專利名稱：末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)領(lǐng)域，更具體地說，涉及一種末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途。該種末端閉鎖的五螺旋蛋白可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結(jié)構(gòu)明確并有完整抗原決定部位的免疫原來開發(fā)疫苗。
HIV和Ebola等包膜蛋白病毒感染細(xì)胞的首要步驟為病毒粘附到宿主細(xì)胞及病毒與細(xì)胞膜融合。該首要步驟由病毒表面的包膜糖蛋白調(diào)節(jié)。包括HIV的gp41及Ebola病毒的GP2在內(nèi)的這些包膜糖蛋白也被稱為融合蛋白，它們對膜融合至關(guān)重要。融合蛋白的外部通常為由三個相同亞基組成的棒狀α-螺旋三聚體。該三聚體的每個亞基都為一個內(nèi)多肽及一個外多肽的一部分，這三個亞基形成一個六螺旋束。該六螺旋束的核心為一個由N-α-螺旋組成的平行三股α-螺旋繞線。該核心的外層由三個C-α-螺旋的外層反平行地包繞。這一結(jié)構(gòu)特征為許多包膜病毒的融合調(diào)節(jié)糖蛋白所共有，例如HIV的gp41亞基，Ebola病毒的GP2亞基，流感病毒的HA2亞基，SV5副黏液病毒的F1亞基，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亞基。上述所有病毒的融合糖蛋白都形成棒狀α-螺旋束(詳見綜述-Skehel and Wiley，Cell95，871，1998)。
當(dāng)HIV感染細(xì)胞時，HIV的gp41發(fā)生下述構(gòu)象改變gp41的N-螺旋區(qū)插入細(xì)胞膜，而gp41 C-螺旋區(qū)仍在病毒包膜中。通過這種重新安排，gp41將細(xì)胞膜和病毒包膜聯(lián)接到一起，從而使融合這一HIV感染的首要步驟成為可能。因此，科學(xué)家們相信阻遏gp41的膜融合功能將抑制HIV感染宿主細(xì)胞。
為了阻遏gp41的膜融合功能，科學(xué)家們已采取了許多策略。其手段之一就是集中發(fā)展相應(yīng)于gp41C-螺旋區(qū)的C-多肽，并以此作為潛在的膜融合抑制劑(Jiang，S.，et al.，Nature365，113，1993，Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.91，9770，1994)。據(jù)建議，這些C-多肽以支配性否定的方式與gp41的N-多肽區(qū)相結(jié)合，從而抑制膜融合。作為C-多肽之一的T-20目前正在臨床試驗中，并在艾滋病人中顯示出抗病毒活性(Kilby，J.M.，et al.，Nature Med.4，1302，1998)。然而，如想采用基因工程技術(shù)來生產(chǎn)，C-多肽又太短，工業(yè)化生產(chǎn)將很困難。此外，C-多肽在人體內(nèi)很容易水解失效。因此，用C-多肽作為融合抑制劑面臨著穩(wěn)定性和產(chǎn)業(yè)化的雙重挑戰(zhàn)。另一方面，相應(yīng)于gp41 N-螺旋區(qū)的N-多肽不僅存在著同樣的穩(wěn)定性和產(chǎn)業(yè)化問題，而且還有溶解度的障礙。如想發(fā)展小分子抑制劑，作為藥物靶物，C-多肽及N-多肽都因無明確結(jié)構(gòu)而無實用價值。
因此，有必要發(fā)展穩(wěn)定性好的可溶性蛋白，以實現(xiàn)下述目的1)作為阻遏膜融合的抑制劑；2)作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；3)作為結(jié)構(gòu)明確并有完整抗原決定部位的免疫原來開發(fā)疫苗。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下。
(1)一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內(nèi)部接鏈和一或兩個末端接鏈所組成；這些內(nèi)部接鏈將五個螺旋連接在一起，并且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內(nèi)部接鏈中的一個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
(2)如技術(shù)方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內(nèi)部接鏈形成交鏈，并且C-末端接鏈與第一個或第三個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
(3)如技術(shù)方案(2)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈均由氨基酸殘基組成。
(4)如技術(shù)方案(3)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈?zhǔn)峭ㄟ^氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用而成。
(5)如技術(shù)方案(4)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈的相互作用是通過共價健而成。
(6)如技術(shù)方案(5)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈的共價健是二硫鍵。
(7)如技術(shù)方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，C-末端接鏈與第一個或第三個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
(8)如技術(shù)方案(1)所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
(9)一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其中，它具有的序列編碼為SEQID NO.1。
