專利名稱：組織再生用基材、移植用材料及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及能夠在醫(yī)療領(lǐng)域廣泛利用的組織再生用基材、移植用材料及其制備方法。
背景技術(shù)：
近年來，培養(yǎng)細(xì)胞再次構(gòu)筑組織的再生組織學(xué)受到了矚目。按照這種再生組織學(xué)，在生物體親和性高的各種材料形成的組織再生用基材上保持各種細(xì)胞，進(jìn)行培養(yǎng)，得到移植用材料。
例如，對于嵌入了成纖維細(xì)胞等的培養(yǎng)皮膚，已知可以利用膠原海綿作為組織再生用基材(特開平4-332561號(hào)公報(bào))，最近還提示可以利用透明質(zhì)酸代替膠原(特開平11-319068號(hào)公報(bào))。
透明質(zhì)酸是一種具有二糖重復(fù)結(jié)構(gòu)的粘多糖，主要存在于動(dòng)物的關(guān)節(jié)液、眼球玻璃體、臍帶或真皮層等結(jié)締組織等中。另外，分子量的數(shù)量級(jí)為數(shù)十萬～數(shù)百萬，具有與非常大量的水結(jié)合的性質(zhì)，這與例如關(guān)節(jié)的低摩擦性和皮膚真皮組織的保水性有關(guān)。另外，受損傷的結(jié)締組織修復(fù)時(shí)，透明質(zhì)酸的產(chǎn)生一時(shí)變得活躍，促進(jìn)組織再構(gòu)筑時(shí)的細(xì)胞移動(dòng)。因此，可以說透明質(zhì)酸作為創(chuàng)傷覆蓋材料發(fā)揮優(yōu)良的性能。
但是，透明質(zhì)酸雖然作為創(chuàng)傷覆蓋材料發(fā)揮優(yōu)良的性能，但由于含水性非常高，作為組織再生用基材利用時(shí)，存在細(xì)胞的粘附性低，體外(in vitro)細(xì)胞培養(yǎng)困難的問題。
本發(fā)明的課題在于解決上述問題，其目的在于提供一種以透明質(zhì)酸作為主體的組織再生用基材，該組織再生用基材適于體外的細(xì)胞培養(yǎng)和移植后的組織再生。另一目的在于提供該組織再生用基材的制備方法。而且，另一目的在于提供利用該組織再生用基材的移植用材料及其制備方法。
發(fā)明公開為了解決上述課題，本發(fā)明人進(jìn)行了悉心研究，結(jié)果完成了下述第1～第4項(xiàng)的發(fā)明。
本發(fā)明的第1項(xiàng)特征在于，具備以透明質(zhì)酸和/或其衍生物為主體的透明質(zhì)酸海綿，以及在上述透明質(zhì)酸海綿的至少一面層壓來源于生物體的高分子材料構(gòu)成的海綿得到的細(xì)胞粘附部。該組織再生用基材的細(xì)胞粘附部由于層壓來源于生物體的高分子材料構(gòu)成的海綿，因而組織再生用基材中嵌入的細(xì)胞能良好地粘附。另外，由于具備以透明質(zhì)酸和/或其衍生物為主體的透明質(zhì)酸海綿，因而促進(jìn)細(xì)胞增殖等創(chuàng)傷治愈能力也優(yōu)良。因此，采用該組織再生用基材，能夠良好地進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)以及移植后的組織再生。另外，以高密度接種細(xì)胞時(shí)，以前的膠原海綿可見較大的收縮，而本發(fā)明的組織再生用基材幾乎見不到這種收縮。該組織再生用基材可以嵌入細(xì)胞作為移植用材料使用，此外也可以作為覆蓋創(chuàng)傷面的創(chuàng)傷覆蓋材料使用。
這里，作為透明質(zhì)酸的衍生物，除透明質(zhì)酸鈉和透明質(zhì)酸鉀等透明質(zhì)酸金屬鹽以外，還可以例舉透明質(zhì)酸的羥基或羧基等醚化、酯化、酰胺化、縮醛化、縮酮化得到的物質(zhì)等，其中優(yōu)選透明質(zhì)酸鈉。另外，作為透明質(zhì)酸海綿，優(yōu)選分子間交聯(lián)的物質(zhì)(交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿)。另外，作為來源于生物體的高分子材料，可以例舉膠原、明膠、纖維蛋白、海藻酸等，其中優(yōu)選膠原，特別是抗原性少的atherocollagen，另外膠原、明膠優(yōu)選分子間交聯(lián)的物質(zhì)。
這種組織再生用基材，優(yōu)選在透明質(zhì)酸海綿和細(xì)胞粘附部的邊界附近，形成來源于生物體的高分子材料摻雜在透明質(zhì)酸海綿內(nèi)的狀態(tài)。這時(shí)，即使透明質(zhì)酸海綿與細(xì)胞粘附部的膨潤率存在差異，也不用擔(dān)心在含水時(shí)兩者會(huì)發(fā)生剝離。
這種組織再生用基材，優(yōu)選透明質(zhì)酸海綿被作為支撐體的織物、無紡布或編織物支撐。這時(shí)，通過支撐體，組織再生用基材的強(qiáng)度增加，即使用小鑷子夾起來時(shí)，也不用擔(dān)心缺損，操作性良好。這里，作為支撐體的材料，只要是發(fā)揮加固透明質(zhì)酸海綿作用的物質(zhì)，并沒有特別的限定，可以例舉尼龍、聚酯、硅氧烷等合成高分子材料，或者絹、棉、麻等天然高分子材料等。
本發(fā)明的第2項(xiàng)是這種組織再生用基材的制備方法，其特征在于，包括下述步驟(1)通過將添加有交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液濃縮，得到透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物的交聯(lián)步驟，(2)通過將上述分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿的海綿化步驟，以及(3)通過使上述透明質(zhì)酸海綿的至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，真空冷凍干燥，形成上述細(xì)胞粘附部的層壓步驟。按照該制備方法，通過將透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥，制成透明質(zhì)酸海綿后，使其至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液，然后再次進(jìn)行真空冷凍干燥。采用該制備方法，可以比較容易地制備本發(fā)明第1項(xiàng)的組織再生用基材。
