專利名稱：擬南芥屬(Arabidopsis)用于生產(chǎn)人類及動(dòng)物的治療及診斷用蛋白質(zhì)的商業(yè)用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及使用鼠耳芥大量制造蛋白質(zhì)。
背景技術(shù)：
大量制造蛋白質(zhì)為有效探勘人類使用的重組基因產(chǎn)物例如治療性蛋白質(zhì)所需。雖然微生物系統(tǒng)經(jīng)常就轉(zhuǎn)殖以及制造轉(zhuǎn)化細(xì)胞速度上提供明白優(yōu)勢(shì)，但由實(shí)驗(yàn)室規(guī)模擴(kuò)大至大型發(fā)酵容器的規(guī)模擴(kuò)增上經(jīng)常有困難。由于細(xì)菌與真核生物間的多種翻譯后處理步驟不同，故有某些蛋白質(zhì)無法于原核生物系統(tǒng)制造。
哺乳類及昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)廣泛用于制造多種蛋白質(zhì)及最顯著的優(yōu)勢(shì)可能是翻譯后處理。但培養(yǎng)基、設(shè)備以及培養(yǎng)條件苛刻的趨勢(shì)制造成本增高，顯然為此種系統(tǒng)的劣勢(shì)所在。此種系統(tǒng)的另一項(xiàng)缺點(diǎn)為可能攜帶有對(duì)人類健康構(gòu)成威脅的病毒粒子或朊病毒。
也曾經(jīng)描述轉(zhuǎn)基因動(dòng)物于乳汁、排泄于尿液、或透過鳥類的卵以制造用來制造人類蛋白質(zhì)。類似動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)，轉(zhuǎn)基因動(dòng)物須提供具有所需翻譯后修飾的蛋白質(zhì)。但轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的制造緩慢、維持困難、不容易大規(guī)模養(yǎng)育。制造成本相當(dāng)高以及同樣的純化問題構(gòu)成此種系統(tǒng)的問題。
使用植物作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)系統(tǒng)或「生物反應(yīng)器」是在基于細(xì)菌、酵母菌、昆蟲、動(dòng)物及細(xì)胞制造系統(tǒng)以外的具有吸引力的替代的系統(tǒng)。植物制造蛋白質(zhì)有多種好處，使用植物于制造轉(zhuǎn)基因蛋白質(zhì)正獲得廣泛證實(shí)。
植物制造系統(tǒng)容易純化，不含動(dòng)物病原性污染物。對(duì)大量植物種屬存在有轉(zhuǎn)化方法。當(dāng)使用多種種子植物及農(nóng)作物時(shí)，對(duì)于收獲以及處理大量材料已經(jīng)存在有方法及基礎(chǔ)架構(gòu)。將規(guī)模放大相當(dāng)直接，只要單純基于擴(kuò)大制造種子以及栽種面積即可。如此生產(chǎn)成本減低，哺乳動(dòng)物的病毒或者朊病毒污染風(fēng)險(xiǎn)下降，原料及制造設(shè)備成本比透過哺乳動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)或轉(zhuǎn)基因動(dòng)物來制造類似材料的設(shè)備投資需求相對(duì)較低。植物通常只有單一顯著缺點(diǎn)，該缺點(diǎn)系在翻譯后蛋白質(zhì)的糖基化作用。但于許多案例已經(jīng)驗(yàn)證植物的替代碳水化合物修改不會(huì)對(duì)糖蛋白造成有害影響或非期望的免疫原性質(zhì)。
已經(jīng)發(fā)展出多種制造系統(tǒng)用以于植物中表達(dá)的蛋白質(zhì)。包括于油體表達(dá)的蛋白質(zhì)(Rooijen等人，109植物生理學(xué)1353-61(1995)；Liu等人，3分子育種463-70(1997))透過根瘤菌表達(dá)的蛋白質(zhì)(Borisjuk等人，17自然生物技術(shù)466-69(1999))于種子表達(dá)的蛋白質(zhì)(Hood等人，3分子育種291-306(1997)；Hood等人，透過高等植物生物工程的化學(xué)品(編輯Shahidi等人)普雷能(Plenum)出版公司，127-148(1999)；Kusnadi等人，56生物技術(shù)及生物工程473-84(1997)；Kusnadi等人，60生物技術(shù)及生物工程44-52(1998)；Kusnadi等人，14生物技術(shù)進(jìn)展149-55(1998)；Witcher等人，4分子育種301-12(1998))，于病毒表面的抗原決定簇(Verch等人，220免疫方法期刊69-75(1998)；Brennan等人，73病毒學(xué)期刊930-38(1999)；Brennan等人，145微生物學(xué)211-20(1999))以及于馬鈴薯塊莖穩(wěn)定表達(dá)的蛋白質(zhì)(Arakawa等人，6轉(zhuǎn)基因研究403-13(1997)；Arakawa等人，16自然生技292-97(1998)；Tacket等人，4自然藥物607-09(1998))。重組蛋白質(zhì)也可將目標(biāo)鎖定于種子、葉綠體或分泌來識(shí)別可獲得最高度蛋白質(zhì)蓄積程度的所在位置。
多方面努力探勘植物，意圖對(duì)蛋白質(zhì)制造問題獲得生物技術(shù)的解決之道，已經(jīng)將目光焦點(diǎn)集中于使用主要農(nóng)作物。大半重點(diǎn)放在生物物質(zhì)的制造，農(nóng)業(yè)已經(jīng)發(fā)展出全球最大型的生物物質(zhì)制造系統(tǒng)，亦即農(nóng)耕。過去7-8年間于農(nóng)作物有許多外來蛋白質(zhì)(例如疫苗、單株抗體、抗生物素及其它)范例。明白驗(yàn)證農(nóng)業(yè)生產(chǎn)性植物可作為制造外來蛋白質(zhì)的相當(dāng)具有成本效益的手段。大多數(shù)情況下，對(duì)照于由典型發(fā)酵技術(shù)所得的產(chǎn)品，由此種植物制造產(chǎn)品的成本估計(jì)指出，使用植物可讓成本降低50至100倍。
當(dāng)考慮可栽種用來制造特定產(chǎn)物的全部土地面積時(shí)，確實(shí)基于植物的制造系統(tǒng)的產(chǎn)能顯然較高。但至今為止此種系統(tǒng)及辦法尚未能排除顯著瑕疵及缺點(diǎn)。由于此種系統(tǒng)系用來制造供醫(yī)藥用途的高度經(jīng)過調(diào)節(jié)的生物物質(zhì)，但其最嚴(yán)重的缺點(diǎn)之一為戶外制造系統(tǒng)本質(zhì)上未經(jīng)調(diào)節(jié)。由于戶外條件多變，難以發(fā)展出一種有效符合CGMP方法，或可能難以在戶外生長此種經(jīng)過基因修改的有機(jī)體(GMOs)。
過去數(shù)十年來，植物生技研究已經(jīng)被初步發(fā)現(xiàn)使用一種小型而生長快速的雜草植物擬南芥屬(水芹)大為推動(dòng)其進(jìn)展。此種植物用于實(shí)驗(yàn)室研究有多項(xiàng)優(yōu)異品質(zhì)。擬南芥屬小型、生命周期短、種子產(chǎn)生能力大量、有相對(duì)小而不復(fù)雜的基因體，且容易藉多種方法做轉(zhuǎn)化，已經(jīng)有多種突變變異株。過去十年來擬南芥屬基因體已經(jīng)完全被測(cè)序，代表第一種高等植物的里程碑。由于這些理由，擬南芥屬變成植物生技常用的研究有機(jī)體。但普遍了解此種小型雜草植物只能作為研究模式。
如此擬南芥屬通常只在研究室內(nèi)探勘。對(duì)于特定農(nóng)作物研究工程，由擬南芥屬種屬獲得的知識(shí)典型用來更完整了解全球主要食物作物及園藝作物，且該項(xiàng)了解應(yīng)用于修改及改進(jìn)該等作物種屬。
發(fā)明概述制造生物醫(yī)藥或診斷材料時(shí)，有多項(xiàng)關(guān)鍵因素需要考慮包括生長條件、產(chǎn)品制造及調(diào)節(jié)需求。根據(jù)本發(fā)明方法提供一種高度可靠而快速的系統(tǒng)，該系統(tǒng)可由早期的試驗(yàn)階段及雛型階段放大規(guī)模直到全規(guī)模制造重組蛋白質(zhì)。
很少有植物像擬南芥屬(Arabidopsis)般適合快速產(chǎn)生植株及種子。就一方面而言，本發(fā)明提供一種經(jīng)由篩選可表達(dá)高產(chǎn)率蛋白質(zhì)的基因構(gòu)建體及轉(zhuǎn)基因植物，而由擬南芥屬大規(guī)模制造重組蛋白質(zhì)的方法。任一種適當(dāng)技術(shù)皆可使用例如土壤桿菌(Agrobacterium)花浸漬或真空浸潤轉(zhuǎn)化程序。較好由轉(zhuǎn)化至轉(zhuǎn)基因種子所需時(shí)間少于10周，例如約8至10周。另一方面，使用快速暫時(shí)性表達(dá)分析系統(tǒng)，例如葉及幼苗浸潤或原生質(zhì)體電穿孔，而在其制造的數(shù)日內(nèi)試驗(yàn)新穎基因構(gòu)建體的適當(dāng)性質(zhì)。
用來導(dǎo)入此種重組基因構(gòu)建體的載體包括有用序列，這些有用序列包括但非限于有助于特定整合于選定的基因體所在位置的位置特異性重組位置，使用的可選擇標(biāo)記(例如BAR、NPTII等)及/或其它可篩選標(biāo)記例如GFP(綠螢光蛋白質(zhì)或其突變形式或修改形式)、蟲螢光素酶或GUS(β葡萄糖醛酸酶)。較好重組構(gòu)建體包含感興趣蛋白質(zhì)的編碼核酸序列、以可操作方式連接至啟動(dòng)子及/或一或多個(gè)基因調(diào)節(jié)元件例如IRES(內(nèi)部核糖體進(jìn)入位置)。
一方面，突變重組蛋白質(zhì)藉隨機(jī)突變發(fā)生、或藉合理設(shè)計(jì)、或藉這些技術(shù)的組合篩選而識(shí)別構(gòu)建體，該構(gòu)建體的蛋白質(zhì)具有例如穩(wěn)定性增高以及活性增高等期望性質(zhì)。表達(dá)此種蛋白質(zhì)的重組構(gòu)建體較好是在暫時(shí)性檢定分析平行于可表達(dá)野生性蛋白質(zhì)形式的構(gòu)建體一起試驗(yàn)。
另一種產(chǎn)生可用于此類型生物「類似物」試驗(yàn)的變異株的方式系改變制造系統(tǒng)中影響終產(chǎn)物改變的某些參數(shù)。此種方式方便于擬南芥屬達(dá)成，使用既存的擬南芥屬變種、或產(chǎn)生植物的蛋白質(zhì)處理特性變更的突變種。如此任何增加至制造新蛋白質(zhì)系統(tǒng)的DNA信息皆可依據(jù)宿主植物的能力做些微變更，來進(jìn)行某些翻譯或翻譯后修飾。
糖基化作用屬于與此處討論特別有關(guān)的范例。已知于糖基化作用期間將糖添加至蛋白質(zhì)在動(dòng)植物間有別。核心聚糖大致相同，但主要差異在于添加木糖以及a-1-3巖藻糖以及不含末端唾液酸。尚未確定何種(若有)以及多少差異將有關(guān)植物產(chǎn)物用作為醫(yī)藥分子的功效及安全性。有足夠參考文獻(xiàn)提示此種變化對(duì)活性及安全性等并不重要。已經(jīng)有一組擬南芥屬突變株可用于制造例如具有不同聚糖支鏈的蛋白質(zhì)，此屬于本發(fā)明的系統(tǒng)性辦法的獨(dú)特優(yōu)點(diǎn)。例如得自擬南芥屬野生型及多種突變株及基因工程形式的蛋白質(zhì)可使用試管功能檢定分析平行試驗(yàn)，使鑒別擬南芥屬突變株或基因工程形式制造醫(yī)藥可接受性重組蛋白質(zhì)產(chǎn)物的能力。
可使用的突變株種系的其它范例包括但非限于蛋白酶缺乏種系，以及比較其它擬南芥屬種系的平均生物物質(zhì)(特別葉部生物物質(zhì))增加的突變株。此處注意力焦點(diǎn)集中在提高產(chǎn)出量，并不一定制造其它產(chǎn)品形式。
如此，本發(fā)明的較佳方面為于制造穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因種系前，決定何種構(gòu)建體、何種突變株形式以及何種宿主系統(tǒng)背景可產(chǎn)生最具有藥理功用的預(yù)定蛋白質(zhì)形式。
檢視本發(fā)明的特佳方面的方式始于公知擬南芥屬工作停止之處。過去擬南芥屬被用來確定某些蛋白質(zhì)可于植物體表達(dá)、或提供有關(guān)特定表達(dá)載體特征資料的研究模式。蛋白質(zhì)及載體通常于商業(yè)上系在不同的植物系統(tǒng)探索。相反地，本發(fā)明提供預(yù)選定期望表達(dá)構(gòu)建體以及以大規(guī)模于擬南芥屬表達(dá)該構(gòu)建體，利用于制造前檢定分析所識(shí)別的最理想構(gòu)建體及擬南芥屬種系(如前述)的方法及系統(tǒng)。于較佳方面，本發(fā)明包含識(shí)別可制造最理想數(shù)量及/或形式蛋白質(zhì)的植物；以及于該植物的子代、克隆相關(guān)植物、或?qū)嵸|(zhì)上基因相同植物制造大規(guī)模數(shù)量的蛋白質(zhì)。
