專利名稱：含分離自白花蛇舌草的活性級分的組合物及使用方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬藥物范疇，明確而言，其涉及用于預防及疾病治療的抗-血管生成藥物領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
血管生成作用是自既存的血管往外生長生成新的血管結(jié)構(gòu)的過程，在此過程中，因為支撐內(nèi)皮細胞的基膜被蛋白水解酶分解，因而內(nèi)皮細胞會脫離基膜，而后這些細胞會遷移出原來的血管、進行分裂，并形成新分化的血管結(jié)構(gòu)(Risau，(1997)Nature386671-674；Wilting等人.，(1995)Cell.Mol.Biol.Res.41(4)219-232)。已發(fā)現(xiàn)數(shù)種不同生物因子具有控制血管生成的功能(Bussolino等人.，(1997)Trends in Biochem Sci22(7)251-256；Folkman及D’Amore，(1996)Cell 871153-1155)，其包括具有各種功能的蛋白質(zhì)，諸如生長因子、細胞表面受體、蛋白酶、蛋白酶抑制劑，及胞外基質(zhì)蛋白質(zhì)(Achen及Stacker，(1998)Int.J.Exp.Pathol.79255-265；Devalaraja及Richmond，(1999)Trends in Pharmacol.Sci.20(4)151-156；Hanahan，(1997)Science27748-50；Maisonpierre等人，(1997)Science27755-60；Suri等人，(1996)Cell 871171-1180；Sato等人，(1995)Nature37670-74；Mignatti及Rifkin，(1996)Enzyme Protein49117-137；Pintucci等人.，(1996)Semin Thromb Hemost22(6)517-524；Vernon及Sage，(1995)Am.J.Pathol.147(4)873-883；Brooks等人.，(1994)Science 264569-571；Koch等人.，(1995)Nature 376517-519)。血管生成作用的復雜性及控制其進展的因子的多樣性提供控制體內(nèi)血管生成作用以為治療方法的可用思維。
正常情況下，血管生成作用以周密控制的方式發(fā)生于胚胎發(fā)育、生長，及特別情況下(例如傷口愈合及女性生殖循環(huán))(Wilting及Christ，(1996)Naturwissenschaften 83153-164；Goodger及Rogers，(1995)Microcirculation 2329-343；Augustin等人.，(1995)Am.J.Pathol.147(2)339-351)。血管生成作用過程中某些重要的步驟有1)生長因子(例如血管內(nèi)皮生長因子，VEGF)信號作用；2)基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)同VEGF受體相互作用；3)內(nèi)皮細胞遷移至生長因子信號作用位置；及4)內(nèi)皮細胞管狀物的生成。病理性血管生成作用在一些人類疾病中扮演重要角色，包括腫瘤生長及移轉(zhuǎn)性癌癥、糖尿病性視網(wǎng)膜病、類風濕性關(guān)節(jié)炎，及其他發(fā)炎性疾病，諸如牛皮癬(Folkman，(1995)Nature Med.1(1)27-31；Polverini，(1995)Rheumatology 38(2)103-112；Healy等人.，(1998)Hum.Reprod.Update 4(5)736-396)。在這些例子中，疾病的惡化由血管生成作用的持續(xù)失控所導致，例如，在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，新毛細血管會侵入關(guān)節(jié)，并破壞軟骨，在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，視網(wǎng)膜中的毛細血管會侵入玻璃體，出血并導致失明，重要的是，腫瘤生長及移轉(zhuǎn)作用與血管生成作用有關(guān)，大部分原發(fā)性固體腫瘤會經(jīng)歷一段長時間的無血管期，期間的生長局限于直徑約為1-2毫米范圍，在此大小的內(nèi)，腫瘤細胞可經(jīng)由被動擴散作用獲取所需的氧及營養(yǎng)，而這些微觀腫瘤質(zhì)體最終會啟動血管生成作用，并募集周邊血管，開始長出毛細血管在腫瘤質(zhì)體內(nèi)形成血管，提供腫瘤持續(xù)擴展并移轉(zhuǎn)惡性腫瘤到遠端位置。雖然在探索病理性血管生成作用的生物過程方面已有明顯的進展，然而目前并無有效的藥用化合物可以控制體內(nèi)的血管生成作用，因此，有效控制血管生成作用的治療法有可能減緩大量人類疾病。
