在25mM Tris(pH7.5)中，并于4℃輕輕振搖培養(yǎng)1小時制備的，其中25mM Tris(pH7.5)含有20％(w/v)蔗糖，200mM NaCl，1mM EDTA和0.1mM PMSF。15,000rpm離心15分鐘后，按照制造商(Amersham Pharmacia Biotech)提供的方法，使用G蛋白柱，通過親和色譜法從上清液純化可溶性scFv蛋白。
實施例XII(e)從噬菌體展示文庫選擇人抗KDR(VEGFR-2)Fab使用含有3.7×1010個克隆的人Fab噬菌體展示文庫進行選擇(DeHaard等，J.Biol.Chem.27418218-30(1999))。該文庫包括PCR-擴增抗體的可變輕鏈基因和可變重鏈基因，它們分別與人恒定輕鏈基因(κ和λ)及編碼IgG1重鏈CH1結構域的DNA融合。重鏈和輕鏈構建體都位于信號序列——即，輕鏈的pelB和重鏈的基因III信號序列之前。重鏈構建體進一步編碼用于噬菌體展示的基因III蛋白的一部分，六組氨酸標記，和11個氨基酸長的c-myc標記，然后是琥珀密碼子(TAG)。六組氨酸和c-myc標記可用于純化或檢測。琥珀密碼子可使用抑制宿主(如TG1細胞)進行噬菌體展示或在轉化到非抑制宿主(如HB2151細胞)中時，產(chǎn)生可溶形式的Fab片段。
文庫原液生長至對數(shù)期，把它引入到M13-K07輔助噬菌體中，并于30℃時，在2YTAK培養(yǎng)基(2YT含有100μg/ml氨芐西林和50μg/ml卡那霉素)中擴增過夜。使噬菌體制品在4％PEG/0.5M NaCl中沉淀，在3％脫脂奶/含500μg/ml AP蛋白的PBS中重懸浮，37℃溫育1小時，以捕獲展示抗-AP Fab片段的噬菌體，并阻斷其它非特異性結合。
首先，在37℃時，用3％奶/PBS封閉包被有KDR(VEGFR-2)-AP(在PBS中為10μg/ml)的Maxisorp Star試管(Nunc，Rosklide，Denmark)1小時，然后用噬菌體制品室溫溫育1小時。用PBST洗滌試管10次，然后用PBS(PBS含0.1％吐溫20)洗滌10次。用1ml新鮮制備的100mM三乙胺溶液(Sigma，St.Louis，MO)室溫洗脫結合的噬菌體10分鐘。用10ml對數(shù)中期的TG1細胞37℃溫育洗脫的噬菌體30分鐘，靜置，振搖30分鐘。使感染的TG1細胞沉淀，把它鋪于數(shù)個大的2YTAG平板上，30℃過夜溫育。把在平板上生長的所有集落刮在3-5ml的2YTA培養(yǎng)基中，與甘油混合(10％終濃度)，等分，-70℃貯存。對于下一輪選擇而言，把100μl噬菌體原液加入到25ml2YTAG培養(yǎng)基中，生長至對數(shù)中期。把培養(yǎng)物引入到M13K07輔助噬菌體中，擴增，沉淀，并按照上述過程用于選擇，隨著結合過程后洗滌次數(shù)的增加，固定在免疫試管上的KDR(VEGFR-2)-AP的濃度越來越小。
總共3次選擇都是在固定化的KDR(VEGFR-2)上進行的，原始結合過程后蛋白濃度和洗滌次數(shù)發(fā)生改變。每輪選擇后，隨機挑選93個克隆，通過噬菌體ELISA測定它們與KDR(VEGFR-2)的結合。在第二次選擇后，在93個克隆中挑選了70個(75％)，在第三次選擇之后，超過90％的回收克隆在KDR(VEGFR-2)結合中呈陽性，表明選擇過程的高效。擴增DNA片段，所述DNA片段編碼在第二次選擇中鑒定的全部70種結合劑的Fab，用BstN I消化，比較指紋模式。對總共42種不同模式進行觀察，表明分離出來的抗-KDR(VEGFR-2)Fab的多樣性很好。交叉反應性檢測證實，42個抗體中的19個是特異性的FLT-1(VEGFR-1)-結合劑，而剩下的23個則可與KDR(VEGFR-2)及其鼠同源物Flk-1結合。進一步的選擇是利用競爭性VEGF-結合測定法進行的，其中測定了有或沒有抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段存在時，可溶性KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結合。該測定法鑒定了4個Fab克隆，它們都能阻斷VEGF和KDR(VEGFR-2)間的結合。其中有3個是KDR(VEGFR-2)的特異性結合劑，有1個與Flk-1交叉反應。DNA指紋和測序分析證實，這4個具有獨特DNA和氨基酸序列的KDR(VEGFR-2)/VEGF阻斷抗體是不同的。
4個克隆的VH和VL的CDR1，CDR2，CDR3的氨基酸序列在表3中給出。
表3-所選結合KDR(VEGFR-2)的人Fabs的CDR序列
VH和VL鏈的完整序列在序列表中給出。對于D1F7而言，VH的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS19和20表示，VL的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS21和22表示。
對于D2C6而言，VH的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS23和24表示，VL的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS25和26表示。
對于D2H2而言，VH的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS30和31表示，VL的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS32和33表示。
對于D1H4而言，VH的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS27和24表示，VL的核苷酸和氨基酸序列分別由SEQ ID NOS28和29表示。
第二個文庫是把D2C6的單一重鏈與原始文庫輕鏈的不同群體結合創(chuàng)造的。鑒定了10個附加的Fabs，命名為SA1，SA3，SB10，SB5，SC7，SD2，SF2，SF7和1121。這10個Fabs的VL的核苷酸及氨基酸序列在下面給出。對于SA1而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS34和35表示。對于SA3而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS36和37表示。對于SB10而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS38和39表示。對于SB5而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS40和41表示。對于SC7而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS42和43表示。對于SD2而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS44和45表示。對于SD5而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS46和47表示。對于SF2而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS48和49表示。對于SF7而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS50和51表示。對于1121而言，VL的核苷酸及氨基酸序列由SEQ IDNOS52和53表示。
VL的CDR序列在表4中給出。
表4-結合KDR(VEGFR-2)的人Fabs的輕鏈CDR序列
實施例XIII測定法實施例XIII(a)定量的KDR(VEGFR-2)結合及KDR(VEGFR-2)/VEGF相互作用的阻斷在直接結合測定法中，把不同量的可溶性Fab蛋白加入到KDR(VEGFR-2)包被的96孔Maxi-sorp微量滴定平板中，室溫溫育1小時，然后用PBST洗滌平板3次。用100μl兔抗人Fab抗體-HRP偶聯(lián)物(Jackson ImmunoResearch Laboratory Inc.，West Grove，PA)室溫溫育該平板1小時。洗滌平板，并按照上述噬菌體ELISA的過程顯影。在競爭性KDR(VEGFR-2)/VEGF阻斷測定法中，把不同量的Fab蛋白與固定量的KDR(VEGFR-2)-AP(100ng)混合，室溫溫育1小時。然后把混合物轉移到預先包被有VEGF165(200ng/孔)的96孔微量滴定板中，再室溫溫育2小時，洗滌平板5次，加入AP的底物(對-硝基苯磷酸，Sigma)。測量405nm處的吸光度，量化結合的KDR(VEGFR-2)-AP分子(8)。然后計算IC50，即，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的Fab蛋白濃度。
4個VEGF-阻斷克隆(D2C6，D2H2，D1H4，D1F7)被表達成可溶性的Fab，并通過G蛋白親和色譜法從大腸桿菌周質(zhì)提取物中純化。這些克隆的純化Fab蛋白的產(chǎn)量為60-400μg/升培養(yǎng)物。各純化Fab制品的SDS-PAGE分析產(chǎn)生了一個具有預期分子大小的單一蛋白帶。
克隆D2C6和D2H2是更有效的結合劑，然后是克隆D1H4和D1F7。所有這四個Fabs都能阻斷KDR(VEGFR-2)與固定化VEGF的結合。對于克隆D2C6，D2H2和D1H4而言，抑制KDR(VEGFR-2)與VEGF結合的50％所需的抗體濃度約為2nM，對于克隆D1F7而言，約為20nM。只有D1F7可阻斷VEGF與Flk-1的結合，其IC50值約為15nM。
實施例XIII(b)可溶性scFv的BIAcore分析可溶性Fab蛋白與KDR(VEGFR-2)的結合動力學是用BIAcore生物傳感器(Pharmacia Biosensor)，通過表面等離子共振測量的。把KDR(VEGFR-2)-AP融合蛋白固定在傳感器芯片上，注射1.5nM-100nM濃度的可溶性Fab蛋白。獲得各濃度的傳感圖，使用BIA Evaluation2.0程序評估，從而測定速率常數(shù)kon和koff。Kd是根據(jù)速率常數(shù)koff/kon的比值計算的。
所有這3個KDR(VEGFR-2)-特異性Fab片段都以2-4nM的Kd與固定化受體結合(表5)。交叉反應克隆D1F7的Kd為45nM，大約比KDR(VEGFR-2)特異性克隆的那些弱10-15倍。值得注意的是，雖然這三個KDR(VEGFR-2)特異性Fab片段的Kd相似，但這些抗體的結合動力學，即，kon和koff大不不同，例如，D2C6具有最快的啟動速度，而D1H4則具有最慢的關閉速度(表5)。
表5-四個中和人抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段的結合動力學
所有數(shù)值都是通過BIAcore分析測定的，代表至少三次測量的平均值±SE。
實施例XIII(c)結合表位的作圖按照前面所述(Lu等，(2000))生產(chǎn)缺失KDR(VEGFR-2)胞外Ig-樣結構域的變體。在表位作圖測定法中，首先使用兔抗-AP抗體(DAKO-免疫球蛋白，Glostrup，Denmark)作為捕獲試劑，把全長KDR(VEGFR-2)-AP，兩個缺失KDR(VEGFR-2)Ig-結構域的變體的AP融合，和Flk-1-AP固定在96孔平板(Nunc)上。然后用各種抗-KDR(VEGFR-2)Fab蛋白室溫培養(yǎng)該平板1小時，接著用兔抗-人Fab抗體-HRP偶聯(lián)物培養(yǎng)。洗滌平板，按照上面所述顯影。
抗-KDR(VEGFR-2)Fab片段的結合表位是用全長KDR(VEGFR-2)和兩個缺失KDR(VEGFR-2)Ig結構域的變體作圖的。KDR(VEGFR-2)(1-3)是含有前三個N-末端Ig結構域的KDR(VEGFR-2)變體。KDR(VEGFR-2)(3)是僅含有第三個Ig結構域的變體。克隆D2C6和D1H4同等結合KDR(VEGFR-2)，KDR(VEGFR-2)(1-3)和KDR(VEGFR-2)(3)，因此結合表位位于Ig結構域3內(nèi)?？寺2H2和D1F7更可有效地結合全長KDR(VEGFR-2)和KDR(VEGFR-2)(1-3)，表明KDR(VEGFR-2)Ig結構域1-3內(nèi)的結合抗原決定部位很多。只有克隆DIF7與Flk-1交叉反應。
實施例XIII(d)抗有絲分裂測定把HUVEC(5×103個細胞/孔)鋪于96孔組織培養(yǎng)平板上200μl沒有VEGF，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)或表皮生長因子(EGF)的EBM-2培養(yǎng)基中，37℃溫育72小時。把不同量的Fab蛋白一式兩份加入到孔中，37℃預溫育1小時，然后加入VEGF165至16ng/ml的終濃度。溫育18小時后，向各孔中加入0.25μCi的[3H]TdR(Amersham)，再溫育4小時。用PBS洗滌細胞一次，使其經(jīng)過胰蛋白酶消化，并用細胞收集器(Harvester 96，MACH III，TOMTEC，Orange，CT)收集在玻璃濾器上。用H2O洗滌該膜3次，風干。加入閃爍液，在閃爍計數(shù)器(Wallach，Model 1450 Microbeta Scintillation Counter)上測定已摻入DNA的放射性。