最好選用的擬南芥屬種系及使用的表達(dá)系統(tǒng)系設(shè)計(jì)成對(duì)每株植物可獲得最高蛋白質(zhì)產(chǎn)量。包括于基因之一序列使用多數(shù)拷貝，以及表達(dá)載體，該表達(dá)載體盡可能如同植物的許多部分可制造蛋白質(zhì)產(chǎn)出量。然后將此種載體引進(jìn)擬南芥屬，誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)植物是于經(jīng)過設(shè)計(jì)成可獲得最大植物生長以及蛋白質(zhì)最大表達(dá)的條件下生長。雖然以可獲得最大產(chǎn)量的最理想系統(tǒng)為最佳，但于本發(fā)明的此一方面的范圍仍然考慮經(jīng)濟(jì)可行的低于最理想產(chǎn)量的系統(tǒng)。
通常根據(jù)本發(fā)明的植物系于有利于葉及根生物物質(zhì)制造的條件下生長，甚至可能犧牲掉種子產(chǎn)量，使產(chǎn)量減少、或在種子產(chǎn)生以及成熟之前即收獲植物。
本發(fā)明的一方面使用土壤桿菌來導(dǎo)入由前述檢定分析選出的最理想載體及構(gòu)建體，用于導(dǎo)引入植物細(xì)胞，以及用于生長及制造可穩(wěn)定表達(dá)感興趣的重組蛋白質(zhì)的植物及/或種子。較好使用浸潤方法例如真空浸潤方法。
在一段極短時(shí)間且在極小的空間中，即可能制造數(shù)以百計(jì)的T1轉(zhuǎn)基因種系，其可能在數(shù)周內(nèi)產(chǎn)生數(shù)以千計(jì)的個(gè)別推定的T1轉(zhuǎn)基因種系。由這些數(shù)以千計(jì)的推定轉(zhuǎn)基因T1植物，進(jìn)行篩選來評(píng)估何種種系具有預(yù)定的轉(zhuǎn)基因表達(dá)。然后讓這些種系自我授粉，約在8周時(shí)間產(chǎn)生T2族群。使用標(biāo)準(zhǔn)孟德爾遺傳學(xué)作為指南，制造的T2世代正常對(duì)單點(diǎn)插入應(yīng)該有25％同種接合轉(zhuǎn)基因種系。然后將這些種系快速擴(kuò)大規(guī)模制造大量「純種」同種接合種子。
希望植物生長規(guī)模遠(yuǎn)超過研究使用的規(guī)模。例如于特定植物生長隔間例如于溫室或生長室內(nèi)，擬南芥屬在任何特定時(shí)間乃唯一生長的植物。但在該溫室中的每株植物不可能含有與獲得確切相同蛋白質(zhì)最大產(chǎn)量確切相同目標(biāo)確切相同的構(gòu)建體。經(jīng)由使用相同表達(dá)系統(tǒng)生長設(shè)計(jì)用來獲得最大蛋白質(zhì)產(chǎn)出量的植物，溫室可用于本發(fā)明。
本發(fā)明的特佳具體實(shí)施例中，以此種規(guī)模持續(xù)制造一段長時(shí)間，例如數(shù)周、數(shù)月或數(shù)年。如此即使有人考慮將整個(gè)溫室種植含有單一構(gòu)建體可表達(dá)單一研究目的蛋白質(zhì)的擬南芥屬，但無法只完成植物的一個(gè)生命周期，無法于確切相同條件下開始第二、第三、第四及第五次栽種，例如將溫室的全部面積收成，然后一再地對(duì)溫室的全部面積再度栽種相同類型的植物其可使用相同類型的表達(dá)系統(tǒng)來表達(dá)相同蛋白質(zhì)。如此本發(fā)明的一方面涉及制造每英畝某種質(zhì)量的蛋白質(zhì)(若于二度空間生長)或每立方米某種質(zhì)量的蛋白質(zhì)(若以三度空間例如在生長室內(nèi)以堆棧層生長)。
根據(jù)本發(fā)明的此一方面的特佳具體實(shí)施例中，持續(xù)以此種規(guī)模生長及/或至少經(jīng)歷6個(gè)月時(shí)間，結(jié)果可獲得具有商業(yè)意義數(shù)量的蛋白質(zhì)。
一方面，約20吋×20吋(400平方呎)的生長室用來當(dāng)植物以單一水平層生長時(shí)約45至60日時(shí)間制造至少約4千克總量擬南芥屬生物物質(zhì)供收成。另一方面，植物生長超過一年。例如增加至少約六成，可在約45至60日每一生長期每一生長室制造約240千克植物生物物質(zhì)。假定每年有6至8個(gè)生長/收成周期，假設(shè)中等表達(dá)約0.5％總可溶性蛋白質(zhì)，則估計(jì)此種系統(tǒng)每年至少可獲得約72至96克可純化蛋白質(zhì)。
如此一方面，本發(fā)明包含一種于適當(dāng)條件下制造轉(zhuǎn)基因擬南芥屬種系的方法，達(dá)成至少約10千克總植物生物物質(zhì)，以及由該總植物生物物質(zhì)，可獲得合理數(shù)量的可純化基因工程蛋白質(zhì)產(chǎn)品。較好經(jīng)由增加栽種面積，增加總蛋白質(zhì)中表示期望蛋白質(zhì)的百分比，縮短獲得某種生物物質(zhì)及期望蛋白質(zhì)所需時(shí)間或前述任一種組合可方便將該方法擴(kuò)大規(guī)模，獲得更大量產(chǎn)物。
本發(fā)明的特佳具體實(shí)施例為由擬南芥屬制造期望蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明也包含由這些方法衍生的蛋白質(zhì)。這些方法包括提供特定多種擬南芥屬的步驟，包括至少一個(gè)表達(dá)暗盒其可表達(dá)至少一種感興趣的蛋白質(zhì)。蛋白質(zhì)可為非同源蛋白質(zhì)或?qū)χ参锒詾橥鈦淼鞍踪|(zhì)。
詳細(xì)描述相反地，本發(fā)明中使用小型雜草植物擬南芥屬作為蛋白質(zhì)制造宿主。本發(fā)明提供可利用多種擬南芥屬生長參數(shù)，使于經(jīng)過控制的室內(nèi)條件下生長致密植物的族群用于收獲生物物質(zhì)及分離蛋白質(zhì)。就此方面而言，本發(fā)明提供每單位時(shí)間每單位面積或空間獲得最大量植物材料生長的參數(shù)或輸入的識(shí)別方法。
定義對(duì)后文書面說明使用的特定術(shù)語提出下列各項(xiàng)定義。
如說明書及權(quán)利要求使用，單數(shù)形的「一」以及「該」除非于上下文中明白指示否則也包括復(fù)數(shù)形。例如「一個(gè)細(xì)胞」一詞包括多個(gè)細(xì)胞也包括其混合物。「一種蛋白質(zhì)」一詞包括多種蛋白質(zhì)。
「擬南芥屬」一詞用于此處表示完整植株或其各部分。本術(shù)語包括但非限制完整植株、植物細(xì)胞、植物器官、植物種子、原生質(zhì)體、胼胝體、細(xì)胞培養(yǎng)以及任何一組植物細(xì)胞組織成為結(jié)構(gòu)單元及/或功能單元。本術(shù)語結(jié)合或未結(jié)合任何特定類型的上列植物組織或本定義包含其它植物組織絕非意圖排除任何其它類型的植物組織。
「植物細(xì)胞」一詞用于此處包括于植物組織的植物細(xì)胞或植物組織以及培養(yǎng)中的植物細(xì)胞及原生質(zhì)體、或分離或半分離細(xì)胞?！钢参锝M織」包括經(jīng)過分化以及未經(jīng)分化的植物組織，包括但非限于根、莖、葉、花粉、種子、腫瘤組織以及多種其它類型的培養(yǎng)細(xì)胞例如單細(xì)胞、原生質(zhì)體、胚細(xì)胞及胼胝體組織。植物組織可于植物體、或于器官、組織或細(xì)胞培養(yǎng)。
用于此處「植物材料」包括經(jīng)過處理后的衍生物，包括但非限于食品、食物、食物補(bǔ)充物、萃取物、濃縮物、丸劑、口含錠、咀嚼組合物、散劑、調(diào)配劑、糖漿劑、糖果劑、圓錠劑、膠囊劑及錠劑。
「篩選」一詞通常表示識(shí)別具有已經(jīng)被轉(zhuǎn)化于植物的重組基因表達(dá)的細(xì)胞。通常篩選系用來選擇經(jīng)過成功地轉(zhuǎn)化的種子(例如轉(zhuǎn)基因種子)用于進(jìn)一步栽培以及生成植物(換言之，制造轉(zhuǎn)基因植物)。如下所述，為了改良識(shí)別轉(zhuǎn)化株的能力，可能需要采用可選擇或可篩選標(biāo)記基因作為感興趣的重組基因，或除了感興趣的重組基因的外采用可選擇或可篩選的標(biāo)記基因。此種情況下，通常系經(jīng)由將細(xì)胞、種子、植物或幼苗暴露于選定的作用劑而檢定分析可能已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的細(xì)胞、種子或植株；或可對(duì)植物的細(xì)胞、種子植株或組織篩選預(yù)定標(biāo)記基因。例如轉(zhuǎn)基因細(xì)胞、種子或植物可于選定條件下篩選，例如將種子或幼苗于含有選定作用劑例如抗生素(潮霉素、卡那霉素、巴龍霉素或巴斯塔(BASTA))的培養(yǎng)基生長種子或幼苗，成功轉(zhuǎn)化的植物已經(jīng)使用對(duì)此種選定作用劑有抗性的編碼基因轉(zhuǎn)化。
用于此處「多亞單位蛋白質(zhì)」為含有多于一種分開多肽或蛋白質(zhì)鏈彼此關(guān)聯(lián)而形成單一球狀蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)，此處至少兩種分開多肽系由不同基因所編碼。一較佳方面，多亞單位蛋白質(zhì)包含至少抗體的免疫活性部分，如此可特別與抗原組合。例如多亞單位蛋白質(zhì)包含抗體分子的重鏈及輕鏈或其部分。多重抗原組合蛋白質(zhì)也可由不同結(jié)構(gòu)基因編碼來產(chǎn)生多價(jià)抗體。
以醫(yī)藥制品為例，「實(shí)質(zhì)純質(zhì)」一詞通常表示該產(chǎn)品為至少97％，更好至少99％，又更好至少99.99％純質(zhì)。
「間質(zhì)流體」一詞表示得自植物未由質(zhì)膜(亦即細(xì)胞表面細(xì)胞膜)覆蓋的全部區(qū)域所得的萃取物。該術(shù)語包括植物的非屬于細(xì)胞內(nèi)的全部流體、材料、區(qū)域或空間(其中細(xì)胞內(nèi)定義為細(xì)胞內(nèi)部的同義詞)，包括通過此項(xiàng)處理未經(jīng)顯著細(xì)胞溶解而可由質(zhì)膜釋放出的分子。本術(shù)語的同義詞為外質(zhì)、或漿質(zhì)、或胞間流體、或胞外流體。
「啟動(dòng)子」一詞表示指示開始轉(zhuǎn)錄且位于結(jié)構(gòu)基因5′端的核苷酸序列。通常需要啟動(dòng)子(但非經(jīng)常性足夠)驅(qū)動(dòng)下游基因的表達(dá)。于非同源啟動(dòng)子/結(jié)構(gòu)基因組合的組成中，結(jié)構(gòu)基因系位于啟動(dòng)子的調(diào)節(jié)控制之下，故結(jié)構(gòu)基因的表達(dá)系受啟動(dòng)子序列控制。啟動(dòng)子偏好位于結(jié)構(gòu)基因上游，啟動(dòng)子距離轉(zhuǎn)錄起點(diǎn)位置的距離約略等于啟動(dòng)子與其于天然設(shè)計(jì)中距離其控制的基因間的距離。如業(yè)界已知，可忍受此種距離有些變化而未尚失啟動(dòng)子功能。用于此處「以可操作方式連接」一詞表示啟動(dòng)子連結(jié)至編碼區(qū)的連結(jié)方式讓該編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄系由該啟動(dòng)子所控制及調(diào)節(jié)。以可操作方式連接啟動(dòng)子至編碼區(qū)的手段為業(yè)界眾所周知。
「重組基因」或「重組核酸」為欲轉(zhuǎn)化植物的外生性或非天然存在的基因/核酸。此種外來序列包括病毒、原核生物及真核生物序列。原核生物序列包括但非限于微生物序列(例如用于制造抗原，抗原可作為疫苗使用；病毒序列也可用于此項(xiàng)目的)。真核生物序列包括哺乳類序列，也包括得自非哺乳類甚至其它植物的序列。于一較佳方面，重組基因/核酸編碼人類蛋白質(zhì)?！钢亟M基因」或「重組核酸」可為天然出現(xiàn)、化學(xué)合成、cDNA、突變、或任何這些序列的組合。
「融合蛋白質(zhì)」為一種含有至少兩種不同胺基酸序列連接于一多肽的蛋白質(zhì)，此處該等胺基酸序列未天然表達(dá)成單一蛋白質(zhì)。