這里，在交聯(lián)步驟中，作為交聯(lián)劑，可以例舉水溶性環(huán)氧化合物或戊二醛等，其中優(yōu)選水溶性環(huán)氧化合物。作為該水溶性環(huán)氧化合物，可以例舉乙二醇二縮水甘油醚、甘油二縮水甘油醚、甘油三縮水甘油醚等。使用水溶性環(huán)氧化合物作為交聯(lián)劑時(shí)，其用量相對于透明質(zhì)酸和/或其衍生物，按重量比優(yōu)選為約1/2～1/10的比例，特別優(yōu)選1/5～1/10。
在該交聯(lián)步驟中，使用透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液，該水溶液中透明質(zhì)酸和/或其衍生物的濃度依賴于使用的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的種類和分子量等，為約0.5～1.5重量％。另外，作為用作溶劑的水，優(yōu)選pH5～6的離子交換水。
在該交聯(lián)步驟中，通過將添加有交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液濃縮，進(jìn)行透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)反應(yīng)，優(yōu)選加熱進(jìn)行。在使用水溶性環(huán)氧化合物作為交聯(lián)劑的場合，濃縮時(shí)的溫度優(yōu)選約30～60℃，更優(yōu)選約40～60℃，特別優(yōu)選約50℃。如果在超過60℃的高溫下加熱，則混合液會(huì)產(chǎn)生氣泡，有時(shí)得到的透明質(zhì)酸海綿的海綿結(jié)構(gòu)均勻性不充分。另一方面，在低于30℃的溫度下，分子間交聯(lián)反應(yīng)速度變小，有時(shí)得到所需濃度的分子間交聯(lián)物需要較長時(shí)間。另外，透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)反應(yīng)優(yōu)選在中性區(qū)域(pH5～8)或酸性區(qū)域(pH3～5)進(jìn)行。另外，如果在酸性區(qū)域進(jìn)行，與在中性區(qū)域進(jìn)行的場合相比，有濃縮時(shí)間變短的趨勢，因而優(yōu)選。
在該交聯(lián)步驟中，優(yōu)選在例如透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液濃度達(dá)到1～10重量％，優(yōu)選2～5重量％，特別優(yōu)選約5重量％的時(shí)刻，終止?jié)饪s。沒有充分進(jìn)行濃縮的場合，由于不能充分抑制以下的海綿化步驟后得到的透明質(zhì)酸海綿的膨潤性，因而不優(yōu)選。也就是說，如果透明質(zhì)酸海綿具有較高的膨潤性，例如在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)浸漬于液體培養(yǎng)基等中的場合，會(huì)發(fā)生必要以上的膨潤，結(jié)果變得不堅(jiān)固，且形狀也變大，因此難以操作。與此相對，如果如上所述控制濃縮的終點(diǎn)，由于能夠充分抑制透明質(zhì)酸海綿的膨潤性，因此浸漬于液體培養(yǎng)基等中的場合不會(huì)發(fā)生必要以上的膨潤，結(jié)果不會(huì)變得不堅(jiān)固，或者形狀變得過大，容易操作。另外，如果進(jìn)行交聯(lián)步驟直到濃縮液完全形成膜狀，即使通過真空冷凍干燥進(jìn)行海綿化步驟，也不能形成透明質(zhì)酸海綿，因此有必要在濃縮液形成膜狀前設(shè)定濃縮的終點(diǎn)。
接著，在海綿化步驟中，通過將交聯(lián)步驟后的分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥得到透明質(zhì)酸海綿，為了不使之形成較大的冰的晶體，真空冷凍干燥時(shí)的溫度條件為約-85℃～-30℃，優(yōu)選約-85℃～-50℃，更優(yōu)選約-85℃，真空條件優(yōu)選30×10-3～100×10-3mmbar(3～10Pa)，更優(yōu)選30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)。
在該海綿化步驟中，優(yōu)選對交聯(lián)步驟中不能進(jìn)行充分濃縮得到的分子間交聯(lián)物，進(jìn)行冷凍解凍操作至少1次以上后，真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿。真空冷凍干燥前不進(jìn)行冷凍、解凍操作的場合，有時(shí)會(huì)形成在含水時(shí)難以保持形狀的海綿，而在真空冷凍干燥前進(jìn)行冷凍、解凍操作的場合，雖然認(rèn)為結(jié)果恐怕會(huì)促進(jìn)氫鍵這樣的分子間相互作用，但是得到了含水時(shí)易于保持形狀的海綿。象這樣在真空冷凍干燥前冷凍、解凍的操作也可以進(jìn)行數(shù)次，如果考慮制備工序的簡化，優(yōu)選進(jìn)行1次。另外，真空冷凍干燥前冷凍、解凍的操作中冷凍的溫度條件為約-85℃～-30℃，優(yōu)選約-85℃～-50℃，更優(yōu)選約-85℃，另外解凍的溫度條件為約20℃～30℃，優(yōu)選為約30℃附近。其中，在解凍時(shí)也可以將溫度分成多個(gè)階段升高進(jìn)行解凍。這時(shí)，應(yīng)注意不要破壞分子間交聯(lián)物。另外，對于在交聯(lián)步驟中在適當(dāng)?shù)臐饪s條件下進(jìn)行充分濃縮得到的分子間交聯(lián)物，由于具有充分的強(qiáng)度，因此不一定必須進(jìn)行真空冷凍干燥前的冷凍/解凍操作。
