專利名稱：甘露聚糖－結合型凝集素(mbl)在免疫受損個體的治療中的新意義的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及甘露聚糖結合型凝集素(MBL)的亞單位和寡聚物在免疫受損個體的預防和/或治愈性治療中的應用。
背景技術：
已知人體中有多組凝集素，即碳水化合物結合蛋白。其中一組是C型凝集素。C型凝集素包含鈣依賴性碳水化合物識別結構域(C-型CRD)1。甘露聚糖結合型凝集素(MBL)(甘露糖結合型凝集素的同義詞)、甘露聚糖結合蛋白或甘露糖結合蛋白(MBP)屬于C型凝集素中稱為膠原凝集素(collectin)的亞組，因為這些可溶性蛋白由能提呈附著于膠原性質的莖上的三個CRD的亞單位組成2。MBL與廣泛多種微生物所提呈的碳水化合物相互作用，越來越多的證據表明，其在先天性免疫防御中起重要作用3。MBL當與碳水化合物結合后能活化補體系統。
補體系統可通過三種不同途徑來激活經典途徑、旁路途徑、以及新描述的第三途徑，甘露聚糖結合型凝集素(MBL)途徑，該途徑因MBL與微生物所提呈的碳水化合物的結合而啟動。旁路途徑的成分和MBL途徑的成分都屬于先天性免疫防御，也稱為天然或非克隆化免疫防御的一部分，而經典途徑則涉及與具有特異性免疫防御作用的抗體的合作4。
人MBL蛋白由18條相同的32kDa多肽鏈組成27，每條多肽鏈包含一個只有21個氨基酸的N-末端短片段，該片段包括三個半胱氨酸殘基，緊接著是膠原蛋白基元Gly-X-Y的7個重復單位，其被一個Gln殘基打斷，后隨另外12個Gly-X-Y重復。一個含有34個殘基的“頸部區(qū)”將93個氨基酸的C末端鈣依賴性凝集素結構域與該分子的膠原部分相連28。
三條多肽鏈的膠原區(qū)組合成一個經二硫鍵穩(wěn)定地共價連接的亞單位。各個亞單位之間通過二硫鍵以及通過非共價相互作用而相連27。
但這些二硫鍵的位置尚未完全闡明。MBL的非還原SDS-PAGE顯示出表觀分子量(m.w.)大于200kDa的帶，它們可能是3、4、5和甚至6個亞單位聚集成的大塊。
天然人MBL蛋白中亞單位的真實數目尚有爭論。Lipscombe等(1995)利用超速離心獲得的數據提示，25％的人血清MBL由2-3個亞單位組成，僅有很少一部分達到6個亞單位的大小。離子交換層析所得級分經SDS-PAGE分析、Western印跡、然后利用化學發(fā)光的魯米諾進行密度測定而獲得相對定量，結果顯示，大多數共價連接的MBL亞單位鏈由三聚體組成，但僅有五聚體或六聚體復合物能激活補體。相反，凝膠滲透層析(GPC)顯示，MBL的大小與C1復合物相當。可在允許研究MBL分子的形成中蛋白質-蛋白質弱相互作用的重要性的條件下進行GPC。GPC級分中MBL的含量可通過標準的MBL分析技術測定。
MBL由肝細胞在肝臟中合成并分泌至血液。它結合細菌、酵母、寄生性原蟲以及病毒表面的碳水化合物結構，可通過活化最終的裂解性補體成分或通過促進吞噬作用(調理作用)而殺死微生物，因此具有抗細菌活性。MBL的sertiform結構與C1q(經典途徑中第一個成分的免疫球蛋白結合亞成分)的花束樣結構十分相似3。C1q與兩種絲氨酸蛋白酶C1r和C1s結合，形成C1復合物。類似地，MBL與兩種絲氨酸蛋白酶MASP-15和MASp-26，以及另一種稱為Map 19的蛋白7結合。MASP-1和MASP-2具有與C1r和C1s相同的分子結構6。MBL與碳水化合物的結合誘導MASP-1和MASP-2的活化，然后MASP-2裂解C4和C2產生C3轉化酶C4b2b。有報道說，MASP-1可直接活化C3。目前對MBL/MASP復合物的化學計量以及活化順序一無所知。在其它動物如嚙齒類、牛(cattle)、小雞和猴子中也鑒定出了MBL。
人血清中的MBL濃度主要通過基因測定，但據報道在急性期反應期間升高最多三倍8。三種導致結構改變的突變以及兩種在啟動子區(qū)域中的突變均與MBL缺陷相關9。MBL缺陷與對各種感染的易感性相關。對五例成人的罕見重癥感染的檢查顯示，其中三例為MBL結構突變的純合子，兩例為雜合子10。由丹麥國家醫(yī)院(Danish National Hospital)對229例兒童進行的非HIV相關免疫缺陷的調查顯示，MBL結構性突變的等位基因中出現純合子的頻率比對照組所見高10倍以上11。倫敦StMary’s醫(yī)院的617位相繼住院的兒童的異型分析(allotyping)顯示，感染兒童群與未感染兒童群相比，突變的同種異型純合子和雜合子的出現頻率顯著較高12。
