專(zhuān)利名稱(chēng)：莧菜籽核糖體失活蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及有機(jī)化學(xué)領(lǐng)域，特別是涉及到生物化學(xué)中一種核糖體失活蛋白-莧菜籽蛋白及其制備和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
在本文中，核糖體失活蛋白可被定義為至少具有下列活性之一的蛋白質(zhì)RNA N-糖苷酶活性，多核苷酸腺苷糖苷酶活性，抗腫瘤活性，抗病毒活性，特別是抗HIV活性，引產(chǎn)蛋白活性。該蛋白是寡聚的，單肽鏈的簡(jiǎn)單蛋白或糖蛋白。
從高等植物中提取的核糖體失活蛋白，根據(jù)其分子結(jié)構(gòu)可以分為兩類(lèi)，類(lèi)型I是單肽鏈蛋白，例如，來(lái)自葫蘆科植物塊根和種籽的天花粉蛋白(Trichosanthin)，苦瓜籽蛋白(Momorcharin)和來(lái)自商陸科植物的商陸抗病毒蛋白(PAP)。類(lèi)型II是雙肽鏈蛋白，例如，來(lái)自大戟科植物種籽的蓖麻毒素(Ricin)和來(lái)自豆科植物種籽的相思子毒素(Abrin)。類(lèi)型I蛋白和類(lèi)型II的A鏈都具有RNA N-糖苷酶活性，也叫做多核苷酸腺苷糖苷酶[EC3.2.2.22]活性，都可以裂解真核生物核糖體內(nèi)28S rRNA的4324位腺嘌呤和核糖間的N-C鍵，而使真核細(xì)胞核糖體60S亞基失活(Endo and Tsaragi1987，J.Biol.Chem.2628128-8130，Stirpe，F(xiàn).et al.，1988，Nacl.AcidRes.161349-1357)。關(guān)于類(lèi)型I和類(lèi)型II的核糖體失活蛋白已經(jīng)有很多的專(zhuān)利和文獻(xiàn)報(bào)道。
莧菜(Amaranthus mangostanus L.)是莧科莧菜屬的一個(gè)品種，其莖葉是常見(jiàn)蔬菜。Kwon，S et at從莧屬植物Amaranthus visidis的葉子中分離出一種核糖體失活蛋白，命名為Amaranthin(Kwon，S etat1997，Biosci.Biotech.Biochem.611613-1614)其分子量為29kDa，等電點(diǎn)大于9.8，IC50為25pM，與商陸抗病毒蛋白(PAP)相當(dāng)。該屬植物中其它的核糖體失活蛋白未見(jiàn)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是從我國(guó)南方常見(jiàn)的莧菜品種(Amaranthus mangostanusL.)的種籽中，制備出一種新的核糖體失活蛋白-莧菜蛋白(Amaramangin)，并公開(kāi)了它的制備方法及用途。經(jīng)SDS-PAGE顯示它的分子量為29kDa，等電點(diǎn)pI＞9。
本發(fā)明采用一種溫和的分離純化方法，即莧菜籽加入醋酸緩沖液，或磷酸緩沖液，或水，或鹽水浸泡，然后在高速勻漿機(jī)上勻漿，經(jīng)低溫離心或過(guò)濾獲得抽提液，抽提液再經(jīng)SP-瓊脂糖、S-瓊脂糖、CM-瓊脂糖或CM-纖維素等強(qiáng)或弱陽(yáng)離子凝膠介質(zhì)層析分離，就可得到電泳一條帶的純蛋白，我們把它命名為莧菜籽蛋白(Amaramangin)，SDS-PAGE顯示它的分子量為29kDa，等電點(diǎn)pI＞9，用阿爾新藍(lán)染色(孫冊(cè)，《凝集素》P21)，證明莧菜蛋白是糖蛋白。同時(shí)，莧菜蛋白可以被Cibacron blue-介質(zhì)所吸附。
本發(fā)明的莧菜籽蛋白與天花粉蛋白和商陸抗病毒蛋白相類(lèi)似，可以用作引產(chǎn)藥物原料用于制備抗腫瘤制劑、抗病毒制劑抗艾滋病毒制劑。
本發(fā)明的莧菜籽蛋白，還可以作為RNA N-糖苷酶或多核苷酸腺苷糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究。
本發(fā)明的莧菜蛋白，對(duì)真核生物細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)生物合成有強(qiáng)烈抑制作用，適合于作免疫毒素的毒素材料。