在進(jìn)行以下的層壓步驟之前，優(yōu)選設(shè)置洗滌海綿化步驟中制備的透明質(zhì)酸海綿的水洗步驟。在該水洗步驟中，也可以在洗滌用水中添加使未反應(yīng)的交聯(lián)劑失活的失活劑。例如，使用水溶性環(huán)氧化合物作為交聯(lián)劑的場合，作為失活劑，優(yōu)選具有使環(huán)氧基開環(huán)的功能且對生物體無害的物質(zhì)，例如可以使用甘氨酸。
接著，在層壓步驟中，使透明質(zhì)酸海綿的至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，進(jìn)行真空冷凍干燥，從而形成細(xì)胞粘附部，作為來源于生物體的高分子材料，如上所述可以例舉膠原、明膠、纖維蛋白、海藻酸等，其中優(yōu)選膠原，特別是抗原性少的atherocollagen。另外，作為來源于生物體的高分子材料的水溶液，可以使用0.2～1.0重量％的水溶液，優(yōu)選0.2～0.5重量％的水溶液，更優(yōu)選0.5重量％的水溶液，另外來源于生物體的高分子材料和透明質(zhì)酸的重量比可以是1∶2～10，優(yōu)選1∶2～4，特別優(yōu)選1∶4。另外，真空冷凍干燥的條件與海綿化步驟中的真空冷凍干燥條件相同。
另外，在該層壓步驟中，由于使透明質(zhì)酸海綿的至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液，因而在得到的組織再生用基材的透明質(zhì)酸海綿與細(xì)胞粘附部的邊界附近，形成來源于生物體的高分子材料摻雜到透明質(zhì)酸海綿中的狀態(tài)。因此，即使透明質(zhì)酸海綿和細(xì)胞粘附部的膨潤率存在差異，使組織再生用基材含水時(shí)，也不用擔(dān)心兩者會(huì)剝離。
在該層壓步驟中，也可以在透明質(zhì)酸海綿的一面開設(shè)多個(gè)洞，使其開了洞的一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，真空冷凍干燥形成上述細(xì)胞粘附部。這時(shí)，來源于生物體的高分子材料的水溶液除了浸透透明質(zhì)酸海綿具有的多孔中，還進(jìn)入多數(shù)個(gè)洞中，因此在與透明質(zhì)酸海綿之間還可以得到錨環(huán)效果。這樣使各洞或多孔中浸透生物體高分子材料的水溶液后，進(jìn)行真空冷凍干燥，能夠進(jìn)一步提高組織再生用基材的透明質(zhì)酸海綿與細(xì)胞粘附部的密合性。另外，這里所說的“洞”，除圓洞或方洞等一般的洞以外，還包括例如斷縫或凹凸等比平面接觸面積大的洞。
在該層壓步驟中，使用膠原或明膠作為來源于生物體的高分子材料時(shí)，優(yōu)選層壓步驟后照射紫外線燈，使膠原或明膠部分進(jìn)行分子間交聯(lián)，防止含水時(shí)膠原或明膠流出，更優(yōu)選之后用氧化乙烯氣體等進(jìn)行滅菌。另外，不進(jìn)行上述水洗步驟時(shí)，為了使未反應(yīng)的交聯(lián)劑失活，優(yōu)選預(yù)先在來源于生物體的高分子材料的水溶液中添加失活劑。作為失活劑，與上述相同，例如使用水溶性環(huán)氧化合物作為交聯(lián)劑的場合，優(yōu)選甘氨酸等具有使環(huán)氧基開環(huán)的功能且對生物體無害的物質(zhì)。
另外，也可以采用以下的海綿化·層壓步驟代替上述海綿化步驟和層壓步驟。也就是說，也可以采用使交聯(lián)步驟后的分子間交聯(lián)物與來源于生物體的高分子材料的水溶液接觸后，進(jìn)行真空冷凍干燥，形成上述透明質(zhì)酸海綿以及細(xì)胞粘附部的步驟。這時(shí)，由于真空冷凍干燥進(jìn)行1次即可，因此可以使制備過程簡化。
在該海綿化·層壓步驟中，由于使海綿化前的分子間交聯(lián)物與來源于生物體的高分子材料的水溶液接觸，因此來源于生物體的高分子材料的水溶液難以浸透海綿化前的分子間交聯(lián)物，最終得到的組織再生用基材的透明質(zhì)酸海綿和細(xì)胞粘附部的密合性恐怕不充分。因此，優(yōu)選在透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物的上下方向上設(shè)置多數(shù)個(gè)洞，增大與來源于生物體的高分子材料的水溶液的接觸面積，得到錨環(huán)的效果。優(yōu)選這樣使生物體高分子材料的水溶液浸透各洞后，進(jìn)行真空冷凍干燥，從而提高組織再生用基材的透明質(zhì)酸海綿和細(xì)胞粘附部的密合性。另外，這里所說的“洞”，除圓洞或方洞等一般的洞以外，還包括例如斷縫或凹凸等比平面接觸面積大的洞。
采用該海綿化·層壓步驟，制作透明質(zhì)酸海綿被支撐體支撐的組織再生用基材時(shí)，例如按照以下順序進(jìn)行。即，預(yù)先將支撐體敷在容器的底面，在該容器內(nèi)裝入添加了交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液。然后，對該水溶液加熱，進(jìn)行濃縮，制作透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物。然后，在該容器內(nèi)在分子間交聯(lián)物的上下方向上設(shè)置多數(shù)個(gè)洞，加入來源于生物體的高分子材料的水溶液，使之與分子間交聯(lián)物接觸，進(jìn)行真空冷凍干燥。另外，根據(jù)需要也可以在真空冷凍干燥前(例如設(shè)置洞前或設(shè)置洞后)對分子間交聯(lián)物進(jìn)行冷凍解凍操作。通過進(jìn)行這種操作，可以得到提高了強(qiáng)度，含水時(shí)易于保持形狀的海綿。