有較寬范圍的寡糖可與MBL結合。由于目標糖通常并不以高密度暴露于哺乳動物細胞表面，因此MBL通常不識別自身決定簇，但特別適于與提呈重復的糖類決定簇的微生物細胞表面發(fā)生相互作用。在體外，酵母(白色念珠菌(Candida albicans)和新形隱球菌(Cryptococcus neoformans))、病毒(HIV-1，HIV-2，HSV-2，及各類甲型流感病毒(influenza A))和多種細菌已顯示能被MBL識別。在一些細菌的例子中，與MBL的結合因莢膜的存在而受損13。但是，即使是有莢膜的細菌(腦膜炎奈瑟氏菌(Neisseriameningitisdis))也顯示與MBL的強有力結合14。
感染MBL缺陷型個體的微生物可來自多種不同的細菌、病毒和真菌物種12，15-17。缺陷還與習慣性流產有關18。事實上，MBL可作為針對絕大多數細菌的廣譜防御分子，并因此被認為是如此多的細菌不能致病的一個原因。
雖然越來越多的信息提請人們注意MBL的保護作用，但也有發(fā)現提示，在MBL完善的個體中比在MBL缺陷的個體中，某些微生物，特別是胞內病原體的感染出現的頻率更高19，20。這與一項動物實驗的結果一致，在該實驗中，小鼠肝臟在注射人的MBL之前HSV-2的數量增加21。
已能從供血者血漿中獲得臨床級MBL，它們可安全用于輸注22。也能產生具有與天然MBL相似的結構和活性的重組MBL(專利申請PA 199900668/C5/KH)。
發(fā)明簡述本發(fā)明涉及MBL在預防和/或治療感染中的應用，所述MBL可從天然來源純化，或從經重組技術產生的，或通過任何其它適當的MBL產生型細胞產生的物質中純化。所述情況可能與一種治療性或醫(yī)療性處理，如細胞毒性治療有關。MBL可在開始所述處理之前或之后給與，并可持續(xù)任何被認為適當的時間。
本發(fā)明還涉及對具有正常MBL水平的個體進行處理，因為這些個體很可能-在任何細胞毒性處理之前-因MBL給藥而受益。
相應地，本發(fā)明一個方面涉及對免疫受損個體的感染進行的治療和/或預防，或涉及對由于接受了已知與免疫受損情況的發(fā)生有關的治療而很可能出現這類病癥的個體進行的治療。所述治療的實例如化療和放療如X-線處理。
化療和放療被作為數種癌癥的治療的一部分，它們旨在減緩疾病的進展或通過治愈性治療而逆轉這種進展。化療和放療都是損害免疫的，因為免疫系統的細胞被殺死，因而導致一種免疫抑制狀態(tài)，其尤以嗜中性粒細胞缺少癥為特征。
據信MBL主要通過其調理活性(使微生物做好被吞噬的準備)來發(fā)揮其抗微生物活性。該活性依賴于MBL結合至微生物表面后的補體活化以及C4b和C3b在該微生物表面的沉積。MBL還可促進直接由補體介導的對微生物的殺傷作用，其通過激活補體的最終裂解途徑并將膜攻擊復合物(MAC)插入細胞膜中而實現。該機制被認為重要性不大。多種微生物，如肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumonia)等革蘭氏陽性細菌均對MAC有抗性，但可通過調理吞噬而被裂解。當將調理吞噬作用作為MBL介導的微生物清除作用的主要效應機制時，驚奇地發(fā)現MBL處理對缺陷最重要的吞噬細胞，即嗜中性粒細胞的人有利。
在近30年前就已經認識到了嗜中性粒細胞缺乏癥在接受細胞毒性化療的癌癥患者之嚴重感染危險性中的重要性。感染因此非常頻繁地出現在接受化療和其它免疫受損性干預治療的血液癌癥患者和其它癌癥患者中。隨著化療的越來越強化應用，感染的問題增加，并且現已成為支持療法中的主要難題24。相應地，所有血液學和癌癥學部門都利用多種資源與感染作斗爭。由于多重耐藥的細菌菌株的出現，這種斗爭不斷變得越來越難。
在免疫受損期間或之后缺乏免疫系統中重要的細胞成分的人都依賴于一種有效的先天性體液免疫系統如補體系統，如在嗜中性粒細胞缺乏的情況中。目前尚無足夠精確且可信的預后因素能預測接受化療、放療、或其它免疫損傷治療的個體中嚴重感染的增加的危險性24。
相應地，因醫(yī)療處理而出現的免疫受損很可能使相應個體對感染高度易感。根據本發(fā)明，有可能在已知能導致免疫受損狀況的處理之前或期間對處在所述免疫受損狀況下的個體進行預防感染的處理。通過在已知能導致所述狀況的處理之前或期間用MBL進行預防性處理，可預防隨后的感染或減小該個體因免疫受損而對感染的易感性。如果該個體由于，例如，導致免疫受損狀況的處理而發(fā)生感染，也可通過給與該個體以本發(fā)明的MBL組合物而治療所述感染。
本發(fā)明還涉及通過輸注MBL而治療所述缺陷。此外，本發(fā)明還涉及MBL血漿濃度在預測接受諸如化療的個體對感染的易感性中的用途。
本發(fā)明另一方面涉及含有至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位，或至少一種寡聚體(其含至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位)的組合物在制備用于預防、緩解或治愈性治療血漿MBL水平超過50ng/ml的個體中感染的藥物中的應用。尤其所述個體可能具有能導致增加對感染的易感性的先天性MBL缺陷或后天獲得的MBL缺陷。相應地，本發(fā)明還涉及對甘露聚糖結合型凝集素(MBL)缺陷(包括MBL的產生和/或功能方面的任何缺陷)個體中的感染的治療。