使用本發(fā)明的方法，可以從莧科其他種屬植物的種籽或莖葉(如雞冠花Celosia cristata L，青葙子Celosia argentea L，千里紅Gomphrenaglobosa L，老槍谷Amaranthus caudatus L.，刺莧A.spinosus L.，綠穗莧A.hybridus，反枝莧A.retroflexux等)中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在29kDa左右，等電點(diǎn)偏堿性，并具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
使用本發(fā)明的方法，可以從黎科菠菜(Spinacia oleracea Mill)的種籽或莖葉中分離出核糖體失活蛋白，其分子量在29kDa左右，等電點(diǎn)偏堿性，并具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下積極效果
(1).莧菜是常用蔬菜，因其生長(zhǎng)旺盛，抗病蟲(chóng)害，產(chǎn)量高，農(nóng)村用作豬的飼料。采用溫和的提取方法從中可獲得一種新的核糖體失活蛋白-莧菜籽蛋白。
(2).本發(fā)明與本屬植物中分離的Amaranthin相類(lèi)似，它們都屬于類(lèi)型I核糖體失活蛋白，分子量大約29～30kDa之間。本發(fā)明證實(shí)莧菜籽蛋白是一種糖蛋白，可以被Cibacron blue-介質(zhì)所吸附。


現(xiàn)在對(duì)附圖作圖面說(shuō)明附圖1.顯示莧菜籽蛋白進(jìn)行純化的陽(yáng)離子交換層析圖；附圖2.顯示莧菜籽蛋白進(jìn)行再純化的陽(yáng)離子交換色譜圖；附圖3.顯示附圖2.的SDS-PAGE圖，其中Af2；Bf4；Cf5；Df6；Ef7；F分子量標(biāo)準(zhǔn)天花粉蛋白，溶菌酶；附圖4.顯示莧菜籽蛋白在Blue Sepharoe Fast Flow柱上的層析行為。
具體實(shí)施例實(shí)施例1.從莧菜籽中分離純化莧菜籽蛋白(Amaramangin)取200g莧菜籽，加入適量的20mMol/L醋酸緩沖液(pH4.5)勻漿，離心或過(guò)濾收集提取液，用50％的醋酸調(diào)pH4.0，靜置分層，離心或過(guò)濾收集清液，清液上SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換柱，用20mMol/L pH4.5醋酸緩沖液洗柱，然后用20mMol/L pH6.0磷酸緩沖液洗去雜蛋白，最后用0～1M NaCl(在20mM pH6.0磷酸緩沖液中)梯度洗脫。洗脫圖譜見(jiàn)附圖1。
合并9-15管收集液，用50％醋酸調(diào)pH4.0，再次加在SP-瓊脂糖快流速離子交換柱上，用20mMol/L pH4.5的醋酸緩沖液洗柱，再用10mMol/LpH7.2的磷酸緩沖液洗去雜蛋白，最后用0-0.5M NaCl(在10mMol/L磷酸緩沖液中)梯度洗脫，洗脫圖見(jiàn)附圖2。所得組分中第4-7管即為莧菜籽蛋白。SDS-PAGE顯示其分子量為29kD。
實(shí)施例2.SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)核糖體失活蛋白-莧菜籽蛋白，在Bio-Rad公司的微量垂直平板電泳儀上進(jìn)行SDS-PAGE，SDS-PAGE按Leammli的方法進(jìn)行，分離膠濃度為12％，濃縮膠濃度為4％，電泳后按郭堯君方法(1991，生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，1832-37)，用考馬斯亮蘭染色，以天花粉蛋白(MW～27kDa)和溶菌酶(MW～14kDa)為分子量標(biāo)準(zhǔn)對(duì)照，顯示莧菜籽蛋白的分子量為29kDa。SDS-PAGE結(jié)果見(jiàn)附圖3。
實(shí)施例3.SDS-PAGE后阿爾新藍(lán)染色莧菜籽蛋白參照實(shí)施例2的方法進(jìn)行SDS-PAGE，電泳后的膠片用阿爾新藍(lán)染色(孫冊(cè)，《凝集素》，p21)。SDS-PAGE后的凝膠在12.5％的三氯乙酸中固定30分鐘，然后在含7％乙酸的過(guò)碘酸溶液中氧化一小時(shí)，再放入0.5％的偏重亞硫酸鈉溶液中充分震蕩30分鐘，最后用0.5％阿爾新藍(lán)(溶于7％乙酸中)染色4小時(shí)。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)莧菜籽蛋白帶呈藍(lán)綠色，證明莧菜籽蛋白是糖蛋白。