本發(fā)明的第3項(xiàng)是移植用材料，其特征在于，具備上述組織再生用基材、以及該組織再生用基材的細(xì)胞粘附部保持的細(xì)胞。該移植用材料由于細(xì)胞保持在細(xì)胞粘附部，密合性良好，因此在體外能夠容易地進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，而且通過透明質(zhì)酸促進(jìn)細(xì)胞移動(dòng)和保濕效果產(chǎn)生的創(chuàng)傷治愈能力，組織能夠適當(dāng)再生。這里，細(xì)胞粘附部保持的細(xì)胞可以是任何細(xì)胞，例如成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、色素產(chǎn)生細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞等。例如使用保持了來源于他人的成纖維細(xì)胞的移植用材料時(shí)，將該移植用材料移植到皮膚創(chuàng)傷部位，用含有抗菌劑的膜(例如聚氨酯膜)覆蓋，再用繃帶覆蓋。這樣，通過由來源于他人的成纖維細(xì)胞產(chǎn)生的各種細(xì)胞因子促進(jìn)治愈。
本發(fā)明的第4項(xiàng)是這種移植用材料的制備方法，其特征在于，制作上述組織再生用基材后，將細(xì)胞嵌入該組織再生用基材的細(xì)胞粘附部。按照該制備方法，可以比較容易地制作本發(fā)明第3項(xiàng)的移植用材料。這里，作為將細(xì)胞嵌入細(xì)胞粘附部的方法，包括例如通過將組織再生用基材浸漬于培養(yǎng)液中，同時(shí)使細(xì)胞攝入孔內(nèi)進(jìn)行保持的方法。
圖2是表示實(shí)施例2的組織再生用基材的制作順序的說明圖。
圖3是表示實(shí)施例3的組織再生用基材的制作順序的說明圖。
圖4是表示實(shí)施例4的組織再生用基材的制作順序的說明圖。
發(fā)明的最佳實(shí)施方式以下說明本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例。本發(fā)明不受下述實(shí)施例的任何限定。另外，以下只要沒有特別的說明，“％”表示重量％。
(實(shí)施例1)〔1〕組織再生用基材的制作(參照

圖1)〔1-1〕透明質(zhì)酸海綿的制作將透明質(zhì)酸鈉(分子量約200萬)10g溶解于蒸餾水1L中，配制1％透明質(zhì)酸水溶液(pH6)。透明質(zhì)酸的溶解用機(jī)械攪拌器進(jìn)行攪拌，且攪拌足夠的時(shí)間。另一方面，作為水溶性環(huán)氧化合物，將デナコ-ルEX313(甘油二縮水甘油醚，ナガセ化成工業(yè))1g用蒸餾水20ml稀釋，配制デナコ-ルEX313溶液(以下稱為EX313溶液)。將這樣配制的EX313溶液20ml添加到攪拌中的透明質(zhì)酸水溶液中，再攪拌30分鐘，制得透明質(zhì)酸-EX313混合液。
將得到的透明質(zhì)酸-EX313混合液180ml注入到底面積180cm2(10cm×18cm)的托盤中。這時(shí)透明質(zhì)酸-EX313混合液的深度為約1cm。將注入到托盤中的透明質(zhì)酸-EX313混合液在室溫下靜置2小時(shí)，除去透明質(zhì)酸-EX313混合液內(nèi)的氣泡后，將預(yù)先根據(jù)托盤的大小切斷的ベンリ-ゼ(無紡布，旭化成工業(yè))置于透明質(zhì)酸-EX313混合液上。
將上面放置了無紡布的狀態(tài)的透明質(zhì)酸-EX313混合液裝入空氣循環(huán)型干熱器中，在50℃下靜置10小時(shí)。這樣，透明質(zhì)酸的氫氧基(羥基)或羧基與デナコ-ルEX313的環(huán)氧基反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸的分子間交聯(lián)物，同時(shí)液量濃縮至約2/5(即，作為透明質(zhì)酸濃度，為約2.5重量％)。這時(shí)濃縮液的深度為約4mm。
接著，將該濃縮液在-85℃下冷凍。冷凍時(shí)間受冷凍器的能力左右，為約5～6小時(shí)，使之完全冷凍。這樣冷凍后，在室溫下放置1～1.5小時(shí)一次解凍，解凍后，再用-85℃的冷凍器冷凍5～6小時(shí)，完全冷凍。接著，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到具有海綿結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸分子間交聯(lián)物(以下稱為交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿)。
〔1-2〕與膠原海綿的層壓將atherocollagen 1g溶解于蒸餾水500ml中，用1NHC1調(diào)節(jié)為pH4，配制0.2％atherocollagen水溶液。將配制的atherocollagen水溶液90ml注入到底面積180cm2的托盤中。Atherocollagen水溶液的液量為原來透明質(zhì)酸水溶液的液量(180ml)的一半，膠原與透明質(zhì)酸的重量比為1∶10。
將如上所述制作的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿浸漬于裝有atherocollagen水溶液的托盤中，使ベンリ-ゼ位于上方，放置1小時(shí)，使膠原水溶液滲入交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿中。接著，將該在膠原水溶液中浸漬的透明質(zhì)酸海綿在-85℃下冷凍后，真空干燥。
對于真空冷凍干燥后的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿上層壓膠原海綿得到的物質(zhì)，用15W的紫外線燈(254nm)在膠原海綿側(cè)從25cm的距離照射30分鐘，進(jìn)行膠原的分子間交聯(lián)。然后，裝入滅菌袋中，在60℃下進(jìn)行EOG(氧化乙烯氣體)滅菌20小時(shí)。這樣，得到被ベンリ-ゼ(支撐體)支撐的組織再生用基材，即具備交聯(lián)膠原海綿(細(xì)胞粘附部)的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿。