(10)技術(shù)方案(1)至(9)的任一項所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白用于制造針對HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一種病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
本發(fā)明還提供了將本發(fā)明的末端閉鎖的五螺旋蛋白用于制成治療HIV感染的針劑、口服劑、直腸給藥劑和皮膚吸收劑型制劑的用途。下面說明藥物制劑、劑量和給藥形式。首先說明藥用組合物。
本發(fā)明的抗病毒的末端閉鎖的五螺旋蛋白和至少一種其它治療劑的藥用組合物，可用于治療或預(yù)防人或非人的病毒性感染。本發(fā)明的所述的聯(lián)合用藥可產(chǎn)生加合/協(xié)同效果。
優(yōu)選藥用組合物含有末端閉鎖的五螺旋蛋白，并含有至少一種其它抗病毒劑如逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑、蛋白酶抑制劑、mRNA加工的抑制劑、蛋白糖基化抑制劑、病毒吸附劑、CD4受體阻斷劑、趨化因子受體抑制劑、中和性抗體、整合酶抑制劑及其它融合抑制劑。這類治療劑包括(但不限于)核苷類似物或鏈終止劑；趨化因子受體抑制劑AMD-3100(Tremblay，C.L.etal.，2000，艾滋病雜志(J.AIDS)125(2)99-10)。
在本發(fā)明范圍內(nèi)，可與末端閉鎖的五螺旋蛋白聯(lián)合使用的其它治療劑包括(但不限于)2-脫氧-D-葡萄糖(2dGlc)、脫氧野尻霉素?zé)o環(huán)烏苷、病毒唑(virazole)、利福平(rifadin)，金剛烷胺、利福布丁(rifabutine)，更普洛韋(ganciclover、DHPG)、法昔洛韋(Famciclover)、布普洛韋(Buciclover、DHBG)、氟化碘化阿糖胞胞嘧啶(fluoroiodoaracytosine)、碘苷、三氟胸腺嘧啶核苷、阿糖腺苷(ara-A)、ara-AMP、溴乙烯基去氧尿苷、溴乙烯阿糖尿嘧啶(BV-arau)、l-b-D-阿糖呋喃糖苷-E-5-[2-溴乙烯基]尿嘧啶、金剛乙胺，羥基脲，苯乙庚二酮、二芳基脒、(S)-(對硝基芐基)-6-硫代肌苷和膦酰基甲酸鹽。本發(fā)明包括含有末端閉鎖的五螺旋蛋白和任何上述其它化合物的藥用組合物。
本發(fā)明的末端閉鎖的五螺旋蛋白用作預(yù)防性疫苗的實施方案包括給予宿主一定濃度的有效末端閉鎖的五螺旋蛋白以產(chǎn)生足夠中和HIV的免疫應(yīng)答，如抑制HIV感染細(xì)胞的能力?？墒褂迷擃I(lǐng)域內(nèi)普通技術(shù)人員熟知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來測定免疫應(yīng)答的產(chǎn)生。用作疫苗的末端閉鎖的五螺旋蛋白通常肌注給藥。
為增強(qiáng)免疫應(yīng)答，所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白可和適當(dāng)?shù)奶砑觿┡湓谝黄稹＿@類添加劑包括(但不限于)礦物質(zhì)凝膠如氫氧化鋁；表面活性物質(zhì)如溶血卵磷脂；Puronic多元醇，聚陰離子；油乳劑；以及其它潛在的人用添加劑如卡介苗(BCG)和小棒狀桿菌。給予所述疫苗制劑的途徑包括(但不限于)口服、皮內(nèi)、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、靜脈、皮下和鼻內(nèi)。
下面說明末端閉鎖的五螺旋蛋白的劑量。
在治療急性病毒感染的哺乳動物(包括人)時，須給予足以抑制病毒復(fù)制的有效量的末端閉鎖的五螺旋蛋白。給予本發(fā)明的有效劑量可用該領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員所周知的方法來確定，如設(shè)置生物半衰期，生物利用率及毒性等參數(shù)。例如，可按約每天0.2-10.0mg/kg的劑量輸注末端閉鎖的五螺旋蛋白，持續(xù)4～52周。優(yōu)選劑量為2mg～50mg/天。最優(yōu)選的劑量約為5mg-10mg/天；大約持續(xù)52周。末端閉鎖的五螺旋蛋白的給藥間隔約為每兩天一次到每天四次，最好是每天1-2次。最佳劑量是使末端閉鎖的五螺旋蛋白的血漿峰濃度達(dá)到1mg/ml-10mg/ml?？上扔眠m宜緩沖鹽水配制20％的末端閉鎖的五螺旋蛋白無菌注射液，連續(xù)輸注，再通過HPLC測血濃度，再確定所用末端閉鎖的五螺旋蛋白的量是否可以維持所需的血濃度。
與末端閉鎖的五螺旋蛋白聯(lián)合使用的治療劑(如抗病毒劑)的有效劑量的確定以該領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的各種抗病毒劑的推薦劑量為基礎(chǔ)。聯(lián)合用藥的劑量優(yōu)選比文獻(xiàn)所推薦的單獨應(yīng)用的劑量約低10-50％。醫(yī)護(hù)人員須注意出現(xiàn)毒性反應(yīng)的劑量。當(dāng)出現(xiàn)骨髓、肝、腎功能不全或嚴(yán)重藥物相互作用時，醫(yī)生應(yīng)知道如何終止及何時終止、及時中斷或調(diào)整藥物至較低劑量。反之，如未達(dá)到臨床治療效果，醫(yī)生也應(yīng)知道如何提高劑量。
有效治療劑量指該組合物足以改善病人癥狀或延長病人存活期的用量。這類化合物的毒性和治療效果可按標(biāo)準(zhǔn)藥學(xué)程序經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)或動物實驗來確定。如確定半數(shù)致死量LD50(實驗群體中有50％致死的劑量)和半數(shù)有效量ED50(實驗群體中50％達(dá)到治療效果的劑量)。毒性和治療有效劑量的比率叫做治療指數(shù)，可用LD50/ED50的比率來表示。治療指數(shù)越大的化合物越好。從細(xì)胞實驗和動物實驗獲得的數(shù)據(jù)可推測人的劑量范圍。這類化合物的劑量最好在一定血藥濃度范圍內(nèi)，即包括ED50且無毒性或毒性很低，然后再根據(jù)所采用的劑型和給藥途徑來調(diào)整劑量。從這些資料可以較精確地確定人的使用劑量。血漿中的藥物濃度可用高效液相色譜(HPLC)來測定。
下面說明藥物制劑和給藥途徑。
