專(zhuān)利名稱(chēng)：人截短型重組可溶性trail－180蛋白及其在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白及其在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用背景技術(shù)TRAIL(TNF-Related Apoptosis Inducing Ligand)/Apo-2L是1995年發(fā)現(xiàn)的能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡的細(xì)胞因子，屬TNF超家族成員之一。人的TRAIL蛋白屬于II型跨膜蛋白，它的一級(jí)結(jié)構(gòu)由281個(gè)氨基酸組成，分子量為32kDa，其中胞漿區(qū)有17個(gè)氨基酸，跨膜區(qū)有21個(gè)氨基酸，胞外區(qū)則有243個(gè)氨基酸。
TRAIL蛋白的分布非常廣泛，在心肌細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、脾細(xì)胞、胸腺細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、卵巢和小腸細(xì)胞上均有表達(dá)，但在正常的肝細(xì)胞、腦細(xì)胞和睪丸細(xì)胞上則不表達(dá)。TRAIL的胞外區(qū)可被金屬蛋白酶割裂下來(lái)而成為可溶性的細(xì)胞因子，生物學(xué)功能研究證實(shí)，可溶性TRAIL蛋白可誘導(dǎo)不同來(lái)源的腫瘤細(xì)胞及病毒轉(zhuǎn)化的細(xì)胞發(fā)生凋亡，包括腸癌、乳腺癌、黑色素瘤、肺癌、腎癌、中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤、白血病、皮膚癌和多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞等。動(dòng)物全身使用重組的可溶性TRAIL，可誘導(dǎo)所接種的腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡、腫瘤生長(zhǎng)受抑、提高荷瘤動(dòng)物的存活期，而且在嚙齒類(lèi)和其它靈長(zhǎng)類(lèi)動(dòng)物的體內(nèi)實(shí)驗(yàn)中沒(méi)有發(fā)現(xiàn)任何毒副作用。
目前國(guó)際上普遍使用的重組可溶性TRAIL包含一個(gè)氨基酸95～281的片段。該蛋白質(zhì)分子量大、殺腫瘤細(xì)胞活性低，誘導(dǎo)50％細(xì)胞凋亡率的蛋白質(zhì)濃度在200ng/ml以上。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種具有分子量小、活性高的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白；本發(fā)明的另一目的在于該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明的技術(shù)方案如下本發(fā)明提供的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白是一個(gè)包含氨基酸102～281TRAIL蛋白的一個(gè)片段，在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N末端為蘇氨酸，C末端為甘氨酸，含有11個(gè)精氨酸、6個(gè)組氨酸、11個(gè)賴(lài)氨酸、一個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)PI＝9.14，為一堿性蛋白；人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)反向平行的β片層；該蛋白的cDNA序列有540個(gè)核苷酸組成，編碼180個(gè)氨基酸；該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列見(jiàn)序列1；該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的氨基酸序列見(jiàn)序列2。
本發(fā)明提供的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用，即可用于制備腫瘤治療藥物。
本發(fā)明提供的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白能顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，殺死或/和抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)；與國(guó)際上普遍使用的TRAIL95～281片段比較，TRAIL102～281具有分子量小、活性高(誘導(dǎo)50％細(xì)胞凋亡率的蛋白質(zhì)濃度在10ng/ml左右)的特點(diǎn)，比TRAIL95～281蛋白的殺腫瘤細(xì)胞活性高20倍，在腫瘤治療藥物的制備中具有廣闊的應(yīng)用前景。
本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的制備如下1.構(gòu)建pGEX-4T-TRAIL-180質(zhì)粒載體根據(jù)已知的人TRAIL cDNA序列，設(shè)計(jì)了上游和下游兩條寡聚核苷酸引物，上游引物為CGG AAT TCC TAC AGT TCA AGA AAA GAC AC；下游引物為CGG AATTCT TAA CCA ACT AAA AAG GCC CC；以pSectagA-TRAIL為模板，用PCR方法擴(kuò)增長(zhǎng)度為540bp的TRAIL cDNA片段；將PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收、純化，用T4 DNA Ligase連接過(guò)夜，克隆至pGEX-4T載體中，構(gòu)建成pGEX-4T-TRAIL180質(zhì)粒載體，見(jiàn)圖1，圖1為pGEX-4T-TRAIL-180質(zhì)粒載體圖；2該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌，篩選陽(yáng)性克隆，得到表達(dá)人截短型重組可溶性TRAIL-180質(zhì)粒的菌株，從菌株中提取質(zhì)粒，將得到的質(zhì)粒在3100測(cè)序儀上進(jìn)行測(cè)序及DNA序列分析，結(jié)果證明該質(zhì)粒的cDNA序列與Gene Bank登錄的TRAIL cDNA全長(zhǎng)序列中的391～930堿基序列完全相同；將pGEX-4T-TRAIL-180質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21大腸桿菌，加入IPTG(50μM)，在30℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，6000rpm離心10min，棄上清，PBS混懸細(xì)菌沉淀，加入溶菌酶(100μg/ml)，冰浴后超聲波裂解菌體，16000rpm離心30min，收集上清，過(guò)谷胱甘肽-Sepharose-4B柱，再經(jīng)凝血酶酶切，收集切割下來(lái)的蛋白溶液，即為本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白；經(jīng)測(cè)定，本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的生物學(xué)特性為人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白是一個(gè)包含氨基酸102-281 TRAIL蛋白的一個(gè)片段，在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N末端為蘇氨酸，C末端為甘氨酸，含有11個(gè)精氨酸、6個(gè)組氨酸、11個(gè)賴(lài)氨酸、一個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)PI＝9.14，為一堿性蛋白；該蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)反向平行的β片層；人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列有540個(gè)核苷酸組成，編碼180個(gè)氨基酸；該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列見(jiàn)序列1該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的氨基酸序列見(jiàn)序列

