專利名稱：治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及對癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病進(jìn)行基因治療的藥物及其制備方法。
背景技術(shù)：
對于癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病，對其細(xì)胞分裂進(jìn)行干擾或抑制是一種有效的治療方法。紡綞體是進(jìn)行有絲分裂的細(xì)胞器，而微管是紡錘體的主要成分，微管本身則是管蛋白組成。因此，如果對這些結(jié)構(gòu)和成分進(jìn)行改變或施加作用，就有可能達(dá)到對有絲分裂進(jìn)行干預(yù)的目的。紫杉醇(paclitaxel)應(yīng)用到癌癥治療上后，取得了化學(xué)藥物治療癌癥前所未有的成功，證明了這是一條完全可行的途徑。紫杉醇結(jié)合到β-管蛋白上，使微管穩(wěn)定性增強(qiáng)，打破了微管正常的動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，使有絲分裂不能完成，導(dǎo)致對細(xì)胞分裂的抑制。
紫杉醇的成功應(yīng)用啟發(fā)了本發(fā)明治療機(jī)理設(shè)計(jì)基因治療的藥物。而由于基因治療的本身的特點(diǎn)，它可以取得大大優(yōu)于包括紫杉醇在內(nèi)的藥物的治療效果。微管具有動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性，一方面在進(jìn)行組裝，另一方面在進(jìn)行去組裝。一旦組裝或去組裝受到影響，動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性即被打破，有絲分裂不能順利進(jìn)行。結(jié)合在β-管蛋白上的GTP的水解，是微管去組裝的先決條件。而β-管蛋白上的GTP水解，是由α-管蛋白上谷氨酸254啟動(dòng)的。因此α-管蛋白上的谷氨酸254在微管去組裝中處在提綱攜領(lǐng)的重要位置。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種可使β-管蛋白上的GTP的水解受影響而不能照常進(jìn)行，從而使微管去組裝受阻，微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性被打破，有絲分裂受到干擾，細(xì)胞分裂受到抑制的對癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病進(jìn)行治療的基因藥物及其制備方法。
本發(fā)明的技術(shù)方案是一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，包括載體與活性成分，其活性成份含有編碼第254位氨基酸谷氨酸的核苷酸序列缺失或者是編碼第254位氨基酸谷氨酸的核苷酸序列被其它任一種氨基酸的核苷酸序列置換的突變型人α-管蛋白基因。
所述的突變型人α-管蛋白基因?qū)爰膊〔课缓?，產(chǎn)生一種在微管去組裝過程中干擾人β-管蛋白上的GTP水解的其第254位氨基酸谷氨酸缺失或者是第254位氨基酸谷氨酸被其它任一種氨基酸置換的突變型人α-管蛋白。
所述的導(dǎo)入所使用的載體包括病毒、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、細(xì)胞、各種合成的基因遞送系統(tǒng)如陽離子脂、多聚陽離子、肽、使用基因槍、噴射注射、電脈沖、超聲，以及使用裸露核酸。
所述的導(dǎo)入使用的載體是5型人腺病毒。
所述的置換第254位氨基酸谷氨酸的氨基酸可以是20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中除谷氨酸以外的其它19種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的任何一種，它可以是丙氨酸也可以是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天門冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺中的任一種。
治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物的制備方法合成兩個(gè)人α-管蛋白基因的寡聚核苷酸引物，其中5′-引物序列為AATTCGCAAGCTGGC，3′-引物為跨越谷氨酸254編碼區(qū)且其中谷氨酸254編碼缺失或置換為非谷氨酸編碼的序列，用這兩個(gè)引物以pATub為模板進(jìn)行PCR合成，得到長度為400-403bp的產(chǎn)物，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI消化，得到長度為378-381bp的ApaLI-NcoI片段。將pATub用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI消化，得到長度為165bp EcoRI-NcoI片段。