人抗-KDR(VEGFR-2)Fab具有阻斷HUVEC上VEGF-刺激的有絲分裂活性的能力。所有這4個人Fab片段都可以劑量依賴性方式抑制HUVEC中VEGF誘導的DNA合成。抑制HUVEC中VEGF-刺激的[3H]-TdR摻入的50％所需的Fab濃度(EC50)，對于克隆D2C6和D1H4而言約為0.5nM，對于克隆D2H2而言約為0.8nM，對于克隆D1F7而言約為15nM。對照組只含有VEGF(1500cpm)和純培養(yǎng)基(60cpm)。一式兩份進行測定。所示數(shù)據(jù)表示至少3次的獨立實驗。
實施例XIII(e)白血病遷移測定法用沒有血清的純RPMI 1640培養(yǎng)基洗滌HL60和HEL細胞3次，以1×106/ml懸浮在培養(yǎng)基中。把100μl細胞混懸液的等分試樣加入到HL60細胞的3μm-孔經(jīng)孔插入物，或HEL細胞的8μm-孔經(jīng)孔插入物中(Costar，Corning Incorporated，Corning，NY)，37℃時與抗KDR(VEGFR-2)Fab蛋白(5μg/ml)溫育30分鐘。然后把插入物放在24孔平板的孔中，所述24孔平板含有0.5ml有或沒有VEGF165的，沒有血清的RPMI 1640。遷移是在37℃，5％CO2的條件下進行的，HL60細胞進行16-18小時，HEL細胞進行4小時。從區(qū)室下部采集遷移的細胞，用Coulter計數(shù)器(Model Z1，Coulter Electronics Ltd.，Luton，England)計數(shù)。
VEGF可以劑量依賴性方式誘導HL60和HEL細胞的遷移，最大刺激是在200ng/獲得的。所有抗KDR(VEGFR-2)Fab片段都可顯著抑制VEGF-刺激的HL60和HEL細胞遷移。在這個測定法中，作為對照，C225，一種針對EGF受體的抗體的Fab片段，沒有顯示出顯著的抑制作用。
實施例XIV.IgG的生產(chǎn)實施例XIV(a)表達IgG的載體的構建構建表達IgG輕鏈和重鏈的獨立載體。消化克隆的VL基因，并把它連接到載體pKN100中。消化克隆的VH基因，并把它連接到載體pGID105中，所述pGID105含有人IgG I(γ)重鏈恒定結構域。構建是通過限制酶消化檢測的，并通過雙脫氧核苷酸測序加以證實。在這兩種情況中，表達都是在HCMV啟動子的控制下進行的，并由人工終止序列終止。
然后把組裝的重鏈和輕鏈基因克隆到Lonza GS表達載體pEE6.1和pEE12.1中。把重鏈和輕鏈載體重組為單一載體，用于CHO細胞和NSO細胞的穩(wěn)定轉染。在缺少谷氨酰胺的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉染的細胞，并以高達1g/L的水平表達抗體。
序列表<110>帕特里夏.羅克韋爾尼爾I.戈爾茨坦<120>用血管內(nèi)皮生長因子受體拮抗劑抑制腫瘤生長的聯(lián)合療法<130>11245/46276<140>PCT/US02/06762<141>04-03-2002<160>85<170>WordPerfect 8.0 for Windows<210>1<211>11<212>PRT<213>人<400>1Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr Leu Ala5 10<210>2<211>7<212>PRT<213>人<400>2Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr5<210>3<211>9<212>PRT<213>人<400>3Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro Thr5<210>4<211>11<212>PRT<213>人
<400>4Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg Leu Ala510<210>5<211>7<212>PRT<213>人<400>5Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr5<210>6<211>9<212>PRT<213>人<400>6Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro Thr5<210>7<211>14<212>PRT<213>人<400>7Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr Asp Leu Val Ser5 10<210>8<211>7<212>PRT<213>人<400>8Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser5<210>9<211>10<212>PRT<213>人
<400>9Asn Ser Tyr Val Ser Ser Arg Phe Tyr Val5 10<210>l0<211>13<212>PRT<213>人<400>10Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn Thr Ala Asn5 10<210>11<211>7<212>PRT<213>人<400>11Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser5<210>12<211>12<212>PRT<213>人<400>12Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu Asn Gly His Trp Val5 10<210>13<211>10<212>PRT<213>人<400>13Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ser Met Asn5 10<210>14<211>17<212>PRT<213>人<400>14Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys
510 15Gly17<210>15<211>7<212>PRT<213>人<400>15Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile5<210>16<211>10<212>PRT<213>人<400>16Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Ile Ser5 1 10<210>17<211>18<212>PRT<213>人<400>17Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe5 10 15Gln Gly18<210>18<211>16<212>PRT<213>人<400>18Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe Asp Tyr5 10 15<210>19<211>375<212>DNA<213>人
<400>19gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gct gag gtg aag aag cct ggg gcc48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15tca gtg aag gtc tcc tgc aag gct tct gga ggc acc ttc agc agc tat96Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30gct atc agc tgg gtg cga cag gcc cct gga caa ggg ctt gag tgg atg144Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45gga ggg atc atc cct atc ttt ggt aca gca aac tac gca cag aag ttc192Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60cag ggc aga gtc act ttt acc gcg gac aaa tcc acg agt aca gcc tat240Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80atg gag ttg agg agc ctg aga tct gac gac acg gcc gtg tat tac tgt288Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gga tac gat tac tat gat agt agt ggc gtg gct tcc ccc ttt336Ala Arg Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe100 105 110gac tac tgg ggc cag gga acc ctg gtc acc gtc tca agc 375Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>20<211>125<212>PRT<213>人<400>20Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala5 10 15Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Gly Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30
Ala Ile Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met35 40 45Gly Gly Ile Ile Pro Ile Phe Gly Thr Ala Asn Tyr Ala Gln Lys Phe50 55 60Gln Gly Arg Val Thr Phe Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr65 70 75 80Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Gly Tyr Asp Tyr Tyr Asp Ser Ser Gly Val Ala Ser Pro Phe100 105 110Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120 125<210>21<211>333<212>DNA<213>人<400>21cag tct gtg ctg act cag cca ccc tca gcg tct ggg acc ccc ggg cag48Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc atc tct tgt tct gga agc acc tc cac atc ggt act aat 96Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn20 25 30act gca aac tgg ttc cag cag ctc cca gga acg gcc ccc aaa ctc ctc144Thr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45atc cac aat aat aat cag cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc tct 192Ile His Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60ggc tcc aag tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc agt ggg ctc cag 240Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80tct gag gat gag gct gat tat tac tgt gca gca tgg gat gac agc ctg 288Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95
