專利名稱：生物組織薄切片制成的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)載體以及利用該載體的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法和移植方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物組織薄切片制成的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)載體以及利用該載體的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法和移植方法。更詳細(xì)地講，本申請的發(fā)明是關(guān)于能為動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)體系中提供生物組織的場所以及時(shí)間上的環(huán)境信息的培養(yǎng)載體，以及在該載體上動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)方法和在該載體上培養(yǎng)的細(xì)胞的移植方法的發(fā)明，由于在來自各種生物組織的載體上能夠培養(yǎng)各種各樣的細(xì)胞，所以利用該載體對維持功能細(xì)胞的培養(yǎng)、對細(xì)胞行為和功能的評價(jià)以及對接近生物體的組織再構(gòu)建成為可能，因此該發(fā)明在基因功能的評價(jià)、培養(yǎng)臟器的開發(fā)以及細(xì)胞移植等方面是有用的。
背景技術(shù)：
通過改善動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)環(huán)境，培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞的應(yīng)用領(lǐng)域可擴(kuò)大到醫(yī)藥品等生理活性物質(zhì)的開發(fā)研究以及其制造手段、或者培養(yǎng)臟器的制造和其移植，對現(xiàn)代社會(huì)作貢獻(xiàn)。而人們?yōu)榱耸谷∽詣?dòng)物的功能細(xì)胞發(fā)揮其功能一直在開發(fā)培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞用的各種各樣的培養(yǎng)載體。因?yàn)橥ㄟ^在培養(yǎng)載體的原材料和形狀上開動(dòng)腦筋，可以對細(xì)胞的貼附、生長、移動(dòng)、浸潤、增殖、分化、極化、自身組織化等細(xì)胞行為以及細(xì)胞和培養(yǎng)液的相互作用機(jī)制進(jìn)行控制。
到目前為止，動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)載體的材料可分為天然材料、人工材料以及天然材料和人工材料的混合材料，這些載體的形狀各式各樣可吸在支持物上的吸附物、支持物的被膜、膠片、膜、平板、培養(yǎng)皿、燒瓶、中空纖維、纖維或其編織物、凝膠、中空顆粒等。作為天然材料有膠原、纖維連接蛋白、板蛋白、葡糖胺聚糖、蛋白聚糖或基底凝膠(由EHS腫瘤提取之后再構(gòu)建的基底膜；Kleinman，H.K，et al.Basement membranecomplexes with biological activity，生物化學(xué)(Biochem.)25，312，1986.)等從動(dòng)物組織提取的細(xì)胞外基質(zhì)組成成分、由動(dòng)物組織制備的無細(xì)胞真皮基質(zhì)(Livesey，S.A.，et al.Transplanted acellularallograft dermal matrix.Transplant.60，1，1996)、來自貽貝的黏蛋白、絹或棉等。而作為培養(yǎng)載體開發(fā)的人工材料有尼龍等生物非吸收性的合成高分子、聚二醇酸等生物吸收性的合成高分子、或陶瓷等。
一般來說，動(dòng)物的原代培養(yǎng)細(xì)胞如果使用塑料培養(yǎng)皿作為培養(yǎng)載體培養(yǎng)的話，就會(huì)使生物體內(nèi)出現(xiàn)的組織特異性功能喪失掉；而如果使用含有細(xì)胞外基質(zhì)組成成分的培養(yǎng)載體進(jìn)行培養(yǎng)的話，比較能夠維持其功能，特別是用基底凝膠作為培養(yǎng)載體對上皮細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)，可以促進(jìn)細(xì)胞分化，提高組織特異性功能。而如果使用無細(xì)胞真皮基質(zhì)作為培養(yǎng)載體培養(yǎng)角質(zhì)化細(xì)胞的話，角質(zhì)化細(xì)胞分化，在無細(xì)胞真皮基質(zhì)上可形成再構(gòu)建的表皮。這些見識(shí)表明為了誘導(dǎo)培養(yǎng)細(xì)胞的組織特異功能或三維微細(xì)結(jié)構(gòu)形態(tài)，要將該培養(yǎng)的細(xì)胞在原來生物體內(nèi)存在場所的信息正確地反映在培養(yǎng)載體上是很重要的。在動(dòng)物的組織內(nèi)，細(xì)胞隨著時(shí)間的推移從未分化狀態(tài)過渡到終末分化的狀態(tài)，隨著細(xì)胞分化狀態(tài)的變化細(xì)胞外基質(zhì)也時(shí)時(shí)刻刻在變化著，所以各個(gè)細(xì)胞所在的細(xì)胞外基質(zhì)環(huán)境也隨著時(shí)間變化。就是說，處于生物體組織內(nèi)的細(xì)胞的周圍環(huán)境除了所處場所的信息之外，還有時(shí)間信息。
然而，反映處于各種各樣分化狀態(tài)的細(xì)胞構(gòu)成的生物組織的環(huán)境的培養(yǎng)載體，就是說正確反映生物組織的場所以及時(shí)間信息的培養(yǎng)載體到目前為止還沒有開發(fā)出來。
因此對于任意的動(dòng)物細(xì)胞賦予它酷似生物體內(nèi)的細(xì)胞外環(huán)境的培養(yǎng)體系是不可能實(shí)現(xiàn)的。
本申請的發(fā)明是針對上述那樣的狀況作出的發(fā)明，該發(fā)明的課題之一是作為動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)載體提供更貼近生物組織的培養(yǎng)環(huán)境、即提供靶生物組織的場所以及時(shí)間信息綜合環(huán)境；而本申請發(fā)明的另一個(gè)課題是通過在該培養(yǎng)載體上對細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，利用與靶細(xì)胞的相互作用，與生物組織場所以及時(shí)間信息的相互作用闡明細(xì)胞的各種性質(zhì)和特性，以及利用這些相互作用對基因的功能進(jìn)行解析，利用生物組織的模型解析組織的再構(gòu)建以及再構(gòu)建組織的移植都成為可能。
發(fā)明的公開本申請發(fā)明為動(dòng)物細(xì)胞在培養(yǎng)體系中提供生物組織的場所以及時(shí)間上的環(huán)境信息的培養(yǎng)載體，發(fā)現(xiàn)了對通常在組織學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域?yàn)檫M(jìn)行顯微鏡觀察而將制備的薄的生物組織切片直接或?qū)嵤o細(xì)胞化處理等之后用作培養(yǎng)載體的方法。因此，本申請發(fā)明包括以下一些內(nèi)容，第1提供生物組織薄切片制成的動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)載體；第2提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體是生物組織的薄切片貼附于支持物或貼附生長于支持物上而成；第3提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體的支持物為玻璃、塑料、橡膠、金屬、天然或合成的絲和/或其織物以及從生物體吸收性材料選出的1種以上材料；第4提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體預(yù)先實(shí)施了促進(jìn)切片貼附或貼附生長的處理。