本發(fā)明另一方面提供了一種評估正接受化療或任何其它形式免疫損傷性治療的患者體內任何臨床顯著感染發(fā)生的可能性的方法，所述方法包括測定得自該患者血漿或血清中的MBL濃度，并根據所測濃度評估所述可能性的步驟。
在本文中，免疫受損是指其原有含義，即一個個體由于正常免疫防御系統的一或多個要素中的原發(fā)性或繼發(fā)性缺陷(誘導型或非誘導型)而不能激發(fā)足夠的免疫應答。
發(fā)明詳述迄今為止，MBL已用于治療MBL缺陷，所述缺陷被限定為低于50ng/ml，或更經常是低于10ng/ml血清的任意水平，所述界值水平通常與各種MBL檢測試驗的敏感性水平一致，因此將該水平設定為基本上不能被現有技術中的各種試驗檢測到的MBL水平。
本發(fā)明顯示，可在不關免疫受損個體的血清MBL水平的情況下對所述個體中的感染進行預防和/或處理。尤其當在MBL水平超過50ng/ml血清的免疫受損個體中給與MBL時，可阻止這些個體中的感染。此外，MBL水平超過75ng/ml血清的個體可能需要治療，如MBL水平超過100ng/ml血清的個體，以及MBL水平超過150ng/ml血清的個體。
還可通過將MBL與相關抗生素、抗病毒試劑或抗真菌試劑聯合給與這些個體，而用MBL治療感染。
具體地，處在因接受醫(yī)療處理而導致免疫受損狀態(tài)的危險中的個體將從所述治療之前、期間、以及可能還有之后的MBL預防性處理中受益，從而防止與免疫受損狀態(tài)相關的疾病，如感染。
一般情況下，已經免疫受損或處在免疫受損的危險中的所有個體應在不考慮他們的特異性MBL水平的情況下用MBL進行治療。這樣做的原因是，感染可能導致MBL耗竭，因此能提高MBL水平的MBL“激發(fā)劑(booster)”將減小MBL耗竭至缺陷水平以下的危險，而這些患者的免疫防御能力可通過給與重組型或天然血漿衍生型MBL而得到加強。尤其是，向MBL水平超過50ng/ml血清的個體給與MBL可防止感染。此外，MBL水平超過7 ng/ml血清的個體可能需要治療，如MBL水平超過100ng/ml血清的個體，以及MBL水平超過150ng/ml血清的個體。
本發(fā)明人還在本文中指出，MBL水平超過500ng/ml血清的個體的免疫受損狀態(tài)尤其能從MBL治療中受益。因此，MBL水平超過400ng/ml血清的個體尤其能受益，如MBL水平超過300ng/ml血清的個體，MBL水平超過250ng/ml血清的個體，MBL水平超過200ng/ml血清的個體。
故，本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方案涉及MBL在藥物制備中的應用，所述藥物用于在血清MBL水平處于50-500ng/ml范圍內(如在100-500ng/ml范圍內)的個體中治療和/或預防感染，尤其與該個體的免疫受損狀態(tài)有關的感染。
所述免疫受損狀態(tài)可能歸因于上述醫(yī)療處理，即化療或其它免疫抑制性治療，如由類固醇、環(huán)磷酰胺、硫唑嘌呤、氨甲蝶呤(metotrexate)、環(huán)孢菌素、和/或雷帕霉素(rapamycin)的治療引起的那些，尤其與癌癥治療相關的那些。
免疫受損狀態(tài)還可能歸因于獲得性免疫缺陷，如AIDS，或白血病，尤其嗜中性粒細胞缺乏癥或其它繼發(fā)性免疫缺陷。
此外，MBL水平高于50ng/ml且低于500ng/m的個體將總體上從MBL治療中受益，從而防止感染，尤其慢性感染。
其中一組需要MBL治療以便防止和/或治療感染的個體是不管MBL水平本身如何但功能性MBL水平較低的個體。這是由于，對某些MBL突變而言，已發(fā)現盡管血清中表達了MBL亞單位及其寡聚體，但它們的功能較低。MBL的功能或功能性活性可通過其形成MBL/MASP復合物，從而導致補體系統活化的能力來評估。當C4被MBL/MASP裂解后，暴露出一個活性硫羥基酯，而C4則共價附著至鄰近的親核基團。C4b的絕大部分因此而附著至已包被的塑料孔中，可用抗C4抗體檢測。
MBL功能性活性的定量TRIFMA可如下進行1)用1mg甘露聚糖的100ml緩沖液包被微滴板上的孔；2)用吐溫20封閉；3)加入待檢樣品，如稀釋的MBL制劑；4)加入MBL缺陷型血清(這導致形成MBL/MASP復合物)；或可先將MBL與MBL缺陷型血清混合，然后加入微滴板的孔中；5)加入5mg/ml純化的補體因子C4；6)37℃保溫1小時；7)加入Eu標記的抗C4抗體；8)加入增強(enhancement)液；9)利用時間分辨型熒光測定法(timeresolved fluorometry)讀取Eu。除了步驟8和9以外，各步驟之間，都將所述平板室溫保溫并洗滌。