aat ggc cat tgg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg aac gtc ctg333Asn Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>22<211>111<212>PRT<213>人<400>22Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Thr Ser Asn Ile Gly Thr Asn20 25 30Thr Ala Asn Trp Phe Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu35 40 45Ile His Asn Asn Asn Gln Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser50 55 60Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Gln65 70 75 80Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Ala Trp Asp Asp Ser Leu85 90 95Asn Gly His Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>23<211>348<212>DNA<213>人<400>23gag gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tga gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc144Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
35 40 45tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg192Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc336Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110acc gtc tca agc 348Thr Val Ser Ser115<210>24<211>116<212>PRT<213>人<400>24Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Thr Val Ser Ser
115<210>25<211>321<212>DNA<213>人<400>25gaa att gtg atg aca cag tct cca gcc acc ctg tct ttg tct cca ggg48Glu IIe Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly5 10 15gaa aga gcc acc ctc tcc tgc agg gcc agt tcg agt gtt agc agc tac96Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr20 25 30tta gcc tgg tac caa cag aaa cct ggc cag gct ccc agg ctc ctc atc144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45tat gat tca tcc aac agg gcc act ggc atc cca gcc aga ttc agt ggc192Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60agt ggg tct ggg aca gac ttc act ctc acc atc agc agc cta gag cct 240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca act tat tac tgt cta cag cat aac act ttt cct ccg 288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95acg ttc ggc caa ggg acc aag gtg gaa atc aaa 321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>26<211>107<212>PRT<213>人<400>26Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly5 10 15Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Tyr
20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ser Ser Asn Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln His Asn Thr Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys100 105<210>27<211>348<212>DNA<213>人<400>27gag gtc cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg 48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca tc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg192Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag aac tca ctg tat240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80ctg caa atg aac agc ctg aga gcc gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336
Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110acc gtc tca agc 348Thr Val Ser Ser115<210>28<211>330<212>DNA<213>人<400>28cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc ctg tct ggg tct cct gga cag 48Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Pro Gly Gln5 10 15tcg atc acc atc tcc tgc gct gga acc acc act gat ctt aca tat tat 96Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr20 25 30gac ctt gtc tcc tgg tac caa cag cac cca ggc cca gca ccc aaa ctc144Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu35 40 45gtg att tat gac ggc aat aag cgg ccc tca gga gtt tct aat cgc ttc 192Val Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60tct ggc tcc aag tct ggc aac acg gcc tcc ctg aca atc tct gga ctc 240Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80cag gct gag gac gag gct gat tat tac tgc aac tca tat gta agc agc 288Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Val Ser Ser85 90 95agg ttt tat gtc ttc gga act ggg acc aag gtc acc gtc cta 330Arg Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 105 110<210>29<211>110<212>PRT<213>人<400>29
Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Leu Ser Gly Ser Pro Gly Gln5 10 15Ser Ile Thr Ile Ser Cys Ala Gly Thr Thr Thr Asp Leu Thr Tyr Tyr20 25 30Asp Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu35 40 45Val Ile Tyr Asp Gly Asn Lys Arg Pro Ser Gly Val Ser Asn Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Val Ser Ser85 90 95Arg Phe Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 105 110<210>30<21l>348<212>DNA<213>人<400>30gaa gtg cag ctg gtg cag tct ggg gga ggc ctg gtc aag cct ggg ggg48Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15tcc ctg aga ctc tcc tgt gca gcc tct gga ttc acc ttc agt agc tat 96Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30agc atg aac tgg gtc cgc cag gct cca ggg aag ggg ctg gag tgg gtc 144Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45tca tcc att agt agt agt agt agt tac ata tac tac gca gac tca gtg 192Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60aag ggc cga ttc acc atc tcc aga gac aac gcc aag gac tca ctg tat 240Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr65 70 75 80
ctg caa atg aac agc ctg aga gec gag gac acg gct gtg tat tac tgt 288Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95gcg aga gtc aca gat gct ttt gat atc tgg ggc caa ggg aca atg gtc 336Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110acc gtc tca agc 348Thr Val Ser Ser115<210>31<211>116<212>PRT<213>人<400>3lGlu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Leu Val Lys Pro Gly Gly5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr20 25 30Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ser Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val50 55 60Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asp Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Arg Val Thr Asp Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val100 105 110Thr Val Ser Ser115<210>32<211>32l<212>DNA<213>人