傳統(tǒng)上，通過篩選具有所需藥物特性的合成化學化合物，而后在體內(nèi)試驗其毒性及有效性，以開發(fā)出藥用化合物。利用此法所篩選的化合物常于體內(nèi)具有毒性副作用，且此方法尚未成功發(fā)展出可作為疾病療法的有效的血管生成抑制劑。近來，已應(yīng)用分子生物技術(shù)發(fā)展血管生成作用抑制劑，已發(fā)現(xiàn)，在實驗?zāi)Ｐ椭锌煽刂蒲苌傻难苌傻牡鞍滓种苿?，諸如血管抑制蛋白(angiostatin)(O’Reilly等人.，(1994)Cell79(2)315-328)及內(nèi)皮抑制蛋白(endostatin)(O’Reilly等人.，(1997)Cell 88(2)277-285)。但是，生產(chǎn)此種蛋白質(zhì)相當昂貴，難以制劑，且不易傳送至受體中。目前，蛋白質(zhì)血管生成抑制劑尚未開發(fā)為疾患者者的醫(yī)療藥物，因此，需要能安全施用于患者，且有效抑制血管內(nèi)皮細胞的病理性生長的治療性化合物。本發(fā)明提供的組合物及方法即是用于此目的，并可提供相關(guān)的優(yōu)勢。
發(fā)明公開本發(fā)明提供自白花蛇舌草(Hedyotis Diffusae)提取藥學活性級分(又稱“提取物”，“化合物”或“藥物”)的方法。在一方面，該方法自白花蛇舌草熱(約80-90℃，約30分鐘)茶中提取出名為AHD04級分，以柱層析分離，其具有光學吸收值介于約210nm至約250nm。獲得此級分的一個方法是將有效量的白花蛇舌草泡在有效量的熱水中，制成液態(tài)提取物，后過濾該提取物后獲得澄清的液體提取物。此命名為EHDa的粗提取物可加工成食品或健康補品。EHDa經(jīng)冷凍干燥，重懸浮，利用層析分離出藥物活性級分ADH04。
本發(fā)明提供通過傳送生長抑制含量的本發(fā)明級分至細胞中，以抑制內(nèi)皮細胞生長的方法，通過傳送抗血管生成作用含量的級分至組織中，可以抑制組織中血管生成作用。本發(fā)明亦提供治療各種疾病，包括癌癥的方法。
附圖簡述

圖1描述本發(fā)明的例示過程。然而需知，雖未總是申明在此所述藥劑僅為例示，其等同物為本領(lǐng)域所熟知。以下為實例，而其等同物屬于本發(fā)明范。
圖1描述分離可作食品及健康補品，名為EHDa活性級分的步驟及分離AHD04活性級分的方法。簡略而言，自白花蛇舌草提取粗提取物開始于將干燥植物浸泡于溫度范圍約60℃至約100℃的熱水中，時間約10分鐘至60分鐘。利用cheesecloth或Miracloth過濾液體提取物，去除液體提取物中的物理性物質(zhì)及大分子，而后以1000rpm的速度離心提取液約10分鐘，保留澄清的液態(tài)上清液，并冷凍干燥濃縮分離自白花蛇舌草的活性級分。進行CPAE分析來決定該新的粗提取物EHDa抑制血管生成作用的有效濃度。利用CPAE分析法分析所有的級分、沉淀物、及上清液、確保每一純化步驟中抗-血管生成活性并未消失，或遺漏。經(jīng)由層析法進一步分離產(chǎn)生基本純化的活性級分AHD04。
圖2所示為自G-25凝膠過濾層析分離的級分的活性[柱＝體積20公分×80公分；在4℃進行實驗，流速為3.0毫升/毫升水]。
圖3所示為自C-18層析柱所分離的級分的活性。
圖4所示為經(jīng)第二次C-18柱層析后所得的抑制作用(％)(Y軸)與濃度(X軸)關(guān)系圖形。
實施本發(fā)明的方式在此整篇公開內(nèi)容中各種發(fā)表文獻、專利及發(fā)表的專利說明書系以明確引用作為參考。這些發(fā)表文獻、專利及發(fā)表的專利說明書并入本專利說明書作為參考，以便更完全詳述本發(fā)明的技術(shù)狀態(tài)。
除非特別說明，本發(fā)明所采用操作為本領(lǐng)域內(nèi)分子生物學(包括重組技術(shù))、微生物學、細胞生物學、有機學、生物化學及免疫學常規(guī)技術(shù)，有文獻詳細說明此類技術(shù)。
定義本專利說明書中所用的某些名詞具有下列的定義。
除非在上下文中有明確指出，否則本專利說明書及權(quán)利要求中所指單數(shù)“一種”包括其復數(shù)，例如，“一種細胞”包括細胞的復數(shù)，包括其混合物。
本專利說明書中所用“包括”意指該組合物及方法中包含所列舉的元素，但不排除包含其他元素。當以“基本由…組成”定義組合物及方法時，不包括其他任何對組合有基本重要性的元素。因此，基本由本專利說明書所定義的元素組成的組合物不排除有在分離及純化時帶入的少量污染物，及藥學上可接受的載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液、防腐劑及類似物?！坝伞M成”指排除對于施用本發(fā)明組合物的其他超過微量成分的元素，及實質(zhì)性的方法步驟。由這些變化的術(shù)語定義的實施方案屬本發(fā)明范圍內(nèi)。