第5提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體中的生物組織是由新鮮組織或預(yù)先用固定液固定的組織制備的；第6提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體是未切片的生物組織或?qū)ι锝M織薄切片實(shí)施無細(xì)胞化處理的組織；第7提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體其特征是實(shí)施使生理活性物質(zhì)能夠結(jié)合于生物組織薄切片的抗體或核酸探針處理之后，在切片的特定部位導(dǎo)入外源生理活性物質(zhì)；第8提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體其特征是對生物組織薄切片進(jìn)行酶處理等生物學(xué)處理或者酸或堿或表面活性劑處理等化學(xué)處理之后，改變或修飾切片中的生物組成成分或微細(xì)結(jié)構(gòu)；第9提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體是由為對生物組織實(shí)施切片而預(yù)先使生物組織凍結(jié)或凍結(jié)包埋、石蠟包埋、或樹脂包埋的組織制備的；第10提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體來自動(dòng)物或植物組織；第11提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體是由哺乳動(dòng)物組織制備的；第12提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中生物組織是取自處于出生前發(fā)育階段的動(dòng)物的全身或其一部分組織；第13提供的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中生物組織是取自處于出生后的動(dòng)物的全身或其一部分組織。
另外本申請發(fā)明的第14提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是將第1至第13發(fā)明中的任一個(gè)發(fā)明中的細(xì)胞培養(yǎng)載體裝入培養(yǎng)容器中對動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)；第15提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是開始培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的手段是通過接種細(xì)胞懸液、切碎的組織片、受精卵、或重新形成三維的多細(xì)胞凝集塊進(jìn)行的；第16提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是在接種的動(dòng)物細(xì)胞貼附增殖之后將切片或?qū)那衅L出的組織從第2至第4發(fā)明中的支持物上剝離下來；第17提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是從支持物上剝離后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，形成攝入切片或攝入從切片長出的組織的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)；第18提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是原代培養(yǎng)細(xì)胞、株化細(xì)胞、受精卵和/或從導(dǎo)入外源基因的上述細(xì)胞中選出的1種或2種以上的細(xì)胞；第19提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞取自于未分化的干細(xì)胞、處于分化過程的細(xì)胞、終末分化的細(xì)胞、和/或去分化的細(xì)胞；第20提供細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是未分化的干細(xì)胞是胚干細(xì)胞；第21提供第14～20發(fā)明的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液是含有血清的培養(yǎng)液或不含血清的無血清培養(yǎng)液；第22提供細(xì)胞移植方法，其特征是將利用上述那些細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞移植到動(dòng)物中；第23提供細(xì)胞移植方法，其中進(jìn)行移植的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
附圖的簡單說明

圖1是將4塊貼附生長牛胎盤5μm厚冷凍切片的載玻片放到菌液盤后的實(shí)體照片。
圖2是對由5μm厚牛胎盤冷凍切片構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)載體進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖3是使發(fā)情后第13天的未經(jīng)產(chǎn)牛子宮的5μm厚石蠟切片進(jìn)行貼附生長的直徑35mm的聚苯乙烯親水性培養(yǎng)皿的實(shí)體照片。
圖4是使5μm厚的發(fā)情后第13天的未經(jīng)產(chǎn)牛子宮的石蠟切片進(jìn)行貼附生長的直徑35mm的聚苯乙烯疏水性培養(yǎng)皿的實(shí)體照片。
圖5是對經(jīng)0.01％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖6是對經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)
圖7是對經(jīng)0.5％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖8是對經(jīng)1.0％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖9是在沒有貼附切片的載玻片上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖10是在沒有貼附切片的載玻片上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的，用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖11是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖12是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖13是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖14是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)一天后的用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖15是在沒有貼附切片的載玻片上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖16是在沒有貼附切片的載玻片上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖17是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)