<400>32gac atc cag ttg acc cag tct cca tct tct gtg tct gca tct gta gga48Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15gac aga gtc acx atx act tgt cgg gcg agt cag ggt att agt agt cgg96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg20 25 30tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aaa gcc cct aag ctc ctg atc144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat gct gca tcc agt ttg caa act ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc192Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc act atc agc agc ctg cag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca act tac tat tgt caa cag gct aac agg ttc cct ccg288Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro85 90 95act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 321Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>33<211>107<212s PRT<213>人<400>33Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Ser Ser Arg20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Arg Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>34<211>333<212>DNA<213>人<400>34cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag48Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc cac tcc aac ttc ggg gca gga96Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly20 25 30act gat gta cat tgg tac caa cac ctt cca gga aca gccc Gcc aga ctc 144Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu35 40 45ctc att cat gga gac agt aat cgg ccc tcc ggg gtc cct gac cga ttc192Leu Ile His Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60tct ggc tcc agg tct ggc acc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc 240Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80cgg gtt gag gat gag gct gat tat tac tgt cag tcg tat gac tat ggc288Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly85 90 95ctg aga ggt tgg gtg ttc ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctt333Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>35<211>111<212>PRT<213>人
<400>35Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly20 25 30Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu35 40 45Leu Ile His Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Arg Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly85 90 95Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>36<211>321<212>DNA<213>人<400>36gta gtt gtg atg act cag tct cca tcg tcc ctg tct gca tct gta ggg48Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15gac aga gtc acc atc act tgc cgg gac agt cag aac att aac aac tat96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr20 25 30tta aat tgg tat caa cag aaa cca gga aaa gcc cct aag ctc ctg atc144Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat gct gcc tcc act ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agt ggc192Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc acc agc tca cag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80gaa gat tct gca act tat tac tgc caa cag tat tcc cgt tat cct ccc288Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro85 90 95act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gag atc aca 321Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr100 105<210>37<211>107<212>PRT<213>人<400>37Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr20 25 30Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Thr Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Thr100 105<210>38<211>330<212>DNA<213>人<400>38cag tct gcc ctg act cag cct gcc tcc gtg tct ggg tct cgt gga cag48Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln
5 10 15tcg atc acc ctc tcc tgc acc ggc tcc agc act gat gtg ggt aat tat96Ser Ile Thr Leu Ser Cys Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr20 25 30aac tat atc tcc tgg tac caa caa cac cca ggc caa gcc ccc aaa ctc144Asn Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gin Ala Pro Lys Leu35 40 45ttg att tac gat gtc act agt cgg ccc tca ggt gtt tct gat cgc ttc192Leu Ile Tyr Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe50 55 60tct ggc tcc aag tca ggc ctc acg gcc tcc ctg acc atc tct gga ctc240Ser Gly Ser Lys Ser Gly Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80cag cct gaa gac gag gct gac tat tac tgc aac tcc tat tct gcc acc288Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Ser Ala Thr85 90 95gac act ctt gtt ttt ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta330Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>39<211>110<212>PRT<213>人<400>39Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser Arg Gly Gln5 10 15Ser Ile Thr Leu Ser Cys Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr20 25 30Asn Tyr Ile Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser Gly Val Ser Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Leu Thr Ala Ser Leu Thr Ile Ser Gly Leu65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Asn Ser Tyr Ser Ala Thr85 90 95Asp Thr Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>40<211>333<212>DNA<213>人<400>40cag gct gtg ctg act cag ccg tcc tca gtg tct ggg gcc cca gga cag48Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc at tcc tgc act ggg caa agc tcc aat atc ggg gca gat 96Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp20 25 30tat gat gta cat tgg tac cag caa ttt cca gga aca gcc ccc aaa ctc144Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45ctc atc tat ggt cac aac aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc192Leu Ile Tyr Gly His Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60tct ggc tcc aag tct ggc acc tca gtc tcc ctg gtc atc agt ggg ctc240Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu65 70 75 80cag gct gag gat gag gct gat tat tat tgc cag tcc tat gac agc agt288Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95cta agt ggt ttg gta ttc ggc gga ggg acc aag gtg acc gtc cta333Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 105 110<210>41<211>111<212>PRT<213>人<400>41
