專利名稱：新的無白蛋白的因子Ⅷ制劑的制作方法
本
背景技術(shù)：
因子VIII是在血漿中發(fā)現(xiàn)的導(dǎo)致凝血地級聯(lián)反應(yīng)中的輔助因子。血液中因子VIII活性量的缺乏可導(dǎo)致稱為甲型血友病的凝血障礙，一種主要影響男性的遺傳病。目前甲型血友病以因子VIII的療效性制劑治療，所述因子VIII制劑來源于人血漿或采用重組DNA技術(shù)制備。這些制劑或者針對急性出血(需要治療)給藥或者經(jīng)常性間隔給藥以防止失控性出血(預(yù)防)。
已知因子VIII在療效性制劑中相對不穩(wěn)定。在血漿中，因子VIII通常與另一種血漿蛋白，維勒布蘭得(von Willebrand)因子(vWF)形成復(fù)合體，后者以大于因子VIII的摩爾量存在于血漿并且被認為可防止因子VIII的早熟降解。另一種循環(huán)血漿蛋白，白蛋白，可能也在體內(nèi)起到穩(wěn)定因子VIII的作用。因此目前市售的因子VIII組合物主要依靠采用白蛋白和/或vWF使因子VIII在制備過程和貯藏過程中保持穩(wěn)定。
目前應(yīng)用于市售的因子VIII組合物中的白蛋白和/或vWF來源于人血漿，然而，這些物質(zhì)的采用存在某些缺點。由于通常加入比因子VIII大的摩爾量的白蛋白以增加因子VIII在這些制劑中的穩(wěn)定性，因而這些制劑中因子VIII蛋白難以體現(xiàn)其自身特性。對重組制備的因子VIII組合物來說加入來源于人的白蛋白到因子VIII中也發(fā)現(xiàn)是有缺陷的。這是因為沒有這些另加的白蛋白時，重組來源的因子VIII組合物不會含有來源于人的蛋白，因此理論上的傳播病毒的危險應(yīng)當會減少。
配制不含白蛋白或vWF(或使用相對低水平的這些賦形劑)的因子VIII的幾種嘗試已有描述。例如，F(xiàn)reudenberg的美國專利No.5565427(EP 508194)(轉(zhuǎn)讓至Behringwerke)中描述的因子VIII組合物中，除賦形劑如氯化鈉和蔗糖外，還含有去污劑和氨基酸的特殊組合，特別是精氨酸和甘氨酸。所描述的去污劑，聚山梨醇酯20或聚山梨醇酯80，以0.001至0.5％(v/v)間的量存在，而精氨酸和甘氨酸的存在量在0.01至1mol/L之間。所描述的蔗糖存在量在0.1至10％之間。該專利的實施例2提出了溶液中穩(wěn)定性不超過16小時的溶液(1)0.75％蔗糖、0.4M甘氨酸、和0.15M NaCl，和(2)0.01M檸檬酸鈉、0.08M甘氨酸、0.016M賴氨酸、0.0025M氯化鈣、和0.4M氯化鈉，而溶液(3)1％蔗糖、0.14M精氨酸、0.1M氯化鈉以及(4)1％蔗糖、0.4M甘氨酸、0.14M精氨酸、0.1M氯化鈉、和0.05％吐溫80則呈現(xiàn)出穩(wěn)定性。
Nayer的美國專利No.5763401(歐洲專利818204)(轉(zhuǎn)讓至Bayer)也描述了不含白蛋白的治療用因子VIII制劑，其包括15-60mM蔗糖、最多50mM的NaCl、最多5mM的氯化鈣、65-400mM甘氨酸、以及最多50mM的組氨酸。下列特定制劑經(jīng)檢測是穩(wěn)定的(1)150mMNaCl、2.5mM氯化鈣、和165mM甘露醇；和(2)1％蔗糖、30mM氯化鈉、2.5mM氯化鈣、20mM組氨酸、和290mM甘氨酸。發(fā)現(xiàn)一種糖含量較高的制劑(10％麥芽糖、50mM NaCl、2.5mM氯化鈣、和5mM組氨酸)在冷凍干燥狀態(tài)下與制劑(2)相比呈現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。
