專利名稱：一種禾本科植物過敏原的dna序列和重組生產(chǎn)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及鑒別和確定一種草類花粉過敏原的特點，以及編碼該過敏原的重組DNA分子。梯牧草(Phleum pratense)的花粉被用作天然的原材料。本發(fā)明也包括片段、部分序列和突變體。該重組DNA分子和衍生的多肽、片段和變體可用于治療花粉變態(tài)反應(yīng)疾病。而且，通過重組方法產(chǎn)生的蛋白和片段可用于診斷花粉過敏原。
1型變態(tài)反應(yīng)具有世界范圍的重要性。在工業(yè)化國家，高達20％的人群遭受諸如過敏性鼻炎，結(jié)膜炎或支氣管哮喘的困擾。這些變態(tài)反應(yīng)通過空氣中存在的過敏原(空氣過敏原)引起，這些過敏原由例如植物花粉、螨、貓或狗等各種來源釋放。在草類花粉的病例中，高達40％的1型變態(tài)反應(yīng)表現(xiàn)為特異性IgE反應(yīng)性(Friedhoff et al.，1986，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志78，1190-201)。
激發(fā)1型變態(tài)反應(yīng)的物質(zhì)是蛋白、糖蛋白或多肽。經(jīng)粘膜吸收后，這些過敏原與致敏人群的結(jié)合在肥大細胞表面的IgE分子反應(yīng)。如果2個IgE分子經(jīng)過1個過敏原彼此連接，就導致效應(yīng)細胞的介導分子(例如組胺、前列腺素)和細胞因子的釋放，然后引起相應(yīng)的臨床癥狀。
根據(jù)具有抗一些過敏原的IgE抗體的變態(tài)反應(yīng)患者的相對發(fā)生率，可以看出主要過敏原和次要過敏原的差別。在梯牧草的病例中，迄今為止，Phl p1(Petersen et al.，1993，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志92，789-796)，Phl p5(Matthiesen and Lwenstein，1991，臨床實驗變態(tài)反應(yīng)21，297-307；Petersen et al.，1992)，Phl p6(Petersenet al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108，49-54)和Phl p2/3(Dolecek et al.，1993，F(xiàn)EBS 335(3)，299-304)被描述為主要過敏原，而Phl p4(Lwenstein et al.，1978，變態(tài)反應(yīng)進展25，1-62)以及來自黑麥草(Lolium perenne)的10和11組(Ansari et al.，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志，80，229-235)為次要過敏原。
關(guān)于本發(fā)明，Phl p4過敏原尤為重要，這是因為它具有與新抗原相似的分子量，大約55 kDa(Fischer et al.，1996，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志98(1)，189-98)，因而最可與按照本發(fā)明產(chǎn)生的抗原相比較，但在免疫學和生物化學方面明顯不同。與上述提到的其他過敏原相反，唯獨Phl p4的基因或轉(zhuǎn)錄(cDNA)序列至今未被鑒定。對Phlp1(Laffer et al.，1994，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志94，1190-98；Petersen et al.，1995，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志95(5)，987-994)，Phl p5(Vrtala et al.，1993，免疫學雜志151(9)，4773-4781)，Phl p6(Petersen et al.，1995，Int.Arch.Allergy Immunol.108(1)，55-59)和Phl p2(Dolecek et al.，1993，F(xiàn)EBS 335(3)，299-304)來說，其序列資料已經(jīng)得到。求助于cDNA序列，有可能產(chǎn)生用于診斷和治療的重組過敏原(Scheiner and Kraft，1995，變態(tài)反應(yīng)50，384-391)。