基于ELISA的評估可類似地進行，如在步驟7)中加入生物素標記的抗C4；8)加入堿性磷酸酶標記的親和素；9)加入底物；和10)讀取色度。
功能性可表示為MBL的比活性，如1個單位的MBL活性/ng MBL。非功能性MBL可限定為比活性小于血漿比活性的50％，如小于血漿比活性的25％，其中血漿MBL比活性是從不含任何MBL突變的個體中純化得到的。具體地，血漿MBL基準為血漿庫LJ 6.57 28/04/97。
故，本發(fā)明還涉及對個體中感染的防止和/或治療，所述個體在他們的MBL基因中帶有一個突變，其導致MBL的表達減少和/或非功能性MBL的表達。
特別是，MBL基因中的所述突變可導致第52位(此編號包括MBL的先導肽)的氨基酸從精氨酸變?yōu)榘腚装彼幔?4位的氨基酸從甘氨酸變?yōu)樘於彼峄虻?5位的氨基酸從甘氨酸變?yōu)楣劝彼帷?br> MBL基因的啟動子區(qū)中的突變還可導致MBL水平降低。尤其-位和-221位的突變對MBL的表達有影響。
MBL序列可在swiss.prot中找到，錄入號為11226。
用于制備MBL藥物的MBL組合物可從現有的任何MBL源產生。MBL源可以是天然MBL，其中MBL均產生于天然宿主生物中，即MBL由通常表達MBL的細胞產生。產生MBL組合物的一個常規(guī)方法是，從人類體液，如血液或血漿中提取MBL，但也可從肝細胞培養(yǎng)物中收獲MBL。
另一方面，MBL寡聚體可由天然狀態(tài)下不表達MBL多肽的宿主生物，通過諸如重組技術而產生。
在第一個實施方案中，MBL源可以是血清，從中可通過純化血清、血漿、乳產物、初乳等等而獲得MBL組合物，所述純化利用適當的純化方法，如利用了碳水化合物衍生的基質(如甘露糖或甘露聚糖偶聯型基質)的親和層析。WO99/64453公開了這樣一種方法，其中在純化步驟之后，是除去病毒以除去來自MBL源的感染因子的步驟，因為從體液純化的蛋白質的主要問題之一就是在引入所需蛋白的同時導入感染因子的危險。WO99/64453已全文引入作為參考。
用于制備MBL藥物的MBL組合物優(yōu)選含有MBL寡聚體，其中所述寡聚體具有與血清中MBL的大小分配基本上相同的大小分配，如與血清中MBL的大小分布譜至少50％相同的大小分布譜。相同，指至少50％的寡聚體具有高于200kDa的表觀分子量(當用SDS-PAGE和/或Western印跡進行分析時)。
在一個更優(yōu)選的實施方案中，所述大小分布譜與血清MBL的大小分布譜至少75％相同，如與血清MBL的大小分布譜至少90％相同，更優(yōu)選與血清MBL的大小分布譜至少95％相同。
當從原本具有另一種大小分布譜的MBL源進行純化時，優(yōu)選使得用于從所述MBL源進行純化的親和層析有利于純化表觀分子量高于200kDa的寡聚體。這可通過利用對MBL亞單位和/或二聚體基本不具有親和力的碳水化合物衍生化基質來實現。優(yōu)選所述碳水化合物基質基本上僅對重組MBL四聚體、五聚體和/或六聚體具有親和力。
所述基質可用任何碳水化合物或碳水化合物混合物來衍化，所述化合物或混合物可與MBL結合，并優(yōu)選與MBL的較高級寡聚體結合。所述碳水化合物衍生的基質優(yōu)選為己糖衍生的基質，如甘露糖-或N-乙酰葡糖胺衍生的基質，如最優(yōu)選甘露糖衍生的基質。
碳水化合物衍生的基質的選擇性可通過確保該基質本身，即未衍生的基質基本上對MBL多肽不具備親和力，尤其對MBL三聚體或更小的寡聚體不具有親和力來獲得。當基質本身不含碳水化合物時可確保這一點。尤其所述基質應該不含任何Sepharose或類似物。優(yōu)選，基質由含有非碳水化合物的聚合物，如FractogelTSK珠組成。
所述基質可以是適于層析的任何形式，優(yōu)選為珠子，如塑料珠子。
將所述MBL源上樣至層析柱后，洗柱，優(yōu)選用非變性緩沖液洗柱，該緩沖液所具有的組成、pH以及離子強度導致消除蛋白質但不洗脫較高級的MBL寡聚體。如緩沖液可以是TBS。MBL的洗脫用能有效洗脫較高級MBL寡聚體的選擇性脫附劑，如含有EDTA(例如5mM EDTA)或甘露糖(例如50mM甘露糖)等脫附劑的TBS進行，然后收集MBL寡聚體。這種純化方法已在與本申請同一天提交的題為“重組人甘露聚糖結合型凝集素”的共同未決之國際專利申請中描述。
在一個優(yōu)選的方面，臨床級MBL組合物可利用重組技術所產生的MBL源來獲得，其中所述MBL源為MBL產生細胞的培養(yǎng)物。
因此，本發(fā)明包含用產生重組甘露聚糖結合型凝集素(MBL)的方法產生的MBL，所述方法包括以下步驟-制備基因表達構建體，其含有編碼MBL多肽或其功能等效物的DNA，-用所述構建體轉化宿主細胞培養(yǎng)物，-培養(yǎng)所述宿主細胞培養(yǎng)物，從而表達所述多肽并將其分泌至培養(yǎng)基中，然后-獲得含有人重組MBL的培養(yǎng)基。