將含有末端閉鎖的五螺旋蛋白的藥用組合物直接給予病人，或?qū)⒑心┒碎]鎖的五螺旋蛋白的藥用組合物與適宜的載體或賦形劑混合，以達(dá)到治療病毒感染、特別是HIV感染的劑量。本申請的化合物制劑和給藥技術(shù)為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
本發(fā)明的抗病毒活性可表現(xiàn)出一種亞型特異性，即特異的蛋白僅對特異性的病毒有抑制作用。本發(fā)明對HIV-1最敏感，這種優(yōu)點可體現(xiàn)在診斷試劑領(lǐng)域。如可利用本發(fā)明的抗HIV-1特異性來鑒別某一病毒分離株的類型(HIV-1或HIV-2)。例如在末端閉鎖的五螺旋蛋白存在的條件下，用一未知病毒株感染所分離的未感染的CD4+細(xì)胞，然后繼續(xù)培養(yǎng)。并對細(xì)胞上清液的逆轉(zhuǎn)錄病毒活性進(jìn)行測定。如果逆轉(zhuǎn)錄病毒活性幾乎完全被抑制，則該病毒分離株含HIV-1。如果病毒活性未被抑制或僅有少量抑制，該病毒分離株可能不含HIV-1。
本發(fā)明還包括使用藥學(xué)上可接受的載體，按本文公開的和/或藥用組合物配制成適宜的劑型，用于全身給藥。正確地選用載體和適當(dāng)?shù)纳a(chǎn)工藝，可使本發(fā)明的組合物，特別是配成溶液的組合物通過胃腸外途徑給藥，包括(但不限于)靜脈注射。所述的化合物還可采用該領(lǐng)域熟知的并且藥學(xué)上可接受的載體配成適宜于口服給藥的劑型。這類載體能將本發(fā)明的化合物配制成片、丸、膠囊、液體、凝膠、糖漿、淤漿和混懸等劑型。
本發(fā)明及上述藥用組合物可用本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的途徑給藥。給藥途徑可包括口腔、直腸、透膜或腸道給藥；胃腸外給藥包括肌內(nèi)、皮下、髓內(nèi)注射、鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射；透皮、局部用藥、陰道用藥等。劑型包括(但不限于)片劑、錠劑、散劑、懸浮劑、栓劑、溶液、膠囊、霜劑、貼劑、微泵劑。
為了方便起見，本發(fā)明涉及的藥用組合物可使用一種或多種生理學(xué)可接受的載體，并以常規(guī)方式配制成藥學(xué)上可接受的任何制劑。本發(fā)明涉及的藥用組合物可含一種或多種賦形劑和便于加工活性化合物的輔助劑。合適的制劑取決于所選的給藥途徑。為了方便注射，可將本發(fā)明的治療劑配成水溶液，如生理鹽水。對透膜給藥，制劑中應(yīng)使用利于透過屏障的滲透劑，這些滲透劑是該領(lǐng)域內(nèi)普遍熟知的。
本發(fā)明涉及的蛋白及其藥用組合物的口服制劑可用固體賦形劑磨碎成均勻的混合物，再加工成顆粒，必要時加入適宜的輔助劑，制成片劑或糖衣片的片芯。適宜的賦形劑及填料如糖；包括乳糖、蔗糖、甘露醇或山梨糖醇；纖維素制品劑如玉米淀粉、小麥淀粉、米淀粉、馬鈴薯淀粉、明膠、西黃耆膠、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素、羧甲基纖維素鈉和/或聚乙烯吡咯烷酮。如果必要，可以加入崩解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸或其鹽類如藻酸鈉。糖衣片芯應(yīng)提供適當(dāng)包衣?？刹捎脻饪s糖溶液，溶液中可含阿拉伯樹膠、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、carbopol凝膠、聚乙二醇、二氧化鈦、硝基纖維素溶液及適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。為了區(qū)別或標(biāo)示活性化合物，可將不同組合的染料或食用色素加到片劑或糖衣片的包衣中。
用于口服的藥用組合物包括由明膠制成的裝填式膠囊，以及由明膠和一種增塑劑如甘油或山梨醇制成的密封軟膠囊。裝填式膠囊含有填充劑如乳糖、粘合劑如淀粉，和/或潤滑劑如滑石或硬脂酸鹽。也可用穩(wěn)定劑來穩(wěn)定活性成分。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮于適當(dāng)?shù)囊后w中，如脂肪油、液體石蠟或液狀聚乙二醇。此外，還可加入穩(wěn)定劑?？诜乃兄苿┒紤?yīng)是方便病人服用的合適劑型。對于口腔給藥而言，所述組合物可采用片劑或錠劑等方便的形式配制。
對于吸入給藥，本發(fā)明使用的化合物可用氣霧劑噴射的形式很方便地釋放出來。可通過高壓包或噴霧器，或使用某種合適的拋射劑如二氯二氟甲烷，三氯氟代甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它適合的氣體來實現(xiàn)。在高壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過一個閥的計量釋放來確定。用作吸入器或吹氣器的明膠膠囊和藥筒可制成含有所述的蛋白和一種合適的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的混合物。
可將所述的蛋白配制成便于胃腸外給藥的劑型，如注射，包括集合藥團(tuán)注射或連續(xù)靜脈滴注。便于注射的制劑可包裝成單位劑量形式，如安瓶。多劑量的制劑可包裝成單位劑多劑量的制劑可包裝成單位劑量形式，如安瓶或多劑量容器，并加入保存劑。所述組合物也可采用混懸液、溶液或以油或水為介質(zhì)的乳劑形式，且可含有一定的配方劑如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。
用于胃腸外給藥的藥用組合物包括活性物質(zhì)的水溶液，即水溶形式。活性物質(zhì)的懸浮液也可制成適宜的油狀注射懸浮液。合適的親油溶劑或載體包括脂肪油如芝麻油、或合成的脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸浮液可含有增加懸浮液粘度的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉、山梨醇或葡聚糖。所述懸浮液也可選擇性地包含合適的穩(wěn)定劑或增加化合物溶解度的物質(zhì)，以制備高濃度的溶液。粉針劑的活性成分可與適當(dāng)?shù)娜苊剑鐭o菌去熱源注射用水配合，然后使用。
所述的化合物也可配制成直腸給藥制劑如栓劑或滯留灌腸劑?？捎贸Ｒ?guī)基質(zhì)如可可脂或其它甘油酯配制。