圖18是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖19是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖20是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)4天后用calcein熒光發(fā)色觀察生存細(xì)胞的熒光顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖21是在沒有貼附切片的載玻片上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖22是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖23是在10μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖24是在20μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖25是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖26是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的10μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖27是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的20μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對BeWo細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖28是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的20μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)NHDF細(xì)胞，在切片上多層增殖的細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時(shí)，攝入切片組織的細(xì)胞層開始從載玻片上剝離的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖29是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的20μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)NHDF細(xì)胞，切片上多層增殖的細(xì)胞培養(yǎng)到第7天時(shí)，攝入切片組織的細(xì)胞層開始從載玻片上剝離的與圖28不同部分的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖30是在20μm厚切片上多層增殖的NHDF細(xì)胞在培養(yǎng)液中完全剝離時(shí)的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖31是攝入切片組織的細(xì)胞層在疏水性培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)7小時(shí)后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖32是在疏水性培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)2天后形成的攝入切片組織的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖33是在沒有貼附切片的載玻片上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖34是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖35是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)1天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖36是在沒有貼附切片的載玻片上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)3天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖37是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)3天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖38是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)3天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖39是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)3天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖40是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對CPAE細(xì)胞培養(yǎng)3天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖41是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。特別是在牛胎盤切片上相當(dāng)于含有胎盤隔的絨毛叢的區(qū)域(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖42是在10μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。特別是在牛胎盤切片上相當(dāng)于含有胎盤隔的絨毛叢的區(qū)域(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖43是在20μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。