用于此處「效應(yīng)物分子」表示胺基酸序列例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，且包括但非限于調(diào)節(jié)因子、酶、抗體、毒素等。由效應(yīng)物分子產(chǎn)生的期望效應(yīng)的非限制例包括，但非限于細(xì)胞增殖或細(xì)胞死亡、引發(fā)免疫反應(yīng)、或作為診斷目的的檢測(cè)分子(例如融合物可編碼螢光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。
用于此處「減低糖基化」表示比野生型種系擬南芥屬的糖基化程度至少低10％的糖基化。
用于此處「經(jīng)培養(yǎng)」或「培養(yǎng)」表示由種子生長至產(chǎn)生葉的擬南芥屬。
用于此處「診斷性蛋白質(zhì)」或「診斷試劑」表示一種蛋白質(zhì)或多肽，其與生物分子的反應(yīng)可用來診斷該生物分子是否存在。用于此處「與生物分子的反應(yīng)」表示結(jié)合至生物分子、生物分子的催化、裂解或修改。一方面，診斷性蛋白質(zhì)或試劑經(jīng)直接或間接加標(biāo)記，讓其與生物分子的反應(yīng)產(chǎn)生可測(cè)量的響應(yīng)。根據(jù)本發(fā)明的診斷性蛋白質(zhì)/試劑例如為抗體或其抗原結(jié)合片段?？贵w可為雙鏈或單鏈。若為雙鏈抗體，則抗體鏈可編碼于分開的順反子、或編碼作為多順反子單元之一部份。
用于此處「效應(yīng)物分子」表示胺基酸序列例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，且包括但非限于調(diào)節(jié)因子、酶、抗體、毒素等。由效應(yīng)物分子產(chǎn)生的期望效應(yīng)的非限制例包括，但非限于細(xì)胞增殖或細(xì)胞死亡、引發(fā)免疫反應(yīng)、或作為診斷目的的檢測(cè)分子(例如融合物編碼螢光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。
用于此處「生物物質(zhì)」表示由生長區(qū)段亦即生長隔間的特定區(qū)域分離的全部擬南芥屬活存組織。較好此種生物物質(zhì)為種子以外的定量組織。
擬南芥屬種系擬南芥屬種系可由商業(yè)上購得，且例如可得自雷爾(Lehle)種子公司(sales@arabidopsis.com)以及各個(gè)儲(chǔ)存中心例如擬南芥屬生物研究中心(ABRC)(俄亥俄州立大學(xué)，美國俄亥俄州43210哥倫比亞尼爾大道1735號(hào)植物與動(dòng)物學(xué)系大樓309室)、諾汀罕(Nottingham)擬南芥屬儲(chǔ)存中心(英國LE12 5RD，勞伯洛，撒坦伯尼頓(Sutton Bonnington)校園諾汀罕大學(xué)生物科學(xué)植物科學(xué)分部)。一方面使用野生型種系作為后述基因構(gòu)建體的宿主背景(例如參考http//www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/wildtypes/lwl.html)。這些種系可含或未含標(biāo)記使用來輔助選出轉(zhuǎn)基因種系。
擬南芥屬突變株制造其它形式蛋白質(zhì)產(chǎn)物由于有多種擬南芥屬突變種系，因此也可取得且使用于特定路徑上有缺陷的擬南芥屬種系，結(jié)果制造出其它形式蛋白質(zhì)。由于擬南芥屬的基因體已經(jīng)完全測(cè)序，故可識(shí)別、分離、或于特定基因及路徑形成突變來達(dá)成期望效果。既有較佳突變株例如包括cg1及mur突變株，其具有較低度翻譯后蛋白質(zhì)糖基化程度。這些種系經(jīng)由免除植物特異性蛋白質(zhì)糖基化作用，有助于制造某種類型的蛋白質(zhì)(亦即人類抗體或人類糖蛋白)。
目前未知糖化作用于植物制造生物物質(zhì)的功效、安全性以及使用上扮演何種角色。內(nèi)生植物糖蛋白以及于轉(zhuǎn)基因植物表達(dá)的重組蛋白質(zhì)的糖化模式上高度不一致。此種不一致情況可能受到植物生長階段影響，以及受到特定生長條件例如溫度和光影響。因此于本發(fā)明之一方面cg1、mur1及mur4突變種系用于形成轉(zhuǎn)基因植物用來制造蛋白質(zhì)，特別系用作為治療劑。另一方面，將可編碼人類糖基轉(zhuǎn)移酶的基因引進(jìn)背景種系，用來制造更多人類植物宿主系統(tǒng)。例如參考WO 0,034,490所述。
其它期望種系可使用標(biāo)準(zhǔn)突變發(fā)生技術(shù)產(chǎn)生。此外，經(jīng)過突變發(fā)生的種子可由商業(yè)來源獲得，例如得自雷爾種子公司(http//www.arabidopsis.com/main/cat/seeds/M2/EMS/12e.html)。
表達(dá)暗盒本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例中，野生型或突變種或經(jīng)過修改的擬南芥屬變種經(jīng)過基因工程處理而表達(dá)感興趣的基因。此種構(gòu)建體至少包含一種編碼預(yù)定蛋白質(zhì)的核酸序列，以可操作方式連接至啟動(dòng)子及/或其它調(diào)節(jié)元件，來輔助基因的轉(zhuǎn)錄以及最終輔助蛋白質(zhì)的翻譯。
一方面，基因構(gòu)建體經(jīng)過基因工程處理，而于5′至3′方向帶有啟動(dòng)子、基因及終止子。另一方面，基因構(gòu)建體包含多個(gè)編碼區(qū)連接于一個(gè)共通質(zhì)體上，或共同轉(zhuǎn)化入植物(此種共同轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體合并包含于此處使用的「基因構(gòu)建體」一詞的范圍)。多數(shù)基因可編碼為分離順反子、或編碼作為多順反子單元的一部份。另一方面，基因構(gòu)建體包含一或多個(gè)IRES元件。
蛋白質(zhì)對(duì)于欲藉本發(fā)明制造的蛋白質(zhì)并無預(yù)設(shè)限制，但某些類別蛋白質(zhì)特別相關(guān)，需要于經(jīng)過調(diào)節(jié)且可再現(xiàn)的條件下制造產(chǎn)品。特別包括于實(shí)驗(yàn)過程需要采用優(yōu)良實(shí)驗(yàn)室規(guī)范及有效方法的各類醫(yī)藥及/或診斷用蛋白質(zhì)。
也可表達(dá)用于營養(yǎng)品及化妝品使用的蛋白質(zhì)，原因在于這些產(chǎn)品系供人體直接攝食、注射或施用(例如局部投藥)。也可表達(dá)可用于制造同樣經(jīng)過調(diào)節(jié)的獸醫(yī)用蛋白質(zhì)產(chǎn)品。但通常后述方法及轉(zhuǎn)基因植物及植物細(xì)胞可用于任何類型的大量蛋白質(zhì)制造，無論是否經(jīng)調(diào)節(jié)且無論是否預(yù)期供人類或動(dòng)物消費(fèi)使用、或供治療或診斷用皆可。
可制造的范例蛋白質(zhì)包括但非限于生長因子(例如胰島素類生長因子I)、受體、配體、發(fā)訊分子；激酶、腫瘤抑制劑、凝血蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、端粒酶、代謝性蛋白質(zhì)、神經(jīng)元蛋白質(zhì)、心臟蛋白質(zhì)、特定疾病狀態(tài)缺乏的蛋白質(zhì)、抗體、抗原例如(口服抗原)、提供疾病抵抗力的蛋白質(zhì)、抗微生物蛋白質(zhì)、人類血清白蛋白(例如人類血清白蛋白)、干擾素及細(xì)胞因子。
植物也可使用一或多種基因轉(zhuǎn)化來再現(xiàn)化學(xué)合成或其它產(chǎn)業(yè)制程的酶路徑。
另一方面，擬南芥屬以一或多種基因轉(zhuǎn)化來提高該種植物用作為大規(guī)模制造蛋白質(zhì)的來源植物。此種基因包括讓擬南芥屬對(duì)疾病及昆蟲有抗性的基因、及/或編碼蛋白質(zhì)而該蛋白質(zhì)具有抗霉菌、抗細(xì)菌或抗病毒活性的基因。
一方面，選擇可編碼預(yù)定蛋白質(zhì)的核酸序列，其中核酸序列系設(shè)計(jì)成可提供擬南芥屬所偏好的密碼子。擬南芥屬使用的密碼子特征述于Wada等人，「由基因存庫基因序列資料列表的密碼子用途」，核酸研究19(補(bǔ)遺)1981至1986(1991)(舉例)。
如下所述，一方面本發(fā)明提供一種表達(dá)多種重組蛋白質(zhì)的方法。此種蛋白質(zhì)可于個(gè)別獨(dú)立的構(gòu)建體共同轉(zhuǎn)化時(shí)表達(dá)，或可由后述的多順反子表達(dá)單元表達(dá)。此種蛋白質(zhì)包括于其天然狀態(tài)需要多個(gè)結(jié)構(gòu)基因協(xié)力表達(dá)才能變成具有生物活性的蛋白質(zhì)。一方面，蛋白質(zhì)需要多個(gè)亞單位的組裝才能變成具有活性。另一方面，蛋白質(zhì)系以不成熟形式制造，需要藉一或多種其它蛋白質(zhì)之處理例如蛋白質(zhì)的裂解或修改(例如磷酸化、糖基化、核糖基化、乙?；?、法尼基化(farnesylation)等)才能變成具有活性。
這些蛋白質(zhì)的非限制性實(shí)例包括非同質(zhì)二聚體或非同質(zhì)多聚體蛋白質(zhì)例如T細(xì)胞受體、MHC分子、免疫球蛋白家族的蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)(例如復(fù)制因子、轉(zhuǎn)錄因子等)、酶、抗體酶(abzymes)、受體(特別可溶性受體)、生長因子、細(xì)胞膜蛋白質(zhì)、分化因子、血紅素類蛋白質(zhì)、多聚體激酶等。
本發(fā)明的較佳方面，表達(dá)暗盒可編碼人類蛋白質(zhì)。
于特佳方面，表達(dá)暗盒可編碼一或多種單株抗體基因。此種基因可得自鼠、人或其它動(dòng)物來源。另外，此種單株抗體基因可為合成，例如編碼抗體分子的重鏈或輕鏈組成元件的基因嵌合體形式或修改形式。編碼區(qū)于構(gòu)建體的順序亦即重鏈及輕鏈或輕鏈然后重鏈并不重要。編碼重及輕多肽(例如可變重多肽及可變輕多肽)的基因可衍生自可制造IgA、IgD、IgE、IgG或IgM的細(xì)胞。制造基因體DNA片段的方法而由該基因體DNA可克隆免疫球蛋白可變區(qū)基因，此種方法為業(yè)界眾所周知。例如參考Herrmann等人，酶學(xué)方法，152180-183(1987)；Frischauf，酶學(xué)方法，152183-190(1987)；Frischauf，酶學(xué)方法，152199-212(1987)。較佳具體實(shí)施例中，例如后述，這些基因被編碼為多順反子單元之一部份。
基因也可編碼融合蛋白質(zhì)。例如結(jié)構(gòu)基因可包含編碼效應(yīng)物多肽的序列。用于此處「效應(yīng)物分子」表示胺基酸序列例如蛋白質(zhì)、多肽或肽，且包括但非限于調(diào)節(jié)因子、酶、抗體、毒素等。由效應(yīng)物分子產(chǎn)生的期望效應(yīng)的非限制例包括但非限于細(xì)胞增殖或細(xì)胞死亡、引發(fā)免疫反應(yīng)、或作為診斷目的的檢測(cè)分子(例如融合物編碼螢光多肽如GFP、EGFP、BFP、YFP、EBFP等)。又另一方面，蛋白質(zhì)包括胺基酸序列其可提高蛋白質(zhì)安定性，或可增加蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。例如蛋白質(zhì)可融合至轉(zhuǎn)錄活化劑，該轉(zhuǎn)錄活化劑可活化由該基因以可操作方式連接的啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄(例如參考Schwechheimer等人，功能整合基因體1(1)35-43(2000))。
調(diào)節(jié)元件可基于欲表達(dá)的重組蛋白質(zhì)類型選擇可產(chǎn)生特定構(gòu)建體的適當(dāng)調(diào)節(jié)元件。通常需要于全部或大部分20-40日齡擬南芥屬植株的植物組織高度表達(dá)能力。
植物啟動(dòng)子使用的構(gòu)建體包括全部遺傳物質(zhì)以及例如啟動(dòng)子、IRES元件等。這些表達(dá)暗盒需要若干外部刺激來誘發(fā)表達(dá)，例如添加特定營養(yǎng)素或化學(xué)劑、改變溫度等，或可設(shè)計(jì)成可于生長期間瞬間及/或自發(fā)表達(dá)所編碼的蛋白質(zhì)。