除了已描述過的制劑外，還可將所述的蛋白或藥用組合物配成長效制劑。這種長效制劑可采用皮下或肌肉植入法或肌注給藥。因此，所述蛋白及其衍生物或藥用組合物可用合適的聚合物或疏水物質(zhì)(如油乳劑)或離子交換樹脂、或微溶的衍生物如微溶鹽來配制。
本發(fā)明的疏水化合物的藥物載體為含芐醇，非極性表面活性劑，與水混溶的有機(jī)聚合物和水相的共溶體系。該共溶體系可為VPD共溶體系。VPD是一種由3％(重量/容量W/V)芐醇溶液，8％(W/V)的非極性表面活性劑多乙氧基醚，及65％(W/V)的聚乙二醇300在無水乙醇中組成的溶液。而VPD共溶體系(VPD5W)由1∶1稀釋的VPD與5％的葡萄糖在水溶液中配成。這種共溶體系能較好地溶解疏水性化合物，而體系本身對全身給藥的毒性很低。在不破壞其溶解度和毒性的情況下，共溶體系的比例可有較大的變化。而且，共溶成分的同一性也可以變化，如可用其它低毒性的非極性表面活性劑來取代多乙氧基醚；聚乙二醇的所占比例也可改變；其它生物相容的聚合物也可取代聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；其它糖或多糖可代替葡萄糖。
所述的藥用組合物也可包括適當(dāng)?shù)墓滔嗷蚰z相載體式賦形劑。這類載體或賦形劑包括(但不限于)碳酸鈣、磷酸鈣、各種糖、淀粉、纖維素衍生物、明膠及聚合物如聚乙二醇。適于本發(fā)明的藥用組合物也包括為達(dá)到治療目的所用的有效量的活性成分的組合物。有效量的確定方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
與本領(lǐng)域的同類現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下有益效果1.穩(wěn)定性好，因此有效作用的時間長，從而可以減少用藥次數(shù)；
2.對病毒融合作用的抑制效果好，因此可以減少單次用藥的劑量；3.既可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結(jié)構(gòu)明確并有完整抗原決定部位的免疫原來開發(fā)疫苗。
對附圖的簡要說明

圖1a與1b表示五螺旋蛋白的設(shè)計與結(jié)構(gòu)。圖1a是五螺旋蛋白的設(shè)計草圖。核心部分有3個N-螺旋(內(nèi)層)和2個C-螺旋(外層)，由4個內(nèi)部接鏈結(jié)合在一起。圖1b是五螺旋蛋白的仰視、側(cè)視和俯視圖。虛線標(biāo)明了缺失天然HIV gp41的第三個C-螺旋部位。缺失的C-螺旋暴露了α-螺旋束的內(nèi)核上的結(jié)合部位。因而使五螺旋蛋白具有模擬HIV gp41內(nèi)核的功能。
圖2表示末端閉鎖的五螺旋蛋白的設(shè)計草圖。該圖顯示引進(jìn)了位于五螺旋蛋白每端的兩個半胱氨酸，其中一對來自于N-末端和第二內(nèi)部接鏈，另一對來自于C-末端和第三內(nèi)部接鏈。
圖3表示末端閉鎖的五螺旋蛋白從Superdex-75色譜分離柱洗脫的特征峰圖。其分子量為23.4k道爾頓，并表明末端閉鎖的五螺旋蛋白可溶。分子量與洗脫峰(13.2ml)的一致性表明末端閉鎖的五螺旋蛋白可再折疊。
圖4表示末端閉鎖的五螺旋蛋白的二向色性圖譜(CD圖譜)。圖示其具有典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)的CD圖譜，且表明末端閉鎖的五螺旋蛋白呈正確的再折疊。
圖5a與5b表示末端閉鎖的五螺旋蛋白與天然gp41(N36C34)的穩(wěn)定性比較。圖5a是天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔融曲線，熔點僅53℃。圖5b是末端閉鎖的五螺旋蛋白在3M GuHCl的PBS溶液中的熔融曲線，熔點為69℃。
圖6表示末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒感染的抑制活性。據(jù)病毒-細(xì)胞融合分析，從HXB2(CXCR4)衍生的末端閉鎖的五螺旋對HIV JRFL(CCR5)病毒的50％抑制濃度(EC50)為0.75nM，而對HIV HXB2病毒的50％抑制濃度(EC50)為15.03nM。證明末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒感染的抑制活性是廣譜的。
下面結(jié)合附圖詳細(xì)地描述本發(fā)明。
除C-多肽外，融合蛋白的內(nèi)核對開發(fā)抑制劑和藥物靶物也是非常有吸引力的候選者(Wild，C.T.，et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，10537，1992)。當(dāng)gp41的N-多肽與其C-多肽區(qū)結(jié)合時，N-多肽也應(yīng)能抑制膜融合。然而，如果在結(jié)構(gòu)的外部無外層多肽(C-多肽區(qū))，僅由三個內(nèi)部多肽(N-多肽區(qū))形成的內(nèi)核本身通常既不穩(wěn)定，也不易溶解。為此，用N-多肽發(fā)展融合抑制劑或藥物靶物的難度相當(dāng)大。
為了獲得穩(wěn)定易溶的融合蛋白內(nèi)核，本發(fā)明人設(shè)計了一個由三個內(nèi)部多肽(N-多肽)和兩個外部多肽(C-多肽)組成并由接鏈結(jié)合的五螺旋束(見圖1a)。此蛋白被稱為五螺旋蛋白。這個五螺旋蛋白具有與天然gp41同樣的內(nèi)核(都由三個N-螺旋組成)，但僅有兩個C-螺旋，因此在gp41的C-螺旋部位產(chǎn)生了一個空位點(見圖1b)。五螺旋蛋白上的這個空位點對gp41 C-螺旋具有高親和力。為此，發(fā)明人建議這個五螺旋蛋白可能有許多不同的用途，包括作為膜融合抑制劑，HIV疫苗以及篩選其它抑制劑的工具。
五螺旋蛋白的初步分析數(shù)據(jù)提示雖然它本身比N-螺旋穩(wěn)定，但對許多想要開發(fā)的用途來說，五螺旋蛋白還不夠穩(wěn)定。由于其N-末端和C-末端仍然開放，此五螺旋蛋白可能容易松開并失去其構(gòu)象。該構(gòu)象的必要性不僅在于與gp41的C-區(qū)結(jié)合，還體現(xiàn)在與小分子抑制劑結(jié)合及激發(fā)抗HIV感染的中和性抗體等其它方面。因此，本發(fā)明人推理如果五螺旋蛋白的兩端都被閉鎖，其穩(wěn)定性和溶解度都將大大改善，從而使其更適于上述提議的用途。