對變態(tài)反應(yīng)有效治療的經(jīng)典方法是特異免疫治療和脫敏治療(Fiebig，1995，變態(tài)反應(yīng)雜志4(6)，336-339，Bousquet et al.，1998，臨床變態(tài)反應(yīng)免疫學雜志102(4)，558-562)。在這些方法中，把天然過敏原提取物以逐步增加劑量的方式給病人皮下注射。不過，該方法必須承受變態(tài)反應(yīng)甚至過敏性休克的風險。為了把這些風險降低到最小程度，現(xiàn)在采用以類變應(yīng)原形式的新穎制備物。與未處理過的提取物相比，這些化學修飾的過敏原提取物，明顯地降低IgE反應(yīng)性，而具有一致的T細胞反應(yīng)性(Fiebig，1995，變態(tài)反應(yīng)雜志4(7)，377-382)。
通過重組方法產(chǎn)生的過敏原，有可能更大程度地優(yōu)化治療方法。通過重組方法產(chǎn)生高純度的過敏原的特定合劑，如果需要與各個病人相匹配，可以代替來源于天然過敏原的提取物，因為除了各種過敏原外，后者還含有相對大量的免疫原性但不伴有過敏原性的蛋白。用表達產(chǎn)物獲得安全脫敏療法的真實前景，可通過特異突變重組過敏原實現(xiàn)，在這些過敏原中，IgE表位被特異缺失，而不損壞治療所須的T細胞表位(Schramm et al.，1999，免疫學雜志162，2406-2414)。
通過治療方法影響過敏患者中擾亂的Th細胞平衡的另一個可能是，用編碼相關(guān)過敏原的可表達DNA治療。給嚙齒類注射編碼過敏原的DNA，已經(jīng)得到了對過敏原特異的免疫應(yīng)答的初步實驗證據(jù)(Hsu etal.，1996，自然醫(yī)學2(5)，540-544)。
本發(fā)明優(yōu)先地用于體內(nèi)和體外診斷變態(tài)反應(yīng)疾病，特別是花粉病。為實現(xiàn)本目的，克隆的核酸被連接到一種表達載體中，然后該構(gòu)建體在一種合適的細胞類型中表達。經(jīng)過生化純化后，制備了該重組過敏原，用于已經(jīng)建立的方法檢測IgE抗體。另一方面，本發(fā)明也用作特異免疫治療中，含重組過敏原或含核酸的制備物的基本組分。在此方面的應(yīng)用中，存在多種可能性。首先，擁有未修飾一級結(jié)構(gòu)的蛋白可以是該制備物的一種成分。其次，通過特異缺失整個分子的IgE表位或者產(chǎn)生編碼T細胞表位的各個片段，可按照本發(fā)明把低變應(yīng)原性(類變應(yīng)原)形式用于治療，以避免非所需的副作用。最后，通過核酸本身，如果它與真核表達載體連接，可以產(chǎn)生一種制備物，當直接使用時，從治療意義上說該制備物能修飾過敏原性免疫狀態(tài)。
本發(fā)明描述一種重組的DNA分子，該DNA分子由(

圖1)的核酸序列組成，編碼一種過敏原。禾本科的花粉粒，例如特別是梯牧草、黑麥草、鴨茅(Dactylis glomerata)、草地早熟禾(Poa pratensis)、狗牙草(Cynodon dactylon)、絨毛草(Holcus lanatus)的花粉粒用作天然的原材料。
分離和純化所述的天然過敏原后，進行N末端的蛋白測序。依據(jù)從蛋白推導的核酸序列，產(chǎn)生引物。用該引物，通過PCR、克隆并確定特性，從花粉的cDNA庫中獲得相應(yīng)的cDNA。根據(jù)本發(fā)明，從編碼過敏原的該DNA分子中產(chǎn)生片段和部分序列。
通過合適的表達載體，在細胞體系中表達該重組DNA分子或其片段和部分序列后，純化該過敏原或其低變應(yīng)原性的變體或片段。
用二步方法，從梯牧草花粉中純化天然過敏原。將花粉經(jīng)水相提取后，通過疏水相互作用層析法，把得到的提取物分為2個級分，過層析柱的級分和洗脫液。過層析柱的級分含有3個過敏原，Phl p1(30-35kDa)，Phl p2/3(11-14 kDa)和一種未知的過敏原(55-60 kDa)。這些蛋白可從另一種用Superdex 75的凝膠過濾法中分離出來。
至此，該未知過敏原(工作名為p55)通過SDS-PAGE法分離出來，接著印跡到PVDF膜上，分離得到精制的級分。經(jīng)Edman降解法測定該p55分子的N末端的氨基酸序列。