〔2〕移植用材料的制備在與組織再生用基材的ベンリ-ゼ相反的一面，以5×104細(xì)胞/cm2的密度接種浮游在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecoo改進(jìn)的Eagle極限必需培養(yǎng)基(DMEM+10％FBS，Gibcoo公司制)中的培養(yǎng)兔成纖維細(xì)胞后，在CO25％、37℃的恒溫箱中培養(yǎng)7天，制得作為移植用材料的培養(yǎng)真皮。除去培養(yǎng)基，將其裝入冷凍保存液(含有10％DMSO的DMEM+20％FBS)中，在-152℃的冰柜中保存。
〔3〕移植試驗(yàn)在使用時(shí)將保存在冰柜中的培養(yǎng)真皮(移植用材料)解凍，除去冷凍保存液，用Hanks液30ml洗滌2次，用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。在兔的背部描繪直徑7cm的圓，切除所有皮膚層，形成皮膚缺損創(chuàng)傷。在該皮膚缺損創(chuàng)傷處適用上述培養(yǎng)真皮，縫合創(chuàng)傷面的周邊，在其上適用聚氨酯薄膜制創(chuàng)傷覆蓋材料，再放上滅菌墊，縫合創(chuàng)傷的周邊，用伸縮性繃帶加壓固定。結(jié)果，觀察到良好的肉芽組織形成和創(chuàng)傷面積的顯著減小。
(實(shí)施例2)〔1〕組織再生用基材的制作(參照圖2)〔1-1〕透明質(zhì)酸海綿的制作與實(shí)施例1同樣，配制透明質(zhì)酸-EX313混合液，將得到的透明質(zhì)酸-EX 313混合液180ml注入到底面積180cm2(10cm×18cm)的托盤中。在托盤中預(yù)先載放根據(jù)其大小切斷的ベンリ-ゼ(如上所述)，加入少量蒸餾水，使之含水，并使之粘附在托盤底面。注入托盤中的透明質(zhì)酸-EX313混合液的深度為約1cm。
將這種狀態(tài)的透明質(zhì)酸-EX313混合液裝入空氣循環(huán)型干熱器中，在50℃下靜置15小時(shí)。這樣，透明質(zhì)酸的氫氧基(羥基)或羧基與デナコ-ルEX313的環(huán)氧基反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸的分子間交聯(lián)物，同時(shí)液量濃縮至約1/5(即，作為透明質(zhì)酸濃度，為約5重量％)。這時(shí)濃縮液的深度為約2～3mm。
接著，將該濃縮液在-85℃下冷凍。冷凍時(shí)間受冷凍器的能力左右，為約5～6小時(shí)，使之完全冷凍。接著，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到具有海綿結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸分子間交聯(lián)物(以下稱為交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿)。然后，為了除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，在裝有15L離子交換水的容器內(nèi)將交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿浸漬1天，用水洗滌。
〔1-2〕與膠原海綿的層壓將atherocollagen 2.5g溶解于蒸餾水500ml中，用1N HCl調(diào)節(jié)為pH3.2，配制0.5％atherocollagen水溶液。將水洗后的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿置于底面積180cm2的托盤上，使無紡布朝下，在其上注入配制的atherocollagen水溶液90ml。Atherocollagen水溶液的液量為原來透明質(zhì)酸水溶液的液量(180ml)的一半，膠原與透明質(zhì)酸的重量比為1∶4。
交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿周圍有一些收縮，與托盤側(cè)面之間產(chǎn)生縫隙。通過a therocollagen水溶液浸入到該縫隙中，設(shè)置膠原，使之包圍透明質(zhì)酸海綿的周圍，抑制膨潤時(shí)交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿和膠原海綿的分離。
注入atherocollagen水溶液經(jīng)過一晝夜后，將含有atherocollagen水溶液的透明質(zhì)酸海綿在-85℃下真空冷凍干燥。對于真空冷凍干燥后的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿上層壓膠原海綿得到的物質(zhì)，用15W的紫外線燈(254nm)在膠原海綿側(cè)從25cm的距離照射30分鐘，進(jìn)行膠原的分子間交聯(lián)。然后，裝入滅菌袋中，在60℃下進(jìn)行EOG滅菌20小時(shí)。這樣，得到被ベンリ-ゼ(支撐體)支撐的組織再生用基材，即具備交聯(lián)膠原海綿(細(xì)胞粘附部)的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿。
〔2〕移植用材料的制備將按照上述方法制備的180cm2的組織再生用基材切成90cm2大小。將切斷的組織再生用基材裝入180cm2的托盤中，注入DMEM+10％FBS 100ml，調(diào)節(jié)pH。調(diào)節(jié)pH后(pH7.4)，一度將培養(yǎng)液廢棄，在組織再生用基材上以5×105細(xì)胞/cm2的密度接種人成纖維細(xì)胞懸浮液5ml。接種后，在37℃下靜置一夜，使人成纖維細(xì)胞固定在組織再生用基材上。然后，加入上述DMEM+10％FBS培養(yǎng)基100ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)1周。這樣制得的培養(yǎng)真皮(移植用材料)不僅具有充分的強(qiáng)度，而且周圍僅有2～3mm程度的收縮，因此操作性良好，不用擔(dān)心缺損。