如此，編碼所需蛋白質(zhì)的基因的表達(dá)可由組成啟動(dòng)子或經(jīng)過調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子加以控制。經(jīng)過調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可為組織特異性、經(jīng)過發(fā)育調(diào)節(jié)、或以其它方式經(jīng)過誘導(dǎo)或壓制，但必須于植物細(xì)胞有功能。調(diào)節(jié)可基于時(shí)間、空間或發(fā)育線索、可由環(huán)境發(fā)訊、或利用化學(xué)誘導(dǎo)劑或壓制劑控制，這些作用劑可屬于天然或合成來源，啟動(dòng)子可屬于天然來源或經(jīng)過基因工程處理。啟動(dòng)子也可為嵌合體。換言之，使用來自兩種或多種不同的天然或合成啟動(dòng)子的序列元件衍生而得。
較好用于構(gòu)建體的啟動(dòng)子可獲得基因的高度表達(dá)，允許基因蓄積至占總可溶性蛋白質(zhì)的至少約0.1至1％，至少約1至5％及更好至少約5％；及/或獲得至少約0.1％，較好至少約0.5％及最好至少約1％的總胞間流體(ICF)可萃取蛋白質(zhì)。
啟動(dòng)子偏好允許于全部植物組織表達(dá)，但最好于全部葉、莖及根組織表達(dá)。此外或另外啟動(dòng)子允許于花及/或種子組織表達(dá)。本發(fā)明中，以擬南芥屬肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子、OCS(MAS)啟動(dòng)子及其變化形式、CaMV35S以及玄蔘嵌紋病毒34S啟動(dòng)子為較佳。但也可使用其它組成性啟動(dòng)子。例如泛素啟動(dòng)子也曾經(jīng)由多種種屬轉(zhuǎn)殖而用于轉(zhuǎn)基因植物(例如向日葵(Binet等人，植物科學(xué)7987至94(1991)；及玉米(Christensen等人，植物分子生物學(xué)，12，619至632(1989))。進(jìn)一步有用的啟動(dòng)子為得自玉米的U2及U5 snRNA啟動(dòng)子(Brown等人，核酸研究，17，8991(1989))以及得自酒精去氫酶的啟動(dòng)子(Dennis等人，核酸研究，12，3983(1984))。
另一方面，經(jīng)過調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子系以可操作方式連接至該基因。經(jīng)過調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子包括，但非限于受到外部影響而調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子(例如藉施用外部作用劑例如化學(xué)、光、溫度等)，或受到內(nèi)因性調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子，例如植物體經(jīng)過調(diào)節(jié)的發(fā)育變化。經(jīng)調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子可用于特別于或接近于收獲時(shí)間，誘發(fā)期望基因的高度表達(dá)。如此特別可用于該期望基因限制或以其它方式約束植物的生長，或以某種方式而變成不穩(wěn)定的案例。
藉某些方法控制轉(zhuǎn)基因于不同植物組織的表達(dá)的植物啟動(dòng)子為熟暗技藝人士已知(Gasser & Fraley，科學(xué)2441293-99(1989))?；ㄒ饲都y病毒35S啟動(dòng)子(CaMV)以及經(jīng)過提升的CaMv啟動(dòng)子衍生物(Odell等人，自然，3(13)810(1985))、肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(McElroy等人，植物細(xì)胞2163-71(1990))、AdHI啟動(dòng)子(Fromm等人，生物/技術(shù)8833-39(1990)，Kyozuka等人，分子基因遺傳學(xué)22840-48(1991))、泛素啟動(dòng)子、玄蔘嵌紋病毒啟動(dòng)子、曼諾平(mannopine)合成酶啟動(dòng)子、諾帕林(nopaline)合成酶啟動(dòng)子及歐托平(octopine)合成酶啟動(dòng)子及其衍生物被視為組成性啟動(dòng)子。將經(jīng)過調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子描述為光可誘變(核酮糖二磷酸羧基酶啟動(dòng)子小型亞單元)、熱震啟動(dòng)子、硝酸鹽以及其它化學(xué)可誘變的啟動(dòng)子(例如參考美國專利第5,364,780及5,777,200號(hào))。
當(dāng)需要于植物的特定部分表達(dá)的蛋白質(zhì)時(shí)可使用組織特異性啟動(dòng)子。葉特異性啟動(dòng)子包括前方由35S促進(jìn)基因的C4PPDK啟動(dòng)子(Sheen，15EMBO，123497-505(1993))或任何其它于葉部表達(dá)的特異性啟動(dòng)子。用于于種子表達(dá)的蛋白質(zhì)，可使用納平(napin)基因啟動(dòng)子(美國專利第5,420,034及5,608,152號(hào))、乙酰-CoA羧基酶啟動(dòng)子(美國專利第5,420,034及5,608,152號(hào))、2S白蛋白啟動(dòng)子、種子儲(chǔ)存蛋白質(zhì)啟動(dòng)子、菜豆素(phaseolin)啟動(dòng)子(Slightom等人，Proc.Natl.Acad Sci.USA801897-1901(1983))、油素(oleosin)啟動(dòng)子(Plant等人，植物分子生物學(xué)25193-205(1994)；Rowley等人，1997，Biochim.Biophys.Acta.13451-4(1997)；美國專利第5,650,554號(hào)；PCT WO 93/20216)、玉米蛋白啟動(dòng)子、麩蛋白啟動(dòng)子、淀粉合成酶啟動(dòng)子、以及淀粉歧化酶啟動(dòng)子。
通常任一種植物可表達(dá)的基因構(gòu)建體皆可用于本發(fā)明方法。考慮表達(dá)的重組蛋白質(zhì)類型而選用特殊啟動(dòng)子。
也可提供其它調(diào)節(jié)元件例如促進(jìn)基因序列。例如一方面，使用含有得自花椰菜嵌紋病毒(CaMV)35S基因的多元件轉(zhuǎn)錄促進(jìn)基因。例如參考Weigel等人，植物生理122(4)1003-13(2000)。
IRES元件一般認(rèn)為編碼產(chǎn)物的DNA基本功能節(jié)段，包括啟動(dòng)子接著為蛋白質(zhì)編碼區(qū)然后為終止子。此種基本上單一順反子(也稱作「一順反子」)格式成為于任何有機(jī)體表達(dá)基因的標(biāo)準(zhǔn)。根據(jù)核糖體掃描模式，亦即大部分真核生物mRNA傳統(tǒng)采用的核糖體掃描模式，40S核糖體亞單元結(jié)合至5′-帽，順著未經(jīng)翻譯的5′序列移動(dòng)至其到達(dá)AUG密碼子(Kozak Adv.Virus Res.31229-292(1986)；Kozak J.Mol.Biol.108229-241(1989))。雖然對(duì)大部分真核生物mRNA而言，只有第一個(gè)開放閱讀框(ORF)具有翻譯活性，但有也不同機(jī)制，藉該機(jī)制mRNA可發(fā)揮多順反子功能(Kozak Adv.Virus Res.31229-292(1986))，因此可表達(dá)多數(shù)編碼區(qū)，而個(gè)別未由分開啟動(dòng)子所控制。
如此于本發(fā)明的一方面，提供使用IRES技術(shù)做翻譯調(diào)節(jié)的表達(dá)暗盒。如此本發(fā)明并非限于對(duì)各編碼區(qū)仰賴使用啟動(dòng)子的基因構(gòu)建體。
IRES元件可為前述元件之一(Atebekov等人，WO 98/54342)或?yàn)槿嗽霫RES，其于植物細(xì)胞具有活性。至于含多數(shù)IRES構(gòu)建體，可使用有不同DNA序列的IRES元件。晚近由藥菜(Oleracia officinalis L.)植物已經(jīng)分離一種新穎托巴摩病毒(tobamovirus)，crTMV，crTMV的基因體已經(jīng)測(cè)序(6312核苷酸)(Dorokhov等人，332Doklady，蘇聯(lián)科學(xué)院518-22(1993)；Dorokhov等人，350FEBS Lett.5-8(1994))。
不似典型托巴摩病毒的RNA，crTMV RNA的3′-近端CP基因的翻譯于試管內(nèi)以及于植物體內(nèi)系由一種內(nèi)部核糖體進(jìn)入機(jī)制進(jìn)行，內(nèi)部核糖體進(jìn)入機(jī)制系由特測(cè)序列元件IRESCP所媒介(Ivanov等人，病毒學(xué)232，32至43(1997))。結(jié)果指出crTMV RNA的CP基因上游148核苷酸區(qū)含有于試管內(nèi)以及活體內(nèi)(原生質(zhì)體以及轉(zhuǎn)基因植物)激活內(nèi)部引發(fā)翻譯的IRESCP。
晚近也顯示(Skulachev等人，病毒學(xué)263139-154(1999))托巴摩病毒的基因體RNAs含有MP基因上游序列，該序列可于試管試驗(yàn)中以帽-非相依性方式，激活由以可操作方式連接至該序列的嵌合體mRNAs進(jìn)行3′-近端基因表達(dá)。crTMV RNA的MP基因(IRESMP228CR)上游228核苷酸序列媒介由雙順反子轉(zhuǎn)錄的3′-近端GUS基因的翻譯。crTMVRNA的MP基因上游的75-核苷酸區(qū)仍然可有效作為228-核苷酸序列。因此75-核苷酸序列含有IRESMP元件(IRESMP75CR)。發(fā)現(xiàn)類似crTMVRNA，托巴摩病毒族群之一種型成員(TMV UI)的基因體RNA上游75-核苷酸序列也含有IRESMP75UI元件，該元件可調(diào)節(jié)3′-近端基因的帽-非相依性翻譯。
托巴摩病毒提供內(nèi)部引發(fā)翻譯的新范例，本范例系于對(duì)小RNA病毒以及其它病毒性及真核生物mRNA所示的IRES顯然不同。可調(diào)節(jié)帽-非相依性翻譯的IRESMP元件不僅含于crTMV RNA，同時(shí)也含于托巴摩病毒族群中一種型成員的基因體TMV UI；以及另一種托巴摩病毒、黃瓜綠斑駁斑紋病毒的基因體。結(jié)果托巴摩病毒族群的不同成員皆含有IRESMP。
如此本發(fā)明也包括使用IRESes及/或啟動(dòng)子的任一種組合，基于多順反子基因構(gòu)建體的表達(dá)而制造蛋白質(zhì)。
舉例言的兩種特定IRES元件用于證實(shí)本發(fā)明。得自十字花科煙草斑紋病毒(crTMV)基因體的兩種IRESes的核苷酸序列IRESmp75cr
5′TTCGTTTGCTTTTTGTAGTATAATTAAATATTTGTCAGATAAGAGATTGTTTAGAGATTTGTTCTTTGTTTGATA3′(序列ID編號(hào)1)IREScp148cr5′GAATTCGTCGATTCGGTTGCAGCATTTAAAGCGGTTGACAACTTTAAAAGAAGGAAAAAGAAGGTTGAAGAAAAGGGTGTAGTAAGTAAGTATAAGTACAGACCGGAGAAGTACGCCGGTCCTGATTCGTTTAATTTGAAAGAAGAAA3′(序列ID編號(hào)2)如此本發(fā)明的一方面系有關(guān)一種重組核酸分子其含有5′至3′轉(zhuǎn)錄起始因子以及多個(gè)結(jié)構(gòu)基因，其個(gè)別由一個(gè)內(nèi)部核糖體結(jié)合序列(IRES)分開。
包含IRES元件的構(gòu)建體進(jìn)一步述于PCT/US02/17927，申請(qǐng)日2002年6月7日，該案以引用方式并入此處。
靶序列較佳具體實(shí)施例中，表達(dá)產(chǎn)物對(duì)靶向植物細(xì)胞的特定位置，例如細(xì)胞膜、胞外空間或細(xì)胞小器官，例如色素體例如葉綠體。較佳具體實(shí)施例中，表達(dá)產(chǎn)物系靶向胞外空間，如此可基于胞內(nèi)流體的分離做純化。例如參考專利案第6,096,546號(hào)，美國專利案第6,284,875號(hào)及WO 0,009,725。