含有人重組MBL多肽的培養(yǎng)基可然后如上文關于MBL純化所述進行處理。
所述MBL多肽優(yōu)選為哺乳動物MBL多肽，如更優(yōu)選人的MBL多肽。所述基因表達構建體可通過本領域已知的傳統方法產生，如美國專利5,270,199所述的方法。
在另一個實施方案中，所述基因表達構建體如丹麥專利申請PA 199900668或與本申請同一天提交的題為“重組人甘露聚糖結合型凝集素”的共同未決之國際專利申請中所述而制備。
表達優(yōu)選在諸如哺乳動物細胞中進行，本發(fā)明的制劑通過應用含有MBL基因的內含子序列以及至少一個外顯子序列的表達載體而獲得。本文中，將轉基因動物作為表達系統，這種動物已經被遺傳修飾，因而包含并能表達人MBL基因或其片段或其類似物。
除了純化方法，優(yōu)選所述基因表達構建體和宿主細胞也有利于較高級寡聚體的產生，所述產生可利用下述基因表達構建體實現，所述構建體含有來自人MBL基因或其功能等效物，哺乳動物細胞以及昆蟲細胞的至少一種內含子序列。
尤其MBL組合物可用于治療和/或預防個體中與免疫受損狀態(tài)相關的感染。任何微生物感染，即由一個微生物物種引起的任何感染均可用MBL進行治療和/或預防。
因此，MBL組合物可用于預防和/或治療免疫受損個體中由真菌、酵母、原生動物和/或細菌這些微生物物種引起的感染。
MBL組合物還可用于治療由抗常規(guī)藥物的微生物物種所致的感染，如由能抗至少一種抗生素的細菌物種引起的感染。更重要的是，對多重耐藥的細菌物種所致感染的預防和/或治療。
所述免疫受損個體可能患有由病原性細菌物種，如肺炎鏈球菌、沙門氏菌(Salmonelle)和葡萄球菌物種引起的感染。
但目前已知，特別是免疫受損的個體還常?；加杏赏ǔ５姆侵虏⌒约毦锓N，即條件致病菌，如大腸埃希氏菌引起的感染，這些物種中有很多對常規(guī)抗生素治療有抗性。
與免疫受損狀態(tài)有關的感染還可以是病毒感染，如逆轉錄病毒的感染。
免疫受損狀態(tài)還可以是人類免疫缺陷病毒(HIV)這種逆轉錄病毒的感染。但根據本發(fā)明所治療和/或預防的病毒感染通常并非由逆轉錄病毒引起，而可能由諸如DNA病毒引起。
可利用親和層析等的洗脫物來制藥。但優(yōu)選在使用前進一步純化該洗脫物。
除了MBL寡聚體，所述藥物還可包含可藥用的載體物質和/或賦形劑。尤其，可加入穩(wěn)定劑以穩(wěn)定MBL蛋白。穩(wěn)定劑可以是糖醇，糖類，蛋白和/或氨基酸。穩(wěn)定劑的實例如麥芽糖或白蛋白。
可根據諸如給藥形式在藥物中添加其它常規(guī)的添加劑。在一個實施方案中，所述藥物為適于注射的形式?？墒褂贸Ｒ?guī)載體物質，如等滲鹽水。
在另一實施方案中，所述藥物為適于經肺給藥的形式，如可吸入的粉末或可局部應用的乳膏(crème)或流體。
給藥途徑可以是任何適當的途徑，如靜脈內、肌肉內、皮下、或皮內。本發(fā)明還考慮了經肺給藥或局部給藥。
MBL組合物給藥還可與另一治療同時、順次、或分開進行，所述另一治療為導致該個體免疫受損的治療，如化療?？稍诨熁蚱渌委熼_始前的一段時間內，以及在化療開始后的至少一段時間內給與所述藥物。
MBL組合物給藥采用適當的劑量方案，優(yōu)選以適當間隔重復給藥，如一周1或2次，始于化療開始前并按一定的間隔維持(如每周1次)，直至至少化療全程的其中一部分時間段，優(yōu)選維持化療全程。
通常根據接受治療的個體每劑給藥1-100mg，如2-10mg，最優(yōu)選給與5-10mg/劑，例如給與約0.1mg/kg體重。
MBL組合物還可以以試劑盒中的藥物之一的形式使用，該試劑盒中可含有另一種藥物，如抗真菌、抗酵母、抗細菌和/或抗病毒的藥物。
抗病毒藥物可以是能使病毒減毒和/或徹底消滅的藥物。
本發(fā)明還涉及利用對MBL水平的測量作為個體發(fā)生感染的危險性的預示指標，并因此指示是否需要治療。具體是，當MBL水平低于500ng/ml時，可作為預示指標來指示需用MBL進行治療，特別是對那些免疫受損的個體或具有免疫受損危險性的個體而言更是如此。
預示指標可能與任何感染相關，但尤其與正接受免疫損傷性細胞毒治療的個體中的敗血癥或肺炎相關。
因此，本發(fā)明還涉及利用MBL組合物預防和/或減少個體中感染的方法，該方法包括以下步驟i)測定個體中的血清MBL水平，ii)評估該個體出現顯著臨床感染的可能性，并任選，給與該個體一種MBL組合物。
測定了血清或血漿中的MBL水平，方法可以是時間分辨型免疫熒光試驗(TRIFMA)，ELISA，RIA或比濁法。
MBL水平還可以根據如上所述對MBL基因的基因型分析來推斷，其中MBL的突變導致MBL水平下降。
本發(fā)明已就多個方面進行了詳細描述，再用以下圖1和圖2，以及優(yōu)選實施方案的非限制性實施例進一步舉例說明。