Osterberg的美國專利No.5733873(歐洲專利627924)(轉(zhuǎn)讓至Pharmacia & Upjohn)公開的制劑中含有0.01-1mg/ml的表面活性劑。該專利公開的制劑中含有下列范圍內(nèi)的賦形劑至少0.01mg/ml量的聚山梨醇酯20或80，優(yōu)選0.02-1.0mg/ml；至少0.1M NaCl；至少0.5mM鈣鹽；和至少1mM組氨酸。更特殊地，下列特別實施例被公開(1)14.7-50-65mM組氨酸、0.31-0.6M NaCl、4mM氯化鈣、0.001-0.02-0.025％聚山梨醇酯80、有或無0.1％ PEG 4000或19.9mM蔗糖；以及(2)20mg/ml甘露醇、2.67mg/ml組氨酸、18mg/ml NaCl、3.7mM氯化鈣、和0.23mg/ml聚山梨醇酯80。
其它采用低或高濃度氯化鈉的嘗試也被描述。Lee的美國專利No.4877608(歐洲專利315968)(轉(zhuǎn)讓至Rhone-Poulenc Rorer)指出含相對低濃度氯化鈉的制劑，即制劑含有0.5mM-15mM NaCl、5mM氯化鈣、0.2mM-5mM組氨酸、0.01-10mM賴氨酸鹽酸鹽和最多10％的糖。該“糖”可以是最多10％的麥芽糖、10％蔗糖、或5％甘露醇。
Lee的美國專利5605884(歐洲專利0314095)(轉(zhuǎn)讓至Rhone-Poulenc Rorer)指出含有相對高濃度氯化鈉的制劑。這些制劑包括0.35M-1.2M NaCl、1.5-40mM氯化鈣、1mM-50mM組氨酸、和最多10％的“糖”如甘露醇、蔗糖或麥芽糖。作為實例的一種制劑中含有0.45M NaCl、2.3mM氯化鈣、和1.4mM組氨酸。
Roser的國際專利申請書WO 96/22107(轉(zhuǎn)讓至Quadrant HoldingsCambridge Limited)描述了含有海藻糖的制劑。這些制劑包括(1)0.1MNaCl、15mM氯化鈣、15nM組氨酸、和1.27M(48％)海藻糖；或(2)0.011％氯化鈣、0.12％組氨酸、0.002％ Tris、0.002％吐溫80、0.004％PEG 3350、7.5％海藻糖、和0.13％或1.03％ NaCl。
已有技術(shù)中的其它治療用因子VIII組合物一般包含為使因子VIII穩(wěn)定的白蛋白和/或vWF，因而與本發(fā)明無關(guān)。例如，Schwinn的美國專利No.5328694(EP 511234)(轉(zhuǎn)讓至Octapharma AG)描述的制劑中包括100-650mM二糖和100mM-1.0M氨基酸。特別是，公開了下列制劑(1)0.9M蔗糖、0.25M甘氨酸、0.25M賴氨酸、和3mM氯化鈣；以及(2)0.7M蔗糖、0.5M甘氨酸、和5mM氯化鈣。
盡管已經(jīng)進行了幾項配制不含白蛋白或vWF的因子VIII的嘗試，但對在不含白蛋白或其它蛋白下穩(wěn)定的治療用因子VIII制劑的需求仍然存在。
本發(fā)明概述
本發(fā)明涉及在不含白蛋白條件下的穩(wěn)定的治療用因子VIII組合物。特別地，本發(fā)明包括因子VIII組合物，除因子VIII外，還包含4％至10％的選自甘露醇、甘氨酸和丙氨酸的填充劑；1％至4％的選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM鈣鹽；100mM至300mM NaCl；以及使pH保持在約6和8之間的緩沖劑。該組合物還可含表面活性劑如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、普盧蘭尼克(Pluronic)F68、或玻雷吉(Brij)35。當表面活性劑為聚山梨醇酯80時，其存在量應(yīng)低于0.1％。