蛋白質(zhì)通過靶序列的功效而可靶向特定細(xì)胞以下或胞外所在位置。某些情況下，胺基酸序列被合成為多肽的胺基端基部分，以及于轉(zhuǎn)位或局限化過程后或過程中藉蛋白酶裂解。例如于真核生物的蛋白的分泌路徑模式為于核糖體結(jié)合至mRNA且翻譯起始后，出現(xiàn)新生多肽鏈。若該多肽鏈為預(yù)定分泌的蛋白質(zhì)，則出現(xiàn)的蛋白質(zhì)胺基端可由信號(hào)辨識(shí)粒子辨識(shí)(SRP)，SRP帶來翻譯的暫時(shí)拖延翻譯，同時(shí)mRNA、核糖體及SRP復(fù)體?？坑趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)。于?？恐螅謴?fù)翻譯，但現(xiàn)在多肽鏈系以共同翻譯方式轉(zhuǎn)位至ER管腔。
也可能蛋白質(zhì)于翻譯后轉(zhuǎn)位；但此種過程于活體內(nèi)遠(yuǎn)較為無效，通常不被考慮為進(jìn)入ER的正常途徑。蛋白質(zhì)靶向內(nèi)膜系統(tǒng)用來局限于空泡內(nèi)或用來分泌的信號(hào)序列于動(dòng)物體及植物體類似。信號(hào)肽可根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)調(diào)整用于本發(fā)明(例如制備適當(dāng)末端用于與任何其它基因做架構(gòu)內(nèi)克隆)。
一方面，編碼所需蛋白質(zhì)的表達(dá)暗盒包含于架構(gòu)內(nèi)融合至編碼預(yù)定蛋白質(zhì)序列的信號(hào)序列。于較佳方面，信號(hào)序列為可指示基因表達(dá)產(chǎn)物至分泌路徑的序列。
由于抗體通常為分泌蛋白質(zhì)，故分泌過程于成熟抗體分子的制造中扮演重要角色。為了于植物體達(dá)成此項(xiàng)目的，基因經(jīng)合成例如(克隆)而具有其天然哺乳類信號(hào)肽編碼區(qū)，或呈融合基因，其中植物分泌信號(hào)肽經(jīng)取代。信號(hào)肽與蛋白質(zhì)間的融合須為藉植物處理時(shí)，結(jié)果所得蛋白質(zhì)的胺基終端系與人類宿主產(chǎn)生的胺基終端完全相同。
于較佳具體實(shí)施例中，使用得自鈣網(wǎng)素(calreticulin)蛋白質(zhì)的分泌目標(biāo)信號(hào)。已經(jīng)證實(shí)此種植物信號(hào)肽可有效將外來蛋白質(zhì)靶向植物的胞質(zhì)外空間(例如參考Borisjuk等人，17自然生物技術(shù)466-69(1999))。也可使用其它植物蛋白質(zhì)信號(hào)肽，例如對(duì)大麥所述(a-淀粉酶During等人15植物分子生物學(xué)287-93(1990)；Schillberg等人8轉(zhuǎn)基因研究255-63(1999))。
對(duì)于通常需要胺基端處理才能達(dá)成成熟形式蛋白質(zhì)，將蛋白質(zhì)靶向植物內(nèi)膜系統(tǒng)屬于本發(fā)明的較佳具體實(shí)施例，原因在于如此提供蛋白質(zhì)胺基端的適當(dāng)成熟。進(jìn)一步若感興趣的蛋白質(zhì)具有或被基因工程處理而含有額外靶信息，則可達(dá)成局限于內(nèi)膜系統(tǒng)特定區(qū)(例如述于Voss等人，1分子育種39-50(1995)；During等人，15植物分子生物學(xué)281-93(1990)；Baum等人，9分子植物微生物交互作用，382-87(1996)；DeWilde等人，114植物科學(xué)，231-41(1996)；Ma等人，24歐洲免疫學(xué)期刊131-38(1994)；Schouten等人，30植物分子生物學(xué)781-93(1996)；Firek等人，23植物分子生物學(xué)，861-70(1993)；Artsaenko等人，8植物期刊745-50(1995)；Conrad & Fiedler 38植物分子生物學(xué)101-09(1998))。
靶向小器官例如色素體(例如葉綠體及粒線體)也可有利地達(dá)成預(yù)定胺基端的成熟，原因在于靶向這些位置系依據(jù)胺基端信號(hào)序列的指令，該指令隨后進(jìn)行裂解。較佳具體實(shí)施例中，信號(hào)肽指示表達(dá)產(chǎn)物至色素體(例如葉綠體)或其它次細(xì)胞小器官。例如苜蓿核酮糖-二磷酸羧基酶的小型亞單元暫時(shí)性肽(Khoudi等人，197基因343-5(1997))。過氧化物酶體靶序列表示任何可將蛋白質(zhì)靶向過氧化物酶體的肽序列，包括N-端、內(nèi)部或C-端，例如植物C-端靶三肽SKL(Banjoko等人，107植物生理學(xué)1201-08(1995))。
其它方面，核定位信號(hào)并非天然限于蛋白質(zhì)5′端位置(胺基端)，也未藉任何已知細(xì)胞機(jī)制以蛋白質(zhì)分解方式去除。如此，由處理觀點(diǎn)視之，將蛋白質(zhì)靶向核并不合乎所需。
此外，或作為將蛋白質(zhì)靶向特定次細(xì)胞位置的替代之道，一方面增加「抗原決定簇標(biāo)記」及/或位置特異性裂解位置來形成融合蛋白質(zhì)。利用此種標(biāo)記讓其可提供方便的純化機(jī)制。例如包含由生物素結(jié)合至鏈絲菌抗生物素的關(guān)鍵胺基酸序列的小型肽可于感興趣基因5′端做基因工程處理。新合成的蛋白質(zhì)基本上可基于生物素鏈絲菌抗生物素結(jié)合而藉多種已知方法捕捉。若希望由蛋白質(zhì)去除「仿生物素肽」，則也可包括蛋白酶辨識(shí)位置。蛋白質(zhì)辨識(shí)位置可插入「抗原決定簇標(biāo)記」序列之下游，且恰位在編碼預(yù)定蛋白質(zhì)成熟形式的序列的前方。熟諳技藝人士了解對(duì)抗原決定簇及蛋白酶(例如因子Xa、煙草蝕刻病毒蛋白酶、腸激酶等)有多種選擇，較佳位置及蛋白酶的選擇系依據(jù)該特定蛋白質(zhì)胺基酸及DNA序列決定。
如前述，調(diào)節(jié)元件例如啟動(dòng)子、促進(jìn)基因、IRES元件及信號(hào)序列的選擇通常系依據(jù)欲表達(dá)的蛋白質(zhì)類型而定。例如于一方面，若干用于制造IgG目的的較佳構(gòu)建體包括構(gòu)建體，該構(gòu)建體具有5′擬南芥屬肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子鈣網(wǎng)素(任何植物)信號(hào)肽IgG重鏈基因成熟部分編碼區(qū)翻譯中止信號(hào)IRES(mp75 cp148)BAR轉(zhuǎn)錄中止及腺苷化序列；以及第二構(gòu)建體(含有類似前述元件)，但以輕鏈基因置換重鏈基因，以及以另一選擇/篩選標(biāo)記例如GFP置換BAR基因。另外，于另一較佳具體實(shí)施例中，重鏈基因及輕鏈基因可位于同一DNA構(gòu)建體上。
載體通常，適當(dāng)表達(dá)載體可為任一種已知可用于轉(zhuǎn)化植物的載體系統(tǒng)。通常此種載體含有一或多個(gè)序列用以于植物細(xì)胞穩(wěn)定復(fù)制載體，此種基因可作為附加體、或作為內(nèi)生性植物染色體一部份?？商峁┯兄谡嫌谥参锶旧w的序列。就某些方面而言，需要提供由不同類型細(xì)胞復(fù)制起點(diǎn)，來輔助于一類型細(xì)胞擴(kuò)增以及于另一類型細(xì)胞作蛋白質(zhì)表達(dá)。例如雖然一般而言蛋白質(zhì)表達(dá)可于植物細(xì)胞達(dá)成，但擴(kuò)增可于原核細(xì)胞(例如細(xì)菌細(xì)胞)進(jìn)行，使獲得適量核酸用于隨后植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化。
就本發(fā)明的精髓而言，有關(guān)欲導(dǎo)入擬南芥屬植物的基因構(gòu)建體確切性質(zhì)并無特殊區(qū)別，表示任何可于擬南芥屬表達(dá)的核酸(DNA或RNA構(gòu)建體)皆適合用于本發(fā)明，包括基于病毒的表達(dá)系統(tǒng)。但因本發(fā)明之一方面系有關(guān)新穎基因轉(zhuǎn)化入擬南芥屬的速度優(yōu)勢(shì)，以及于隨后的世代提供大量種子的優(yōu)勢(shì)，故以土壤桿菌花浸漬及真空浸潤方法為導(dǎo)入基因用以穩(wěn)定整合于基因體的較佳方法，因此以適合用于此種技術(shù)的構(gòu)建體為特佳。
例如用于土壤桿菌媒介轉(zhuǎn)化，較佳載體為Ti質(zhì)體衍生載體。其它有用的適當(dāng)載體為業(yè)界已知。這些轉(zhuǎn)化植物組織及原生質(zhì)體的載體述于deFramond，A.等人，生物/技術(shù)1，263(1983)；An，G.等人，EMBO J.4，277(1985)；及Rothstein，S.J.等人，基因53，153(1987)。
也提供其它有助于位置特異性基因體的整合及/或以控制方式剪接及/或再插入基因體的序列。例如Cre/lox系統(tǒng)可用來于擬南芥屬基因體的lox位置獲得土壤桿菌T-DNA的靶整合。位置特異性重組株(而非隨機(jī)事件)偏好經(jīng)由活化無聲lox-新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(nptII)目標(biāo)基因而選擇。使用共同轉(zhuǎn)化辦法可暫時(shí)性提供Cre重組酶。例如參考Vergunst等人，植物分子生物學(xué)38(3)393-406(1998)的說明。
使用適合用于葉綠體轉(zhuǎn)化的載體。葉綠體系在真核細(xì)胞內(nèi)部的原核隔間。由于葉綠體的轉(zhuǎn)錄及翻譯機(jī)制皆類似大腸桿菌(Brixey等人，1997)，故于植物葉綠體比于植物細(xì)胞核可以極高程度表達(dá)原核基因。此外植物細(xì)胞含有多達(dá)50,000圓形色素體基因體復(fù)本(Bendich1987)，色素體基因體可類似質(zhì)體而擴(kuò)增重組基因，加強(qiáng)表達(dá)程度。葉綠體的表達(dá)比于轉(zhuǎn)基因植物的細(xì)胞核表達(dá)高100倍(Daniell，WO 99/10513)。
因此一方面，表達(dá)暗盒被克隆于葉綠體載體。較好表達(dá)暗盒包含重組基因以可操作方式連接至葉綠體啟動(dòng)子(例如16S rRNA啟動(dòng)子)。一方面，可提供可選擇標(biāo)記基因[例如胺基糖苷腺苷基轉(zhuǎn)移酶(aadA)，提供對(duì)觀霉素(spectinomycin)的抗藥性]。也可提供重組基因下游的終止子及/或可選擇標(biāo)記基因[例如得自擬南芥屬葉綠體基因體psbA 3′區(qū)的終結(jié)序列(得自編碼光系統(tǒng)II反應(yīng)中心組成分的基因的終止子)]。較好載體額外編碼擬南芥屬葉綠體基因體作為同源重組的旁出序列。
可選擇標(biāo)記及/或報(bào)道子基因可選擇標(biāo)記，例如抗生素(例如卡那霉素及潮霉素，nptII，hpt)抗性、殺草劑(古芙希納(glufosinate)、伊米達(dá)諾(imidazlinone)、葛來福塞(glyphosate)、AHAS、EPSPS)抗性或生理標(biāo)記(可目視或生物化學(xué))用來選擇以核酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。其它方面，非轉(zhuǎn)基因細(xì)胞(亦即非轉(zhuǎn)化體)則被殺死，或于選用的條件下不會(huì)生長。一方面，可選擇標(biāo)記基因?yàn)榫幋a提供抗性的蛋白質(zhì)或生理標(biāo)記基因。另一方面，可選擇標(biāo)記基因?yàn)榫幋a反義核酸的基因。
報(bào)道子基因可涵括于構(gòu)建體，或報(bào)道子基因可含于載體，而該載體最終將該構(gòu)建體轉(zhuǎn)運(yùn)至植物細(xì)胞。用于此處「報(bào)道子基因」為任何可對(duì)該基因于其中表達(dá)的細(xì)胞提供可觀察或可量測(cè)的表達(dá)型的基因。
由報(bào)道子基因的表達(dá)獲得可檢測(cè)的結(jié)果，例如可目測(cè)的比色、螢光、發(fā)光或生物化學(xué)可檢定分析產(chǎn)物；可選擇標(biāo)記允許基于生理及生長差異而選擇轉(zhuǎn)化體；或顯示可目測(cè)的生理或生化蹤跡。常用的報(bào)道子基因包括lacZ(β-半乳糖苷酶)、GUS(β-葡萄醛糖苷酶)、GFP(綠色螢光蛋白質(zhì)及其突變或修改形式)、蟲螢光素酶或CAT(氯霉素(chloramphenicol)乙酰轉(zhuǎn)移酶)該等報(bào)道子基因容易以目測(cè)觀察或可檢定分析。這些基因組合可選擇標(biāo)記或替代可選擇標(biāo)記用來容易挑選出感興趣的純株。一方面可選擇標(biāo)記基因?yàn)榫幋a蛋白質(zhì)產(chǎn)物的基因。