為了產(chǎn)生和克隆p55相對應(yīng)的cDNA，按照本發(fā)明構(gòu)建了一條基于該N末端序列(圖3)的特異DNA引物(21mer)。第2條所用的引物是一種錨定序列，該序列定位在用于反轉(zhuǎn)錄寡-dT引物中。用來自梯牧草花粉的代表性mRNA群體產(chǎn)生的cDNA和按照本發(fā)明的引物以及所述的錨定引物，在嚴格條件下進行PCR反應(yīng)。在PCR反應(yīng)物的分析性凝膠電泳中，鑒別出了一條大小為1.65kb的擴增DNA。把該擴增的DNA連接到pCR2.1載體中，并成功地轉(zhuǎn)化。對2個不同克隆插入片段的測序得到一致的序列。
在這種初始擴增的DNA中，鑒別出了1個1492bp的可讀框(ORF)(見圖1)。
為了從所述的核酸中產(chǎn)生相應(yīng)的重組蛋白(圖4)，首先用限制性內(nèi)切酶把pCR2.1載體重新克隆到表達載體pProEx Htb中。該表達產(chǎn)物表達并經(jīng)生化純化后，對該產(chǎn)生的具有過敏原性質(zhì)的蛋白進行了多種分析。在所有的分析中，例如蛋白印跡法和點印跡法，重組蛋白與來自被診斷為草類花粉變態(tài)反應(yīng)臨床癥狀的病人的IgE特異地反應(yīng)。所用的對照蛋白是天然的p55。因此，該重組蛋白顯然是一種過敏原。這樣，本表達產(chǎn)物被用于對草類花粉變態(tài)反應(yīng)患者的高度特異改進的診斷方法中。
為了產(chǎn)生低變應(yīng)原性變體以改進治療用途，按照本發(fā)明從克隆到表達載體中的核酸開發(fā)了確定片段和部分序列的組合。此外，導入了特異定點突變，優(yōu)選地在編碼半胱氨酸的三聯(lián)體中導入。因此，本發(fā)明的這部分內(nèi)容與開發(fā)用于診斷目的的本發(fā)明內(nèi)容不同點，在于降低或缺乏IgE反應(yīng)性。這樣，由于減低(lacuna)而明顯低或沒有副作用的制備物，可用于脫敏治療。如果編碼低變應(yīng)原性蛋白變體的核酸或編碼p55的未修飾核酸與一種人表達載體相連接，這些構(gòu)建體同樣能用作特異免疫治療的制備物。
因此，本發(fā)明的內(nèi)容是a)一種重組DNA分子，該DNA分子含有一種編碼作為過敏原的多肽的核苷酸序列，優(yōu)選地由禾本科(Gramineae)(禾本科(Poaceae))和單子葉植物表達；b)一種所示的具有來源于梯牧草核苷酸序列的DNA分子；c)一種如圖1所示的DNA分子的核苷酸序列；d)一種含有如下核苷酸序列的DNA分子，所述的核苷酸序列能與上面提到的圖1中描述的核苷酸序列雜交；e)按照c)或d)項所述的核苷酸序列的部分序列和部分序列的組合；f)一種含有如a)-d)所述的核苷酸序列的DNA分子，該DNA分子可通過單個密碼子的特異突變和消除或添加而修飾；g)一種按照c)所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段；h)一種按照d)所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段；i)一種按照e)所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段；j)一種按照f)所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段；k)一種重組DNA表達載體或克隆體系，該載體或體系包括在a)-d)中描述重組DNA分子，它與一種表達控制序列有功能地相連接；1)一種由按照c)所述的核酸編碼的多肽；m)一種由按照d)所述的核酸編碼的多肽；n)一種由按照e)所述的核酸編碼的多肽；o)一種由按照f)所述的核酸編碼的多肽；p)一種由按照g)所述的核酸編碼的多肽；q)一種由按照h)所述的核酸編碼的多肽；r)一種由按照i)所述的核酸編碼的多肽；s)一種由按照j)所述的核酸編碼的多肽；t)一種生產(chǎn)多肽、片段或其衍生物的方法，該方法培養(yǎng)已被權(quán)利要求11的表達載體轉(zhuǎn)化的單核或真核細胞，然后從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的蛋白或多肽；u)一種應(yīng)用按照1)-n)所述的多肽，體內(nèi)或體外診斷花粉變態(tài)反應(yīng)的方法；v)一種藥學制備物，該制備物包括按照1)-n)所述的多肽、片段或衍生物，用于治療患花粉變態(tài)反應(yīng)的人類或動物；w)一種使用v)中描述的藥學制備物，治療患花粉變態(tài)反應(yīng)的人類或動物的方法；x)一種通過使用k)中描述的構(gòu)建體DNA免疫接種，治療花粉變態(tài)反應(yīng)的方法；y)一種通過使用k)中描述的含有免疫刺激DNA片段的構(gòu)建體DNA免疫接種，治療花粉變態(tài)反應(yīng)的方法。因此，本發(fā)明作為病人特異的分辨過敏原組分敏感譜的鑒別部分，用于改進體外診斷方法。同樣地，本發(fā)明也用于生產(chǎn)免疫治療草類花粉過敏原患者而明顯改進的的制備物。