糖蛋白染色后的凝膠重新按實(shí)施例2方法，用考馬斯亮蘭復(fù)染，觀(guān)察到原染色帶位置是莧菜籽蛋白帶。
實(shí)施例4.Blue-Sepharose Fast Flow層析行為Blue-Sepharose Fast Flow是Pharmacia Brotech公司生產(chǎn)的CibacronBlue 3GA交聯(lián)的瓊脂糖快流速凝膠。合并附圖2中第4-7管，對(duì)10mMol/LpH7.5的Tris-HCl緩沖液透析后，上Blue-Sepharose Fast Flow層析柱，先用上樣緩沖液洗去雜蛋白，然后用0.3M NaCl(在10mMol/L pH7.5 Tris-HCl緩沖液中)階段洗脫，得一尖峰，見(jiàn)附圖4。
此例證明莧菜籽蛋白可以被Cibacron Blue-介質(zhì)所吸附。
權(quán)利要求
1.莧菜籽核糖體失活蛋白，是從莧菜的種籽中分離出來(lái)的，其特征在于，它的分子量為29kDa，等電點(diǎn)大于9。
2.如權(quán)利要求1所述的莧菜籽核糖體失活蛋白，其特征在于，它具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
3.一種權(quán)利要求1的莧菜籽核糖體失活蛋白的分離純化方法，包括緩沖溶液抽提、二次SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析，其特征在于，通過(guò)適當(dāng)?shù)木彌_液抽提和二次SP-瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析。
4.一種權(quán)利要求3所述，從雞冠花Celosia cristata L，青葙子Celosiaargentea L，千里紅Gomphrena globosa L，老槍谷Amaranthuscaudatus L.，刺莧A.spinosus L.，綠穗莧A.hybridus，反枝莧A.retroflexus采用相似的方法分離出核糖體失活蛋白，其分子量在29kDa左右，等電點(diǎn)偏堿性，并具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
5.如權(quán)利要求3所述，可以從常見(jiàn)蔬菜菠菜屬植物菠菜的種籽中，采用相似的方法分離出核糖體失活蛋白，其分子量在29kDa左右，等電點(diǎn)偏堿性，并具有強(qiáng)烈抑制細(xì)胞內(nèi)核糖體蛋白質(zhì)合成的活性。
6.莧菜籽核糖體失活蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該蛋白可作為藥物原料應(yīng)用于制備抗腫瘤制劑、抗病毒制劑和抗艾滋病毒制劑。
7.如權(quán)利要求1所述的莧菜籽蛋白的應(yīng)用，其特征在于，該蛋白可作為RNAN-糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)的研究，并可作為制備免疫毒素的毒素材料。
全文摘要
莧菜籽核糖體失活蛋白(Amaramangin)，涉及到生物化學(xué)中一種核糖體失活蛋白及其制備與應(yīng)用。它是從常用蔬菜莧菜(Amaranthus mangostanusL.)的種籽中分離出來(lái)的，其分子量為29 kDa(SDS－PAGE檢測(cè))，等電點(diǎn)大于9。我們采用溫和的提取方法，經(jīng)二次SP－瓊脂糖快流速凝膠離子交換層析，獲得了高純度的蛋白質(zhì)。該蛋白可以作為藥物原料應(yīng)用于制備抗腫瘤制劑、抗病毒制劑和抗艾滋病毒制劑；可以作為RNA N－糖苷酶用于分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究，并可用作為免疫毒素的毒素材料。
文檔編號(hào)A61P31/12GK1491961SQ0214566
公開(kāi)日2004年4月28日 申請(qǐng)日期2002年10月22日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月22日
發(fā)明者陳明晃, 王艷芹, 王梓壬, 石小莉, 葉曉明 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院福建物質(zhì)結(jié)構(gòu)研究所