(實(shí)施例3)〔1〕組織再生用基材的制作(參照圖3)〔1-1〕透明質(zhì)酸海綿的制作將透明質(zhì)酸鈉(分子量約200萬)20g溶解于蒸餾水2L中，配制1％透明質(zhì)酸水溶液(pH6)后，用1N HCl調(diào)節(jié)為pH3.5。透明質(zhì)酸的溶解用機(jī)械攪拌器進(jìn)行攪拌，且攪拌足夠的時(shí)間。另一方面，作為水溶性環(huán)氧化合物，將デナコ-ルEX810(甘油二縮水甘油醚，ナガセ化成工業(yè))4g用蒸餾水40ml稀釋，配制デナコ-ルEX810溶液(以下稱為EX810溶液)。將這樣配制的EX810溶液(40ml)添加到攪拌中的透明質(zhì)酸水溶液中，再攪拌30分鐘，制得透明質(zhì)酸-EX810混合液。
將得到的透明質(zhì)酸-EX810混合液50g注入到底面積110cm2(10cm×11cm)的托盤中。在托盤中預(yù)先載放根據(jù)其大小切斷的ベンリ-ゼ(如上所述)，加入少量蒸餾水，使之含水，并使之粘附在托盤底面。注入托盤中的透明質(zhì)酸-EX810混合液的深度為約5mm。
將這種狀態(tài)的透明質(zhì)酸-EX810混合液裝入空氣循環(huán)型加熱器中，在50℃下靜置5小時(shí)。這樣，透明質(zhì)酸的氫氧基(羥基)或羧基與デナコ-ルEX810的環(huán)氧基反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸的分子間交聯(lián)物，同時(shí)液量濃縮至約1/2(即，作為透明質(zhì)酸濃度，為約2重量％)。這時(shí)濃縮液的深度為約2～3mm。
接著，將該濃縮液在-85℃下冷凍。冷凍時(shí)間受冷凍器的能力左右，為約5～6小時(shí)，使之完全冷凍。接著，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理。然后，為了除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，在裝有1L蒸餾水的容器內(nèi)將交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿浸漬一夜，用水洗滌。
水洗后，再用-85℃的冷凍器完全冷凍。然后，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到具有海綿結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸分子間交聯(lián)物(以下稱為交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿)。
〔1-2〕與膠原海綿的層壓在用膠原海綿層壓之前，使用劍山將交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿穿孔。這時(shí)孔的間隔為約4mm。
將atherocollagen 8g溶解于蒸餾水1.6L中，用1N HCl調(diào)節(jié)為pH3.5，配制0.5％atherocollagen水溶液。將配制的atherocollagen水溶液40g注入到底面積110cm2的托盤中。Atherocollagen水溶液的液量為原來透明質(zhì)酸水溶液的液量(50g)的約4/5，膠原與透明質(zhì)酸的重量比為2∶5。
使如上所述制作的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿浮在注入了athorocollagon水溶液的托盤中，使ベンリ-ゼ位于上方，靜置一夜，使膠原水溶液滲入交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿中。接著，將滲入了膠原水溶液的透明質(zhì)酸海綿在-85℃下完全冷凍后，進(jìn)行真空冷凍干燥。
對真空冷凍干燥后的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿上層壓膠原海綿得到的物質(zhì)的兩側(cè)，分別用15W的紫外線燈(254nm)從20cm的距離照射30分鐘，進(jìn)行膠原的分子間交聯(lián)。然后，裝入滅菌袋中，在60℃下進(jìn)行EOG(氧化乙烯氣體)滅菌20小時(shí)。這樣，得到被ベンリ-ゼ(支撐體)支撐的組織再生用基材，即具備交聯(lián)膠原海綿(細(xì)胞粘附部)的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿。
〔2〕移植用材料的制備將按照上述方法制備的組織再生用基材裝入托盤中，注入DMEM+10％FBS 50ml，調(diào)節(jié)pH。調(diào)節(jié)pH后(pH7.4)，一度將培養(yǎng)液廢棄，在組織再生用基材上以1×105細(xì)胞/cm2的密度接種人成纖維細(xì)胞懸浮液5ml。接種后，在37℃下靜置一夜，使人成纖維細(xì)胞固定在組織再生用基材上。然后，加入上述DMEM+10％FBS培養(yǎng)基50ml，在37℃、5％CO2下培養(yǎng)1周。這樣制得的培養(yǎng)真皮(移植用材料)除去培養(yǎng)基，將其裝入冷凍保存液(含有10％DMSO的DMEM+20％FBS)中，在-152℃的冰柜中保存。
〔3〕移植試驗(yàn)在使用時(shí)將保存在冰柜中的培養(yǎng)真皮(移植用材料)解凍，除去冷凍保存液，用乳酸林格氏液30～50ml洗滌3次，用于人體臨床。創(chuàng)傷面除去殘留壞死組織后，進(jìn)行消毒，用生理鹽水充分洗滌。在該皮膚缺損創(chuàng)傷處適用上述培養(yǎng)真皮，縫合固定培養(yǎng)真皮的周圍。在其上適用浸透了含有抗生素的軟膏的紗布，再放上滅菌紗布，縫合創(chuàng)傷的周邊，用伸縮性繃帶加壓固定。結(jié)果，觀察到良好的肉芽組織形成和創(chuàng)傷面積的顯著減小，創(chuàng)傷周圍長出上皮。