所有的數(shù)值名稱，例如pH、溫度、時間、濃度及分子量，包括范圍，以0.1數(shù)值增(+)或減(-)的變化近似。需知，雖然無法總是精確列舉，所有數(shù)值前有“約”字。亦需知，雖然無法總是明確申請，但本專利說明書所述試劑只是實例，而其等同物為本領(lǐng)域技術(shù)所熟知。
“分離”指將化合物從正常情況下與其有關(guān)的組成物、細胞及其他成分分開。
“受體”或“宿主”指脊椎動物，優(yōu)選動物或哺乳動物，更優(yōu)選為人類患者，哺乳動物包括，但不局限于，鼠科、猿類、人類患者、農(nóng)場動物、比賽動物、及寵物。
相互變化用詞，且不論單數(shù)或復數(shù)的“癌癥”、“惡性腫瘤”及“腫瘤”指已進行惡性轉(zhuǎn)化的細胞，其對宿主機體造成病理性傷害。利用良好建立的技術(shù)，特別是組織學檢查，可輕易區(qū)分原發(fā)性癌癥細胞(即，獲自靠近惡性轉(zhuǎn)換位點的細胞)與非-癌癥細胞。本專利說明書所用“癌癥”定義不僅包括原發(fā)性癌癥細胞，亦包括衍生自癌癥細胞祖先的任何細胞，包括移轉(zhuǎn)的癌癥細胞，及體外培養(yǎng)細胞，及衍生自癌癥細胞的細胞系。當稱某類癌癥正常為固體腫瘤時，“臨床可檢測的”腫瘤是種根據(jù)腫瘤質(zhì)量可檢測到的腫瘤；例如，利用諸如CAT掃描步驟、核磁共振影像(MRI)、X-光、超聲波或觸診檢測。只以生化或免疫學所發(fā)現(xiàn)的不足以符合此定義。
本專利說明書所指“抑制”為終止、延滯或減緩內(nèi)皮細胞的生長、增殖或細胞分裂，或血管在組織中的生成。監(jiān)控抑制作用的方法包括，但不局限于內(nèi)皮細胞增殖分析、利用測定血液成分及定量測定血管結(jié)構(gòu)密度以測定血管床的體積。當培養(yǎng)細胞為細胞混合物時，利用定量測定表達內(nèi)皮細胞特異性的標記，諸如血管生成因子、蛋白水解酶及內(nèi)皮細胞特異性的細胞吸附分子的細胞，以監(jiān)控新血管生成。
“組合物”指活性劑及其他惰性或活性化合物或組合物，如佐劑的組合?！八幬锝M合物”指包括活性劑和惰性或活性載體的組合物，其載體使該組合物適于體內(nèi)或體外或離體的診斷或治療用途。
本專利說明書中所用“藥學上可接受的載體”包括任何標準藥用載體，諸如磷酸緩沖鹽溶液、水及浮化液，諸如油/水或水/油浮化液，及各種類型的潤濕劑。組合物亦可包括穩(wěn)定劑及防腐劑。載體、穩(wěn)定劑及佐劑的實例，可參考Martin，REMINGTON’S PHARM.SCI.，15版(Mack出版公司.，Easton(1975))。
“有效量”指足以產(chǎn)生有益或所需結(jié)果的量，此量與預防有效量可相同或不相同，所謂預防有效量指預防疾病或疾病癥狀發(fā)生的必須量。可以在一或多次施用、應(yīng)用或劑量中施用該有效量。
申請者已經(jīng)確定自白花蛇舌草提取藥學活性級分的步驟。一方面，該步驟要求自白花蛇舌草熱茶(約80-90℃，約30分鐘)提取出級分，其中該級分具有光學吸收值介于約210nm至250nm，進一步，該活性級分具有光學吸收值約220nm至約240nm。另一方面，層析法純化后的藥物活性級分具有光學吸收值約230nm。將有效量的白花蛇舌草浸泡于有效量的熱水中，制備液態(tài)提取物，后過濾該提取物得澄清液體提取物，該提取物質(zhì)經(jīng)冷凍干燥，而后重懸于適當載體中，并以層析法分離出藥物活性級分。
本發(fā)明者亦發(fā)現(xiàn)該級分可抑制內(nèi)皮細胞生長，且具有抗-血管生成特性。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明提供通過傳送生長抑制含量的級分至細胞中，以抑制內(nèi)皮細胞生長的方法。本發(fā)明亦提供通過傳送抗-血管生成含量的本發(fā)明級分至組織中，以抑制組織中血管生成的方法。
本發(fā)明可應(yīng)用于體外或體內(nèi)。當應(yīng)用于體外操作時，將內(nèi)皮細胞或血管化組織培養(yǎng)于本領(lǐng)域所熟知的條件下，如以下所例示。細胞和/或組織可源自已建立的細胞株或培養(yǎng)自患者切片樣品。而后將該級分直接加入培養(yǎng)基中，或以藥物組合物中的成分傳送該級分。
不是每一種治療對每個個體均有效，因此，利用體外分析調(diào)節(jié)對各患者的有效性是有利的。本方法提供這些方式，以確定是否組合物或治療法可治療與病理性內(nèi)皮細胞增長或血管生成作用有關(guān)的特異性疾病。例如，自患者分離出組織切片，并處以本專利說明書定義的有效量的藥物組合物或治療法，并置于細胞增殖及生長的有效條件下。利用常規(guī)步驟，例如本專利說明書中所述的CPAE分析法，測定病理細胞生長的抑制，其顯示發(fā)明的組合物和/或治療法可有效治療患者。