序列表<110>Merck Patent GmbH<120>DNA-Sequenz und rekombinante Herstellung einesGraminaen-Allergens<130>DNA-Sequenz<140><l41><160>4<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1187<212>DNA<213>禾本科<214><400>1gggaagaagg aggagaagaa ggaggagaag aaggagagtg gagatgctgc gtccggggcc 60gacggaacct acgacatcac caagctcggc gccaaacccg acggcaagac ggactgcacc 120aaggaggtgg aggaggcatg ggcttcggct tgcggtggta ccgggaagaa tacgatcgtc 180atccccaagg gtgatttcct gaccgggcct ctgaatttca ccgggccatg caagggcgac 240agcgtcacca tcaagctgga cggcaacctg ctgagctcca acgacctggc caagtacaag 300gctaactgga tcgagatcat gcggatcaag aaactcacta tcaccggcaa aggcacgctc 360gacggccaag gcaaggccgt gtggggcaag aacagctgcg ccaagaacta caactgcaag 420atcttgccaa acacattggt gctggacttc tgtgacgacg ctctcatcga aggcatcacc 480ctcctaaacg ccaagttctt ccatatgaac atctacgagt gcaagggcgt gaccgtcaag 540gacgtgacca tcaccgcgcc cggggacagc cccaacaccg acggcatcca catcggcgac 600tcgtccaagg tcaccatcac cgacaccacc atcggcaccg gcgacgactg catctccatc 660ggccccggaa gcaccggcct caacatcacc ggcgtgacct gcggtccagg ccacggcatc 720agcgttggca gcctgggacg gtacaaggac gagaaggacg tgaccgacat caccgtaaag 780aactgcgtgc tcaagaagtc caccaacggc ctccggatca agtcgtacga ggacgccaag 840tcgccgctga cggcgtcgaa gctgacctac gagaacgtga agatggagga cgtgggctac 900cccatcatca tcgaccagaa gtactgcccc aacaagatct gcacctccaa gggagactcc 960gccagggtca ccgtcaagga cgtcaccttc cgcaacatca ccggcacctc ctccaccccc 1020gaggccgtca gcctgctctg ctccgacaag cagccctgca atggtgtcac catgaacgac 1080gtcaagatcg agtacagcgg caccaacaac aagaccatgg ctgtctgcac caacgccaag 1140gtcaccgcca agggtgtcag cgaggctaac acctgcgccg cctgatg 1187<210>2<211>20<212>PRT<2l3>Künstliche Sequenz<214>人工序列<220><223>人工序列描述p55特異性引物<400>2Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Asp Glu Lys Lys Glu Ser Gly Asp Ala1 5 10 15Ala Ser Xaa Ala20<210>3<211>26<212>DNA<213>Künstliche