根據(jù)本發(fā)明的因子VIII組合物的緩沖劑優(yōu)選以10mM至50mM的濃度存在，并優(yōu)選選自組氨酸、Tris、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES和ACES。緩沖劑最好是組氨酸或Tris。本發(fā)明的因子VIII組合物還可以包含抗氧化劑。
本發(fā)明的因子VIII組合物同時包括填充劑和穩(wěn)定劑。填充劑的存在量可以從約6％至約8％，優(yōu)選約8％。穩(wěn)定劑的存在量優(yōu)選約2％。氯化鈉也存在于這些組合物中，優(yōu)選量是從150至350mM，并且更優(yōu)選的量為約225mM。該組合物的鈣鹽也優(yōu)選氯化鈣，并且該組合物自身優(yōu)選為凍干形式。
在另一種實施方案中，本發(fā)明可包括不含白蛋白的配制的因子VIII組合物，其除因子VIII外還包含下列賦形劑2％至6％羥乙基淀粉；1％至4％的選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM鈣鹽；100mM至300mM NaCl；以及使pH保持在約6至8之間的緩沖劑。該組合物優(yōu)選含有約4％羥乙基淀粉，且NaCl的存在量為200mM。還優(yōu)選穩(wěn)定劑的存在量為約2％。
在又一種實施方案中，本發(fā)明包括不含白蛋白的配制的因子VIII組合物，其包含300mM至500mM NaCl；1％至4％的選自蔗糖、海藻糖、棉子糖、精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM鈣鹽；和保持pH約6至8之間的緩沖劑。NaCl優(yōu)選以約400mM的量存在。
另一種實施方案中，本發(fā)明包括采用冷凍干燥機在容器中將含水因子VIII組合物冷凍干燥的方法，其中該方法包括初次冷凍步驟，且該初次冷凍步驟進一步包括下列步驟(a)使凍干機凍干室溫度降低至至少-45℃；(b)使凍干室的溫度上升至約-15℃至-25℃；隨后(c)使凍干室溫度降低至至少-45℃。在該方法中，凍干室溫度上升或下降的速率優(yōu)選在每分鐘約0.5℃至約1.0℃之間。在步驟(a)中，其溫度優(yōu)選保持約1小時，再降低到約-55℃。在步驟(b)中，溫度優(yōu)選在-15℃至-25℃之間，且更優(yōu)選在-22℃保持約1至3小時，并且步驟(c)中的溫度優(yōu)選保持約1小時。在該方法中采用的因子VIII組合物優(yōu)選含有4％至10％的選自甘露醇、甘氨酸和丙氨酸的試劑，還優(yōu)選含有1％至4％的選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的試劑。此外，在該方法中使用的因子VIII組合物還優(yōu)選含有約100mM至300mMNaCl。
本發(fā)明詳述
定義
除非另有說明外，用于本文時，下列術(shù)語及其變化形式應(yīng)作如下定義
因子VIII-天然存在的以及在治療用制劑中作為非均質(zhì)分布的多肽(來源于單一基因產(chǎn)品)的因子VIII分子(參見，例如，Andersson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83，2979-2983，1986年5月)。術(shù)語“因子VIII”用于本文時指所有這些多肽，不論是來源于血漿或是采用重組DNA技術(shù)制備。商業(yè)上可以獲得的含因子VIII的治療用制劑實例包括以商品名HEMOFIL M和RECOMBINATE銷售的那些制劑(可以從美國伊利諾斯州Deerfield的Baxter Healthcare Corporation獲得)。目前在開發(fā)中的其它制劑主要含單一亞型的因子VIII分子，其分子缺少B結(jié)構(gòu)域蛋白。