(實(shí)施例4)〔1〕組織再生用基材的制作(參照圖4)〔1-1〕透明質(zhì)酸海綿的制作將透明質(zhì)酸鈉(分子量約200萬)2g溶解于蒸餾水200ml中，配制1％透明質(zhì)酸水溶液(pH6)后，用1N HCl調(diào)節(jié)為pH3.5。透明質(zhì)酸的溶解用機(jī)械攪拌器進(jìn)行攪拌，且攪拌足夠的時(shí)間。另一方面，作為水溶性環(huán)氧化合物，將デナコ-ルEX8100.2g用蒸餾水2ml稀釋，配制デナコ-ルEX810溶液(以下稱為EX810溶液)。將這樣配制的EX810溶液(2ml)添加到攪拌中的透明質(zhì)酸水溶液中，再攪拌30分鐘，制得透明質(zhì)酸-EX810混合液。
將得到的透明質(zhì)酸-EX810混合液4.8g注入到底面積35mm的盤中。注入盤中的透明質(zhì)酸-EX810混合液的深度為約5mm。
將這種狀態(tài)的透明質(zhì)酸-EX810混合液裝入空氣循環(huán)型加熱器中，在50℃下靜置5小時(shí)。這樣，透明質(zhì)酸的氫氧基(羥基)或羧基與デナコ-ルEX810的環(huán)氧基反應(yīng)，生成透明質(zhì)酸的分子間交聯(lián)物，同時(shí)液量濃縮至約1/2(即，作為透明質(zhì)酸濃度，為約2重量％)。這時(shí)濃縮液的深度為約2～3mm。
接著，將該濃縮液在-85℃下冷凍。冷凍時(shí)間受冷凍器的能力左右，為約5～6小時(shí)，使之完全冷凍。接著，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理。然后，為了除去未反應(yīng)的交聯(lián)劑，在裝有1L蒸餾水的容器內(nèi)浸漬一夜，用水洗滌。水洗后，再用-85℃的冷凍器完全冷凍。然后，以30×10-3～50×10-3mmbar(3～5Pa)進(jìn)行真空冷凍干燥處理，得到具有海綿結(jié)構(gòu)的透明質(zhì)酸分子間交聯(lián)物(以下稱為交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿)。
〔1-2〕與膠原海綿的層壓在用膠原海綿層壓之前，使用劍山將交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿穿孔。這時(shí)孔的間隔為約4mm。
另一方面，將0.5％膠原水溶液(KOKENCELLGEN I-PC株式會(huì)社高研制)3.8g注入到φ35mm的盤中。膠原水溶液的液量為原來透明質(zhì)酸水溶液的液量(4.8g)的約4/5，膠原與透明質(zhì)酸的重量比為約2∶5。
使如上所述制作的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿中穿孔的一面朝下，浮在注入了膠原水溶液的盤中，靜置一夜，使膠原水溶液滲入交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿中。接著，將滲入了膠原水溶液的透明質(zhì)酸海綿在-85℃下完全冷凍后，真空冷凍干燥。
對真空冷凍干燥后的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿上層壓膠原海綿得到的物質(zhì)兩側(cè)，分別用15W的紫外線燈(254nm)從20cm的距離照射30分鐘，進(jìn)行膠原的分子間交聯(lián)。然后，裝入滅菌袋中，在60℃下進(jìn)行EOG滅菌20小時(shí)。這樣，得到組織再生用基材，即具備交聯(lián)膠原海綿(細(xì)胞粘附部)的交聯(lián)透明質(zhì)酸海綿。對于該組織再生用基材，沒有通過ベンリ-ゼ增加強(qiáng)度，但是可以用小鑷子等容易地進(jìn)行操作。
本實(shí)施例的組織再生用基材與實(shí)施例1～3同樣，除了可以作為培養(yǎng)真皮利用以外，也可以作為創(chuàng)傷覆蓋材料使用。用作創(chuàng)傷覆蓋材料時(shí)，由于具有生物體吸收性，因而不需要除去，期待通過使膠原側(cè)貼近創(chuàng)傷面，可以得到膠原的細(xì)胞保持效果，適用于創(chuàng)傷后，透明質(zhì)酸溶出到創(chuàng)傷面，發(fā)揮細(xì)胞游走性，可以得到促進(jìn)治愈的效果。
另外，作為與實(shí)施例2不同的實(shí)例，也可以在透明質(zhì)酸-EX313混合液的分子間交聯(lián)反應(yīng)后，不進(jìn)行真空冷凍干燥，在交聯(lián)反應(yīng)物的上下方向上開洞，使其開有洞的面與atherocollagen水溶液接觸后，真空冷凍干燥，在形成透明質(zhì)酸海綿的同時(shí)形成膠原海綿。這時(shí)，可以簡化制備過程，兩種海綿可以通過存在的洞獲得錨環(huán)效果，因此能良好地密合。
工業(yè)實(shí)用性本發(fā)明是以透明質(zhì)酸為主體的組織再生用基材，適于體外的細(xì)胞培養(yǎng)和移植后的組織再生，因此能夠廣泛用于醫(yī)療領(lǐng)域。
權(quán)利要求
1.組織再生用基材，其特征在于，具備以透明質(zhì)酸和/或其衍生物為主體的透明質(zhì)酸海綿，以及在上述透明質(zhì)酸海綿的至少一面層壓來源于生物體的高分子材料構(gòu)成的海綿得到的細(xì)胞粘附部。
2.如權(quán)利要求1所述的組織再生用基材，其特征在于，上述來源于生物體的高分子材料為膠原、明膠、纖維蛋白或海藻酸。
3.如權(quán)利要求1或2所述的組織再生用基材，其特征在于，上述透明質(zhì)酸海綿和上述細(xì)胞粘附部均進(jìn)行了分子間交聯(lián)。
4.如權(quán)利要求1～3中任意一項(xiàng)所述的組織再生用基材，其特征在于，上述透明質(zhì)酸海綿和上述細(xì)胞粘附部的邊界附近呈來源于生物體的高分子材料摻雜在透明質(zhì)酸海綿內(nèi)的狀態(tài)。
5.如權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的組織再生用基材，其特征在于，上述透明質(zhì)酸海綿被作為支撐體的織物、無紡布或編織物支撐。