Sequenz<214>人工序列<220><223>人工序列描述p55特異性引物<220><221>變體<222>(3)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(6)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(9)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(12)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(15)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(18)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(21)<223>n＝次黃嘌呤核苷<220><221>變體<222>(24)<223>n＝次黃嘌呤核苷<400>3ggnaanaang anganaanaa nganga 26<210>4<211>394<212>PRT<213>禾本科<400>4Gly Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Glu Lys Lys Glu Set Gly Asp Ala1 5 10 15Ala Ser Gly Ala Asp Gly Thr Tyr Asp Ile Thr Lys Leu Gly Ala Lys20 25 30Pro Asp Gly Lys Thr Asp Cys Thr Lys Glu Val Glu Glu Ala Trp Ala35 40 45Ser Ala Cys Gly Gly Thr Gly Lys Asn Thr Ile Val Ile Pro Lys Gly50 55 60Asp Phe Leu Thr Gly Pro Leu Asn Phe Thr Gly Pro Cys Lys Gly Asp65 70 75 80Ser Val Thr Ile Lys Leu Asp Gly Asn Leu Leu Ser Ser Asn Asp Leu85 90 95Ala Lys Tyr Lys Ala Asn Trp Ile Glu Ile Met Arg Ile Lys Lys Leu100 105 110Thr Ile Thr Gly Lys Gly Thr Leu Asp Gly Gln Gly Lys Ala Val Trp115 120 125Gly Lys Asn Ser Cys Ala Lys Asn Tyr Asn Cys Lys Ile Leu Pro Asn130 135 140Thr Leu Val Leu Asp Phe Cys Asp Asp Ala Leu Ile Glu Gly Ile Thr145 150 155 160Leu Leu Asn Ala Lys Phe Phe His Met Asn Ile Tyr Glu Cys Lys Gly165 170 175Val Thr Val Lys Asp Val Thr Ile Thr Ala Pro Gly Asp Ser Pro Asn180 185 190Thr Asp Gly Ile His Ile Gly Asp Ser Ser Lys Val Thr Ile Thr Asp195 200 205Thr Thr Ile Gly Thr Gly Asp Asp Cys Ile Ser Ile Gly Pro Gly Ser210 215 220Thr Gly Leu Asn Ile Thr Gly Gly Ala Cys Gly Pro Gly His Gly Ile225 230 235 240Ser Val Gly Ser Leu Gly Arg Tyr Lys Asp Glu Lys Asp Val Thr Asp245 250 255Ile Thr Val Lys Asn Cys Val Leu Lys Lys Ser Thr Asn Gly Leu Arg260 265 270Ile Lys Ser Tyr Glu Asp Ala Lys Ser Pro Leu Thr Ala Ser Lys Leu275 280 285Thr Tyr Glu Asn Val Lys Met Glu Asp Val Gly Tyr Pro Ile Ile Ile290 295 300Asp Gln Lys Tyr Cys Pro Asn Lys Ile Cys Thr Ser Lys Gly Asp Ser305 310 315 320Ala Arg Val Thr Val Lys Asp Val Thr