國際單位，IU-國際單位，或IU，是一種以標準測定法測定因子VIII血液凝集活性的度量單位，例如下列方法之一
一步測定法。一步測定法在本領(lǐng)域內(nèi)是已知的，例如Lee，MartinL等，在An Effect of Predilution on Potency Assays of Factor VIIIConcentrates(預(yù)先稀釋對因子濃度效力分析的影響)，ThrombosisResearch(血栓形成研究)(Pergamon Press Ltd.)30，511-519(1983)中描述的方法。
顯色測定法。顯色測定試劑盒可以從商業(yè)上購得，例如CoatestFactor VIII，可以從瑞典Molndal的Chromogenix AB獲得。
退火-術(shù)語退火用于表示進行藥用制劑冷凍干燥的凍干過程中的一個步驟，在制劑的冷凍-干燥之前，其制劑溫度由較低溫度上升至較高溫度然后在一段時間后再次冷卻。
填充劑-在本申請的目的中，填充劑是這樣的化學(xué)物，它使藥用制劑凍干后形成“餅狀物”或殘余固態(tài)團塊的結(jié)構(gòu)并且防止它塌陷。可結(jié)晶的填充劑應(yīng)當指所述填充劑可以在凍干過程中結(jié)晶，氯化鈉除外。HES不包括在這組可結(jié)晶填充劑之內(nèi)。
冷凍-干燥、冷凍、凍干- “冷凍-干燥”，除非通過其出現(xiàn)的上下文而另有說明外，應(yīng)當用于表示凍干過程中的藥用制劑的溫度被升高以除去制劑中的水分的這一部分。凍干過程中的“冷凍”步驟是發(fā)生在冷凍干燥之前的那些步驟。除另有說明外，“凍干”應(yīng)指凍干全過程，包括冷凍步驟和冷凍-干燥步驟。
除另有說明外，術(shù)語百分比表示重量/體積百分比并且溫度是攝氏溫度。
制劑組分
本發(fā)明的因子VIII組合物包括填充劑、穩(wěn)定劑、緩沖劑、氯化鈉、鈣鹽、以及，最好含有其它賦形劑。選擇這些賦形劑目的是獲得因子VIII在凍干制劑中的最大限度的穩(wěn)定性。而且，本發(fā)明的VIII組合物在液體狀態(tài)下也呈現(xiàn)出穩(wěn)定性。
本發(fā)明制劑中所采用的填充劑，其形成凍干產(chǎn)品中的晶體部分(HES情況下除外)，選自甘露醇、甘氨酸、丙氨酸、和羥乙基淀粉(HES)。甘露醇、甘氨酸或丙氨酸以4-10％，優(yōu)選6-9％，且更優(yōu)選約8％的量存在。當采用HES作為填充劑時，其存在量為2-6％，優(yōu)選3-5％，且更優(yōu)選約4％。
用于本發(fā)明制劑中的穩(wěn)定劑選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸。這些物質(zhì)在本發(fā)明制劑中的存在量在1-4％之間，優(yōu)選2-3％，更優(yōu)選約2％。山梨糖醇和甘油被認為是可能的穩(wěn)定劑，但發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明制劑中是較差的穩(wěn)定劑。
本發(fā)明制劑中含氯化鈉的量為100-300mM，優(yōu)選150-250mM，且最優(yōu)選約225mM。在本發(fā)明的一種實施方案中，氯化鈉自身可以被使用而沒有任何上述填充劑，在此情況下制劑的NaCl含量應(yīng)當在300mM和500mM之間，優(yōu)選350至450mM NaCl，且更優(yōu)選約400mMNaCl。