用連接酶將ApaLI-EcoRI片段和EcoRI-NcoI片段連接，得到長度為543-546bp的ApaLI-NcoI片段。先后用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI和NcoI消化pATub，去除小片段，分離純化出大片段，再用連接酶將之與上面得到的ApaLI-NcoI片段連接，得到突變型α-管蛋白基因；將得到的突變型α-管蛋白基因克隆到穿梭載體pShuttle-CMV中，將此質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶PmeI切成線狀，再將之與5型人腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1共同轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌細(xì)胞中，用卡那霉素選擇出重組質(zhì)粒pAd-ATub(M)。將pAd-ATub(M)用限制性核酸內(nèi)切酶PacI切成線狀，然后轉(zhuǎn)染到人腎293細(xì)胞中，得到重組腺病毒。
所述的將第254位氨基酸谷氨酸替換成丙氨酸時(shí)以pATub為模板進(jìn)行PCR合成所用的3′-引物的序列為AATGCTGTCAGGTCA。
所述的在將第254位氨基酸編碼處空缺時(shí)以pATub為模板進(jìn)行PCR合成所用的3′-引物的序列為AATGTCAGGTCAACATT。
這里披露的新發(fā)明的藥物，是基因治療藥物，其用途為對癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病進(jìn)行治療。藥物在導(dǎo)入疾病部位后，產(chǎn)生的基因產(chǎn)物為突變型人α-管蛋白，其突變處為野生型人α-管蛋白谷氨酸254。藥物的制備方法為，在體外將野生型人α-管蛋白的基因或基因片段進(jìn)行改變，即對α-管蛋白谷氨酸254進(jìn)行置換或刪除，獲得突變型α-管蛋白基因并以可表達(dá)的形式置入載體。藥物的作用為，在導(dǎo)入到疾病部位后，所表達(dá)的突變型α-管蛋白與野生型β-管蛋白結(jié)合，形成二聚體，并組裝微管。突變型α-管蛋白因其原谷氨酸254的突變，啟動(dòng)β-管蛋白上的GTP水解的功能受到影響或喪失，使β-管蛋白上的GTP的水解不能照常進(jìn)行，從而使微管去組裝受阻，微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性隨即打破，有絲分裂受到干擾，遂使細(xì)胞分裂受到抑制，達(dá)到對癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病進(jìn)行治療的目的。
具體實(shí)施例方式實(shí)施例1從人細(xì)胞提取總RNA，以其中的poly(A)RNA為模板用反轉(zhuǎn)錄酶合成cDNA，用PCR(多聚酶鏈反應(yīng))擴(kuò)增α-管蛋白cDNA，提純，將α-管蛋白cDNA克隆到質(zhì)粒中得到pATub，其序列以測序進(jìn)行核實(shí)。合成兩個(gè)人α-管蛋白基因的寡聚核苷酸引物供PCR之用，其中5′-引物序列為AATTCGCAAGCTGGC，3′-引物序列為AATGCTGTCAGGTCA，3′-引物跨越谷氨酸254編碼區(qū)，但將第254位氨基酸編碼處合成為5′TGC3′(其互補(bǔ)鏈即為5′GCA3′)，從而使之由編碼谷氨酸(核苷酸序列為GAA)變?yōu)榫幋a丙氨酸(核苷酸序列為GCA)。用這兩個(gè)引物以pATub為模板進(jìn)行PCR合成，得到長度為403bp(堿基對)的產(chǎn)物，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI消化，得到長度為381bp的ApaLI-EcoRI片段。將pATub用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI消化，得到長度為165bp的EcoRI-NcoI片段。用連接酶將ApaLI-EcoRI片段和EcoRI-NcoI片段連接，得到長度為546bp的ApaLI-NcoI片段。先后用限制性核酸內(nèi)節(jié)酶ApaLI和NcoI消化pATub，去除小片段，分離純化出大片段，再用連接酶將之與上面得到的ApaLI-NcoI片段連接，得到新的克隆pATub(A)，其中的α-管蛋白基因編碼的第254位氨基酸已不是谷氨酸，而是丙氨酸，完成了突變，其序列以測序進(jìn)行核實(shí)。