血管生成作用或新血管的形成是新血管生成的基本步驟，其參與重要的生理事件，諸如生殖發(fā)育及傷口愈合。正常情況下，血管生成作用受到高度調(diào)控，而持續(xù)的血管生成作用的失控會造成疾病。在類風濕性關(guān)節(jié)炎中，新毛細血管會侵入關(guān)節(jié)，并破壞軟骨。在糖尿病性視網(wǎng)膜病中，視網(wǎng)膜中的毛細血管會侵入玻璃體，出血并導致失明。而腫瘤生長及移轉(zhuǎn)作用依賴血管生成。大部分原發(fā)性固體腫瘤會經(jīng)歷一段長時間的無血管期，并明顯靜止，期間的生長局限于直徑約為1-2毫米范圍，在此大小的內(nèi)，腫瘤細胞可經(jīng)由被動擴散作用獲取所需的氧及營養(yǎng)。通過募集周邊成熟宿主血管細胞開始長出新的毛細血管，開啟這些微觀腫瘤質(zhì)體的血管生成作用，最終為滲透腫瘤質(zhì)體，因此啟動無限擴展腫瘤質(zhì)體，及血移轉(zhuǎn)作用。血管生成啟動作用開始假設(shè)是通過腫瘤細胞異位生產(chǎn)并制造名為“腫瘤血管生成因子(TAF)”的生長因子而啟動。
本發(fā)明亦提供通過對患者施用本發(fā)明治療有效含量的提取物或含該提取物的藥物組合物，以治療患者中與病理性新血管生成有關(guān)疾病的方法。本文所用“治療”一詞指減緩病理新血管生成相關(guān)癥狀，及減少新血管生成作用。此種疾病包括，但不局限于關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤，角膜移值排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉柏綜合癥、心肌血管生成作用、及硬皮癥。關(guān)節(jié)炎疾病實例選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎。對于治療癌癥及固體腫瘤而言，“治療”包括抑制血管的生長，使得腫瘤和/或癌細胞生長時所需的營養(yǎng)物質(zhì)缺乏。腫瘤及生成物減少，及可能消失不見。治療關(guān)節(jié)炎疾病時，會減少軟骨，特別是關(guān)節(jié)中血管的形成，使得這些區(qū)域移動性及靈活性增加。對于治療牛皮癬，用藥可減少皮膚性癥狀，諸如疙瘩、鱗片化及皮膚表面以下的可見血管。對于糖尿病性視網(wǎng)病而言，施用本發(fā)明活性級分可減少視網(wǎng)膜內(nèi)多余血管的形成，產(chǎn)生非障礙性視覺。治療卡波西氏肉瘤時，施用本發(fā)明級分可抑制血管的生長和/或血管的進一步形成，因此可抑制所產(chǎn)生的損傷和/或腫瘤。
當將該活性級分施予受體時，諸如小鼠、大鼠或人類患者，該級分可加至藥學可接受的載體中，并以全身性、經(jīng)口、經(jīng)皮或局部投藥方式施用于受體。治療含量可根據(jù)經(jīng)驗確定，并可根據(jù)欲治療的疾病、欲治療的患者，及治療方法所用活性級分的形式的毒性而調(diào)整。該活性級分可以經(jīng)口、靜脈內(nèi)、經(jīng)腹膜內(nèi)或經(jīng)皮方式傳送。當投與動物時，該方法可進一步確認活性級分的有效性。
當以動物模式為實例時，裸鼠(Balb/c NCR nu/nu雌性，Simonsen，Gilroy，CA)各組皮下植入約105至約109本專利說明書所定義的病理細胞，當移植物建立后，在移植物周邊以皮下注射施用該級分，提取物或化合物。利用游標測徑器測定其移植物在二個維度上大小的減少，每周測定兩次。
得自Jackson Labs(Maine)的MRL/Ipr小鼠(MRL/MpJ-Fas1pr)可用以測定或監(jiān)控對關(guān)節(jié)炎疾病的效果。有效治療效果包括減少動物關(guān)節(jié)處及后腿處的腫脹程度，及減少軟骨退化程度，其可利用X-光監(jiān)控。
在療程中可以單一劑量、復劑量、持續(xù)或間斷投藥實現(xiàn)體內(nèi)投藥。決定最有效方式及投藥劑量的方法為本領(lǐng)域所熟知，且可根據(jù)治療所用的組合物、治療目的、欲治療的靶細胞及欲治療的受體而調(diào)整。根據(jù)治療醫(yī)師所選定的劑量水平及形式進行單一劑量或復劑量投藥。本專利說明書公開施用該活性級分的適當劑量的劑型及投藥方法。
本發(fā)明組合物及藥物組合物可用以制備藥物和根據(jù)常規(guī)步驟施用諸如藥物組合物中的活性成分治療人類及其他動物。
該藥物組合物可以經(jīng)口、經(jīng)鼻、經(jīng)腸胃外或吸入療法投藥，且可為片劑、錠劑、顆粒、膠囊、藥丸、安瓶、栓劑或氣溶膠形式投藥，其投藥形式亦可為活性成分于水或非水稀釋液的懸浮液、溶液及乳化液、糖漿、顆?；蚍勰?。除了本發(fā)明化合物以外，該藥物組合物亦可含有其他藥物活性成分。
更具體的是，通過適當?shù)耐緩?，包括?jīng)口、直腸、鼻腔、局部(包括經(jīng)皮、氣溶膠、口腔及舌下)、陰道、經(jīng)腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮內(nèi))及肺部，可施用該活性級分(也稱活性成分)，以達治療目的。需知優(yōu)選途徑根據(jù)疾病狀況及患者年紀，及欲治療的疾病而有所不同。