可選擇標(biāo)記也包括有助于分離表達(dá)該標(biāo)記細(xì)胞的基因。例如可選擇標(biāo)記可編碼抗原，該抗原可由抗體辨識(shí)出，且用來藉基于親核純化技術(shù)或藉流動(dòng)細(xì)胞計(jì)量法而分離轉(zhuǎn)化細(xì)胞。報(bào)道子基因也包含對(duì)植物細(xì)胞為外來基因的可檢測(cè)的序列(例如藉PCR檢測(cè))。本具體實(shí)施例中，報(bào)道子無需表達(dá)的蛋白質(zhì)、或于表達(dá)型中造成可目測(cè)的變化。
擬南芥屬的轉(zhuǎn)化DNA基因移轉(zhuǎn)且整合于植物宿主基因體的方法為眾所周知。以擬南芥屬真空浸潤或浸漬方法為較佳，原因在于許多植物可在小空間內(nèi)轉(zhuǎn)化，獲得大量種子用來篩選轉(zhuǎn)化體。典型地，土壤桿菌可移轉(zhuǎn)帶有特定末端(T-DNA)邊界的線性DNA片段(T-DNA)，因此使利用土壤桿菌成為較佳的方法。也可使用直接DNA轉(zhuǎn)化例如顯微注射、化學(xué)處理、或微彈射碰撞或生物彈(biolistics)較好用于葉綠體媒介的轉(zhuǎn)化。除了對(duì)重組構(gòu)建體的大小有限制的外，基因編碼序列也可使用病毒載體而輸送入植物體。經(jīng)轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞可為原生質(zhì)體、細(xì)胞培養(yǎng)、胼胝體組織、懸浮培養(yǎng)、葉、花粉或分生組織。第一階段，只需暫時(shí)性表達(dá)，換言之，表達(dá)一段時(shí)間來確定該構(gòu)建體用于產(chǎn)生隨后穩(wěn)定轉(zhuǎn)化種系的適合性。快速轉(zhuǎn)化系統(tǒng)包括，但非限于花浸漬或真空浸潤(Bechtold等人，C.R.Acad.Sci.巴黎，316生命科學(xué)1194-99(1993))；葉及幼苗浸潤(Kapila等人，122植物科學(xué)101-108(1997))，以及原生質(zhì)體電穿孔。
較佳具體實(shí)施例中，適當(dāng)基因型擬南芥屬植物可生長至開花。擬南芥屬的轉(zhuǎn)化的最方便方式系將發(fā)育中的植物組織浸漬于土壤桿菌溶液內(nèi)。此步驟進(jìn)行中可將幼苗植物(35日齡附近)于浸漬階段接觸真空或未接觸真空。于花浸漬的數(shù)周內(nèi)，擬南芥屬植物產(chǎn)生的種子可被收獲及篩檢含有感興趣基因的T1植物。例如參考Clough及Bent，植物期刊16735-43(1998)。
較佳具體實(shí)施例中，篩選方式系將種子以每平方呎約10顆或10顆以上種子的密度展開于盆裝土壤混合物(例如美徹密斯(Metromix)350)，然后以足夠殺死未轉(zhuǎn)化植物的施用率噴霧施用古芙希納或佛菲諾辛(phophinothricin)進(jìn)行篩選?？杀磉_(dá)可選擇標(biāo)記(本例為BAR)的T1轉(zhuǎn)基因植物于此種處理下形成，于施用選擇作用劑之后的1至3日內(nèi)方便識(shí)別。有其它方法及可選擇作用劑可使用，且系涵蓋于本發(fā)明的范圍，但由于此種方法簡單且產(chǎn)出量高，故以此種方法為佳。
識(shí)別最理想的構(gòu)建體T1植物生長至成熟，讓T1植物自我授粉。較佳具體實(shí)施例中進(jìn)行暫時(shí)性表達(dá)檢定分析，使識(shí)別用于特定蛋白質(zhì)表達(dá)計(jì)劃為最理想的基因構(gòu)建體。更好平行引進(jìn)一系列構(gòu)建體，用來篩選何種構(gòu)建體有適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)表達(dá)、蛋白質(zhì)修改、蛋白質(zhì)安定性及/或活性等性質(zhì)。至少有一構(gòu)建體表達(dá)野生型蛋白質(zhì)，另外有一或多個(gè)構(gòu)建體將表達(dá)隨機(jī)突變及/或合理的突變蛋白質(zhì)。
此種構(gòu)建體的表達(dá)可使用對(duì)感興趣蛋白質(zhì)有適當(dāng)敏感度的檢定分析評(píng)估，可由各種幸存的經(jīng)過轉(zhuǎn)化的T1植物取少量組織來試驗(yàn)，使證實(shí)期望產(chǎn)物的表達(dá)/活性。此種試驗(yàn)可用來識(shí)別以最高相對(duì)量表達(dá)期望蛋白質(zhì)的植物及/或該表達(dá)的蛋白質(zhì)有特定期望活性或活性程度。于較佳具體實(shí)施例，至少平行試驗(yàn)約50，至少約100，至少約250或至少約500構(gòu)建體。
另一方面，去除小量植物組織或間質(zhì)流體(例如夠大量而可獲得適當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)試樣)，將該組織/間質(zhì)流體軋碎或藉真空過濾捕捉，進(jìn)行適當(dāng)檢定分析來測(cè)量蛋白質(zhì)含量及/或活性?？蛇x用適合用于評(píng)估蛋白質(zhì)含量/活性的任一種適當(dāng)檢定分析。一具體實(shí)施例中，該檢定分析為免疫檢定分析。
例如試樣經(jīng)過離心，以及點(diǎn)墨于適當(dāng)類型的過濾膜(例如PVDF)上而結(jié)合蛋白質(zhì)。較好過濾膜經(jīng)洗滌，然后于一次及二次抗體存在下培養(yǎng)。一次抗體可辨識(shí)且結(jié)合感興趣的蛋白質(zhì)，而二次抗體可結(jié)合一次抗體。二次抗體典型系連接至堿性磷酸酶或辣根過氧化酶，因而可藉添加單純比色或螢光計(jì)量基質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)。同理于多孔板進(jìn)行ELISA檢定分析，可用來檢測(cè)一或多種感興趣的蛋白質(zhì)。此種方法通常為熟諳技藝人士已知，可視需要經(jīng)修改而適合檢測(cè)任何特定蛋白質(zhì)。
此外或另外，可進(jìn)行多種檢定分析來證實(shí)擬南芥屬的表達(dá)暗盒或「轉(zhuǎn)基因」的存在。這些檢定分析例如包括分子生物學(xué)檢定分析，如南方(southern)及北方(northern)點(diǎn)分析及PCR；生物化學(xué)檢定分析，酶功能檢定分析；電泳檢定分析；層析檢定分析；質(zhì)譜術(shù)；植物部分檢定分析，例如葉或根的檢定分析；也可藉分析全株再生植株的表達(dá)型而檢定分析。
T2及T3世代種子同樣經(jīng)過篩選來識(shí)別帶有最高制造程度且最穩(wěn)定的基因構(gòu)建體的植物種系。通常較好獲得插入基因同種接合的植物種系，可經(jīng)由獲得第二及第三世代來完成及證實(shí)屬于插入基因的同種接合植物種系?；诿系聽栠z傳學(xué)基本原理。若欲插入多于一種基因，而基因并非實(shí)體連接在一起，則可制造較多世代來篩選出于各個(gè)位置呈現(xiàn)同種接合的種系?？偠灾?，擬南芥屬由于容易產(chǎn)生后代以及產(chǎn)生后代的速度因而提供優(yōu)于典型作物的特殊優(yōu)勢(shì)。擬南芥屬只需要8至10周即可完成一個(gè)世代周期。每株擬南芥屬預(yù)期可至少產(chǎn)生200個(gè)后代種子，且更常見顯著高于此數(shù)目(例如約500顆種子)。
如此，于一具體實(shí)施例中該方法為階層式，篩選第一T1世代，識(shí)別帶有預(yù)定性質(zhì)構(gòu)建體；然后選出可表達(dá)此種構(gòu)建體的最理想T1植物，來產(chǎn)生帶有穩(wěn)定「預(yù)定表達(dá)性質(zhì)」的最理想的隨后各植物世代，換言之，穩(wěn)定的轉(zhuǎn)基因種系。暫時(shí)性檢定分析也系以階層方式進(jìn)行，換言之，首先于基于細(xì)胞的檢定分析篩選構(gòu)建體，然后篩選于T1世代于第一檢定分析識(shí)別的最理想構(gòu)建體。特佳具體實(shí)施例中，植物經(jīng)過篩選，而識(shí)別出對(duì)指定量生物物質(zhì)而言可表達(dá)出最高量蛋白質(zhì)的植物。一具體實(shí)施例中，識(shí)別可產(chǎn)生至少約50，至少約100，至少約150，及至少約200克生物物質(zhì)/平方呎培養(yǎng)植物的植物種系。
大規(guī)模制造蛋白質(zhì)一具體實(shí)施例中，多種含有至少一個(gè)基因構(gòu)建體的擬南芥屬系于可促進(jìn)營養(yǎng)體以及葉性生物物質(zhì)制造的條件下生長。簡言之，如此表示帶有強(qiáng)勁葉系統(tǒng)的健康植物，且在植物產(chǎn)生成熟種子之前收成。為了放大規(guī)模，某種族群的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物于產(chǎn)生種子的有利條件下生長使由各植物獲得至少約200克種子。然后收成擬南芥屬(種子或成熟植株)，且由收割的植物分離一或多種感興趣的蛋白質(zhì)。若制造多種重組蛋白質(zhì)，則可制造成為個(gè)別蛋白質(zhì)、或制造成多重亞單元復(fù)體。較好此種多重亞單元復(fù)體組裝后具有功能性。
根據(jù)本發(fā)明用于大規(guī)模制造的擬南芥屬種系可以已知活性程度/活性類型以及已知修改模式表達(dá)已知量的蛋白質(zhì)。同理，植物本身的生物特征為已知(例如對(duì)蛋白質(zhì)穩(wěn)定性、靶、修飾等的影響)。如此與先前技藝使用擬南芥屬的方法相反，用于大規(guī)模制造蛋白質(zhì)時(shí)，預(yù)設(shè)且預(yù)選定的擬南芥屬及表達(dá)系統(tǒng)被提供「預(yù)定表達(dá)性質(zhì)」。如此表示經(jīng)由前述暫時(shí)性表達(dá)檢定分析，已經(jīng)測(cè)定所表達(dá)的蛋白質(zhì)性質(zhì)、表達(dá)程度、于植物或植物細(xì)胞的表達(dá)點(diǎn)(葉、根、全株、胞漿體、ER、葉綠體)、較佳條件、較佳表達(dá)載體、產(chǎn)量等。
例如用于欲大規(guī)模生長的特定擬南芥屬種系，已知此種擬南芥屬變種若于栽種后且于特定條件下生長時(shí)于某一日收獲，將表達(dá)粗略可預(yù)定量的外來/非同源蛋白質(zhì)。提供具有預(yù)定表達(dá)性質(zhì)的植物或種子用于大規(guī)模生長擬南芥屬，用以制造至少一種期望蛋白質(zhì)生物物質(zhì)。
此種區(qū)別可通過相對(duì)于時(shí)間、面積、產(chǎn)量及條件等因素討論生長而獲得最佳說明。但由于時(shí)間及面積可放大，故最好取一組條件作為舉例說明但非限制性。因此考慮20呎×20呎的植物生長隔間或生長室含有單層植物生長介質(zhì)(自然土、商業(yè)及人造土、水耕法介質(zhì))。根據(jù)本發(fā)明的「植物生長隔間」一詞包括任何類型可完全隔離自然光、水等的空間，或可為溫室其允許暴露于不等量的自然光、雨水等。該術(shù)語也涵蓋20呎×20呎暴露或經(jīng)過覆蓋的田野面積，例如用于水耕法或公知以土壤為主的農(nóng)耕。
一具體實(shí)施例中，擬南芥屬系于可促進(jìn)營養(yǎng)性及葉性生物物質(zhì)制造的條件下生長。較好植物通常系暴露于約8至10小時(shí)日光或適當(dāng)生長光照條件下，且維持于約18℃至約24℃溫度。生長介質(zhì)供給足夠營養(yǎng)(肥料)來促進(jìn)激烈生長(例如米洛克葛羅(Miracle Grow)品牌植物肥料或其它類似產(chǎn)品)。于土壤生長時(shí)，最好系由底部澆水維持濕潤，但整個(gè)生長期間并未過飽和土壤。
根據(jù)本發(fā)明之一具體實(shí)施例，植物生長隔間栽種包括至少一個(gè)表達(dá)暗盒的單種擬南芥屬變種，該表達(dá)暗盒將于前述條件下表達(dá)至少一種感興趣的蛋白質(zhì)。確實(shí)植物變種與表達(dá)暗盒的組合已經(jīng)經(jīng)過試驗(yàn)并決定特征，讓其表達(dá)的蛋白質(zhì)為已知，表達(dá)程度已知至合理估值，故可基于每個(gè)隔間收獲某種數(shù)量的擬南芥屬做估計(jì)。
理想上于適當(dāng)規(guī)定條件下生長的植物系于栽種后約30至80日，更好40至70日及最好約45至60日間收成。最佳生成日數(shù)通常系于早先階段預(yù)先規(guī)定，界定最適當(dāng)?shù)臄M南芥屬宿主變種、最佳表達(dá)暗盒、以及對(duì)期望蛋白質(zhì)的最佳生物物質(zhì)對(duì)蛋白質(zhì)產(chǎn)率。通常收獲的目標(biāo)日期系于外消旋混合物出現(xiàn)時(shí)或出現(xiàn)附近直到恰在形成種子前或附近決定。鎖定此一時(shí)間窗口，如此讓可收成的葉及根生物物質(zhì)量變最大量。