將得到的pATub(A)中的突變型α-管蛋白基因克隆到穿梭載體pShuttle-CMV中(T.-C.lle等，PNAS，1998年，第95卷，第2509-2514頁)(其表達(dá)即置于巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子(cytomegalovirus promoter)控制之下)，將此質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶PmeI切成線狀，再將之與5型人腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1共同轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌細(xì)胞中，用卡那霉素選擇出重組質(zhì)粒pAd-ATub(A)。將pAd-ATub(A)用限制性核酸內(nèi)切酶PacI切成線狀，然后轉(zhuǎn)染到人腎293細(xì)胞中，得到重組腺病毒。重組腺病毒經(jīng)繁殖后，以氯化銫超離心純化，懸浮于5％的甘油中，于攝氏零下80度保存。其滴度以PFU(plaque-forming unit)表示。
在體外培養(yǎng)人乳腺癌細(xì)胞MDA-AB-231細(xì)胞。將得到的重組腺病毒以50MOI(multiplicity of infection，感染倍數(shù))感染MDA-AB-231細(xì)胞，時(shí)間為12小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)組，將感染了重組腺病毒的MDA-AB-231細(xì)胞與未感染重組腺病毒的MDA-AB-231細(xì)胞以1∶100的比例混合，然后將5×106個(gè)細(xì)胞注射到裸鼠皮下。作為對照，將同樣數(shù)量的未感染重組腺病毒的MDA-AB-231細(xì)胞注射到裸鼠皮下。對照組小鼠長出腫瘤，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生成則受到抑制。
在體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞HGT-1細(xì)胞。將得到的重組腺病毒以50 MOI感染HGT-1細(xì)胞，時(shí)間為12小時(shí)。在實(shí)驗(yàn)組，將感染了重組腺病毒的HGT-1細(xì)胞與未感染重組腺病毒的HGT-1細(xì)胞以1∶100的比例混合，然后將5×106個(gè)細(xì)胞注射到裸鼠皮下。作為對照，將同樣數(shù)量的未感染重組腺病毒的HGT-1細(xì)胞注射到裸鼠皮下。對照組小鼠長出腫瘤，實(shí)驗(yàn)組小鼠的腫瘤生成則受到抑制。
將5×106個(gè)人乳腺癌細(xì)胞MDA-AB-231細(xì)胞注射到裸鼠皮下，待腫瘤長至直徑5毫米時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組，將109PFU重組腺病毒注射到腫瘤中，對照組注射不含病毒的等量溶液。實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤生長受到抑制，腫瘤縮小。對照組小鼠腫瘤繼續(xù)長大。
將5×106個(gè)人胃癌細(xì)胞HGT-1細(xì)胞注射到裸鼠皮下，待腫瘤長至直徑5毫米時(shí)，在實(shí)驗(yàn)組，將109PFU重組腺病毒注射到腫瘤中，對照組注射不含病毒的等量溶液。實(shí)驗(yàn)組小鼠腫瘤生長受到抑制，腫瘤縮小。對照組小鼠腫瘤繼續(xù)長大。
實(shí)施例2合成兩個(gè)人α-管蛋白基因的寡聚核苷酸引物供PCR之用，其中5′-引物序列為AATTCGCAAGCTGGC，3′-引物序列為AATGTCAGGTCAACATT，3′-引物跨越谷氨酸254編區(qū)，并使第254位氨基酸編碼處空缺，即不合成5′TTC3′(其互補(bǔ)鏈即為編碼谷氨酸的5′GAA3′)，導(dǎo)致谷氨酸254缺失。用這兩個(gè)引物以實(shí)施例1中得到的pATub為模板進(jìn)行PCR合成，得到長度為400bp(堿基對)的產(chǎn)物，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI消化，得到長度為378bp的ApaLI-EcoRI片段。將pATub用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI消化，得到長度為165bp的EcoRI-NcoI片段。用連接酶將ApaLI-EcoRI片段和EcoRI-NcoI片段連接，得到長度為543bp的ApaLI-NcoI片段。先后用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI和NcoI消化pATub，去除小片段，分離純化出大片段，再用連接酶將之與上面得到的ApaLI-NcoI片段連接，得到新的克隆pATub(-E)，野生型α-管蛋白基因的谷氨酸254編碼在pATub(-E)中缺失，突變完成，其序列以測序進(jìn)行核實(shí)。
權(quán)利要求
1.一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，包括載體與活性成分，其特征在于其活性成份含有編碼第254位氨基酸谷氨酸的核苷酸序列缺失或者是編碼第254位氨基酸谷氨酸的核苷酸序列被其它任一種氨基酸的核苷酸序列置換的突變型人α-管蛋白基因。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，其特征在于所述的突變型人α-管蛋白基因?qū)爰膊〔课缓螅a(chǎn)生一種在微管去組裝過程中干擾人β-管蛋白上的GTP水解的其第254位氨基酸谷氨酸缺失或者是第254位氨基酸谷氨酸被其它任一種氨基酸置換的突變型人α-管蛋白。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，其特征在于所述的導(dǎo)入所使用的載體包括病毒、脂質(zhì)體、質(zhì)粒、細(xì)胞、各種合成的基因遞送系統(tǒng)如陽離子脂、多聚陽離子、肽、使用基因槍、噴射注射、電脈沖、超聲，以及使用裸露核酸。