需知本發(fā)明活性級分的適當劑量視疾病的類型及嚴重性及時期而定，且患者與患者之間有所不同。最佳劑量根據(jù)治療效益水平相對任何本發(fā)明療法的風險及負面效果的平衡而確定。
理想的是，施用提取物(“藥物”)或含它的組合物時，該活性化合物在疾病位點可達到最高濃度。例如，可通過靜脈注射藥物，可選鹽水中，或以口服投藥，例如以片劑、膠囊或含有活性成分的糖漿，而達到此目的。利用持續(xù)性輸注，可維持所需血該藥濃度，以便提供疾病組織中活性成分的治療有效量。本發(fā)明亦包括操作性組合物的用途，治療組合物中所需的每個成分藥劑的總劑量低于當每種單個治療化合物或藥物單獨使用時的所需劑量，因此，可以降低副作用。
雖然該藥物成份可以單獨施用，但優(yōu)選施用至少含有一種上述定義的活性成分與一種或多種藥學上可接受的載體及可選其他治療藥劑的藥物制劑。所謂每種載體必須“可接受”指其須與劑型中其他成分相容，且不會對患者有害。
劑型包括適合以經(jīng)口、直腸、鼻腔、局部(包括經(jīng)皮、口腔及舌下)、陰道、經(jīng)腸胃外(包括皮下、肌內(nèi)、靜脈內(nèi)及皮內(nèi))及肺部施用的劑型。劑型可以方便地以單位劑量形式存在，且可以藥學領(lǐng)域中所熟知的方法制備。這些方法包括將活性成分與構(gòu)成一種或多種附屬成分的載體結(jié)合。一般而言，劑型以將活性成分與液態(tài)載體或微細固態(tài)載體或兩者均質(zhì)緊密結(jié)合而制備，而后若有需要可定型產(chǎn)品。
適合經(jīng)口投藥的本發(fā)明劑型可為單個單位形式，諸如膠囊、藥丸或片劑，各含有事先確定含量的活性成分；可為粉末或顆粒；可為水或非水液體的溶液或懸浮液；或為水包油液態(tài)乳化液或油包水液態(tài)乳化液?；钚猿煞忠嗫蔀榇笏幫?、糖膏劑或糊劑形式。
可利用壓縮作用或定模作用，可選與一或多種附屬成分制成片劑。在適當?shù)膲嚎s機器中，壓縮自由流動形式的活性成分，諸如粉末或顆粒，可選混有粘合劑(例如聚烯吡酮、明膠、羥基丙基甲基纖維素)、潤僅劑、惰性稀釋劑、防腐劑、分解劑(例如淀粉乙醇酸鈉、交聯(lián)聚烯吡酮、交聯(lián)羧基甲基纖維素鈉)、表面活性劑或分散劑，制成壓縮片劑。在適當?shù)亩C器中，定?；煊卸栊砸簯B(tài)稀釋劑的粉末化合物后，可制成定模片劑，片劑可視情況包衣或蝕刻并配制成能提供使用時緩慢釋放或控制釋放活性成分的形式，例如，以各種比例的羥基丙基甲基纖維素提供所需的釋放速度，片劑可視情況涂覆腸衣，以便在胃部以外的消化道釋放。
適合口腔局部投藥的劑型包括含有經(jīng)調(diào)味基材，通常為蔗糖及阿拉伯膠或黃蓍膠調(diào)味的活性成分的糖錠；包含在惰性基材，諸如動物膠及甘油，或蔗糖及阿拉伯膠中含活性成分的軟錠片；及在適當液態(tài)載體中含有活性成分的漱口水。
根據(jù)本發(fā)明適合局部投藥的藥物組合物可制成軟膏、乳膏、懸浮液、乳液、粉末、溶液、貼片、凝膠、噴劑、氣溶膠或油狀物?；蛘撸瑒┬涂砂ú紬l或崩帶類藥品，諸如浸漬活性成分及可選一或多種賦型劑或稀釋劑的崩帶或吸附性貼片。
對眼睛或其他外部組織，例如口腔及皮膚的疾病而言，劑型優(yōu)選以含有活性成分的局部軟膏或乳膏施用。當調(diào)配成軟膏時，藥物可與石蠟物質(zhì)或與水易混合的軟膏基材使用?；蛘?，藥物成分可以水包油乳膏基材調(diào)配成乳膏。
假若有需要，乳膏基材的水相可包括，例如，至少約30％重量/重量的多羥基醇，即，具有兩個或多個羥基的醇類、諸如丙二醇、1，3-丁二醇、甘露醇、山梨糖醇、甘油及聚乙二醇及其混合物。局部劑型可包括能增進活性級分吸收或經(jīng)由皮膚或其他感染部件穿透的化合物，此種透皮促進劑的實例包括二甲基亞砜及相關(guān)的類似物。
本發(fā)明乳化液的油相包括任何已知方式的已知成分。雖然此相只包括乳化劑(或稱為乳化藥劑)，其可包括至少一種具有脂肪或油脂或兩者的乳化劑。優(yōu)選，親水乳化劑與作為穩(wěn)定劑的親脂性乳化劑一起。優(yōu)選包括油脂及脂肪。同時，含/不含穩(wěn)定劑的乳化劑組成所謂的乳化蠟，而蠟與油脂和/或脂肪組成所謂的乳化軟膏基材，其形成乳膏劑型的油狀分散相。
適合用于本發(fā)明劑型的乳化劑及乳化穩(wěn)定劑包括Tween 60、Span8、十六醇十八醇混合物、十四醇、單硬脂酸甘油酯及月桂硫酸鈉。
選擇適合于劑型的油脂或脂肪根據(jù)能夠達成的所需化妝品特性而定，因為活性化合物在大級分可能用于藥物乳化劑型的油脂中的溶解度相當?shù)?，因此，乳液?yōu)選為非-油膩性、非-染劑且可清洗掉的有適當稠度的產(chǎn)物，以避免自管狀容器或其他容器中滲漏出來?？墒褂弥辨I或支鏈，單元或雙元烷基酯，諸如二-異已二酸酯，硬脂酸異十六酯，椰子脂肪酸的丙二醇二酯，十四酸異丙酯，油酸癸酯，棕櫚酸異丙酯，硬脂酸丁酯，棕櫚酸2-乙基己酯，或已知為Crodamol CAP的支鏈酯的混合物。這些可根據(jù)所需要的特性單獨使用或組合使用。或者，可以使用高熔點脂肪，諸如白軟蠟和/或液態(tài)蠟或其他礦物油。