圖1具有顯著臨床感染(CSI)的白血病患者以及非CSI白血病患者的血漿中MBL濃度的分布。
圖2具有顯著臨床感染(CSI)的多發(fā)性骨髓瘤患者以及非CSI多發(fā)性骨髓瘤患者的血漿中MBL濃度的分布。
實施例以下實施例證實了，關于MBL缺陷對一組接受化療的血液病患者體內顯著臨床感染的發(fā)生的影響的檢查結果。
研究人群本研究包括對依次來丹麥Aarhus大學血液學系就診的一組患者的檢查。這些患者中大多數接受了化療。他們包括7例急性髓細胞白血病，17例多發(fā)性骨髓瘤(MM)，11例紅細胞增多癥，13例非Hodgkin’s淋巴瘤，1例Brrkitt’s淋巴瘤，1例Waldenstrm’s巨球蛋白血癥，5例慢性淋巴細胞白血病，3例不確定型顯著性單克隆γ球蛋白病(MGUS)，5例Hodgkin’s淋巴瘤，2例慢性髓細胞性白血病，1例急性淋巴細胞白血病，1例再生障礙性貧血，和1例骨髓纖維變性。其中MM組全部接受了化療。一共使用了三種不同治療VAD長春新堿(0.4mg/24hr)和阿霉素(9mg/m2/24hr)通過連續(xù)輸注給藥4天，在每28天一個循環(huán)的其中第1-4天、第9-12天、第17-20天給藥地塞米松(40mg，口服(p.o.))；NOP米托蒽醌(10mg/m2)和長春新堿(1.4mg/m2)通過連續(xù)輸注給藥一次，強的松(2×50mg，口服)在每個循環(huán)的每一天給藥；MP苯丙氨酸氮芥(melphalan)(0.25mg/kg/天)通過輸注給藥4天，強的松(2×50mg，口服)給藥4天。
表現顯著臨床感染(CSI，限定為菌血癥或肺炎)的患者通過對患者數據庫的回顧性計算機搜索來鑒定。在表現CSI的MM患者中，4例患有肺炎球菌性肺炎，3例為非特異性肺炎，1例患有金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)所致的肺炎。
在開始化療前采血至含EDTA的空試管(使EDTA終濃度為約10mM)。將血漿分成數等份，于-80℃保存直至分析。用類似方法從健康供血者獲得血漿樣品。患者采血時沒有感染。
MBL分析MBL濃度通過時間分辨型免疫熒光分析(TRIFMA)測定。微滴孔(fluoroNunc，Nunc，Kamstrup，丹麥)用抗體包被，方法是室溫下與500ng抗人MBL抗體(Mab 131-1，Statens Serum Institut，哥本哈根，丹麥)的100μlPBS(0.14 M NaCl，10mM磷酸，pH7.4)溶液保溫過夜。用含吐溫的緩沖液(TBS，0.14M NaCl，10mM Tris/HCl，7.5mM NaN3，pH7.4，含0.05％吐溫20)洗滌后，在含有0.5M NaCl和10mM EDTA的TBS/吐溫中添加待檢樣品(血漿1/20)和校準品的稀釋液。
4℃保溫過夜并洗滌后，在含25μM的TBS/吐溫中添加顯色的銪標記型抗體(用含Eu的螯合劑異硫氰酸-苯甲基-二亞乙基-三胺-四乙酸標記的Mab 131-112.5ng，按廠商Wallac，Turku，芬蘭的建議)。
保溫2小時并洗滌后，添加熒光增強液(Wallac)，在時間分辨型熒光測定儀(Delfia 1232，Wallac)上讀板。用保存于-80℃的一等份血漿的稀釋液制備標準曲線。該血漿中的MBL濃度(3.6μg/ml)通過與高純度MBL(經定量氨基酸分析而定量)比較而測定。
結果多個MBL缺陷的個體顯示，在血液病患者和正常人之間無差異。
CSI型血液病患者的MBL水平顯著低于非CSI患者(圖1)。對一組MM患者進行分析發(fā)現，其中的CSI型患者的MBL水平較低(圖2)。
討論迄今，關于MBL缺陷與感染頻率之間相關性的研究，是通過限定一個有關缺陷的任意水平(如50ng/ml18)來進行，或利用兩條染色體上都發(fā)生MBL等位基因突變而指示缺陷來進行11，12。在本研究中，患者本身將所述水平限定為臨床癥狀明顯時，即低于500ng MBL/ml。在另一組患者中，所述水平經明確證實不同于此，因為在不同患者人群中不同免疫學參數具有不同的重要性。
圖1和圖2的結果說明，血漿MBL濃度低于500ng/ml的患者在接受化療后更容易被感染。應在該組患者接受化療期間使用MBL對他們進行替代治療。該治療可在開始化療之前就啟動，并維持至其它免疫學參數正常為止。MBL可從人血漿來制備，或可利用重組技術來生產。
顯然，可預見接受細胞毒治療(化療或X-線治療)的其它癌癥患者應該也能從MBL治療中受益。
未公開的結果顯示敗血癥之后MBL濃度下降，因此MBL治療可能是針對首先表現出正常MBL水平的患者的有效療法。
MM患者的存活期從幾個月至幾年不等。人們已付出相當的努力，嘗試對接受化療之癌癥患者的存活力限定預后參數。