Gln Ala Val Leu Thr Gln Pro Ser Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly His Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Val Ser Leu Val Ile Ser Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Ser Ser85 90 95Leu Ser Gly Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Thr Val Leu100 105 110<210>42<211>321<212>DNA<213>人<400>42gac atc cag ttg acc cag tct cca tct tct gtg tct gca tct gtt gga48Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15gac agc gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag gat att agc agc tgg96Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp20 25 30tta gcc tgg tat caa cag aaa cca ggg gag gcc cct aag ctc ctg atc144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tat gct gca tcc ctt ctt caa agt ggg gtc cca tca cgg ttc agc ggc192Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca gat ttc gct ctc act atc aac age ctg cag cct240Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca act tac ttt tgt caa cag gct gac agt ttc cct ccc288
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro85 90 95acc ttc ggc caa ggg aca cgg ctg gag att aaa 321Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>43<211>107<212>PRT<213>人<400>43Asp Ile Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Ser Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Ser Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ala Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys100 105<210>44<211>321<212>DNA<213>人<400>44gac atc gag ttg acc cag tct cca tct tcc gtg tct gca tct gtg gga48Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15gac aga gtc acc ctc act tgt cgg gcg agt cag agt att aag agg tgg96Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp
20 25 30tta gcc tgg tat cag cag aaa cca ggg aag gcc cct agg ctc ctc atc144Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45tat gct gca tcc act ttg caa agt ggg gtc cca tca agg ttc agc ggc192Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60ggt gga tct ggg aca gat ttc act ctc acc atc aac agc ctg cag cct240Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80gaa gat ttt gca att tac tac tgt caa cag gct aac agt ttc cct ccc288Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro85 90 95act ttc ggc cct ggg acc aaa gtg gat atc aaa 32lThr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>45<211>107<212>PRT<213>人<400>45Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Leu Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Ile Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105
<210>46<211>333<212>DNA<213>人<400>46cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag48Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc atc tcc tgc agt ggg agc agg tcc aac atc ggg gca cac96Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His20 25 30tat gaa gtc cag tgg tac cag cag ttt ccg gga gca gcc ccc aaa ctc144Tyr Glu Val Gln Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu35 40 45ctc atc tat ggt gac acc aat cgg ccc tca ggg gtc cct gag cga ttc192Leu Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60tct gcc tcc cac tct ggc acc tca gcc tcc ctt gcc atc aca ggg ctc240Ser Ala Ser His Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcg tat gac acc agt288Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser85 90 95cta cgt ggt ccg gtg ttc ggc gga ggg acc aag ctg acc gtc cta333Leu Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>47<211>111<212>PRT<213>人<400>47Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His20 25 30
Tyr Glu Val Gln Trp Tyr Gln Gln Phe Pro Gly Ala Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Ala Ser His Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Thr Ser85 90 95Leu Arg Gly Pro Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>48<211>333<212>DNA<213>人<400>48cag tct gtc gtg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg gcc cca ggg cag48Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc at tcc tgc act ggg agc agc tcc aac atc ggg aca ggt 96Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly20 25 30tat gat gta cat tgg tac cag cag gtt cca gga tca gcc ccc aaa ctc144Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu35 40 45ctc atc tat gct tac acc aat cgg ccc tca ggg gtc cct gac cga ttc192Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60tct ggc tcc aag tct ggc atg tca gcc tcc ctg gtc atc ggt ggt ctc240Ser Gly Ser Lys Ser Gly Met Ser Ala Ser Leu Val Ile Gly Gly Leu65 70 75 80cag gct gag gat gag gct gat tat tac tgc cag tcc ttt gac gac agc288Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Phe Asp Asp Ser85 90 95ctg aat ggt ctt gtc ttc gga cct ggg acc tcg gtc acc gtc ctc333Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Leu
100 105 110<210>49<211>111<212>PRT<213>人<400>49Gln Ser Val Val Thr Gln Pro Pro ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Sys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly20 25 30Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Val Pro Gly Ser Ala Pro Lys Leu35 40 45Leu Ile Tyr Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Lys Ser Gly Met Ser Ala Ser Leu Val Ile Gly Gly Leu65 70 75 80Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr TyrCys Gln Ser Phe Asp Asp Ser85 90 95Leu Asn Gly Leu Val Phe Gly Pro Gly Thr Ser Val Thr Val Leu100 105 110<210>50<211>333<212>DNA<213>人<400>50cag tct gtg ttg acg cag ccg ccc tca gtg tct ggg ggc cca ggg cag 48Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15agg gtc acc atc tcc tgc act ggg agc cac tcc aac ttc ggg gca ggt96Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly20 25 30act gat gtc cat tgg tac caa cac ctt cca gga aca gcc ccc aga ctc 144Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro arg Leu35 40 45
ctc att cat gga gac act cat cgg ccc tcc ggg gtc gct gac cga ttc192Leu Ile His Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe50 55 60tct ggc tcc gg tct ggc gcc tca gcc tcc ctg gcc atc act ggg ctc240Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80cgg gtt gag gat gag gtc gat tat tac tgt cag tcg tat gac tat ggc 288Arg Val Leu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly85 90 95ctg aga ggt tgg gtg ttc ggc ggc ggg acc aag ctg acc gtc ctt333Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>51<211>111<212>PRT<213>人<400>51Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln5 10 15Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly20 25 30Thr Asp Val His Trp Tyr Gln His Leu Pro Gly Thr Ala Pro Arg Leu35 40 45Leu Ile His Gly Asp Thr His Arg Pro Ser Gly Val Ala Asp Arg Phe50 55 60Ser Gly Ser Arg Ser Gly Ala Ser Ala Ser Leu Ala Ile Thr Gly Leu65 70 75 80Arg Val Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly85 90 95Leu Arg Gly Trp Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu100 105 110<210>52<211>32l<212>DNA