本發(fā)明提供了一個末端閉鎖的五螺旋蛋白，該蛋白的組成為HIVgp41的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內(nèi)部接鏈和一或兩個末端接鏈；這些螺旋由內(nèi)部接鏈結(jié)合在一起，并由一個末端接鏈結(jié)合到一個螺旋上，該末端接鏈能與四個內(nèi)部接鏈中的一個形成交鏈。
上文所述的“N-螺旋”和“C-螺旋”分別指多肽序列相應(yīng)于HIV gp41亞基的N-多肽部分和C-多肽部分。
上文所述的“五螺旋蛋白”指通過基因工程產(chǎn)生的蛋白，它包括三個N-螺旋和兩個C-螺旋，并通過內(nèi)部接鏈連在一起。
上文所述的“末端閉鎖的五螺旋蛋白”指由一或兩個末端接鏈連接的五螺旋蛋白；該末端接鏈又與其中一個內(nèi)部接鏈交叉結(jié)合在一起。該五螺旋蛋白的閉鎖可以發(fā)生在任何一端或雙端。
蛋白是由一些氨基酸經(jīng)肽鍵聯(lián)接而成的，肽鍵則是通過一個氨基酸的α-羧基與另一個氨基酸的α-氨基反應(yīng)形成的。如上所述，“交鏈”指非肽鍵的其它化學(xué)鍵。這些化學(xué)鍵可以是共價鍵、離子鍵或具有類似強(qiáng)度的其它鍵。
上文所述的“內(nèi)部接鏈”指聯(lián)接兩個螺旋(最好是N-螺旋和C-螺旋)的接鏈。
上文所述的“末端接鏈”指僅僅聯(lián)接一個螺旋(最好是N-螺旋)并能與其中一個內(nèi)部接鏈交叉聯(lián)接的接鏈。
只要可以保留末端閉鎖的五螺旋蛋白的構(gòu)象并形成內(nèi)部接鏈和末端接鏈之間交鏈，不論是內(nèi)部接鏈還是末端接鏈都可具有任意長度或組成。接鏈最好是由氨基酸殘基組成。
只要保留與HIV gp41蛋白與C-多肽區(qū)結(jié)構(gòu)互補(bǔ)的表面(最好是能與C-多肽區(qū)結(jié)合)，此末端閉鎖的五螺旋蛋白的氨基酸序列可被改變。為進(jìn)一步增加此蛋白的穩(wěn)定性和水溶性，改變序列也許有必要。
在本發(fā)明所首選的具體表述中，此五螺旋蛋白的組成如下(從N-到C-)一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中N-末端接鏈與第二個或第四個內(nèi)部接鏈形成交鏈，并且C-末端接鏈與第一個或第三個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
在本發(fā)明所首選的具體表述中，兩個末端接鏈均由氨基酸殘基組成。這些接鏈的長度可從一個氨基酸殘基到幾個氨基酸殘基不等，但最好多于一個氨基酸。換言之，這些接鏈最好是多肽。末端接鏈的長度應(yīng)隨著與之交鏈的內(nèi)部接鏈的長度而改變。內(nèi)部接鏈和末端接鏈的長度應(yīng)長到可在接鏈間形成化學(xué)鍵并能保持五螺旋蛋白構(gòu)象的程度。另一方面，這些接鏈還應(yīng)短至能以反向方式”鎖住”N-多肽和C-多肽的程度。如果這些接鏈太長，交鏈將不能防止N-多肽和C-多肽的解聚。
根據(jù)本發(fā)明首選的具體表述，該五螺旋蛋白的末端接鏈通過氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用與內(nèi)部接鏈交鏈。被交鏈的氨基酸殘基可為末端接鏈或內(nèi)部接鏈中任何位置的氨基酸殘基。但更為理想的是，內(nèi)部接鏈被交鏈的氨基酸殘基應(yīng)位于內(nèi)部接鏈的中間，而末端接鏈被交鏈的氨基酸殘基最好是末端氨基酸殘基。末端接鏈及其相應(yīng)的內(nèi)部接鏈應(yīng)至少有一個能形成側(cè)鏈交鏈的氨基酸殘基。
交鏈也能在內(nèi)部接鏈中的氨基酸殘基側(cè)鏈與末端接鏈中的末端氨基酸的α-羧基或α-氨基之間形成。
根據(jù)本發(fā)明首選的進(jìn)一步具體表述，此末端閉鎖的五螺旋蛋白的末端接鏈通過一個共價鍵與內(nèi)部接鏈形成交鏈。
根據(jù)本發(fā)明首選的最佳具體表述，五螺旋蛋白的末端接鏈通過一個很強(qiáng)的共價鍵——二硫鍵與內(nèi)部接鏈形成交鏈。在兩個半胱氨酸殘基的側(cè)鏈之間形成的二硫鍵(S-S)是在一個或兩個多肽的兩個不同片段中的最常見的交鏈方式。兩個半胱氨酸殘基的硫醇基(SH)被氧化形成二硫基(S-S)，從而導(dǎo)致兩個半胱氨酸殘基被聯(lián)在一起，形成為所謂的胱氨酸(Cys-S-S-Cys)。
二硫鍵能在一個分子內(nèi)(即一個單多肽鏈內(nèi))形成，也可在分子間(即兩個多肽鏈之間)形成。分子內(nèi)二硫鍵能穩(wěn)定蛋白的三級結(jié)構(gòu)，而分子間的二硫鍵則涉及蛋白四級結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。二硫鍵的數(shù)量越多，蛋白受洗滌劑、熱等其它影響而導(dǎo)致變性的可能性就越小。因此，將一些二硫鍵引入五螺旋蛋白應(yīng)能增加其在體內(nèi)和在體外的穩(wěn)定性。
二硫鍵的形成發(fā)生在真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和原核生物的胞質(zhì)間隙。二巰基硫羥基的取代和二硫鍵的形成是由硫羥-二巰氧化還原酶催化的。在真核細(xì)胞中，此過程由蛋白二硫基同化酶(PDI)所催化；原核生物的催化酶則為dsbA。PDI和dsbA的活性部位與硫基還原酶的活性部位具有結(jié)構(gòu)類似的結(jié)構(gòu)。
氧化是形成二硫鍵的必要條件。真核細(xì)胞的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)比外周的細(xì)胞漿的氧化程度高。這種高氧化環(huán)境是靠氧化型谷胱甘肽與還原型谷胱甘肽之間的高比率來維持的。因此，真核細(xì)胞的大多數(shù)分泌蛋白都有二硫鍵，而大部分胞漿蛋白則無二硫鍵。由于缺乏還原勢來維持硫原子的還原性，細(xì)胞外蛋白中的半胱氨酸殘基通常由二硫鍵交鏈。因此，末端閉鎖的五螺旋蛋白既可用于細(xì)胞外的條件，也可用于體外條件。
各種氧化劑如氧(空氣)、二甲亞砜、氧化型谷胱甘肽、氰鐵酸鉀及三氟乙酰鉈都曾被用于巰基-二硫基的轉(zhuǎn)化。在體外，半胱氨酸殘基的氧化和二硫鍵的形成可由空氣中的氧氣來催化。另一方面，雖然二硫鍵是一種很強(qiáng)的共價鍵，但它卻能被象β-巰基乙醇(HSCH2CH2OH)這樣適當(dāng)?shù)倪€原劑所破壞。為了抑制純化中二硫鍵的形成，可加入抗壞血酸(維生素-C)或二硫赤蘚糖醇(DTT)，以防止半胱氨酸被空氣中的氧所氧化。因此，可用適當(dāng)?shù)难趸瘎┖瓦€原劑來控制五螺旋蛋白中二硫鍵的形成。