6.制備權(quán)利要求1～4中任意一項(xiàng)所述的組織再生用基材的方法，其特征在于，包括下述步驟(1)通過將添加有交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液濃縮，得到透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物的交聯(lián)步驟，(2)通過將上述分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿的海綿化步驟，以及(3)通過由上述透明質(zhì)酸海綿的至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，真空冷凍干燥，形成上述細(xì)胞粘附部的層壓步驟。
7.制備如權(quán)利要求5所述的組織再生用基材的方法，其特征在于，包括下述步驟(1)通過將添加有交聯(lián)劑的透明質(zhì)酸和/或其衍生物的水溶液在與織物、無紡布或編織物接觸的狀態(tài)下濃縮，得到透明質(zhì)酸和/或其衍生物的分子間交聯(lián)物的交聯(lián)步驟，(2)通過將上述分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿的海綿化步驟，以及(3)通過由上述透明質(zhì)酸海綿的至少一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，真空冷凍干燥，形成上述細(xì)胞粘附部的層壓步驟。
8.如權(quán)利要求6或7所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，在上述交聯(lián)步驟中，以透明質(zhì)酸和/或其衍生物的濃度達(dá)到1～10重量％的時(shí)刻作為濃縮的終點(diǎn)。
9.如權(quán)利要求6～8中任意一項(xiàng)所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，在上述海綿化步驟中，對上述分子間交聯(lián)物進(jìn)行冷凍解凍操作至少1次以上后，真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿。
10.如權(quán)利要求6～9中任意一項(xiàng)所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，在上述層壓步驟中，在上述透明質(zhì)酸海綿的一面開多數(shù)個(gè)洞，由其開了洞的一面吸收來源于生物體的高分子材料的水溶液后，真空冷凍干燥，形成上述細(xì)胞粘附部。
11.如權(quán)利要求6～8中任意一項(xiàng)所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，包括下述海綿化·層壓步驟以代替上述海綿化步驟和上述層壓步驟，即，使上述交聯(lián)步驟后的分子間交聯(lián)物與來源于生物體的高分子材料的水溶液接觸后，進(jìn)行真空冷凍干燥，形成上述透明質(zhì)酸海綿以及由該高分子材料構(gòu)成的上述細(xì)胞粘附部。
12.如權(quán)利要求11所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，在上述海綿化·層壓步驟中，具有下述步驟在上述交聯(lián)步驟后的分子間交聯(lián)物的上下方向上設(shè)置多數(shù)個(gè)洞的步驟；使之與來源于生物體的高分子材料的水溶液接觸，使該水溶液浸透上述洞的步驟；進(jìn)行真空冷凍干燥，形成上述透明質(zhì)酸海綿以及由該高分子材料構(gòu)成的上述細(xì)胞粘附部的步驟。
13.如權(quán)利要求11或12所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，在上述海綿化·層壓步驟中，對上述交聯(lián)步驟后的分子間交聯(lián)物進(jìn)行冷凍解凍操作至少1次以上后，真空冷凍干燥。
14.如權(quán)利要求6～13中任意一項(xiàng)所述的制備組織再生用基材的方法，其特征在于，還具有使上述細(xì)胞粘附部進(jìn)行分子間交聯(lián)的粘附部交聯(lián)步驟。
15.移植用材料，其特征在于，具備權(quán)利要求1～5中任意一項(xiàng)所述的組織再生用基材或者按照權(quán)利要求6～14中任意一項(xiàng)所述的制備方法制得的組織再生用基材、以及上述組織再生用基材的細(xì)胞粘附部保持的細(xì)胞。
16.如權(quán)利要求15所述的移植用材料，其中，上述細(xì)胞是成纖維細(xì)胞、角化細(xì)胞、色素產(chǎn)生細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、上皮細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞、成肌細(xì)胞、脂肪細(xì)胞、肝細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、胰島細(xì)胞。
17.制備權(quán)利要求15或16所述的移植用材料的方法，其特征在于，按照權(quán)利要求6～14中任意一項(xiàng)所述的組織再生用基材的制備方法制得組織再生用基材后，將細(xì)胞嵌入該組織再生用基材的細(xì)胞粘附部。
全文摘要
將添加了作為交聯(lián)劑的水溶性環(huán)氧化合物的1％透明質(zhì)酸水溶液加熱濃縮，得到透明質(zhì)酸的分子間交聯(lián)物。接著，將該分子間交聯(lián)物真空冷凍干燥，得到透明質(zhì)酸海綿。在該透明質(zhì)酸海綿中浸漬atherocollagen溶液后，真空冷凍干燥，得到組織再生用基材。
文檔編號(hào)A61L27/38GK1774272SQ0182026
公開日2006年5月17日 申請日期2001年12月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年12月7日
發(fā)明者黑柳能光 申請人:株式會(huì)社日本組織工程