附圖1為pGEX-4T-TRAIL-170質(zhì)粒載體的構(gòu)建示意圖；附圖2-1至附圖2-6為本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示意圖，呈現(xiàn)劑量依賴(lài)性關(guān)系；本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；其中附圖2-1未用TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞對(duì)照組，細(xì)胞的凋亡率為16.75％；附圖2-250ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為50.59％；附圖2-325ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為50.56％；附圖2-412.5ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為42.18％；附圖2-56.25ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為33.21％；附圖2-63.125ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為26.41％；附圖3為PBS組和本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組的腫瘤重量比較示意圖；本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，p＝0.049＜0.05；附圖4為PBS組和本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組的腫瘤大小比較示意圖；本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，p＝0.023＜0.05；具體實(shí)施方式
實(shí)施例1，本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白具有殺傷腫瘤細(xì)胞的作用的實(shí)驗(yàn)將純化的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白處理各種不同的腫瘤細(xì)胞系，如Jurkat細(xì)胞系(人T淋巴細(xì)胞白血病細(xì)胞)、MCF-7細(xì)胞系(人乳腺癌細(xì)胞)、KU-8細(xì)胞系(人陰莖癌細(xì)胞)、U937細(xì)胞系(人髓樣白血病細(xì)胞)、NCI-H929細(xì)胞系和IM-9細(xì)胞系(人骨髓瘤細(xì)胞)，以FITC-Annexin V和PI染色為細(xì)胞凋亡的檢測(cè)指標(biāo)，流式細(xì)胞術(shù)分析TRAIL-180誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的情況，結(jié)果證明，TRAIL-180具有廣泛的殺傷腫瘤細(xì)胞的作用，但不同類(lèi)型的腫瘤細(xì)胞敏感程度不一樣，其中，Jurkat細(xì)胞系和MCF-7細(xì)胞系對(duì)TRAIL-170的敏感性最高，誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞50％凋亡率的TRAIL180蛋白濃度在10ng/ml左右；見(jiàn)附圖2-1至附圖2-6，附圖2-1至附圖2-6為本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白誘導(dǎo)Jurkat細(xì)胞凋亡的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)示意圖；其中附圖2-1未用TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞對(duì)照組，細(xì)胞的凋亡率為16.75％；附圖2-250ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為50.59％；附圖2-325ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為50.56％；附圖2-412.5ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為42.18％；附圖2-56.25ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為33.21％；附圖2-63.125ng/ml TRAIL-180蛋白處理的Jurkat細(xì)胞凋亡，細(xì)胞凋亡率為26.41％；由本實(shí)施例可知，本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-170蛋白處理組可顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；實(shí)施例2本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白具有殺傷小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的作用的實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)用動(dòng)物Balb/C小鼠，共10只，分成兩組，每組5只，一組為PBS陰性對(duì)照，另一組為T(mén)RAIL-180蛋白處理組；將體外培養(yǎng)的小鼠骨髓瘤細(xì)胞(SP2/0細(xì)胞，4×106/只)連同TRAIL-180蛋白(100μg/只)或PBS，注射于小鼠背部皮下，5天后同劑量TRAIL-180蛋白或PBS加強(qiáng)注射，21天后處死小鼠，測(cè)量形成腫瘤的大小和重量，結(jié)果顯示，PBS組小鼠背部均有腫瘤生長(zhǎng)，且大小均勻，而TRAIL-180蛋白處理的小鼠有兩只背部未長(zhǎng)腫瘤，一只腫瘤較小，兩只腫瘤的大小同PBS組，將兩組的數(shù)據(jù)進(jìn)行t檢驗(yàn)，證明二者有顯著性差異；見(jiàn)附圖3和附圖4，附圖3為PBS組和本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白處理組的腫瘤重量比較示意圖，本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白處理組可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，p＝0.049＜0.05；附圖4為PBS組和本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白處理組的腫瘤大小比較示意圖，本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白處理組可顯著抑制小鼠體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，p＝0.023＜0.05；說(shuō)明TRAIL-180蛋白在體內(nèi)可以發(fā)揮殺腫瘤細(xì)胞作用，抑制腫瘤的生長(zhǎng)。