適合眼睛局部用藥的劑型包括眼藥水，其中活性成分溶解或懸浮于適當?shù)妮d體中，特別是活性成分的水性溶劑。用于直腸用藥的劑型可為含有適當基質(zhì)的栓劑，例如包含可可油或水楊酸。
適合陰道用藥的劑型可為子宮套、棉塞、乳液、凝膠、貼片、泡沫或噴霧劑型，除活性成分，尚可包括本領(lǐng)域中所熟知的適當載體。
載體為固體的適合鼻腔用藥的劑型，包括具有顆粒大小，例如范圍約20至約500微米的粗顆粒，其系以鼻吸入的方式投藥，即將含有粉末的容器靠近鼻子后，快速的吸入而進入鼻腔通道。載體為液態(tài)的適合鼻腔用藥的劑型，例如，鼻腔噴霧，鼻腔藥水，或以噴鼻器施用的氣溶膠，包括含有活性成分的水溶液或油脂溶液。
適合經(jīng)腸胃外投藥的劑型包括等張無菌注射用的水溶液或非水溶液，其可包含有抗-氧化劑，緩沖液，抑菌劑及使劑型與欲治療受體血液等張的溶質(zhì)；并且包括懸浮劑及粘稠劑，與設(shè)計為將化合物靶向血液成分或一或多種器官的脂質(zhì)體或其他微顆粒系統(tǒng)的水性或非水性無菌懸浮液。劑型可置于單位劑量或多劑量密封容器，例如，安瓶及小瓶，可以冷凍干燥(凍干的)方式保存，在使用的前，只需加入無菌液態(tài)載體，例如注射用水即可。即時注射用溶液及懸浮液可從前述無菌粉末，顆粒及片劑種類制得。
優(yōu)選的單位劑量劑型包括藥劑成分的每日劑量或單位，每日次劑量(subdose)如本專利說明書前述，或其適當級分。其亦可包括額外的活性藥劑，例如，抗-腫瘤，抗-癌，抗-血管生成藥劑或免疫促進劑。
需知，除了前述所特別說明的成分外，本發(fā)明的劑型可包括有關(guān)劑型類型的本領(lǐng)域其他常規(guī)藥劑，例如，適合口服者包括甜味劑，增稠劑及調(diào)味劑。
相同的提取物(“藥劑”)或組合物亦可用為獸用型劑型，其可例如以本領(lǐng)域中常規(guī)的方法制備。
本發(fā)明進一步提供篩選用以抑制新血管生成或內(nèi)皮細胞生長的治療藥劑的方法，篩選方法包括(a)將藥劑與適當?shù)募毎蚪M織樣品接觸；(b)將另一份適當?shù)募毎蚪M織與治療有效量的本發(fā)明提取物或含有該提取物的藥學可接受組合物接觸；及(c)比較步驟(a)樣品的生長與步驟(b)樣品的生長，其中生長抑制情況與步驟(b)樣品相同或相似程度的任何步驟(a)的試劑為抑制新血管生成或內(nèi)皮細胞生長的治療藥劑。
如本專利說明書所使用，適當?shù)臉悠芬庵溉魏魏袃?nèi)皮細胞的樣品。該方法可如本專利說明書所述在體外或體內(nèi)實施。
本發(fā)明亦提供治療受體病理性新血管生成相關(guān)疾病的試劑盒，該試劑盒包括治療含量的提取物及使用說明書，該試劑盒可用以治療關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移值排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐期勒-偉柏綜合癥、心肌血管生成作用、硬皮癥、牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎。
下列的實施例用以說明本發(fā)明，非限制本發(fā)明。
實施例材料下述方法采用下列材料。
將白花蛇舌草干燥植物均質(zhì)化，并以熱(80℃-90℃(Sigma)提取；醋酸鈉(Sigma)；硫酸銨(Sigma)；鹽酸(VWR科技公司)；磷酸酶底物(Sigma)；Sephadex G-25(Sigma)；及Triton X-100(Sigma)。
實施例1分離及純化本發(fā)明提供數(shù)個從白花蛇舌草制備生物活性級分的方法的具體實施例。一方面(如圖1所示)，該方法包括提取具有光學吸收值介于約210nm至約250nm的可溶級分AHD04。進一方面，該級分具有吸收值介于約220nm至240nm。進一方面，該活性級分的吸收值為約230nm。在進一方面，將植物的葉子和/或莖浸泡在熱水(60℃及60℃以上任何溫度，優(yōu)選為90℃以上)，提取茶液并濃縮，獲得EHDa。
實施例2以內(nèi)皮細胞培養(yǎng)物(EGG)分析法測定對血管生成的抑制作用用以測定血管生成抑制作用的百分比的分析法是D.T.Connally，等人，(1986)Anal.Biochem.152136-4經(jīng)(Liang及Wong(1999)ANGIOGENESISFROM THE MOLECULAR TO INTEGRATIVEPHARMACOLOGY，Maradoudakis編輯，Kluwer Academic/Plenum出版社，紐約)修飾過的變化方法，通過磷酸酶活性水平來測定細胞數(shù)目。將源自美國類型組織培養(yǎng)(ATTC)的CPAE(心肺動脈內(nèi)皮細胞，牛)在培養(yǎng)基MEM-10E中生長至近95％匯合度。以0.25％胰蛋白酶將細胞從組織培養(yǎng)瓶上釋放，將其接種在24-孔的組織培養(yǎng)盤中，密度為10000細胞/孔，細胞在37℃5.0％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8小時，加入分析樣品及對照，每個樣品加至兩個不同的孔中(100微升/孔)，以確保試驗重復性。樣品培養(yǎng)60小時后，吸出培養(yǎng)液，根據(jù)細胞酸性磷酸酶的呈色測定來測定細胞的數(shù)目。