如上所述，基于棒狀融合蛋白的結(jié)構(gòu)信息，可以用各種方式在每端引入兩個半胱氨酸來使N-末端和C-末端閉鎖。半胱氨酸的引入也可通過其它方式來實現(xiàn)，但下述設(shè)計更為理想。
如圖2所描述，在一個末端閉鎖的五螺旋蛋白的頂端，在N-末端接鏈上的半胱氨酸與第二個內(nèi)部接鏈上的半胱氨酸配對。在尾端，C-末端接鏈的半胱氨酸與第三個內(nèi)部接鏈上的半胱氨酸配對。
根據(jù)該應(yīng)用的一種具體表述，此末端閉鎖的五螺旋蛋白具有序列編碼為SEQ ID NO.1，并如下所示MCGGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGSGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGCGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGCGGSWMEWDREINNYTSLIHSLIEESQNQQEKNEQELLSGGSGGSQLLSGIVQQQNNLLRAIEAQQHLLQLTVWGIKQLQASGGGC(SEQ ID NO.1)以上是單字碼序列，且劃線部份代表末端接鏈和內(nèi)部接鏈。
在帶有靈活內(nèi)部接鏈的每端或一末端的兩個半胱氨酸之間的距離應(yīng)足夠近，才能形成以共價鍵聯(lián)接的二硫鍵，從而使末端閉鎖。由于內(nèi)部接鏈和末端接鏈的靈活性和長度，二硫鍵的形成應(yīng)該不改變蛋白的構(gòu)象。此外，這些接鏈的長度不應(yīng)長至將N-末端和C-末端鎖到一起的程度。因此，末端閉鎖的五螺旋蛋白束將能保持折疊狀態(tài)，以便有效地增加其穩(wěn)定性和水溶性。
要想合成含二硫鍵的蛋白，可首先用基因工程技術(shù)產(chǎn)生含半胱氨酸的序列，然后再將硫醇基氧化形成二硫鍵。如果只有一對半胱氨酸，二硫鍵的形成將很簡單。如果有一對以上的半胱氨酸，二硫鍵的形成就變得復(fù)雜起來。如果要將五螺旋蛋白的兩端閉鎖，需要兩對半胱氨酸?？砂聪率龇椒▉肀苊獍腚装彼岬腻e配。先合成蛋白，再用尿素打開，并用DTT等還原劑來防止半胱氨酸被空氣中的氧所氧化。然后除去尿素，進(jìn)行直接稀釋或凝膠過濾。在蛋白被折疊后，兩個二硫鍵就形成了，這是因為在此棒狀蛋白每端的每對半胱氨酸都離得很近。如圖2所闡明，在五螺旋蛋白正確折疊及接鏈長度適當(dāng)?shù)臈l件下，只能形成所想要的二硫鍵，蛋白末端也將被正確地閉鎖。
Ellman試驗可用來測量殘留硫醇基的數(shù)量，從而監(jiān)測半胱氨酸的氧化及二硫鍵形成的程度，反向色譜(RP-HPLC)可用來監(jiān)測氧化的進(jìn)度。
可用常規(guī)技術(shù)來克隆相應(yīng)于上述設(shè)計蛋白的基因編碼，并將其以可溶性蛋白或包涵體的形式表達(dá)到細(xì)菌、昆蟲細(xì)胞、酵母或哺乳動物細(xì)胞中。如果以包涵體的形式表達(dá)蛋白，可將包涵體溶于8M尿素或6M鹽酸胍，加5mM DTT，并通過直接稀釋，逐漸透析或凝膠過濾的方法將蛋白重新折疊。只有在正確穩(wěn)定的蛋白重新折疊后，二硫鍵才能形成?？杉尤腓F鹽來促進(jìn)蛋白內(nèi)二硫鍵的形成。
末端閉鎖的五螺旋蛋白內(nèi)的交鏈也可以是二硫鍵之外的共價鍵。例如，交鏈可在一個原膠原蛋白分子內(nèi)發(fā)生，兩個賴氨酸殘基被氧化成醛基賴氨酸，一個醛，然后再縮合成lysinonorleucine(在原膠原蛋白分子的非螺旋N-區(qū)形式)。賴氨酸的氧化是由賴氨酰氧化酶催化的。隨著賴氨酸被引入末端接鏈及相應(yīng)的內(nèi)部接鏈，可在適宜的條件下用此交鏈閉鎖并穩(wěn)定五螺旋蛋白。
半胱氨酸以外的氨基酸殘基之間的交鏈可能不會自發(fā)形成。在五螺旋蛋白被合成后，可能要用化學(xué)試劑和酶來進(jìn)一步處理，才能形成交鏈和末端閉鎖的蛋白。
這些重組蛋白可被用于(但不局限于)下述一些方面末端閉鎖的五螺旋蛋白可被用作融合抑制劑來阻止病毒入侵。業(yè)已證明，末端閉鎖的五螺旋蛋白能抑制HIV與宿主細(xì)胞膜融合(見實施例3)。由于這些重組蛋白既穩(wěn)定又可溶，它們本身就能作為候選藥物來阻止病毒膜融合。這些蛋白將通過注射途徑來給藥。
末端閉鎖的五螺旋蛋白可被用于疫苗。這些重組蛋白具有象天然病毒融合蛋白那樣高度守恒的抗原決定部位。用這些重組蛋白引發(fā)的抗體將攻擊天然病毒的表面蛋白，從而抵御病毒對宿主細(xì)胞的感染。
末端閉鎖的五螺旋蛋白也可被用作篩選抗艾滋病藥物的工具。這些可溶性重組蛋白還被用作藥物靶物來鑒別和設(shè)計抑制病毒進(jìn)入細(xì)胞的藥物。例如，這些可溶性重組蛋白可被用作高通量分子文庫篩選小分子抑制劑的靶物?？梢杂媚撤N技術(shù)產(chǎn)生被標(biāo)記的HIV gp41的C-多肽(例如在C-多肽的一端進(jìn)行熒光標(biāo)記)。通過監(jiān)測帶標(biāo)記的C-多肽與末端閉鎖的五螺旋蛋白之間結(jié)合力的干擾程度，可篩選大容量小分子文庫，從而發(fā)現(xiàn)小分子藥物導(dǎo)物。
雖然人類感染絲狀病毒、Ebola病毒、Marburg病毒是比較罕見的，但由此引起的出血熱與高死亡率有關(guān)?；蚪M測序已鑒別出四個Ebola病毒的亞型，它們分別為Zaire、Sudan、Ivory Coast和Reston。它們的單包膜糖蛋白(GP)被合成為單鏈前體，并一起被翻譯及運(yùn)轉(zhuǎn)到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，然后在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔形成三聚體。在翻譯之后，它們又被切割成與HIV的gp120和gp41相似的兩條鏈(GP1 and GP2)。GP2融合亞基的外表區(qū)域也是具有高度α-螺旋性及棒狀構(gòu)象的三聚體。然而GP2本身的內(nèi)核并不穩(wěn)定。設(shè)計HIV gp41抑制劑的策略也可被用來設(shè)計穩(wěn)定可溶的GP2抑制劑，因為這些抑制劑的結(jié)構(gòu)與GP2的內(nèi)核相仿。這些基因工程蛋白也能被用作阻斷Ebola病毒的抑制劑，用作引發(fā)對抗Ebola病毒感染免疫反應(yīng)的疫苗，以及用作鑒別和設(shè)計抑制Ebola病毒進(jìn)入細(xì)胞的藥物的靶物。