雖然進(jìn)一步生長可獲得更多量植物生物物質(zhì)，但這些組織(莖、花、種子莢及種子)通常并非商業(yè)上由擬南芥屬大規(guī)模制造蛋白質(zhì)目的的預(yù)定目標(biāo)組織。因此較好制造可提供有用蛋白質(zhì)產(chǎn)物的最大量生物物質(zhì)而無法再提供更多量有用生物物質(zhì)。
隨后含有相同表達(dá)系統(tǒng)，意圖用于表達(dá)同樣所需蛋白質(zhì)而獲得約略等量期望蛋白質(zhì)的其它相同變種植物被栽種于同一空間或類似空間。可在固定數(shù)月或數(shù)年進(jìn)行2、3、4、5或更多次。于各個(gè)栽種/收成周期后，感興趣的蛋白質(zhì)由所得生物物質(zhì)分離而實(shí)質(zhì)上獲得適合用于藥物的實(shí)質(zhì)純質(zhì)蛋白質(zhì)。如此與意圖供研究用的擬南芥屬相反，相同植物(例如得自可表達(dá)最理想構(gòu)建體的穩(wěn)定轉(zhuǎn)基因植物種系的種子)不斷播種而獲得生物物質(zhì)，由此植物分離經(jīng)過特征化的蛋白質(zhì)產(chǎn)品。較好種子可快速制造(例如少于約8至10周)。
擬南芥屬的獨(dú)特形態(tài)學(xué)也允許有效利用空間來獲得最大生物物質(zhì)制造量。擬南芥屬具有小型緊密生長形態(tài)，而產(chǎn)生葉環(huán)。于約5至8周時(shí)間，播種密度10-15種子/平方呎之一平方呎面積的整個(gè)表面完全被致密的葉席所覆蓋，由生物基質(zhì)表面伸長約2-5厘米。此時(shí)有類似量的生物物質(zhì)系以根的形式制造。由于在此階段植物的生長高度矮，故可于垂直方向堆棧多個(gè)棚架來生長植物(亦即至少約2、至少約3、至少約4、至少約5、至少約6、至少約7、至少約8、至少約9、至少約10)。其它方面，若需增加種子供應(yīng)量，則容易于更適當(dāng)?shù)墓庹沼?jì)劃下生長植物，提供足夠空間給予足夠空間讓花苞萌出。通常由播種種子至下次收成種子需時(shí)約8至10周，每株植株至少產(chǎn)生數(shù)百顆種子。
通常如前述根據(jù)本發(fā)明的20呎×20呎生長隔間于單一生長/收成周期，經(jīng)由收獲于生長隔間生長的擬南芥屬，基于回收的總可溶性蛋白質(zhì)重量，將制造至少0.1％較好至少0.5％及更好1％或以上所需蛋白質(zhì)。
以另一種測(cè)量方式敘述，由此單一20呎×20呎生長隔間，較好制造至少約1克(例如100克/平方呎×400平方呎×6層×10克蛋白質(zhì)/1000克生物物質(zhì)×0.1％占總蛋白質(zhì)的期望蛋白質(zhì)＝2.4克)所需蛋白質(zhì)，更好制造至少約5克且又更好至少約10克感興趣的所需蛋白質(zhì)。更好蛋白質(zhì)系以至少約500毫克、1克、2.5克、5克、7克、8克、9克或至少約10克重組蛋白質(zhì)的數(shù)量制造。
此種蛋白質(zhì)量的制造可為絕對(duì)量，換言之，與時(shí)間無關(guān)。亦即特定生長隔間會(huì)一再使用直到生產(chǎn)所需程度的期望蛋白質(zhì)為止。當(dāng)以此種方式表示時(shí)，是否屬于下列何種情況并不重要，例如1克系由于當(dāng)年度單次栽種的結(jié)果，以大于1％總回收可溶性蛋白質(zhì)的量生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)；或由于8至10次栽種/收成周期所得的結(jié)果，每個(gè)周期各35至45日，而于一年中粗略相等間隔時(shí)間產(chǎn)生的期望蛋白質(zhì)量遠(yuǎn)較不集中。
若擬南芥屬系于低于所需條件下生長，則可能改變收成窗口至某種程度。例如于高于25℃溫度收成始于35日。于低于20℃溫度，雖然較有利于產(chǎn)生葉，但整體植物將受到壓力而相對(duì)不具有生產(chǎn)力。
如前述某些前文討論的因素可放大規(guī)模。例如總產(chǎn)率為多項(xiàng)因素的函數(shù)，包括但非限于植物栽種密度、允許持續(xù)生長的程度、于一段指定時(shí)間例如一年中于指定空間將進(jìn)行栽種與收成周期數(shù)目、指定植物表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量等。但栽種程度于蛋白質(zhì)的最終產(chǎn)量上也扮演重大角色。下述實(shí)例考慮于單層可栽種表面有20呎×20呎生長面積的生長隔間。但通常于生長隔間或溫室，可在指定空間堆棧兩層或兩層以上例如以階梯或多層車架堆棧。產(chǎn)量將因于指定空間栽種的層數(shù)而倍增。較好生長隔間至少約有兩層植物，至少部分系培養(yǎng)非種子的生物物質(zhì)。
產(chǎn)量系以平方呎為單位的面積比例報(bào)告。例如一年期間于具有單層生物物質(zhì)的20呎×20呎生長隔間生產(chǎn)4克期望蛋白質(zhì)，則當(dāng)年的產(chǎn)量系以每年每400平方呎4克表示。若栽種面積達(dá)數(shù)英畝，則產(chǎn)率約略與基于400平方呎考慮的產(chǎn)率相等。若在相同隔間栽種兩層，也可使用相同測(cè)量方式，假設(shè)總栽種平方呎為800平方呎，由總可溶性蛋白質(zhì)分離的蛋白質(zhì)總量在同一年內(nèi)為8克。則比例仍然為每年每400平方呎4克。栽種的最小及最大面積將依據(jù)多項(xiàng)因素決定，例如可利用的空間亦即隔間數(shù)目、英畝數(shù)目等、選用的變種及表達(dá)暗盒系統(tǒng)的實(shí)際產(chǎn)率、所需蛋白質(zhì)期望總量以及時(shí)間限制(若有)。若在一段短時(shí)間內(nèi)需要更大量蛋白質(zhì)，則需栽種更大表面積及/或需要使用更多次栽種/收成周期?？赡苄枰l(fā)展出更有效的表達(dá)系統(tǒng)。
最小量栽種空間為一年至少可產(chǎn)生約100毫克期望蛋白質(zhì)，更好至少約300毫克又更好至少約500毫克，又更好至少約700毫克及最好一年中產(chǎn)生至少一克或一克以上期望蛋白質(zhì)空間。本文所舉范例(20呎×20呎生長室)只做為參考用。該方法的各方面就空間及時(shí)間而言皆可擴(kuò)充而制造更大量特定產(chǎn)物?；谌魏翁囟〝M南芥屬宿主種系，空間及時(shí)間等方面可能對(duì)任何特定蛋白質(zhì)的產(chǎn)率百分比造成正面或負(fù)面影響。
即使于20呎×20呎生長室規(guī)模，較好采用自動(dòng)化或半自動(dòng)化收成方法。依據(jù)實(shí)際生長基質(zhì)而定(土壤相對(duì)于水耕)，有些系統(tǒng)為較佳。由大量生鮮植物組織純化蛋白質(zhì)可藉多種方法達(dá)成，其中部分方法可參考美國專利第6,096,546、WO 00009725及W09946288號(hào)有關(guān)蛋白質(zhì)純化。
擬南芥屬適合用于多種培養(yǎng)室及溫室條件下生長。可改變生長條件，例如光照強(qiáng)度，及白晝長度來有利于葉生物物質(zhì)的產(chǎn)生，以免轉(zhuǎn)成發(fā)育花朵。通常白晝時(shí)間縮短(8至10小時(shí))有利于較多葉表達(dá)型，而白晝長度延長(大于12小時(shí))有利于花及種子的發(fā)育。生長溫度也影響形態(tài)及發(fā)育，溫度較冷較有利于生長葉。如此通常白晝長度8至10小時(shí)及生長溫度20℃至23℃有利于葉的營養(yǎng)性生長，相對(duì)于白晝長度12至14小時(shí)及24至25℃溫度則有利于更快速成熟及產(chǎn)生種子。雖然擬南芥屬就種子繁殖速率而言相當(dāng)多產(chǎn)，但擬南芥屬種子極小而非期望蛋白質(zhì)的可收獲產(chǎn)物。本案中感興趣的蛋白質(zhì)系由植物的營養(yǎng)性部分表達(dá)及分離(但也可表達(dá)于種子)。
一具體實(shí)施例中，植物系于2時(shí)高的平面于美徹密斯350于25℃以白晝長度10小時(shí)生長35日。播種密度為每平方呎10至15植株，則溶液獲得每平方呎100至150克總生鮮產(chǎn)品重量。其中約1克為總可溶性蛋白質(zhì)。任何特定轉(zhuǎn)基因產(chǎn)物的相對(duì)表達(dá)程度，達(dá)成約0.1％至1％總可溶性蛋白質(zhì)表達(dá)程度。較好至少約1至5％及更好大于5％分離作為生物物質(zhì)的總可溶性蛋白質(zhì)為所需重組蛋白質(zhì)。為了達(dá)成商業(yè)量產(chǎn)目的，有100平方呎擬南芥屬幼苗可獲得數(shù)毫克且較好高達(dá)數(shù)克數(shù)量的純質(zhì)蛋白質(zhì)。擬南芥屬高度不高葉生物物質(zhì)產(chǎn)量不大。本研究工作證實(shí)當(dāng)用于高密度生長時(shí)，相對(duì)于生長植物需要的總空間容積、時(shí)間、能量及輸入，擬南芥屬可獲得極佳生物物質(zhì)總產(chǎn)率。
本發(fā)明使用擬南芥屬植物用來量產(chǎn)蛋白質(zhì)，特別包括生產(chǎn)適合用于法規(guī)規(guī)范領(lǐng)域如藥物及診斷試劑用蛋白質(zhì)。
蛋白質(zhì)的分離培養(yǎng)后，收獲生物物質(zhì)，回收重組蛋白質(zhì)。收獲步驟包括收獲整個(gè)植株，或只收獲植物的葉或根或細(xì)胞。此步驟可能殺死植物，或若收獲部分轉(zhuǎn)基因植物則可讓其余部分植物繼續(xù)生長。但較好于生長區(qū)段(亦即生長面積或生長隔間如溫室)的至少部分全部生物物質(zhì)皆收獲，包括收獲含種子的全部植物組織。其余部分可用來獲得種子與用于再度播種，收集種子的植物可讓其繼續(xù)生長，或可加至收集的生物物質(zhì)來回收重組蛋白質(zhì)。
收獲后，蛋白質(zhì)分離可使用業(yè)界例行方法進(jìn)行。例如至少部分生物物質(zhì)可經(jīng)均化，重組蛋白質(zhì)經(jīng)過萃取以及進(jìn)一步純化。萃取包含將均化物浸泡或浸沒于適當(dāng)溶劑。如前文討論，蛋白質(zhì)也可藉真空浸潤方法由植物的間質(zhì)流體分離，如美國專利案第6,284,875號(hào)所述。
純化方法包括但非限于免疫親核純化程序，以及基于蛋白質(zhì)/蛋白質(zhì)復(fù)體的特定大小、電泳移動(dòng)性、生物活性及/或欲分離的重組蛋白質(zhì)凈電荷、或蛋白質(zhì)是否存在有標(biāo)記分子的純化程序。
但一具體實(shí)施例中，重組蛋白質(zhì)未經(jīng)分離，反而獲得部分生物物質(zhì)經(jīng)口投予動(dòng)物(例如人類)。此部分可以下述劑型提供，該等劑型包括但非限于錠劑、膠囊劑、丸粒劑及懸浮液劑(例如呈飲劑、糖漿劑等)。其又一方面該方法包含對(duì)動(dòng)物經(jīng)口投予擬南芥屬細(xì)胞或其部分。
醫(yī)藥組合物由擬南芥屬分離的重組蛋白質(zhì)可用于預(yù)防或治療疾病、用于其營養(yǎng)價(jià)值、用作為營養(yǎng)補(bǔ)充品、化妝品、抗微生物劑，或用于提引出期望的免疫反應(yīng)(例如作為疫苗)等。
于本發(fā)明之一方面，得自擬南芥屬生物物質(zhì)的重組蛋白質(zhì)或其生物活性片段被調(diào)配呈醫(yī)藥組合物。較好醫(yī)藥組合物為無菌水或非水性溶液劑、懸浮液劑或乳液劑，其額外包含生理可接受性載劑(亦即不會(huì)干擾活性成分活性的無毒材料)。更好組合物不含熱原且不含病毒或其它微生物。熟諳技藝人士已知的任何適當(dāng)載劑皆可使用。代表性載劑包括但非限于生理食鹽水溶液、明膠、水、醇類、天然或合成油類、糖類溶液、二醇類、可注射的有機(jī)酯類例如油酸乙酯或這些材料的組合。視需要地，醫(yī)藥組合物額外含有保藏劑及/或其它添加劑例如抗微生物劑、抗氧化劑、螯合劑及/或惰性氣體及/或其它活性成分。
投藥途徑及投藥頻率以及投藥劑量將因病人而異且將依據(jù)欲預(yù)防或治療的病情或欲提供的效果(例如若提供作為營養(yǎng)補(bǔ)充物)改變。通常醫(yī)藥組合物系經(jīng)靜脈、腹內(nèi)、肌肉、皮下、局部、吸入等途徑投藥。但確切投藥方法并無限制。投予有效劑量的重組蛋白質(zhì)或生物活性片段。
用于此處，有效劑量為足夠顯示帶有疾病病情的病人癥狀改善的數(shù)量、或足夠?qū)Σ∪颂峁┬б娴膭┝俊４朔N改善或效益可如業(yè)界已知通過監(jiān)視適當(dāng)臨床終點(diǎn)或生化終點(diǎn)予以檢測(cè)。通常重組蛋白質(zhì)的存在量為每千克宿主約1微克至約100毫克。適當(dāng)劑量將隨病人身材而異，典型用于10至60千克動(dòng)物的劑量系于約10毫升至約500毫升的范圍。病人可為哺乳類如人類或家畜。