實施例3細胞溶解/細胞毒性分析牛肺動脈內(nèi)皮(CPAE)細胞接種在24孔的培養(yǎng)盤中，每個孔10000細胞。在37℃，5％CO2下生長培養(yǎng)約60小時，每個孔中加入樣品一個劑量(約50微升至約100微升)，再培養(yǎng)30分鐘。培養(yǎng)的后，以倒置顯微鏡并通過使用ECC分析法視檢細胞的存在。這兩種方法用以檢測每個孔中是/否存在有內(nèi)皮細胞，使用不含樣品的對照細胞，其生長正常。
實施例4樣品滴定分析為確定級分中是否有抗-血管生成活性，例如ADH04為劑量相關(guān)性，對內(nèi)皮細胞進行滴定分析。制備濃度滴定自1.0毫克/毫升至0.00625毫克/毫升的樣品，不同樣品加至細胞中，空為對照組。結(jié)果示于表1(如下)。
表1不同濃度AHD04的血管生成抑制作用分析
實施例5抑制作用特異性為測定此抑制活性對內(nèi)皮細胞是否具有特異性，用HEP-2細胞(分離自人類喉組織)作對照組的FCC分析法，結(jié)果顯示HEP-2細胞對活性級分不敏感。
結(jié)果示于表2中。
表2
實施例6MMP分析P.C.Brooks，等人(1996)在“基質(zhì)金屬蛋白酶MMP-2通過與整合素ανβ3相互作用定位于侵害細胞表面”Cell85683-93中描述基質(zhì)金屬蛋白酶及αν/β3整合素相互作用的體外分析法。實驗樣品對MMP-2/ανβ3整合素復合物的效果確定該樣品作用機制與是否血管生成途徑這部分的任何破壞有關(guān)。這涉及測該實驗樣品是否可抑制MMP-2與ανβ3整合素的相互作用。開始時，以抗MMP-2抗體的ELISA進行，并測定這些抗體對樣品的結(jié)合。另外研究是否會有陽性結(jié)果產(chǎn)生。已知為MMP-2天然抑制劑的TIMP-2(基質(zhì)金屬蛋白酶-2的組織抑制劑)為對照組。
實施例7內(nèi)皮細胞管狀物/中心管形成分析在冰冷的96-孔微量盤的每個孔中置入馬萃膠(Matrigel)(10毫克/毫升濃度，60微升；Collaborative Lab#35423)，將微量盤置于室溫下15分鐘，而后在37℃培養(yǎng)30分鐘，讓馬萃膠進行聚合化，同時，在EGM-2(Clonetic#CC3162)中制備HUVEC，濃度為2×105細胞/毫升，以相同的培養(yǎng)基制備2X所要濃度的測試化合物(5個濃度水平)。細胞(500微升)與2X級分或化合物(500微升)混合，將雙份此200微升懸浮液置于聚合化的馬萃膠上，培養(yǎng)24小時后，以Bioquant Image Analysis系統(tǒng)拍下每個濃度樣品的情況，每個濃度拍三張。測定所形成小管/管狀物長度及交接點數(shù)目，與未處理對照組比較而評估藥效(IC50)。以TNP-470(NSC 642492)及紫杉醇(paclitaxel)(NSC125973)為參考化合物。
實施例8內(nèi)皮細胞遷移分析利用48-孔Boyden盒子及8微米孔徑大小膠原涂覆的(10微克/毫升老鼠尾部膠原；Collaborative Laboratories)聚碳酸濾膜(Osmonice公司)評估遷移。盒子底層孔只注入27-29微升DMEM培養(yǎng)基(基線)，或含有化學吸引物(bFGF，VEGF或Swiss3T3細胞條件化的培養(yǎng)基)的培養(yǎng)基。盒子上層加入在DMEM+1％BSA中制備的含/不含該級分或化合物的45微升HUVEC細胞懸浮液(1×106細胞/毫升)，在37℃下培養(yǎng)5小時后，濾膜以PBS潤濕，固定，并在Diff-Quick溶液中染色。將遷移細胞朝下方式將濾膜置于玻璃片上，且以Kimwipe除去上面的細胞，該試驗進行4-6個重復，每個孔計算五個視野。刺激對照組及以該級分或化合物處理的數(shù)值減去陰性未刺對照組數(shù)值，所得數(shù)據(jù)以平均遷移細胞±S.D作圖，從所得圖形數(shù)據(jù)計算出IC50。TNP-470(NSC642492)及紫杉醇(NSC125973)用為參考化合物。
為使本發(fā)明更為清楚，雖然前述發(fā)明以已利用說明及實施例進行了一定的詳細說明，但對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說顯然可以進行某些變化及修飾的技藝。例如，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說，本發(fā)明方法可與一或多種已知抗-腫瘤、抗-血管生成或免疫增進治療法及組合物組合，例如鯊魚軟骨，酪胺酸神經(jīng)鞘胺醇或神經(jīng)鞘胺醇。因此，本說明書及實施例不理解為用以限制所附權(quán)利要求限定的本發(fā)明范圍。