此外，在這些制劑中存在緩沖劑，因為一般認為凍干過程中的pH改變可能對因子VIII的分子產(chǎn)生不利影響。在凍干過程中pH優(yōu)選保持在6至8的范圍之內(nèi)，且更優(yōu)選pH約為7。緩沖劑可以是任何生理學(xué)上可接受的能夠充當緩沖劑的化學(xué)物或化學(xué)物的組合，包括組氨酸、Tris、BIS-Tris丙烷、PIPES、MOPS、HEPES、MES和ACES。所有這些緩沖劑的化學(xué)名列于下表1中。這些緩沖劑的標準含量濃度為10-50mM。當制劑中加入組氨酸，其單獨或與其它緩沖劑例如Tris一起時，采用超過20mM的濃度并優(yōu)選約25mM。特別優(yōu)選組氨酸用于本發(fā)明組合物，這在下文中將更詳細地敘述。
表1--緩沖劑
為保護因子VIII的活性，本發(fā)明制劑還含有可以與因子VIII相互作用并維持其活性的鈣或另一種二價陽離子是十分重要的，推測這是通過維持因子VIII的重鏈和輕鏈的聯(lián)系實現(xiàn)的?？梢圆捎?mM至5mM的鈣鹽，更優(yōu)選3-4mM，并最優(yōu)選約4mM。鈣鹽優(yōu)選氯化鈣，但也可以是其它的鈣鹽如葡萄糖酸鈣、葡萄糖二酸(glubinate)鈣、葡庚酸(gluceptate)鈣。
本發(fā)明因子VIII組合物還優(yōu)選含有表面活性劑，優(yōu)選量為0.1％或更低，且更優(yōu)選的量約為0.03％。其表面活性劑可以，例如，選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、普盧尼克多元醇類、和玻雷吉35(聚氧乙烯23十二烷基醚)?？梢缘玫綆讉€等級的普盧尼克多元醇(以商品名普盧尼克出售，BASF Wyandotte公司制造)。這些分子量(從1000到大于16000)以及理化性質(zhì)不同的多元醇被用作表面活性劑。分子量為5000的普盧尼克F-38，和分子量為9000的普盧尼克F-68，都含有80％(重量比)的親水性的聚氧乙烯基團和20％疏水性的聚氧丙烯基團。然而，本發(fā)明制劑中優(yōu)選吐溫-80，一種商品化的聚山梨醇酯，尤其是來源于植物的吐溫-80。
本發(fā)明因子VIII組合物還優(yōu)選含有抗氧化劑。已發(fā)現(xiàn)向本發(fā)明凍干制劑中加入抗氧化劑可以改善這些制劑的穩(wěn)定性，并且延長其貯存期。所采用的抗氧化劑對于所采用的藥用制劑必須是相容性的，此外還優(yōu)選是水溶的。當制劑中加入抗氧化劑時，優(yōu)選在凍干之前的過程中盡可能晚地加入這些抗氧化劑，以避免抗氧化劑的迅速氧化。下表2列舉了合適的抗氧化劑，其可以在商業(yè)上從一些公司如Calbiochem及Sigma獲得。
表2-抗氧化劑
在上述抗氧化劑中，優(yōu)選谷胱甘肽。已發(fā)現(xiàn)濃度在約0.05mg/ml至1.0mg/ml以上的范圍都能夠增加因子VIII組合物的穩(wěn)定性，并且相信更高的濃度也應(yīng)該是有用的(直至達到任何毒性作用或?qū)χ苽溆胁涣加绊?，例如降低凍干產(chǎn)品玻璃化轉(zhuǎn)變溫度)。
特別是發(fā)現(xiàn)組氨酸與谷胱甘肽組合對因子VIII組合物的穩(wěn)定性產(chǎn)生有益的協(xié)同作用。組氨酸，當被用作緩沖劑時，也可以充當金屬螯合劑。對于因金屬誘導(dǎo)的氧化作用導(dǎo)致的因子VIII失活程度，組氨酸可以通過結(jié)合這些氧化的金屬離子從而使因子VIII穩(wěn)定。一般認為通過結(jié)合這些金屬，谷胱甘肽(或存在的其它任何氧化劑)能夠由此進一步發(fā)揮抗氧化保護作用，因為組氨酸已經(jīng)限制了金屬離子的氧化作用。