特別是在牛胎盤切片上相當(dāng)于含有胎盤隔的絨毛叢的區(qū)域(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖44是在沒有貼附切片的載玻片上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖45是在10μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。特別是在牛胎盤切片上與絨毛叢連接的子宮小丘的結(jié)締組織豐富的區(qū)域(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖46是在10μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)2天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。特別是在牛胎盤切片上子宮小丘的粘膜固有層側(cè)的區(qū)域(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖47是在沒有貼附切片的載玻片上對PC-12細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)5天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖48是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)5天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖49是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)5天后的相差顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖50是在經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)5天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)圖51是在5μm厚牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上對PC-12細(xì)胞培養(yǎng)5天后進(jìn)行蘇木精曙紅染色后的光學(xué)顯微鏡照片。(照片上的黑線相當(dāng)于200μm)實(shí)施發(fā)明的最佳方式本申請發(fā)明具有如上所述的特征，以下就其實(shí)施狀況進(jìn)行說明。
本申請的發(fā)明中使用的生物組織可以是動(dòng)物生前或生后的全身或一部分組織，也可以是整個(gè)植物或植物的一部分組織，而且這些組織可以是預(yù)先用固定液固定的組織，也可以是新鮮的組織。使用的固定液有甲醇、乙醇、丙酮、福爾馬林、戊二醛等。利用的哺乳動(dòng)物可以是人、猴、牛、綿羊、山羊、狒狒、豬、狗、兔子、豚鼠、倉鼠、大鼠、小鼠等。使用的動(dòng)物組織只要是動(dòng)物全身或一部分組織并沒有特別限定，例如可以使用腦、脊髓、肌肉、皮膚、血管、食道、胃、小腸、大腸、心臟、肺、肝臟、腎臟、胰臟、脾臟、胸腺、骨、軟骨、子宮、卵巢、輸卵管、睪丸、胎盤、臍蒂等，進(jìn)一步講無論是正常組織，或者是以腫瘤為代表的各種病灶組織都可以。
在本發(fā)明中利用的生物組織薄切片可以是冷凍切片，也可以是石蠟切片，或樹脂切片。在組織學(xué)和病理學(xué)領(lǐng)域中，制備動(dòng)物或植物的整體或一部分組織的薄切片之后，將薄切片鋪在載玻片上，在進(jìn)行了各種染色后于顯微鏡下觀察等一系列的實(shí)驗(yàn)手法都是極其常規(guī)的手法。不用說在生物組織的薄切片中包含著生物組織的場所信息的同時(shí)也包含了時(shí)間的信息，不僅可進(jìn)行一般的染色而且可以通過免疫組織化學(xué)手法或原位雜交技術(shù)進(jìn)行各種各樣信息的解析。
利用這樣的技術(shù)，利用能結(jié)合生理活性物質(zhì)的抗體或核酸探針對薄切片進(jìn)行處理，將外源生理活性物質(zhì)導(dǎo)入切片上的特定場所是有可能的。生理活性物質(zhì)可以是蛋白質(zhì)、糖蛋白、脂蛋白、肽、糖類、脂類、糖脂、核酸、低分子化合物等。這些生理活性物質(zhì)可能具有抗體活性、酶活性、激素作用、細(xì)胞因子作用以及促進(jìn)細(xì)胞粘接、增殖、分化、再生、形態(tài)形成等作用。
另外對薄切片實(shí)施酶作用等生物學(xué)上的處理，或是用酸或堿、表面活性劑等化學(xué)處理，也有可能改變或修飾薄切片中的生物組成成分或微細(xì)結(jié)構(gòu)。在本申請發(fā)明中，冷凍切片是利用冷凍切片機(jī)對未固定的或用福爾馬林等固定的生物組織直接切的，或是包埋于OCT化合物后于液氮等急劇冷凍后切的，切成厚度為1～50μm，最好是4～20μm的薄片。未固定的冷凍切片切后也可用福爾馬林等固定。石蠟切片制備通常是將生物組織用福爾馬林固定后，用乙醇脫水、二甲苯、石蠟置換后，包埋于石蠟后用切片機(jī)切成厚度為0.5～50μm、最好是2～20μm的薄片。另外樹脂切片的制備通常是將生物組織用福爾馬林固定后，用乙醇脫水，包埋于組織樹脂(ヒストレジン)等樹脂后，用切片機(jī)切成厚度為0.1～50μm、最好是O.5～20μm的薄片。
另外，本發(fā)明中可采用的無細(xì)胞化處理可以對切片前的生物組織實(shí)施處理，也可以對切成的生物組織的薄片實(shí)施處理。在無細(xì)胞化處理中可以單獨(dú)或聯(lián)合使用含有鹽類、堿、表面活性劑、螯合劑或酶等溶液?？梢允褂玫柠}類，如氯化鈉、氯化鎂、磷酸鉀等，可以使用的堿如氫氧化鈉、氫氧化鈣、氨水等。另外可以使用的表面活性劑如十二烷基硫酸鈉、Triton X-100、Tween 20和80等，可使用的螯合劑如EDTA、EGTA等。另外可使用的酶如胰蛋白酶、膠原酶、デイスバ-ゼ、酯酶、木瓜蛋白酶、基質(zhì)金屬蛋白酶等蛋白分解酶、透明質(zhì)酸酶等糖分解酶、脫氧核糖核酸酶等核酸分解酶等。
本發(fā)明中使用的生物組織薄切片培養(yǎng)載體可以是只由薄切片構(gòu)成，也可以是由將薄切片貼附在或貼附伸展在玻璃、塑料、橡膠、金屬、天然或合成的絲和/或其織物、以及貼附在或貼附伸展在生物體吸收性材料的支持物而構(gòu)成的復(fù)合體構(gòu)成。另外也可以對支持物實(shí)施促進(jìn)切片貼附或貼附伸展的處理，如在支持物上連接聚賴氨酸、APS等被膜。另外當(dāng)作為培養(yǎng)載體的薄切片混入了OCT化合物、石蠟、樹脂等時(shí)也可以通過水洗、脫石蠟處理、或脫樹脂處理等去除。還有對作為培養(yǎng)載體的薄切片可以進(jìn)行乙醇處理、環(huán)氧乙烷氣處理和γ射線或紫外線等滅菌處理。
在本發(fā)明中使用的動(dòng)物細(xì)胞既可以是原代培養(yǎng)細(xì)胞，也可以是株化的細(xì)胞，也可以是受精卵，或?qū)肓似渌庠椿虻倪@些細(xì)胞，細(xì)胞可以是一種，也可以是2種以上。