4.根據(jù)權(quán)利要求3其所述的一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，其特征在于載體病毒為5型人腺病毒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物，其特征在于所述的置換第254位氨基酸谷氨酸的氨基酸可以是20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中除谷氨酸以外的其它19種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸中的任何一種，它可以是丙氨酸也可以是甘氨酸、纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸、精氨酸、賴氨酸、組氨酸、天門冬氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、天門冬酰胺、谷氨酰胺中的任一種。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物的制備方法，其特征在于合成兩個(gè)人α-管蛋白基因的寡聚核苷酸引物供PCR之用，其中5′-引物序列為AATTCGCAAGCTGGC，3′-引物為跨越谷氨酸254編碼區(qū)且其中谷氨酸254編碼缺失或置換為非谷氨酸編碼的序列，用這兩個(gè)引物以攜帶野生型人α-管蛋白基因的質(zhì)粒pATub為模板進(jìn)行PCR合成，得到長度為400-403bp的產(chǎn)物，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI消化，得到長度為378-381bp的ApaLI-NcoI片段，將pATub用限制性核酸內(nèi)切酶EcoRI消化，用單鏈核酸外切酶將之切成平頭，再用限制性核酸內(nèi)切酶NcoI消化，得到長度為165bp EcoRI-NcoI片段。用連接酶將ApaLI-EcoRI片段和EcoRI-NcoI片段連接，得到長度為543-546bp的ApaLI-NcoI片段，先后用限制性核酸內(nèi)切酶ApaLI和NcoI消化pATub，去除小片段，分離純化出大片段，再用連接酶將之與上面得到的ApaLI-NcoI片段連接，得到突變型α-管蛋白基因，將得到的突變型α-管蛋白基因克隆到穿梭載體pShuttle-CMV中，將此質(zhì)粒用限制性核酸內(nèi)切酶PmeI切成線狀，再將之與5型人腺病毒質(zhì)粒pAdEasy-1共同轉(zhuǎn)化到BJ5183大腸桿菌細(xì)胞中，用卡那霉素選擇出重組質(zhì)粒pAd-ATub(M)，將pAd-ATub(M)用限制性核酸內(nèi)切酶PacI切成線狀，然后轉(zhuǎn)染到人腎293細(xì)胞中，得到重組腺病毒。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物的制備方法其特征在于所述的將第254位氨基酸谷氨酸替換成丙氨酸時(shí)以pATub為模板進(jìn)行PCR合成所用的3′-引物序列為AATGCTGTCAGGTCA。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物的制備方法其特征在于所述的將第254位氨基酸谷氨酸缺失時(shí)以pATub為模板進(jìn)行PCR合成所用的3′-引物序列為AATGTCAGGTCAACATT。
全文摘要
一種治療癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病的基因藥物及其制備方法，包括載體與活性成分，活性成分含有編碼第254位氨基酸谷氨酸的核苷酸序列缺失或者是被其它任一種氨基酸的核苷酸序列置換的突變型人α－管蛋白基因。制備方法為，在體外將野生型人α－管蛋白的基因或基因片段進(jìn)行改變，即對α－管蛋白谷氨酸254進(jìn)行置換或刪除，獲得突變型α－管蛋白基因并以可表達(dá)的形式置入載體。其作用為，在導(dǎo)入到疾病部位后，所表達(dá)的突變型α－管蛋白與野生型β－管蛋白結(jié)合，形成二聚體，并組裝微管。突變型α－管蛋白因其原谷氨酸254的突變，啟動(dòng)β－管蛋白上的GTP水解的功能受影響或喪失，使β－管蛋白上的GTP的水解不能照常進(jìn)行，從而使微管去組裝受阻，微管動(dòng)態(tài)不穩(wěn)定性隨即打破，有絲分裂受到干擾，達(dá)到對癌癥等以細(xì)胞分裂失控為特征的疾病進(jìn)行治療的目的。
文檔編號A61K31/7088GK1416903SQ0113152
公開日2003年5月14日 申請日期2001年11月7日 優(yōu)先權(quán)日2001年11月7日
發(fā)明者王曉 申請人:王曉