其它螯合劑也可以用于本發(fā)明組合物。如果鈣鹽被用于組合物時，這些螯合劑應(yīng)當以大于對鈣的親和力優(yōu)先結(jié)合金屬如銅和鐵。這些螯合劑的其中之一是去鐵敏(deferoxamine)，一種輕易除去Al++和鐵的螯合劑。甲磺酸去鐵敏，C25H48N6O8*CH4O3S，可以從Sigma(Sigma產(chǎn)品No.D9533)獲得。它是鋁和鐵(II)螯合劑，其僅螯合+3價氧化態(tài)的鐵(為1∶1螯合復(fù)合物)，而非+2價氧化態(tài)，并且還可以結(jié)合鎂離子和其它金屬。去鐵敏的使用量最好為0.25mg/l。
本發(fā)明的制劑中所用的因子VIII可以是高度純化的來源于人血漿的因子VIII也可以是更加優(yōu)選的重組產(chǎn)品因子VIII。重組因子VIII可以由攜帶因子VIII分子DNA序列密碼的介導(dǎo)物轉(zhuǎn)染的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞生產(chǎn)。建立這種轉(zhuǎn)染的CHO細胞的方法被特別描述于Toole，Jr.的美國專利No.4757006中，盡管其它方法也為本領(lǐng)域內(nèi)所已知(見，例如，也屬于Toole，Jr.的美國專利No.4868112，以及PCT國際專利申請WO-A-91/09122)。用于培養(yǎng)這些CHO細胞以產(chǎn)生因子VIII的方法也為本領(lǐng)域內(nèi)所已知，例如Genetics Institute的歐洲專利申請No.0362218，標題為“改進的制備因子VIII的方法C-型蛋白”。而且，重組因子VIII也可以在其它細胞系中產(chǎn)生，例如，幼年倉鼠腎(BHK)細胞。因子VIII分子自身，如果是重組產(chǎn)物，可以是全長因子VIII或者是其缺失衍生物，例如B結(jié)構(gòu)域缺失的因子VIII分子。
盡管本申請中所述的因子VIII組合物可以凍干并以指定的濃度重配，但是本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員應(yīng)當理解這些制劑也可以以更加稀釋的形式重新配制。例如，被凍干且/或通常重配成2ml的溶液的本發(fā)明制劑也可以重配成更大體積的稀釋液，例如5ml。這特別適用于當因子VIII制劑快速注射給患者時，因為此時因子VIII失活的可能性更小，因子VIII溶液越稀釋其注射就可以越快。
制劑及凍干過程的改進
為獲得最佳穩(wěn)定性，本發(fā)明的因子VIII組合物優(yōu)選被凍干。在凍干過程中，因子VIII由含水相轉(zhuǎn)變成無定形相，這被認為能夠保護蛋白質(zhì)以避免化學(xué)和/或結(jié)構(gòu)的不穩(wěn)定性。該凍干制劑不僅含有無定形相，而且還含有在凍干過程中結(jié)晶的組分。這被認為能使因子VIII組合物快速凍干以及形成更加精致的餅狀物(即，餅狀物從凍干容器壁上的收縮盡可能小)。在本發(fā)明制劑中，穩(wěn)定劑被選擇存在于凍干產(chǎn)品的初始無定形分散相中，而填充劑(HES除外)被選擇在冷凍過程中結(jié)晶。
因子VIII和穩(wěn)定劑都優(yōu)選分散于無定形相的凍干餅狀物中。穩(wěn)定劑質(zhì)量也優(yōu)選比無定形形式中的其它賦形劑大。此外，無定型相的表觀玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)優(yōu)選在冷凍-干燥過程中相對較高，而固體的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg)同樣優(yōu)選在儲存期間較高。已發(fā)現(xiàn)產(chǎn)品中氯化鈉的結(jié)晶是合乎需要的，因為無定形氯化鈉可降低無定形相的Tg’。