所示結果表明，MBL濃度是化療后的一種很好的預示指標。對MBL濃度的測定因此是化療患者的重要預后參數，并應假定對接受其它細胞毒治療的患者也具有類似意義。由于MBL的基因型確定了MBL的血漿濃度，因此對個體中MBL基因的分析可間接用于評估MBL濃度。
在參考文獻中，有兩項研究包括了對癌癥患者中MBL的測定。Aittoniemi等分析了慢性淋巴細胞白血病(CLL)患者中MBL缺陷與感染的關系25。28例患者中僅6例接受了化療，其中3例接受了瘤可寧(chlorambucil)-[氫化潑尼松(prednisolone)]，3例接受了瘤可寧-[氫化潑尼松]和環(huán)磷酰胺-(羥基柔紅霉素(hydroxydaunorubicin))-長春滅瘟堿(oncovine)-氫化潑尼松。將MBL缺陷限定為MBL濃度低于所用MBL試驗的檢測極限(＜20ng/ml)。所有28例患者中僅1例為MBL缺陷。
該研究未嘗試分析化療患者中MBL水平與感染率之間的關系。因此，該研究未能得出本專利申請的權利要求中的結論。
Lehrnbecher等檢查了白細胞介素-6，白細胞介素-8，C反應蛋白，可溶性Fcγ受體III型，或MBL是否能作為患有癌癥和嗜中性粒細胞減少癥的發(fā)熱兒童中嚴重感染的指示26。共研究了56例兒童，他們經證實患有惡性疾病以及化療誘導的嗜中性粒細胞減少癥。所測定的MBL水平確實未出現在紙件中。正文中僅指出，“MBL水平不能用于區(qū)分威脅生命的感染與不明原因的暫時發(fā)熱或可能由導管引起的菌血癥”。
該項研究中的分組不同于本申請中所示，因為他們均為兒童，且其中27例兒童是因為實體瘤而非白血病才歸為該組。他們未對其余29例白血病患者進行分析。在沒有真實數據的情況下，不可能將該研究與本文所示結果進行比較。
其它生物學及免疫調節(jié)性試劑已用于治療嗜中性粒細胞減少癥和發(fā)熱的患者。靜脈注射免疫球蛋白不能有效阻止嗜中性粒細胞減少癥患者中的發(fā)熱或感染，但有可能對抗體不足的患者具有溫和(moderate)效應。干擾素γ有可能對某些嗜中性粒細胞缺陷患者有利，但這一點未得到最后證實。細胞生長因子(粒細胞以及粒細胞-巨噬細胞集落刺激因子)可能縮短嗜中性粒細胞減少癥的病程，并因此需要抗生素。
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權利要求
1.一種組合物在制備預防和/或治療下述個體之感染所用藥物中的應用，所述組合物含有至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位，或至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)寡聚體，該寡聚體含有至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位，所述個體分為a)有免疫受損狀態(tài)的個體；和/或b)具有因醫(yī)療處理而獲得免疫受損狀態(tài)的危險的個體；和/或c)血清MBL水平高于50ng/ml血清的個體。
2.權利要求1的應用，其中所述組合物包含至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)寡聚體，該寡聚體包含至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位。
3.權利要求2的應用，其中所述寡聚體優(yōu)選選自四聚體，五聚體和/或六聚體。
4.權利要求1的應用，其中所述有免疫受損狀態(tài)的個體的血清MBL水平高于50ng/ml血清。
5.權利要求1的應用，其中所述具有因醫(yī)療處理而獲得免疫受損狀態(tài)的危險的個體，其血清MBL水平高于50ng/ml血清。
6.權利要求1-5中任一項的應用，其中所述血清MBL水平是功能性血清MBL水平。
7.權利要求1的應用，其中所述免疫受損狀態(tài)是嗜中性粒細胞減少癥。
8.權利要求1的應用，其中所述免疫受損狀態(tài)是自身免疫性嗜中性粒細胞減少癥。
9.權利要求1的應用，其中所述感染是微生物感染。
10.權利要求9的應用，其中所述微生物為真菌。
11.權利要求9的應用，其中所述微生物為酵母。
12.權利要求9的應用，其中所述微生物為細菌。
13.權利要求12的應用，其中所述細菌能抵抗至少一種抗生素。
14.權利要求12的應用，其中所述細菌為多重耐藥細菌。
15.權利要求12的應用，其中所述細菌為致病性細菌。
16.權利要求9的應用，其中所述感染為病毒感染。
17.權利要求16的應用，其中所述病毒為逆轉錄病毒。
18.權利要求17的應用，其中所述逆轉錄病毒為人類免疫缺陷病毒。
19.權利要求1作為試劑盒的一部分的應用，所述試劑盒進一步包括一種能使微生物減毒或被消滅的抗微生物藥物。
20.權利要求19的作為試劑盒一部分的應用，所述試劑盒進一步包括一種能使細菌減毒或被消滅的抗細菌藥物。