本發(fā)明提供的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列為序列1acagttcaag aaaagcaaca aaatatttct cccctagtga gagaaagaggtcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaacacattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaataaactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgcacttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatctattcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaagaacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctgaccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatgcagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaaggaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacatggaccatgaa gccagttttt ttggggcctt tttagttggc本發(fā)明提供的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的氨基酸序列為序列2Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg GluArg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly ArgSer Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu GlyArg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe LeuSer Asn Lau His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys GlyPhe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu IleLys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr LysTyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg AsnSer Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr GlnGly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser ValThr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe GlyAla Phe Leu Val Gly
權(quán)利要求
1.一種人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白，其特征在于，該蛋白包含氨基酸102-281 TRAIL蛋白的一個(gè)片段，在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N末端為蘇氨酸，C末端為甘氨酸，含有11個(gè)精氨酸、6個(gè)組氨酸、11個(gè)賴(lài)氨酸、一個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)PI＝9.14，為一堿性蛋白；該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)反向平行的β片層；該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列由540個(gè)核苷酸組成，編碼180個(gè)氨基酸。
2.按權(quán)利要求1所述的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白，其特征在于，該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的cDNA序列為acagttcaag aaaagcaaca aaatatttct cccctagtga gagaaagaggtcctcagaga gtagcagctc acataactgg gaccagagga agaagcaacacattgtcttc tccaaactcc aagaatgaaa aggctctggg ccgcaaaataaactcctggg aatcatcaag gagtgggcat tcattcctga gcaacttgcacttgaggaat ggtgaactgg tcatccatga aaaagggttt tactacatctattcccaaac atactttcga tttcaggagg aaataaaaga aaacacaaagaacgacaaac aaatggtcca atatatttac aaatacacaa gttatcctgaccctatattg ttgatgaaaa gtgctagaaa tagttgttgg tctaaagatgcagaatatgg actctattcc atctatcaag ggggaatatt tgagcttaaggaaaatgaca gaatttttgt ttctgtaaca aatgagcact tgatagacatggaccatgaa gccagttttt ttggggcctt tttagttggc該人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白的氨基酸序列為T(mén)hr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu Val Arg Glu ArgGly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr Arg Gly Arg SerAsn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys Ala Leu Gly ArgLys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His Ser Phe Leu SerAsn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His Glu Lys Gly PheTyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln Glu Glu Ile LysGlu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr Ile Tyr Lys TyrThr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser Ala Arg Asn SerCys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser Ile Tyr Gln GlyGly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe Val Ser Val ThrAsn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser Phe Phe Gly Ala PheLeu Val Gly
3一種權(quán)利要求1所述的人截短型重組可溶性TRAIL-180蛋白在制備腫瘤治療藥物中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明的人截短型重組可溶性TRAIL－180蛋白是一個(gè)包含氨基酸102－281 TRAIL蛋白的一個(gè)片段，在蛋白質(zhì)一級(jí)結(jié)構(gòu)中，N末端為蘇氨酸，C末端為甘氨酸，含有11個(gè)精氨酸、6個(gè)組氨酸、11個(gè)賴(lài)氨酸、一個(gè)半胱氨酸，等電點(diǎn)PI＝9.14，為一堿性蛋白；該蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)中包含兩個(gè)反向平行的β片層；該蛋白的cDNA序列由540個(gè)核苷酸組成，編碼180個(gè)氨基酸；該蛋白能夠顯著誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，殺死或/和抑制動(dòng)物體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，與國(guó)際上普遍使用的TRAIL
文檔編號(hào)A61P35/00GK1448404SQ0211626
公開(kāi)日2003年10月15日 申請(qǐng)日期2002年3月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年3月28日
發(fā)明者陳英玉, 陳佺, 馬大龍, 韓文玲, 金海京, 王曉慧, 李現(xiàn)亭, 史須 申請(qǐng)人:中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所, 北京大學(xué)