<213>人<400>52gac atc cag atg acc cag tct cca tct tcc gtg tct gca tct ata gga48Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly5 10 15gac aga gtc acc atc act tgt cgg gcg agt cag ggt att gac aac tgg96Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30tta ggc tgg tat cag cag aaa cct ggg aaa gcc cct aaa ctc ctg atc144Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45tac gat gca tcc aat ttg gac aca ggg gtc cca tca agg ttc agt gga192Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60agt gga tct ggg aca tat ttt act ctc acc atc agt agc ctg caa gct240Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80gaa gat ttt gca gtt tat ttc tgt caa cag gct aaa gct ttt cct ccc288Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95act ttc ggc gga ggg acc aag gtg gac atc aaa 321Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>53<211>107<212>PRT<213>人<400>53Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Ile Gly5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp20 25 30Leu Gly Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala65 70 75 80Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro85 90 95Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys100 105<210>54<211>13<212>PRT<213>人<400>54Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly Thr Asp Val5 10<210>55<211>7<212>PRT<213>人<400>55Gly Asp Ser Asn Arg Pro Ser5<210>56<211>11<212>PRT<213>人<400>56Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Leu Arg Gly Trp Val5 10<210>57<211>11<212>PRT<213>人<400>57
Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asn Asn Tyr Leu Asn5 10<210>58<211>7<212>PRT<213>人<400>58Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser5<210>59<211>9<212>PRT<213>人<400>59Gln Gln Tyr Ser Arg Tyr Pro Pro Thr5<210>60<211>14<212>PRT<213>人<400>60Thr Gly Ser Ser Thr Asp Val Gly Asn Tyr Asn Tyr Ile Ser5 10<210>61<211>7<212>PRT<213>人<400>61Asp Val Thr Ser Arg Pro Ser5<210>62<211>10<212>PRT<213>人<400>62
Asn Ser Tyr Ser Ala Thr Asp Thr Leu Val5 10<210>63<211>14<212>PRT<213>人<400>63Thr Gly Gln Ser Ser Asn Ile Gly Ala Asp Tyr Asp Val His5 10<210>64<211>7<212>PRT<213>人<400>64Gly His Asn Asn Arg Pro Ser5<210>65<211>11<212>PRT<213>人<400>65Gln Ser Tyr Asp Ser Ser Leu Ser Gly Leu Val5 10<210>66<211>10<212>PRT<213>人<400>66Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Trp Leu Ala5 10<210>67<211>7<212>PRT<213>人
<400>67Ala Ala Ser Leu Leu Gln Ser5<210>68<211>9<212>PRT<213>人<400>68Gln Gln Ala Asp Ser Phe Pro Pro Thr5<210>69<211>11<212>PRT<213>人<400>69Arg Ala Ser Gln Ser Ile Lys Arg Trp Leu Ala5 10<210>70<211>7<212>PRT<213>人<400>70Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser5<210>71<211>9<212>PRT<213>人<400>71Gln Gln Ala Asn Ser Phe Pro Pro Thr5<210>72<211>14
<212>PRT<213>人<400>72Ser Gly Ser Arg Ser Asn Ile Gly Ala His Tyr Glu Val Gln5 10<210>73<211>7<212>PRT<213>人<400>73Gly Asp Thr Asn Arg Pro Ser5<210>74<211>11<212>PRT<213>人<400>74Gln Ser Tyr Asp Thr Ser Leu Arg Gly Pro Val5 10<210>75<211>14<212>PRT<213>人<400>75Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Thr Gly Tyr Asp Val His5 10<210>76<211>7<212>PRT<213>人<400>76Ala Tyr Thr Asn Arg Pro Ser5<210>77
<211>11<212>PRT<213>人<400>77Gln Ser Phe Asp Asp Ser Leu Asn Gly Leu Val5 10<210>78<211>14<212>PRT<213>人<400>78Thr Gly Ser His Ser Asn Phe Gly Ala Gly Thr Asp Val His5 10<210>79<211>7<212>PRT<213>人<400>79Gly Asp Thr His Arg Pro Ser5<210>80<211>11<212>PRT<213>人<400>80Gln Ser Tyr Asp Tyr Gly Leu Arg Gly Trp Val5 10<210>81<211>11<212>PRT<213>人<400>81Arg Ala Ser Gln Gly Ile Asp Asn Trp Leu Gly5 10
<210>82<211>7<212>PRT<213>人<400>82Asp Ala Ser Asn Leu Asp Thr5<210>83<211>9<212>PRT<213>人<400>83Gln Gln Ala Lys Ala Phe Pro Pro Thr5<210>84<211>2351<212>DNA<213>人<400>84ggtaccgag aaagaaccgg ctcccgagtt ctgggcattt cgcccggctc gaggtgcagg 59atg cag agc aag gtg ctg ctg gcc gtc gcc ctg tgg ctc tgc gtg gag107Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu5 10 15acc cgg gcc gcc tct gtg ggt ttg cct agt gtt tct ctt gat ctg ccc155Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro20 25 30agg ctc agc ata caa aaa gac ata ctt aca att aag gct aat aca act203Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr35 40 45ctt caa att act tgc agg gga cag agg gac ttg gac tgg ctt tgg ccc251Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro50 55 60aat aat cag agt ggc agt gag caa agg gtg gag gtg act gag tgc agc299Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser65 70 75 80
gat ggc ctc ttc tgt aag aca ctc aca att cca aaa gtg atc gga aat347Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn85 90 95gac act gga gcc tac aag tgc ttc tac cgg gaa act gac ttg gcc tcg395Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser100 105 110gtc att tat gtc tat gtt caa gat tac aga tct cca ttt att gct tct443Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser115 120 125gtt agt gac caa cat gga gtc gtg tac att act gag aac aaa aac aaa491Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys130 135 140act gtg gtg att cca tgt ctc ggg tcc att tca aat ctc aac gtg tca539Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser145 150 155 160ctt tgt gca aga tac cca gaa aag aga ttt gtt cct gat ggt aac aga587Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg165 170 175att tcc tgg gac agc aag aag ggc ttt act att ccc agc tac atg atc635Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile180 185 190agc tat gct ggc atg gtc ttc tgt gaa gca aaa att aat gat gaa agt683Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser195 200 205tac cag tct att atg tac ata gtt gtc gtt gta ggg tat agg att tat731Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr210 215 220gat gtg gtt ctg agt ccg tct cat gga att gaa cta tct gtt gga gaa779Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu225 230 235 240aag ctt gtc tta aat tgt aca gca aga act gaa cta aat gtg ggg att827Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile245 250 255gac ttc aac tgg gaa tac cct tct tcg aag cat cag cat aag aaa ctt875Asp Phe Asn Trp Glu Tyr Pro Ser Ser Lys His Gin His Lys Lys Leu