上述同樣策略也適于下述藥物的設(shè)計抗流感病毒HA2亞基的藥物，抗SV5副黏液病毒的F1亞基的藥物，以及MuMoLV、HTLV和SIV等逆病毒的TM亞基。在所有這些情況下，融合糖蛋白都形成一個棒狀的α-螺旋束。五螺旋蛋白束的N-末端和C-末端都能閉鎖，從而使其穩(wěn)定可溶，這與通過引入半胱氨酸來形成二硫鍵來模仿其相應(yīng)的內(nèi)核很相似。
下面提供幾個實施例來進(jìn)一步闡明，但這些例證并不旨在限定本發(fā)明的范圍。
2.蛋白表達(dá)編碼該末端閉鎖的五螺旋蛋白的片段進(jìn)一步亞克隆至pRSET(Invitrogen)表達(dá)載體，并導(dǎo)入大腸桿菌BL21 DE3/pUBS。在LB/氨芐培養(yǎng)基和37°的條件下，當(dāng)A595＝0.5時，加入0.1mM IPTG，細(xì)胞繼續(xù)在37°下培養(yǎng)3小時。然后在每分鐘5000轉(zhuǎn)離心速度下離心15分鐘。倒掉上清夜，剩下的沉淀物放在負(fù)20°下保存。
3.蛋白打開細(xì)菌在PBS溶液中用超聲打粹，可溶部分在每分鐘6000轉(zhuǎn)(T.45 rotor，Beckman)離心40分鐘。包涵體(Inclusion bodies)用PBS/0.5％ TritonX-100洗3次，再用PBS洗1次，然后溶解于8M的尿素和5mM DTT中。稀釋該溶液至1mg/ml，加熱至100度，保持30分，然后室溫置放30分使蛋白完全打開。
4.純化/再折疊和末端閉鎖使用膠透色譜Superdex-75過濾柱(Pharmacia)，用PBS緩沖液，在pH7.0的條件下將蛋白再折疊并純化。通過膠透色譜，蛋白緩沖液可交換。去掉尿素，蛋白將再折疊。只有當(dāng)桿狀蛋白適當(dāng)?shù)脑僬郫B，位于末端接鏈與另一個內(nèi)部接鏈之間的雙硫鍵才會自動形成。
色譜分離柱洗脫的特征峰參見圖3。峰值出現(xiàn)在13.5毫升，這同基于23.4kD的末端閉鎖的五螺旋蛋白分子量而計算出的洗脫體積相一致。這說明末端閉鎖的五螺旋蛋白是可溶的，且再折疊結(jié)構(gòu)正確。實施例2 末端閉鎖的五螺旋與GP41的穩(wěn)定性比較末端閉鎖的五螺旋蛋白的CD色譜(見圖4)是在濃度為1mg/ml，PBS緩沖液，pH7.0的條件下，及20℃和1毫米的小杯里，用帶溫電控制器的AVIV623DS spectro-polarimeter記錄的。它表現(xiàn)了典型的α-螺旋結(jié)構(gòu)的CD譜，這就是預(yù)期的末端閉鎖的五螺旋蛋白再折疊后的α-螺旋束結(jié)構(gòu)。
熱力學(xué)穩(wěn)定性的測定范圍在25-95℃，CD的波長222nm，濃度為0.4mg/ml(見圖5a和5b)。天然gp41的6個α-螺旋束(N36氨基酸殘基35-70；C34氨基酸殘基117-150)是在PBS緩沖液，pH7.0的條件下測定的，而末端閉鎖的五螺旋蛋白是在PBS緩沖液并含3M GuHCl，pH7.0的條件下測定的。濃度是用色譜OD值為280，消光系數(shù)59 580/M/cm條件下確定的。而天然型gp41(N36C34)在PBS溶液中的熔點僅53℃，而末端閉鎖的五螺旋蛋白在含3M的GuHCl的PBS溶液中的熔點為69℃，遠(yuǎn)比天然型gp41的熔點高。所以末端閉鎖的五螺旋蛋白比天然型gp41更穩(wěn)定。這項實驗進(jìn)一步證明末端閉鎖的五螺旋蛋白正確地再折疊，并且末端雙硫鍵已形成。實施例3 末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒的抑制活性末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV病毒的抑制活性是通過HIV熒光素酶鑒定法而確定的。病毒是通過用HIV-1的染色體(含經(jīng)移碼突變env和替代nef基因(NL43LucR-E-)的熒光素酶基因)和含有HXB2或JRFL gp160基因的pCMV-HXB2或PEBB-JRFL表達(dá)載體一同轉(zhuǎn)染到293T細(xì)胞來產(chǎn)生的。因為染色體上缺少env基因，病毒感染后只能存活一代。細(xì)胞殘片用低速離心去除。上清液中的病毒用來感染HOS-CD4(HXB2)或者HOS-CD4-CCR5(JRFL)細(xì)胞(來自N.Landau，美國NIH艾滋病試劑中心)。感染兩天后，裂解細(xì)胞，測定熒光素酶的活性。IC50值(半量病毒被抑制的末端閉鎖的五螺旋蛋白的濃度)是把數(shù)據(jù)擬合Langmuir方程式來計算的，[y＝k/(1+[末端閉鎖的五螺旋蛋白]/IC50)]，其中y＝熒光素酶的活性，k是定標(biāo)常數(shù)。
為了測定末端閉鎖的五螺旋蛋白對gp41介導(dǎo)的細(xì)胞膜融合的抑制，我們使用的方法是如上所述的病毒-細(xì)胞融合鑒定法(見圖6所示)。在病毒-細(xì)胞融合鑒定法中，末端閉鎖的五螺旋蛋白對HIV HXB2病毒(實三角)的EC50值是15.03+/-1.41nM；而對HIV JRFL病毒(實方型)的EC50值是0.75+/-0.11nM。在治療艾滋病過程中最主要的問題是由于HIV病毒高突變性而產(chǎn)生的耐藥性。我們使用的末端閉鎖的五螺旋蛋白源于HIVHXB2(該病毒使用CXCR4為輔助受體)。而末端閉鎖的五螺旋蛋白對以CCR5為輔助受體的HIV JRFL的抗病毒活性更強(qiáng)。所以末端閉鎖的五螺旋蛋白具有廣譜的抗HIV病毒活性。