動(dòng)物細(xì)胞可以是來自未分化干細(xì)胞、處于分化過程的細(xì)胞、終末分化的細(xì)胞、和/或去分化的細(xì)胞中的任一種細(xì)胞。未分化干細(xì)胞尤以胚胎干細(xì)胞最好。這樣的動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)是通過接種細(xì)胞懸液、切碎的組織片、受精卵、或重新形成的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)開始的。在動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)中使用的培養(yǎng)液只要是通常動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)液就可以，不管其基礎(chǔ)培養(yǎng)液的組成如何，另外培養(yǎng)液中添加還是不添加血清、抗生素、維生素等物質(zhì)都可以。為了使培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞與切片的親和力強(qiáng)于切片與支持物的親和力，可通過選擇適當(dāng)?shù)闹С治锸沟脛?dòng)物細(xì)胞貼附增殖的切片或切片長出的組織從支持物上剝離下來。通過繼續(xù)培養(yǎng)從支持物上剝離下來的組織，有可能形成攝入切片或切片長出的組織的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)。
另外使用本發(fā)明的培養(yǎng)載體通過如下步驟很容易培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞。例如，將動(dòng)物組織切成厚6μm的冷凍切片1或2片貼附于1塊或2塊載玻片上，然后對其實(shí)施固定、無細(xì)胞化、滅菌、培養(yǎng)液的平衡化等必要的處理后，將該載玻片裝入培養(yǎng)皿中，通過接種動(dòng)物細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)就可以了。另外，移植使用本發(fā)明的培養(yǎng)載體培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞通過如下步驟也容易做到例如將動(dòng)物組織切成厚6μm的冷凍切片貼附于生物體吸收性的網(wǎng)格上，然后對其實(shí)施固定、無細(xì)胞化、滅菌、培養(yǎng)液的平衡化等必要的處理后，將該生物體吸收性網(wǎng)格裝入培養(yǎng)皿中，接種動(dòng)物細(xì)胞懸液進(jìn)行培養(yǎng)后，通過移植培養(yǎng)載體移植動(dòng)物細(xì)胞。
實(shí)施例(實(shí)施例1動(dòng)物組織切片細(xì)胞培養(yǎng)載體的制備)將通過處死采集到的妊娠241日齡的牛胎盤包埋于OCT化合物中，然后在液氮中急速冷凍。用冷凍切片機(jī)切成5、10、20μm的薄片，將薄片置于載玻片(松浪玻璃工業(yè)(株)制造S-0317)上。以后的操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。將貼附在該冷凍切片的4塊載玻片裝入菌液槽內(nèi)(住友電木(株)M-3300N)(參照圖1)向該菌液槽內(nèi)注入20m1的HBSS(Hanks平衡鹽溶液Solution；GIBCO BRL#14025-092)后，于室溫靜置5分鐘后再除去注入的溶液，通過該操作將OCT化合物從切片中除去。然后向菌液槽注入20ml的70％的乙醇，于室溫靜置10分鐘后再除去注入的溶液，通過該操作對切片組織進(jìn)行固定和滅菌。然后用20ml的HBSS洗兩次，再用20m1的培養(yǎng)液洗一次。這樣操作后牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體就可以在以載玻片為支持物、以后作為培養(yǎng)容器使用的菌液槽內(nèi)制備了。根據(jù)常規(guī)方法通過蘇木精曙紅染色法可以觀察該細(xì)胞培養(yǎng)載體。觀察結(jié)果可以確認(rèn)該細(xì)胞培養(yǎng)載體是牛胎盤組織(參照圖2)。
另外，將通過處死采集到的發(fā)情后第13天的未經(jīng)產(chǎn)牛的子宮用10％中性緩沖福爾馬林液固定后，按照病理組織學(xué)的常規(guī)方法包埋于石蠟中。用冷凍切片機(jī)切成5μm的薄片，然后將薄片貼附在載玻片(松浪玻璃工業(yè)(株)制造S-0317)上。用二甲苯對該載玻片進(jìn)行脫石蠟處理后，再依次用100％至50％的乙醇進(jìn)行處理。這以后的操作在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行。將一塊貼附切片的載玻片插入直徑100mm的培養(yǎng)皿(Falcon#353001)中。向該培養(yǎng)皿注入100ml的HBSS，于室溫下緩慢地?cái)嚢?分鐘，將切片從載玻片上剝離下來。用移液器將剝離的切片與少量的HBSS一起移入到直徑35mm的聚苯乙烯親水性(Falcon#353001)或疏水性培養(yǎng)皿(Falcon#351008)中，一個(gè)培養(yǎng)皿一塊切片，在移入切片之前培養(yǎng)皿中注入了2ml的滅菌水。用2ml的滅菌水對各個(gè)培養(yǎng)皿內(nèi)的切片洗2次。對于親水性培養(yǎng)皿通過將切片鋪開，盡可能除去滅菌水，然后風(fēng)干。通過這樣操作，以直徑35mm聚苯乙烯的親水性培養(yǎng)皿作為支持物制備出牛子宮石蠟切片細(xì)胞培養(yǎng)載體(參照圖3)。對于疏水性培養(yǎng)皿用滅菌水洗2次之后，再用2ml的70％的乙醇洗一次。然后使切片鋪開，盡可能除去70％的乙醇后再進(jìn)行風(fēng)干。通過這樣的操作，以直徑35mm聚苯乙烯疏水性培養(yǎng)皿作為支持物制備出牛子宮石蠟切片細(xì)胞培養(yǎng)載體(參照圖4)。
(實(shí)施例2無細(xì)胞化處理切片細(xì)胞培養(yǎng)載體的制作)與實(shí)施例1一樣，將貼附鋪開的牛胎盤的冷凍切片裝入位于超凈工作臺(tái)的菌液槽內(nèi)，注入20ml的HBSS后，于室溫靜置5分鐘將OCT化合物從切片中除去。然后將菌液槽內(nèi)的貼附切片的載玻片移入直徑100mm的培養(yǎng)皿(一個(gè)皿一塊)(Falcon#351001)。分別注入SDS濃度各為0.01％、0.1％、0.5％和1.0％的10ml SDS(十二烷基硫酸鈉)溶液，于室溫下靜置10分鐘，然后除去。通過該操作研究對切片組織進(jìn)行無細(xì)胞化。然后，用20ml的HBSS將培養(yǎng)皿內(nèi)貼附切片的載玻片洗2次，再用培養(yǎng)液洗1次。按照常規(guī)方法對各個(gè)切片進(jìn)行蘇木精曙紅染色后進(jìn)行觀察，結(jié)果可以確認(rèn)經(jīng)0.1％SDS處理牛胎盤的冷凍切片能夠做到無細(xì)胞化(參照圖5-8)。通過這樣的操作，以載玻片為支持物可制作無細(xì)胞化牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體。
(實(shí)施例3在牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)BeWo細(xì)胞)使用人絨毛癌細(xì)胞株BeWo細(xì)胞研究牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體的毒性以及對細(xì)胞的貼附生長和增殖的影響、還有切片的厚度不同對細(xì)胞形態(tài)的影響。BeWo細(xì)胞(來自Human Science振興財(cái)團(tuán)JCRB9111)在含有培養(yǎng)液(15％滅活胎牛血清(SIGMA#F-2442)、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(GIBCO BRL#15140-148))的Ham’s F12(GIBCOBRL#11765-054)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體和在實(shí)施例2中于載玻片上制作的經(jīng)0.1％SDS處理無細(xì)胞化的牛胎盤5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體各2塊(共計(jì)4塊)插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml的培養(yǎng)液接種BeWo細(xì)胞懸液，使其終濃度為2.1×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)的第一天，將菌液槽內(nèi)的載玻片移入加了10ml培養(yǎng)液的直徑100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(一個(gè)皿一塊)。