本說明引用的全部專利案以及非專利案公開文獻(xiàn)皆對(duì)熟諳技藝人士指示本發(fā)明相關(guān)技巧層面。全部這些公開文獻(xiàn)及專利申請(qǐng)案皆以引用方式并入此處，彷佛個(gè)別公開文獻(xiàn)或?qū)＠暾?qǐng)案特別或個(gè)別指示合并于本案。
熟諳技藝人士了解或確定無需使用超過例行實(shí)驗(yàn)即可做出于此處所述特定物質(zhì)及程序相當(dāng)變化。這些等同例被視為屬于本發(fā)明的范圍，涵蓋于權(quán)利要求。
雖然已經(jīng)就特定具體實(shí)施例說明本發(fā)明，但須了解這些具體實(shí)施例僅供舉例說明本發(fā)明的原理及應(yīng)用。因此須了解可未悖離如隨附的權(quán)利要求界定的本發(fā)明的精髓及范圍對(duì)范例具體實(shí)施例以及其它配置做出多項(xiàng)修改。
權(quán)利要求
1.一種于擬南芥屬制造大量重組蛋白質(zhì)的方法包含(a)將至少一個(gè)可表達(dá)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)暗盒導(dǎo)入擬南芥屬(Arabidopsis)細(xì)胞；(b)識(shí)別可表達(dá)期望程度及/或活性重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞；(c)由細(xì)胞子代獲得擬南芥屬種子；(d)于可快速產(chǎn)生種子的條件下培養(yǎng)種子；以及(e)篩選得自該種子的植株，識(shí)別何種植株可表達(dá)期望程度及/或活性的重組蛋白質(zhì)；(f)于可快速產(chǎn)生種子的條件下培養(yǎng)至少二世代蛋白質(zhì)產(chǎn)生性植株且選擇蛋白質(zhì)產(chǎn)量最高的植株；以及(g)于可制造至少約50克生物物質(zhì)/平方呎的條件下，培養(yǎng)可表達(dá)最高量蛋白質(zhì)的植物種系。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每平方呎可制造至少約100克生物物質(zhì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其中每平方呎可制造至少約200克生物物質(zhì)。
4.一種于擬南芥屬制造重組蛋白質(zhì)的方法，包含a.于可促進(jìn)植物性及葉性生物物質(zhì)產(chǎn)量的條件下，生長擬南芥屬變種，該擬南芥屬變種包含至少一個(gè)可表達(dá)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)暗盒；b.于種子形成前，收獲至少部分含重組蛋白質(zhì)的擬南芥屬；以及c.于一年時(shí)間至少回收1克重組蛋白質(zhì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該擬南芥屬系經(jīng)預(yù)先選擇以獲得蛋白質(zhì)的最大表達(dá)及/或最大活性。
6.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該擬南芥屬具有較低翻譯后蛋白質(zhì)糖基化程度。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的方法，其中擬南芥屬包括人類糖基轉(zhuǎn)移酶基因。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的方法，其中該擬南芥屬為cgl或mur突變株。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，還包括下述步驟預(yù)先選出一種擬南芥屬種系，該擬南芥屬種系比野生型擬南芥屬種系可產(chǎn)生出平均量較高的生物物質(zhì)，以及由預(yù)選定的種系獲得擬南芥屬細(xì)胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中至少一個(gè)表達(dá)暗盒系通過浸潤而導(dǎo)入擬南芥屬細(xì)胞。
11.根據(jù)權(quán)利要求10所述的方法，其中浸潤系于真空中進(jìn)行。
12.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中部分?jǐn)M南芥屬系培養(yǎng)至種子形成，以及由該部分獲得種子。
13.根據(jù)權(quán)利要求12所述的方法，其中至少再度栽種若干種子。
14.根據(jù)權(quán)利要求4所述的方法，其中經(jīng)歷至少6個(gè)月時(shí)間重復(fù)進(jìn)行步驟(a)及(b)。
15.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該表達(dá)構(gòu)建體包括一種可表達(dá)重組蛋白質(zhì)的基因，以可操作方式連接至調(diào)節(jié)序列。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該調(diào)節(jié)序列包括一或多個(gè)啟動(dòng)子、促進(jìn)基因序列、轉(zhuǎn)錄終止子、或IRES元件。
17.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該重組蛋白質(zhì)系選自下列組成的組群生長因子、受體、配體、信號(hào)分子、激酶、腫瘤抑制劑、凝血蛋白質(zhì)、細(xì)胞周期蛋白質(zhì)、端粒酶、代謝蛋白質(zhì)、酶、人類缺陷蛋白、抗體、抗原、胰島素、白蛋白、干擾素以及細(xì)胞因子。
18.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該表達(dá)暗盒表現(xiàn)多種重組蛋白質(zhì)。
19.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該表達(dá)暗盒表達(dá)多順反子mRNA。
20.根據(jù)權(quán)利要求19所述的方法，其中該表達(dá)暗盒表達(dá)多亞單元蛋白質(zhì)。
21.根據(jù)權(quán)利要求20所述的方法，其中該多亞單元蛋白質(zhì)系選自T細(xì)胞受體、MHC分子、免疫球蛋白超家族蛋白質(zhì)、核酸結(jié)合蛋白質(zhì)、多亞單位酶及多亞單位抗體酶組成的組群。
22.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該蛋白質(zhì)為人類蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該蛋白質(zhì)為藥劑、診斷用蛋白質(zhì)、營養(yǎng)品、化妝品及動(dòng)物用藥。
24.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該蛋白質(zhì)為融合蛋白質(zhì)。
25.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該融合蛋白質(zhì)包括效應(yīng)物多肽。
26.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，此處該融合蛋白質(zhì)包括一種可提高融合蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄活化多肽。
27.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該融合蛋白質(zhì)包括標(biāo)記多肽。
28.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該融合蛋白質(zhì)包括連接子多肽。
29.根據(jù)權(quán)利要求28所述的方法，其中該連接子多肽為可裂解連接子。
30.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子于約20-40日齡擬南芥屬植物中在大于50％擬南芥屬植物組織具有活性。
31.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該調(diào)節(jié)序列包括啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子于葉、莖及根組織中的至少一或多者具有活性。
32.根據(jù)權(quán)利要求15所述的方法，其中該調(diào)節(jié)序列為一種選自擬南芥屬肌動(dòng)蛋白2啟動(dòng)子、OCS(MAS)啟動(dòng)子、CaMV35S啟動(dòng)子、玄蔘(figwort)斑紋病毒34S啟動(dòng)子及葉綠體啟動(dòng)子組成的組群的啟動(dòng)子。
33.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該蛋白質(zhì)包括靶序列。
34.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其中該靶序列可將重組蛋白質(zhì)靶向植物細(xì)胞的特定位置，該特定位置系選自下列組成的組群細(xì)胞膜、胞外空間、質(zhì)體及內(nèi)膜。
35.根據(jù)權(quán)利要求34所述的方法，其中該靶序列為鈣網(wǎng)素或枯草桿菌蛋白。
36.根據(jù)權(quán)利要求24所述的方法，其中該融合蛋白質(zhì)包括位置特異性裂解位置。
37.根據(jù)權(quán)利要求1或4所述的方法，其還包括分離該蛋白質(zhì)。
38.一種包括至少約10克的擬南芥屬生物物質(zhì)，其中該擬南芥屬生物物質(zhì)中至少0.1％可溶性蛋白質(zhì)包括重組蛋白質(zhì)。
39.根據(jù)權(quán)利要求38項(xiàng)的生物物質(zhì)，其中該生物物質(zhì)包括多于種子者。
40.一種對(duì)人類提供蛋白質(zhì)的方法，包括對(duì)人類經(jīng)口給予擬南芥屬細(xì)胞或其部分。
41.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該蛋白質(zhì)并未于擬南芥屬自然表達(dá)。
42.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該蛋白質(zhì)系由表達(dá)于擬南芥屬細(xì)胞的重組基因編碼。
43.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，其中該細(xì)胞包括可用以提引出有效免疫反應(yīng)的抗原。
44.根據(jù)權(quán)利要求40所述的方法，還包括由至少部分制造的擬南芥屬收獲生物物質(zhì)，其中該生物物質(zhì)并非種子。
45.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該收獲系經(jīng)歷約2個(gè)生長周期至少進(jìn)行約2次。
46.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該收獲系經(jīng)歷約5個(gè)生長周期至少進(jìn)行約5次。
47.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該收獲系經(jīng)歷約10個(gè)生長周期至少進(jìn)行約10次。
48.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該收獲系經(jīng)歷多于2個(gè)生長周期至少進(jìn)行約2次。
49.根據(jù)權(quán)利要求44所述的方法，其中該收獲系經(jīng)歷多于5個(gè)生長周期至少進(jìn)行約5次。
50.根據(jù)權(quán)利要求45或46所述的方法，其中至少有一個(gè)生長周期并未收獲生物物質(zhì)。
全文摘要
本發(fā)明提供利用擬南芥屬(Arabidopsis)的多種生長參數(shù)，使于經(jīng)過控制的室內(nèi)環(huán)境下生長致密植物族群，用以收獲生物物質(zhì)及分離蛋白質(zhì)，特別是適合供醫(yī)藥用途的重組蛋白質(zhì)。
文檔編號(hào)A61K36/00GK1636056SQ02802512
公開日2005年7月6日 申請(qǐng)日期2002年7月26日 優(yōu)先權(quán)日2001年7月27日
發(fā)明者N·拜斯可, M·波西, M·史卡金斯凱, L·海洛雅馬, G·赫爾, T·佩帝, A·哥洛可, M·肯普 申請(qǐng)人:愛康遺傳科技公司