260 265 270gta aac cga gac cta aaa acc cag tct ggg agt gag atg aag aaa ttt923Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe275 280 285ttg agc acc tta act ata gat ggt gta acc cgg agt gac caa gga ttg971Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu290 295 300tac acc tgt gca gca tcc agt ggg ctg atg acc aag aag aac agc aca1019Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr305 310 315 320ttt gtc agg gtc cat gaa aaa cct ttt gtt gct ttt gga agt ggc atg1067Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met325 330 335gaa tct ctg gtg gaa gcc acg gtg ggg gag cgt gtc aga atc cct gcg1115Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala340 345 350aag tac ctt ggt tac cca ccc cca gaa ata aaa tgg tat aaa aat gga1163Lys Tyr Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Trp Tyr Lys Asn Gly355 360 365ata ccc ctt gag tcc aat cac aca att aaa gcg ggg cat gta ctg acg1211Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr370 375 380att atg gaa gtg agt gaa aga gac aca gga aat tac act gtc atc ctt1259Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu385 390 395 400acc aat ccc att tca aag gag aag cag agc cat gtg gtc tct ctg gtt1307Thr Asn Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val405 410 415gtg tat gtc cca ccc cag att ggt gag aaa tct cta atc tct cct gtg1355Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val420 425 430gat tcc tac cag tac ggc acc act caa acg ctg aca tgt acg gtc tat1403Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr435 440 445gcc att cct ccc ccg cat cac atc cac tgg tat tgg cag ttg gag gaa1451Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu
450 455 460gag tgc gcc aac gag ccc agc cat gct gtc tca gtg aca aac cca tac1499Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser His Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr465 470 475 480cct tgt gaa gaa tgg aga agt gtg gag gac ttc cag gga gga aat aaa1547Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys485 490 495att gaa gtt aat aaa aat caa ttt gct cta att gaa gga aaa aac aaa1595Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Leu Ile Glu Gly Lys Asn Lys500 505 510act gta agt acc ctt gtt atc caa gcg gca aat gtg tcea gct ttg tac 1643Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr515 520 525aaa tgt gaa gcg gtc aac aaa gtc ggg aga gga gag agg gtg atc tcc1691Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser530 535 540ttc cac gtg acc agg ggt cct gaa att act ttg caa cct gac atg cag1739Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln545 550 555 560ccc act gag cag gag agc gtg tct ttg tgg tgc act gca gac aga tct1787Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser565 570 575acg ttt gag aac ctc aca tgg tac aag ctt ggc cca cag cct ctg cca1835Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro580 585 590atc cat gtg gga gag ttg ccc aca cct gtt tgc aag aac ttg gat act1883Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr595 600 605ctt tgg aaa ttg aat gcc acc atg ttc tct aat agc aca aat gac att1931Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile610 615 620ttg atc atg gag ctt aag aat gca tcc ttg cag gac caa gga gac tat1979Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr625 630 635 640gtc tgc ctt gct caa gac agg aag acc aag aaa aga cat tgc gtg gtc2027Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val
645 650 655agg cag ctc aca gtc cta gag cgt gtg gca ccc acg atc aca gga aac2075Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn660 665 670ctg gaa aat cag acg aca agt att ggg gaa agc atc gaa gtc tca tgc2123Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys675 680 685acg gca tct ggg aat ccc cct cca cag atc atg tgg tat aaa gat aat2171Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn690 695 700gag acc ctt gta gaa gac tca ggc att gta ttg aag gat ggg aac cgg2219Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg705 710 715 720aac ctc act atc cgc aga gtg agg aag gag gac gaa ggc ctc tac acc2267Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr725 730 735tgc cag gca tgc agt gtt ctt ggc tgt gca aaa gtg gag gca ttt ttc2315Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe740 745 750ata ata gaa ggt gcc cag gaa aag acg aac ttg gaa 2351Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu755 760<210>85<211>764<212>PRT<213>人<400>85Met Gln Ser Lys Val Leu Leu Ala Val Ala Leu Trp Leu Cys Val Glu5 10 15Thr Arg Ala Ala Ser Val Gly Leu Pro Ser Val Ser Leu Asp Leu Pro20 25 30Arg Leu Ser Ile Gln Lys Asp Ile Leu Thr Ile Lys Ala Asn Thr Thr35 40 45Leu Gln Ile Thr Cys Arg Gly Gln Arg Asp Leu Asp Trp Leu Trp Pro50 55 60
Asn Asn Gln Ser Gly Ser Glu Gln Arg Val Glu Val Thr Glu Cys Ser65 70 75 80Asp Gly Leu Phe Cys Lys Thr Leu Thr Ile Pro Lys Val Ile Gly Asn85 90 95Asp Thr Gly Ala Tyr Lys Cys Phe Tyr Arg Glu Thr Asp Leu Ala Ser100 105 110Val Ile Tyr Val Tyr Val Gln Asp Tyr Arg Ser Pro Phe Ile Ala Ser115 120 125Val Ser Asp Gln His Gly Val Val Tyr Ile Thr Glu Asn Lys Asn Lys130 135 140Thr Val Val Ile Pro Cys Leu Gly Ser Ile Ser Asn Leu Asn Val Ser145 150 155 160Leu Cys Ala Arg Tyr Pro Glu Lys Arg Phe Val Pro Asp Gly Asn Arg165 170 175Ile Ser Trp Asp Ser Lys Lys Gly Phe Thr Ile Pro Ser Tyr Met Ile180 185 190Ser Tyr Ala Gly Met Val Phe Cys Glu Ala Lys Ile Asn Asp Glu Ser195 200 205Tyr Gln Ser Ile Met Tyr Ile Val Val Val Val Gly Tyr Arg Ile Tyr210 215 220Asp Val Val Leu Ser Pro Ser His Gly Ile Glu Leu Ser Val Gly Glu225 230 235 240Lys Leu Val Leu Asn Cys Thr Ala Arg Thr Glu Leu Asn Val Gly Ile245 250 255Asp Phe Asn Trp Glu Thr Pro Ser Ser Lys His Gln His Lys Lys Leu260 265 270Val Asn Arg Asp Leu Lys Thr Gln Ser Gly Ser Glu Met Lys Lys Phe275 280 285Leu Ser Thr Leu Thr Ile Asp Gly Val Thr Arg Ser Asp Gln Gly Leu290 295 300Tyr Thr Cys Ala Ala Ser Ser Gly Leu Met Thr Lys Lys Asn Ser Thr305 310 315 320