以后每日交換培養(yǎng)液，一直培養(yǎng)到第4天。在培養(yǎng)的第一天和第4天利用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，以及通過熒光顯微鏡觀察利用存活細(xì)胞的calcein AM(分子探針#L-3224)代謝能的calcein熒光發(fā)色。培養(yǎng)細(xì)胞的calcein AM代謝能是將培養(yǎng)皿內(nèi)的培養(yǎng)液除去、用10ml的PBS將細(xì)胞洗2次后，用10ml含有2μM calceinAM的HBSS于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)培養(yǎng)15分鐘后，用熒光顯微鏡觀察的。結(jié)果觀察到無論是在切片上，還是在無細(xì)胞化處理的切片上與沒有貼附切片的載玻片一樣細(xì)胞在培養(yǎng)第1天貼附生長，而在培養(yǎng)的第4天進(jìn)行增殖，而且貼附生長增殖的細(xì)胞無論在那一個(gè)載體上都能生存(參照圖9-20)。該結(jié)果表明在切片以及經(jīng)無細(xì)胞化處理的切片構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)載體中沒有毒性。
接下來將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤的5、10、20μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體和在實(shí)施例2中于載玻片上制作的經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的牛胎盤5、10、20μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml的培養(yǎng)液接種BeWo細(xì)胞懸液，使其終濃度為4.5×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)培養(yǎng)一天。利用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果表明在沒有貼附切片的載玻片上，粘附集落內(nèi)的各個(gè)細(xì)胞生長成好看的砌石狀，而在切片上以及經(jīng)無細(xì)胞化處理的切片上隨著切片厚度的增加粘附的集落內(nèi)各個(gè)細(xì)胞有凝集成圓形的傾向(參照圖21-27)。
(實(shí)施例4在牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)NHDF細(xì)胞)使用正常新生兒包皮皮膚成纖維細(xì)胞NHDF細(xì)胞研究攝入牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體的多細(xì)胞三維凝集團(tuán)的形成。NHDF細(xì)胞(倉敷紡織(株)KF-4109)在含有培養(yǎng)液(15％滅活胎牛血清(SIGMA#F-2442)、100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素(GIBCO BRL#15140-148))的DMEM(Dulbecco’s Modified Eagle Medium；GIBCO BRL#11885-084)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤5、10、20μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體和在實(shí)施例2中于載玻片上制作的經(jīng)無細(xì)胞化處理的牛胎盤5、10、20μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml的培養(yǎng)液接種NHDF細(xì)胞，使其終濃度為3.3×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4小時(shí)后，將菌液槽內(nèi)的載玻片移入加了10ml培養(yǎng)液的直徑100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(一個(gè)皿一塊)。以后每隔一日交換一次培養(yǎng)液，一直培養(yǎng)到第9天。利用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果表明在培養(yǎng)的第7天在無細(xì)胞化處理的20μm切片上已多層增殖的細(xì)胞形成攝入從切片長出的組織的細(xì)胞層開始從載玻片上剝離(參照圖28、29)，通過輕輕地吸打后，完全剝離浮游在培養(yǎng)液中(參照圖30)。將剝離下的細(xì)胞片與2ml培養(yǎng)液一起移入細(xì)胞難于貼附的直徑35mm的聚苯乙烯疏水性培養(yǎng)皿中繼續(xù)培養(yǎng)。攝入切片的組織的細(xì)胞層在疏水性培養(yǎng)皿內(nèi)培養(yǎng)到第7天凝集得相當(dāng)多(參照圖31)，在第2天(開始培養(yǎng)后的第9天)周圍形成光滑的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)(參照圖32)。而在培養(yǎng)開始后第8天在無細(xì)胞化處理的10μm切片上多層增殖的細(xì)胞也開始從載玻片上剝離，然后在培養(yǎng)開始后第9天，其余的5、10、20μm切片上以及無細(xì)胞化處理的5μm切片上多層增殖的細(xì)胞也開始從載玻片上剝離。
(實(shí)施例5在牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)CPAE細(xì)胞)使用牛肺動(dòng)脈血管內(nèi)皮細(xì)胞株CPAE研究切片細(xì)胞培養(yǎng)載體對細(xì)胞形態(tài)形成的影響。CPAE細(xì)胞(來自Human Science振興財(cái)團(tuán)JCRB9022)在含有培養(yǎng)液(15％滅活胎牛血清、20mM HEPES、100單位/ml青霉素以及含有100μg/ml鏈霉素的DMEM)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤的5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體和在實(shí)施例2中于載玻片上制作的經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的牛胎盤的5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml的培養(yǎng)液接種CPAE細(xì)胞懸液，使其終濃度為3.4×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一天后，將菌液槽內(nèi)的載玻片移入加了10ml培養(yǎng)液的直徑100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(一個(gè)皿一塊)。