Phe Arg Asn Ile Thr Gly Thr325 330 335Ser Ser Thr Pro Glu Ala Val Ser Leu Leu Cys Ser Asp Lys Gln Pro340 345 350Cys Asn Gly Val Thr Met Asn Asp Val Lys Ile Glu Tyr Ser Gly Thr355 360 365Asn Asn Lys Thr Met Ala Val Cys Thr Asn Ala Lys Val Thr Ala Lys370 375 380Gly Val Ser Glu Ala Asn Thr Cys Ala Ala385 390
權(quán)利要求
1.一種重組DNA分子，該DNA分子含有一種編碼用作過敏原的多肽的核苷酸序列，優(yōu)選地由禾本科(禾本科)和單子葉植物表達。
2.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的DNA分子，該DNA分子具有來源于梯牧草的核苷酸序列。
3.一種根據(jù)權(quán)利要求2如圖1所示的核苷酸序列。
4.一種含有如下核苷酸序列的DNA分子，所述的核苷酸序列能與權(quán)利要求3中描述的核苷酸序列雜交。
5.出現(xiàn)在權(quán)利要求3或權(quán)利要求4中所述的核苷酸序列的部分序列和部分序列的組合。
6.一種含有權(quán)利要求1-4所述的核苷酸序列的DNA分子，該DNA分子可通過單個密碼子的特異突變和消除或添加而修飾。
7.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段。
8.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段。
9.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段。
10.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的核苷酸序列，該核苷酸序列編碼一種免疫調(diào)節(jié)T細胞反應(yīng)片段。
11.一種重組DNA表達載體或克隆體系，該載體或體系由在權(quán)利要求1-4中描述的重組DNA分子組成，它與一種表達控制序列有功能地相連接。
12.一種根據(jù)權(quán)利要求3所述的核酸編碼的多肽。
13.一種根據(jù)權(quán)利要求4所述的核酸編碼的多肽。
14.一種根據(jù)權(quán)利要求5所述的核酸編碼的多肽。
15.一種根據(jù)權(quán)利要求6所述的核酸編碼的多肽。
16.一種根據(jù)權(quán)利要求7所述的核酸編碼的多肽。
17.一種根據(jù)權(quán)利要求8所述的核酸編碼的多肽。
18.一種根據(jù)權(quán)利要求9所述的核酸編碼的多肽。
19.一種根據(jù)權(quán)利要求10所述的核酸編碼的多肽。
20.一種生產(chǎn)多肽、片段或其衍生物的方法，該方法培養(yǎng)已被權(quán)利要求11的表達載體轉(zhuǎn)化的原核或真核細胞，然后從培養(yǎng)物中分離相應(yīng)的蛋白或多肽。
21.一種使用根據(jù)權(quán)利要求12-14所述的多肽，體內(nèi)或體外診斷花粉變態(tài)反應(yīng)的方法。
22.一種藥學制備物，該制備物包括根據(jù)權(quán)利要求12-19所述的多肽、片段或衍生物，用于治療患花粉變態(tài)反應(yīng)的人類或動物。
23.一種使用根據(jù)權(quán)利要求22中描述的藥學制備物，治療患花粉變態(tài)反應(yīng)的人類或動物的方法。
24.一種通過使用根據(jù)權(quán)利要求11中描述的構(gòu)建體DNA免疫接種治療花粉變態(tài)反應(yīng)的方法。
25.一種通過使用根據(jù)權(quán)利要求11中描述的含有免疫刺激DNA片段的構(gòu)建體DNA免疫接種治療花粉變態(tài)反應(yīng)的方法。
全文摘要
本發(fā)明描述鑒別和確定一種草類過敏原的特點,以及描述編碼該過敏原的重組DNA分子和相應(yīng)的DNA和肽序列。
文檔編號A61K48/00GK1351664SQ00806656
公開日2002年5月29日 申請日期2000年4月12日 優(yōu)先權(quán)日1999年4月23日
發(fā)明者阿恩德·彼得森, R·蘇克, H·菲比格, O·克羅姆維爾 申請人:默克專利股份公司, 阿恩德·彼得森