Phe Val Arg Val His Glu Lys Pro Phe Val Ala Phe Gly Ser Gly Met325 330 335Glu Ser Leu Val Glu Ala Thr Val Gly Glu Arg Val Arg Ile Pro Ala340 345 350Lys Try Leu Gly Tyr Pro Pro Pro Glu Ile Lys Tyr Tyr Lys Asn Gly355 360 365Ile Pro Leu Glu Ser Asn His Thr Ile Lys Ala Gly His Val Leu Thr370 375 380Ile Met Glu Val Ser Glu Arg Asp Thr Gly Asn Tyr Thr Val Ile Leu385 390 395 400Thr Am Pro Ile Ser Lys Glu Lys Gln Ser His Val Val Ser Leu Val405 410 415Val Tyr Val Pro Pro Gln Ile Gly Glu Lys Ser Leu Ile Ser Pro Val420 425 430Asp Ser Tyr Gln Tyr Gly Thr Thr Gln Thr Leu Thr Cys Thr Val Tyr435 440 445Ala Ile Pro Pro Pro His His Ile His Trp Tyr Trp Gln Leu Glu Glu450 455 460Glu Cys Ala Asn Glu Pro Ser His Ala Val Ser Val Thr Asn Pro Tyr465 470 475 480Pro Cys Glu Glu Trp Arg Ser Val Glu Asp Phe Gln Gly Gly Asn Lys485 490 495Ile Glu Val Asn Lys Asn Gln Phe Ala Ieu Ile Glu Gly Lys Asn Lys500 505 510Thr Val Ser Thr Leu Val Ile Gln Ala Ala Asn Val Ser Ala Leu Tyr515 520 525Lys Cys Glu Ala Val Asn Lys Val Gly Arg Gly Glu Arg Val Ile Ser530 535 540Phe His Val Thr Arg Gly Pro Glu Ile Thr Leu Gln Pro Asp Met Gln545 550 555 560Pro Thr Glu Gln Glu Ser Val Ser Leu Trp Cys Thr Ala Asp Arg Ser565 570 575
Thr Phe Glu Asn Leu Thr Trp Tyr Lys Leu Gly Pro Gln Pro Leu Pro580 585 590Ile His Val Gly Glu Leu Pro Thr Pro Val Cys Lys Asn Leu Asp Thr595 600 605Leu Trp Lys Leu Asn Ala Thr Met Phe Ser Asn Ser Thr Asn Asp Ile610 615 620Leu Ile Met Glu Leu Lys Asn Ala Ser Leu Gln Asp Gln Gly Asp Tyr625 630 635 640Val Cys Leu Ala Gln Asp Arg Lys Thr Lys Lys Arg His Cys Val Val645 650 655Arg Gln Leu Thr Val Leu Glu Arg Val Ala Pro Thr Ile Thr Gly Asn660 665 670Leu Glu Asn Gln Thr Thr Ser Ile Gly Glu Ser Ile Glu Val Ser Cys675 680 685Thr Ala Ser Gly Asn Pro Pro Pro Gln Ile Met Trp Phe Lys Asp Asn690 695 700Glu Thr Leu Val Glu Asp Ser Gly Ile Val Leu Lys Asp Gly Asn Arg705 710 715 720Asn Leu Thr Ile Arg Arg Val Arg Lys Glu Asp Glu Gly Leu Tyr Thr725 730 735Cys Gln Ala Cys Ser Val Leu Gly Cys Ala Lys Val Glu Ala Phe Phe740 745 750Ile Ile Glu Gly Ala Gln Glu Lys Thr Asn Leu Glu755 760
權利要求
1.一種抑制腫瘤生長的方法，包括給予人治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑和治療有效量的表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑。
2.一種抑制腫瘤生長的方法，包括給予人治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑和放療。
3.一種抑制腫瘤生長的方法，包括給予人治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑和化療劑。
4.根據(jù)權利要求1-3任何一項所述的方法，其中所述腫瘤過量表達VEGFR。
5.根據(jù)權利要求1-4任何一項所述的方法，其中所述腫瘤是乳腺，心臟，肺，小腸，結腸，脾，腎，膀胱，頭和頸，卵巢，前列腺，腦，胰腺，皮膚，骨，骨髓，血液，胸腺，子宮，睪丸，子宮頸或肝的腫瘤。
6.根據(jù)權利要求1-5任何一項所述的方法，其中所述腫瘤是結腸腫瘤。
7.根據(jù)權利要求1-5任何一項所述的方法，其中所述腫瘤是非小細胞肺癌(NSCLC)。
8.根據(jù)權利要求1-7任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑靜脈內(nèi)給藥。
9.根據(jù)權利要求1-8任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑口服給藥。
10.根據(jù)權利要求1-9任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑抑制VEGFR與其配體結合。
11.根據(jù)權利要求1-10任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑結合VEGFR。
12.根據(jù)權利要求1-11任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑包含對VEGFR特異的抗體，或其功能等同物。
13.根據(jù)權利要求1-11任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑包含對VEGFR特異的小分子。
14.根據(jù)權利要求1-13任何一項所述的方法，其中所述VEGF受體拮抗劑是fms樣酪氨酸激酶受體(f1t-1)VEGFR-1的拮抗劑。
15.根據(jù)權利要求1-14任何一項所述的方法，其中該方法進一步包括給予一種抗腫瘤劑。
16.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中所述抗腫瘤劑是化療劑或放療。
17.根據(jù)權利要求15所述的方法，其中該方法進一步包括給予一種佐劑。
18.根據(jù)權利要求1-17任何一項所述的方法，其中所述腫瘤過量表達EGFR。
19.根據(jù)權利要求1，4-18任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑靜脈內(nèi)給藥。
20.根據(jù)權利要求1，4-19任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑口服給藥。
21.根據(jù)權利要求1，4-20任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑抑制EGFR與其配體結合。
22.根據(jù)權利要求1，4-21任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑結合EGFR。
23.根據(jù)權利要求1，4-24任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑抑制EGFR與ATP結合。
24.根據(jù)權利要求1，4-22任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的抗體，或其功能等同物。
25.根據(jù)權利要求1，4-23任何一項所述的方法，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的小分子。
26.根據(jù)權利要求1，4-25任何一項所述的方法，其中所述抗體含有人類抗體的恒定區(qū)。
27.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述抗體是含有小鼠抗體可變區(qū)的嵌合抗體。
28.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述抗體是含有可變區(qū)的人源化抗體，而可變區(qū)則含有小鼠抗體的互補決定區(qū)(CDRs)和人類抗體的構架區(qū)。
29.根據(jù)權利要求26所述的方法，其中所述抗體是含有人類抗體可變區(qū)的人類抗體。
30.根據(jù)權利要求3-29任何一項所述的方法，其中所述化療劑不與VEGF受體拮抗劑偶聯(lián)。
31.根據(jù)權利要求3-30任何一項所述的方法，其中所述化療劑選自順鉑，達卡巴嗪，更生霉素，雙氯乙基甲胺，鏈脲霉素，環(huán)磷酰胺，卡莫司汀，羅氮芥，阿霉素，柔紅霉素，丙卡巴肼，絲裂霉素，阿糖孢苷，依托泊苷，甲氨蝶呤，5-氟尿嘧啶，長春花堿，長春新堿，博萊霉素，紫杉醇，多西他賽，阿地流津，天門冬酰胺酶，白消安，卡鉑，克拉屈濱，達卡巴嗪，氟尿苷，氟達拉濱，羥基脲，異環(huán)磷酰胺，干擾素α，利普安，甲地孕酮，美法侖，巰基嘌呤，普卡霉素，米托坦，培加帕酶，噴司他丁，哌泊溴烷，光輝霉素，鏈脲霉素，他莫昔芬，替尼泊苷，睪內(nèi)酯，硫鳥嘌呤，噻替派，尿嘧啶氮芥，維諾利賓，苯丁酸氮芥，紫杉酚及其組合。
32.根據(jù)權利要求3-31任何一項所述的方法，其中所述化療劑選自順鉑，阿霉素，紫杉酚及其組合。
33.一種用于抑制腫瘤生長的試劑盒，含有治療有效量的表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑和治療有效量的血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)受體拮抗劑。
34.根據(jù)權利要求33所述的試劑盒，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的抗體，或其功能等同物。
35.根據(jù)權利要求33所述的試劑盒，其中所述EGFR拮抗劑包含對EGFR特異的小分子。
36.根據(jù)權利要求33-35任何一項所述的試劑盒，其中所述VEGFR拮抗劑包含對VEGFR特異的抗體，或其功能等同物。
37.根據(jù)權利要求33-35任何一項所述的試劑盒，其中所述VEGFR拮抗劑包含對VEGFR特異的小分子。
38.根據(jù)權利要求33-37任何一項所述的試劑盒，其中該試劑盒進一步含有抗腫瘤劑。
39.根據(jù)權利要求33-38任何一項所述的試劑盒，其中該試劑盒進一步含有佐劑。
全文摘要
本發(fā)明提供一種減輕或抑制哺乳動物中腫瘤生長的方法，包括用治療有效量的VEGF受體拮抗劑與放療，化療，和/或其它受體拮抗劑聯(lián)合治療哺乳動物。
文檔編號A61K51/00GK1826139SQ02809226
公開日2006年8月30日 申請日期2002年3月4日 優(yōu)先權日2002年3月4日
發(fā)明者帕特里夏·羅克韋爾, I·戈爾茨坦 尼爾 申請人:伊姆克羅尼系統(tǒng)公司