以后每隔一日交換一次培養(yǎng)液，一直培養(yǎng)到第3天。在培養(yǎng)的第一天利用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果表明在沒有貼附切片的載玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞很多都展成好看的砌石狀，而在切片上以及經(jīng)無細(xì)胞化處理的切片上培養(yǎng)的細(xì)胞很多形態(tài)都呈比較細(xì)長的伸展?fàn)?參照圖33-35)。之后，培養(yǎng)第3天用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，可見在沒有貼附切片的載玻片上幾乎全部為砌石狀，與此相對，在切片上或經(jīng)無細(xì)胞化處理的切片上培養(yǎng)的細(xì)胞攝入切片組織，形成血管網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。(參照圖36-40)
(實(shí)施例6在牛胎盤冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體上培養(yǎng)PC-12細(xì)胞)使用大鼠褐色細(xì)胞瘤PC-12細(xì)胞通過通常傳代培養(yǎng)用的培養(yǎng)液培養(yǎng)和通過無血清培養(yǎng)液培養(yǎng)研究由切片構(gòu)成的細(xì)胞培養(yǎng)載體對細(xì)胞形態(tài)形成的影響。PC-12細(xì)胞(來自理化研究所基因文庫細(xì)胞開發(fā)銀行RCB0009)在含有培養(yǎng)液(10％滅活胎牛血清、20mM HEPES、100單位/ml青霉素以及含有100μg/ml鏈霉素的DMEM)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。
將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤5、10、20μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml的培養(yǎng)液接種PC-12細(xì)胞懸液，使其終濃度為14.5×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)4小時(shí)后，將菌液槽內(nèi)的載玻片移入加了10ml培養(yǎng)液的直徑100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(一個(gè)皿一塊)。以后每日交換一次培養(yǎng)液，一直培養(yǎng)到第2天。在培養(yǎng)2天后，對載玻片進(jìn)行蘇木精曙紅染色后在光學(xué)顯微鏡下觀察，觀察結(jié)果表明5、10、20μm中任一厚度的切片都沒有觀察到來自牛胎盤的細(xì)胞(參照圖41-43)，而切片上培養(yǎng)的細(xì)胞與沒有貼附切片的載玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞相比大而且貼附生長著(參照圖44)。另外，在牛胎盤切片上相當(dāng)于含有胎盤隔的絨毛叢的區(qū)域，在胎盤隔上主要是砌石狀細(xì)胞貼附生長，沿著胎盤隔的邊緣貼附增殖著扁平細(xì)胞(圖42)，在牛胎盤切片上的與絨毛叢連接的子宮小丘的結(jié)締組織豐富的區(qū)域中貼附生長著砌石狀細(xì)胞(圖45)；在牛胎盤切片上的子宮小丘的粘膜固有層側(cè)區(qū)域沿著子宮腺和血管的內(nèi)側(cè)貼附生長著扁平化細(xì)胞(圖46)。這些結(jié)果表明培養(yǎng)細(xì)胞識(shí)別切片上的微細(xì)結(jié)構(gòu)使得細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了變化。
其次將在實(shí)施例1中于載玻片上制作的牛胎盤5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體和在實(shí)施例2中于載玻片上制作的經(jīng)0.1％SDS無細(xì)胞化處理的牛胎盤5μm冷凍切片細(xì)胞培養(yǎng)載體插入到菌液槽內(nèi)。在該菌液槽內(nèi)向20ml無血清的培養(yǎng)液接種PC-12細(xì)胞懸液，使其終濃度為4.6×104/cm2，然后于5％CO2、95％空氣、37℃的保濕保溫箱內(nèi)進(jìn)行培養(yǎng)。培養(yǎng)一天后，將菌液槽內(nèi)的載玻片移入加了10ml無血清培養(yǎng)液的直徑100mm的培養(yǎng)皿內(nèi)(一個(gè)皿一塊)。以后每隔一日交換一次培養(yǎng)液，一直培養(yǎng)到第5天。在培養(yǎng)的第5天利用相差顯微鏡觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)，結(jié)果表明在沒有貼附切片的載玻片上培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎都死了(圖47)，但在經(jīng)無細(xì)胞化處理的切片上培養(yǎng)的細(xì)胞有砌石狀貼附生長的活細(xì)胞(圖48)。另外在切片上培養(yǎng)的細(xì)胞幾乎都是砌石狀貼附生長的活細(xì)胞(圖49)。進(jìn)一步對培養(yǎng)到第5天的載玻片進(jìn)行蘇木精曙紅染色后在熒光顯微鏡下觀察，結(jié)果觀察到在切片上和無細(xì)胞化處理的切片上培養(yǎng)的細(xì)胞都是呈砌石狀貼附生長著的活細(xì)胞，另外在切片上進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)也清楚地觀察到有來自牛胎盤的細(xì)胞，在無細(xì)胞化處理的切片上培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，可以清楚地觀察到除去了牛胎盤細(xì)胞的無細(xì)胞組織(圖50、51)。這些結(jié)果表明由切片構(gòu)成的載體在進(jìn)行無血清培養(yǎng)時(shí)細(xì)胞的生存時(shí)間有可能長時(shí)間維持，而對細(xì)胞進(jìn)行無血清培養(yǎng)時(shí)即使在長時(shí)間培養(yǎng)后也能維持切片的細(xì)胞和組織。
當(dāng)然，本發(fā)明并不限定于以上的例子。不用說在載玻片上放置多個(gè)切片也是可以的。而且不用說制作切片的動(dòng)物組織除了講到的，有關(guān)作為培養(yǎng)對象的動(dòng)物細(xì)胞、切片的狀態(tài)、支持物、培養(yǎng)液組成、培養(yǎng)條件等可以是各種各樣狀態(tài)。本申請的發(fā)明應(yīng)當(dāng)包括這些各種各樣的狀態(tài)、式樣。
發(fā)明的效果利用本發(fā)明作為培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的載體，更接近生物組織的培養(yǎng)環(huán)境，即提供靶生物組織的場所以及時(shí)間上的環(huán)境信息。通過在本發(fā)明的培養(yǎng)載體上培養(yǎng)細(xì)胞能夠?qū)ε囵B(yǎng)載體與靶細(xì)胞以及利用組織的場所上的以及時(shí)間上的信息的相互作用闡明細(xì)胞的各種性質(zhì)和特性，以及利用這些相互作用對基因進(jìn)行功能解析，以及利用生物體組織模板進(jìn)行組織的再構(gòu)建，以及再構(gòu)建組織的移植都成為可能。