權(quán)利要求
1.自白花蛇舌草(Hedyotis Diffusae)組合物中制備生物活性級分AHD04的方法，其包括提取光學吸收值介于約210nm至約250nm的級分。
2.自白花蛇舌草組合物中制備生物活性級分EHDa的方法，其包括將有效量的白花蛇舌草浸泡在有效量的熱水中而獲得液態(tài)提取物，并過濾提取物而獲得EHDa的步驟。
3.權(quán)利要求第1項的方法，其包括步驟(a)將有效量白花蛇舌草浸泡于有效量熱水中，獲得液態(tài)提取物；(b)離心獲得澄清的液態(tài)提取物；(c)干燥液態(tài)提取物并重懸浮于可接受的載體中，及(d)通過層析法獲得效用級分，從而獲得吸收值介于約210nm至約250nm的生物活性提取物AHD04。
4.由權(quán)利要求第1項的方法獲得的生物活性提取物。
5.包含權(quán)利要求第4項的提取物及藥物可接受載體的組合物。
6.權(quán)利要求第1項的組合物，進一步包含有效量的選自抗-血管生成劑、抗-腫瘤劑及免疫增進劑的藥劑。
7.抑制內(nèi)皮細胞生長的方法，其包括向細胞傳送生長抑制含量的權(quán)利要求第4項的提取物。
8.抑制組織中血管生成的方法，其包括向組織中傳送抗-血管生成含量的權(quán)利要求第4項的提取物。
9.治療受體病理性新血管生成相關(guān)疾病的方法，其包括對受體施用治療有效量的權(quán)利要求第4項的提取物。
10.權(quán)利要求第9項的方法，其中疾病選自癌癥、關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、再狹窄癥、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移值排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉柏綜合癥、心肌血管生成作用、及硬皮癥。
11.權(quán)利要求第10項的方法，其中疾病為關(guān)節(jié)炎疾病，選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎。
12.權(quán)利要求第10項的方法，其中傳送以經(jīng)口、靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)、及經(jīng)皮方式實施。
13.權(quán)利要求第9項的方法，其中受體為動物。
14.權(quán)利要求第13項的方法，其中動物選自寵物、農(nóng)場動物或人類患者。
15.權(quán)利要求第7、8或9項中任一項的方法，進一步包括對受體施用有效量的選自抗-血管生成劑、抗-腫瘤劑或免疫促進劑的藥劑。
16.篩選可抑制新血管化或內(nèi)皮細胞生長的治療藥劑的方法，其包括步驟(a)將藥劑與適當?shù)募毎蚪M織樣品接觸；(b)將另一份適當?shù)募毎蚪M織與治療有效量的權(quán)利要求第4項的本發(fā)明提取物接觸；及(c)比較步驟(a)樣品的生長與步驟(b)樣品的生長，其中步驟(a)的生長抑制情況與步驟(b)樣品具有相同或相似程度的任何藥劑為抑制新血管生成或內(nèi)皮細胞生長的治療藥劑。
17.權(quán)利要求第16項的方法，其中接觸為體外或體內(nèi)接觸。
18.權(quán)利要求第16項的方法，進一步包括將步驟(b)樣品與選自抗-血管生成劑、抗-腫瘤劑及免疫促進劑的藥劑接觸。
19.治療宿主病理性新血管生成相關(guān)疾病的試劑盒，其包含治療有效量的權(quán)利要求第4項的提取物及使用說明書。
20.權(quán)利要求第19項的試劑盒，其中疾病選自癌癥、關(guān)節(jié)炎疾病、基于新血管的皮膚疾病、糖尿病性視網(wǎng)膜病、卡波西氏(Karposi’s)肉瘤、衰老相關(guān)的斑退化癥、再狹窄癥、毛細血管擴張、青光眼、瘢痕瘤、角膜移植排斥、傷口肉芽作用、血管纖維瘤、歐斯勒-偉柏綜合癥、心肌血管生成作用、及硬皮癥。
21.權(quán)利要求第20項的試劑盒，其中疾病是關(guān)節(jié)炎疾病，選自牛皮癬關(guān)節(jié)炎、類風濕性關(guān)節(jié)炎及骨關(guān)節(jié)炎。
全文摘要
本發(fā)明提供自白花蛇舌草提取出藥物活性級分的方法；本發(fā)明提供通過傳送生長抑制含量的本發(fā)明級分至細胞，而抑制內(nèi)皮細胞生長的方法；本發(fā)明亦提供通過傳送抗－血管生成作用含量的本發(fā)明級分至組織中，而抑制組織中血管生成的方法；本發(fā)明亦提治療各種疾病的方法，包括癌癥。
文檔編號A61P17/02GK1499979SQ01822410
公開日2004年5月26日 申請日期2001年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月13日
發(fā)明者汪建平 申請人:維克沃姆有限公司