21.權利要求1的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體在天然宿主生物中產生。
22.權利要求21的應用，其中所述天然宿主生物為能天然表達所述MBL亞單位或MBL寡聚體的人類細胞。
23.權利要求1的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體由并非天然表達MBL多肽的宿主生物產生。
24.權利要求1的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體通過包含至少一步體外重組DNA步驟的方法產生。
25.權利要求23或24的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體的產生通過并非天然與MBL多肽表達相關的表達控制序列來控制。
26.權利要求21-25中任一項的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體從所述宿主生物中分離。
27.權利要求26的應用，其中所述MBL亞單位或MBL寡聚體通過包含至少一步涉及親和層析的步驟的方法來分離。
28.權利要求27的應用，其中所述親和層析步驟能從還含有其它MBL寡聚體和/或MBL亞單位的組合物中分離出MBL四聚體，五聚體和/或六聚體。
29.權利要求23-28中任一項的應用，其中所述MBL亞單位和/或MBL寡聚體不含任何當產生于天然宿主生物中時與所述MBL天然相關的雜質。
30.權利要求1的應用，其中所述MBL亞單位為哺乳動物MBL亞單位。
31.權利要求30的應用，其中所述哺乳動物MBL亞單位是人的MBL亞單位。
32.權利要求1的應用，其中所述藥物在另一導致所述個體免疫受損狀態(tài)的治療之前給與該個體。
33.權利要求1的應用，其中所述藥物與一種醫(yī)療處理同時、順次、或分開給與所述個體，其中所述醫(yī)療處理導致該個體中的免疫受損狀態(tài)。
34.權利要求32的應用，其中所述藥物在所述醫(yī)療處理之前，期間，和之后給與該個體。
35.在先權利要求中任一項的應用，其中所述治療是一種預防性治療。
36.權利要求32的應用，其中所述醫(yī)療處理是化療。
37.權利要求32的應用，其中所述醫(yī)療處理是放療。
38.權利要求1-37中任一項的應用，其中所述藥物是使血清MBL水平超過預定之最低血清MBL水平的個體中的血清MBL水平升高的一種激發(fā)劑。
39.權利要求38的應用，其中所述個體的血清MBL水平低于預定的最大血清MBL水平。
40.權利要求1或38的應用，其中所述個體的血清MBL水平超過75ng/ml。
41.權利要求1或38的應用，其中所述個體的血清MBL水平超過100ng/ml。
42.權利要求1或38的應用，其中所述個體的血清MBL水平超過150ng/ml。
43.權利要求1或39的應用，其中所述個體的血清MBL水平低于500ng/ml。
44.權利要求1或39的應用，其中所述個體的血清MBL水平低于400ng/ml。
45.權利要求1或39的應用，其中所述個體的血清MBL水平低于300ng/ml。
46.在先權利要求中任一項的應用，其中所述個體中的血清或血漿MBL水平通過定量分析確定。
47.權利要求46的應用，其中所述分析包括ELISA，TRIFMA，RIA或比濁法中的至少一種。
48.應用MBL組合物防止和/或減少個體中的感染的方法，該方法包括以下步驟a)測定個體的血清MBL水平，b)評估該個體中出現顯著臨床感染的可能性，并任選c)給與該個體一種MBL組合物。
全文摘要
本發(fā)明涉及含有至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位,或至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)寡聚體(其包含至少一種甘露聚糖結合型凝集素(MBL)亞單位)的組合物在制備用于預防和/或治療感染的藥物中的應用。尤其本發(fā)明涉及對免疫受損個體;和/或對由于醫(yī)療處理所致的免疫受損易感個體中的感染進行預防和/治療。本發(fā)明尤其適于預防和/或治療中性粒細胞減少癥患者和/或接受或將要接受化療或類似治療的患者的感染。所述個體可在不考慮他們的血清MBL水平的前提下進行治療,但已顯示,尤其在血清MBL水平為50ng/ml－500ng/ml的患者體內進行的預防和/或治療較有利。
文檔編號A61K9/06GK1359298SQ00809714
公開日2002年7月17日 申請日期2000年5月10日 優(yōu)先權日1999年5月14日
發(fā)明者斯蒂芬·蒂爾, 詹斯·C·詹斯尼厄斯 申請人:斯蒂芬·蒂爾, 詹斯·C·詹斯尼厄斯