權(quán)利要求
1.細(xì)胞培養(yǎng)載體，其特征在于動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)載體是由生物組織薄切片構(gòu)成的。
2.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中生物組織的薄切片貼附于支持物或貼附生長于支持物。
3.權(quán)利要求2記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，支持物為從玻璃、塑料、橡膠、金屬、天然或合成的絲和/或其織物以及生物體吸收性材料選出的1種以上材料。
4.權(quán)利要求2或3記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中對支持物預(yù)先實(shí)施了促進(jìn)切片貼附或貼附生長的處理。
5.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中的生物組織是新鮮組織或預(yù)先用固定液固定的組織。
6.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體是，由對未切片的生物組織或生物組織薄切片實(shí)施無細(xì)胞化處理的組織制備的。
7.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其特征是實(shí)施使抗體或核酸探針能夠結(jié)合于生物組織薄切片的處理之后，在切片的特定場所導(dǎo)入外源生理活性物質(zhì)。
8.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其特征是對生物組織薄切片進(jìn)行酶處理等生物學(xué)處理或酸或堿或表面活性劑處理等化學(xué)處理之后，改變或修飾切片中的生物組成成分或微細(xì)結(jié)構(gòu)。
9.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中為對生物組織實(shí)施切片而預(yù)先將生物組織凍結(jié)或凍結(jié)包埋、石蠟包埋、或樹脂包埋。
10.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中生物是動(dòng)物或植物。
11.權(quán)利要求10記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
12.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中利用的生物組織是取自處于出生前發(fā)育階段的動(dòng)物的全身或其一部分組織。
13.權(quán)利要求1記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體，其中利用的生物組織是取自處于出生后的動(dòng)物的全身或其一部分組織。
14.細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是將權(quán)利要求1至13中任一項(xiàng)記載的細(xì)胞培養(yǎng)載體裝入培養(yǎng)容器中對動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)。
15.權(quán)利要求14記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是開始培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的手段是通過接種細(xì)胞懸液、切碎的組織片、受精卵、或接種重新構(gòu)建的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)進(jìn)行的。
16.權(quán)利要求14～15記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是在接種的動(dòng)物細(xì)胞貼附增殖之后將切片或?qū)⒂汕衅L出的組織從權(quán)利要求2至4中記載的支持物上剝離下來。
17.權(quán)利要求16記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是從支持物上剝離后繼續(xù)進(jìn)行培養(yǎng)，形成攝入切片或攝入由切片長出的組織的三維多細(xì)胞凝集團(tuán)。
18.權(quán)利要求14記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞是原代培養(yǎng)細(xì)胞、株化細(xì)胞、受精卵和/或從導(dǎo)入外源性基因的上述細(xì)胞中選出的1種或2種以上的細(xì)胞。
19.權(quán)利要求14記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞取自于未分化的干細(xì)胞、處于分化過程的細(xì)胞、終末分化的細(xì)胞、和/或去分化的細(xì)胞。
20.權(quán)利要求19記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是未分化的干細(xì)胞是胚性干細(xì)胞。
21.權(quán)利要求14～20記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法，其特征是培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的培養(yǎng)液是含有血清的培養(yǎng)液或不合血清的無血清培養(yǎng)液。
22.細(xì)胞移植方法，其特征是將利用權(quán)利要求14～21記載的細(xì)胞培養(yǎng)方法培養(yǎng)的動(dòng)物細(xì)胞移植到動(dòng)物中。
23.權(quán)利要求22記載的細(xì)胞移植方法，其中進(jìn)行移植的動(dòng)物是哺乳動(dòng)物。
全文摘要
培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的載體,是由生物組織薄切片構(gòu)成的或者是由生物組織薄切片貼附于支持物或貼附伸展于支持物而成的。利用該載體的培養(yǎng)方法和移植方法。利用本發(fā)明作為培養(yǎng)動(dòng)物細(xì)胞的載體,更接近生物組織的培養(yǎng)環(huán)境,即提供靶生物組織的場所以及時(shí)間上的環(huán)境信息。通過在本發(fā)明的培養(yǎng)載體上培養(yǎng)細(xì)胞能夠?qū)ε囵B(yǎng)載體與靶細(xì)胞以及利用組織的場所上的以及時(shí)間上的信息的相互作用闡明細(xì)胞的各種性質(zhì)和特性,以及利用這些相互作用對基因進(jìn)行功能解析,以及利用生物體組織模板進(jìn)行組織的再構(gòu)建,以及再構(gòu)建組織的移植都成為可能。
文檔編號A61L27/00GK1372592SQ01801155
公開日2002年10月2日 申請日期2001年4月2日 優(yōu)先權(quán)日2000年3月31日
發(fā)明者竹澤俊明, 橋爪一善, 今井敬, 高橋透 申請人:獨(dú)立行政法人農(nóng)業(yè)技術(shù)研究機(jī)構(gòu), 竹澤俊明