序列表<110> 周根發(fā)<120> 末端閉鎖的五螺旋蛋白及其用途<130> PF020076CNI Deng Dingji，Zhongzi Law Office<160> 1<170> PatentIn version 3.1<210> 1<211> 215<212> PRT<213> 人類免疫缺陷病毒<220><221> DISULFID<222> (2)..(215)<223> 與殘基87配對的殘基2；與殘基215配對的殘基130<400> 1Met Cys Gly Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln1 5 10 15Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu20 25 30Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly Gly Ser Gly Gly35 40 45Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr Thr Ser Leu Ile50 55 60His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu Lys Asn Glu Gln65 70 75 80Glu Leu Leu Ser Gly Gly Cys Gly Gly Ser Gln Leu Leu Ser Gly Ile85 90 95Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala lle Glu Ala Gln Gln His100 105 110Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu Gln Ala Ser Gly115 120 125Gly Cys Gly Gly Ser Trp Met Glu Trp Asp Arg Glu Ile Asn Asn Tyr130 135 140Thr Ser Leu Ile His Ser Leu Ile Glu Glu Ser Gln Asn Gln Gln Glu145 150 155 160Lys Asn Glu Gln Glu Leu Leu Ser Gly Gly Ser Gly Gly Ser Gln Leu165 170 175Leu Ser Gly Ile Val Gln Gln Gln Asn Asn Leu Leu Arg Ala Ile Glu180 185190Ala Gln Gln His Leu Leu Gln Leu Thr Val Trp Gly Ile Lys Gln Leu195 200 205Gln Ala Ser Gly Gly Gly Cys210 21權(quán)利要求
1.一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它由HIV gp41蛋白的三個N-螺旋和兩個C-螺旋，以及四個內(nèi)部接鏈和一或兩個末端接鏈所組成；這些內(nèi)部接鏈將五個螺旋連接在一起，并且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內(nèi)部接鏈中的一個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
2.如權(quán)利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的組成如下一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內(nèi)部接鏈形成交鏈，并且C-末端接鏈與第一個或第三個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
3.如權(quán)利要求2所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈均由氨基酸殘基組成。
4.如權(quán)利要求3所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈?zhǔn)峭ㄟ^氨基酸殘基側(cè)鏈的相互作用而成。
5.如權(quán)利要求4所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈的相互作用是通過共價健而成。
6.如權(quán)利要求5所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的末端接鏈和內(nèi)部接鏈的交鏈的共價健是二硫鍵。
7.如權(quán)利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的組成如下第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋，以及一個C-末端接鏈；其中，C-末端接鏈與第一個或第三個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
8.如權(quán)利要求1所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它的組成如下一個N-末端接鏈，第一個N-螺旋，第一個內(nèi)部接鏈，第一個C-螺旋，第二個內(nèi)部接鏈，第二個N-螺旋，第三個內(nèi)部接鏈，第二個C-螺旋，第四個內(nèi)部接鏈，第三個N-螺旋；其中，N-末端接鏈與第二個或第四個內(nèi)部接鏈形成交鏈。
9.一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，其特征在于，它具有的序列編碼為SEQ ID NO.1。
10.權(quán)利要求1至9的任一項所述的末端閉鎖的五螺旋蛋白用于制造針對HIV病毒、流感病毒、Ebola病毒、SV5副粘液病毒以及MuMoLV逆病毒、HTLV逆病毒和SIV逆病毒中任一種病毒的抗病毒疫苗或抗病毒化合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種末端閉鎖的五螺旋蛋白，它由HIV gp41蛋白的三個N－螺旋和兩個C－螺旋，以及四個內(nèi)部接鏈和一或兩個末端接鏈組成；這些內(nèi)部接鏈將五個螺旋連接在一起，并且連接在某個螺旋的末端接鏈又與上述四個內(nèi)部接鏈中的一個內(nèi)部接鏈形成交鏈。并且，該末端閉鎖的五螺旋蛋白的序列編碼為SEQ ID NO.∶1。本發(fā)明可作為HIV膜融合的抑制劑；也可作為藥物靶物來篩選小分子抑制劑；以及作為結(jié)構(gòu)明確并具有完整抗原決定部位的免疫原來開發(fā)疫苗。
文檔編號A61K38/16GK1410448SQ0214600
公開日2003年4月16日 申請日期2002年10月23日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月23日
發(fā)明者周根發(fā) 申請人:周根發(fā)