為避免特定組合物的餅狀物的坍塌，初次干燥優(yōu)選在產(chǎn)品溫度低于冷凍濃縮物的表觀玻璃化轉(zhuǎn)變溫度下進行。還可能需要增加干燥時間以補償下降的Tg’。其它關(guān)于凍干的資料可以見于Carpenter，J.F.和Chang，B.S.著，蛋白質(zhì)藥物的凍干(Lyophilization of ProteinPharmaceuticals)，K.E.Avis和V.L.Wu主編生物技術(shù)與生物藥生產(chǎn)，加工及保存(Biotechnology and Biopharmaceutical Manufacturing，Processing and Preservation)，(Buffalo Grove，IL；Interpharm Press，Inc.)，199-264頁(1996)。
實施例1
在數(shù)項研究中調(diào)查了因子VIII的濃度以及添加穩(wěn)定劑對因子VIII復(fù)性的影響。采用甘露醇作為標準填充劑及蔗糖作為標準穩(wěn)定劑進行這些研究。下表3所示三種制劑樣品在這些研究中被采用。這些研究中的所有制劑都含有10mM Tris，200mM NaCl，8％甘露醇，4mMCaCl2，及0.02％吐溫-80并在pH7.0下進行。
這些樣品采用下表4所示的凍干周期進行凍干以維持產(chǎn)品溫度低于表觀玻璃化轉(zhuǎn)變溫度(Tg’)。差示掃描量熱儀(DSC)研究表明甘露醇制劑約在-40℃出現(xiàn)轉(zhuǎn)化。為維持產(chǎn)品溫度低于此值，在初次干燥過程中將支架溫度設(shè)定在-32℃。在這些條件下初次干燥進行約55小時，其整個周期時間約為80小時。
這些樣品的因子VIII的活性，如由一步凝血檢測法測定的，與保持-45℃的對照組比較。檢測結(jié)果見下表5所示。
這些結(jié)果表明蛋白質(zhì)濃度對冷凍期間的因子VIII的恢復(fù)有影響。含60IU/ml的制劑在冷凍步驟中失去起始因子VIII活性的37-42％，而含600IU/ml的制劑則失去6.7％的因子VIII活性。這些結(jié)果表明較高的蛋白質(zhì)濃度在冷凍期間具有保護性作用。盡管蔗糖在保持中間溫度期間以及冷凍-干燥期間對因子VIII提供了一定的保護作用，但在初次冷卻步驟中不能保護蛋白質(zhì)。
實施例2
隨著實施例1所述凍干過程的改進，進一步進行了該步驟的優(yōu)化。已發(fā)現(xiàn)可以如下制備具有較高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的凍干組合物(而且，在理論上，因子VIII的穩(wěn)定性更好)(1)首先降低冷凍溫度至-45℃或更低(例如降低到約-50℃或-55℃)；(2)升溫至-20℃或-22℃(±5℃)；然后(3)再次降低溫度至-45℃或更低。在條件可能時，溫度以約每分鐘0.5℃至約1.0℃之間的速率升高或降低。當達到所需溫度時，組合物在此溫度下保持1至3小時。這種改進的冷凍周期見下表6所示。
表6
除另有說明外，在該實施例中以及其它實施例中涉及的溫度是指凍干機凍干架溫度而實際上不是指產(chǎn)品本身溫度。根據(jù)改進的冷凍周期，其余凍干步驟可以按照上述實施例1所述、或另外按照本文進一步描述或按照本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員決定進行。
已發(fā)現(xiàn)這種改進的凍干方法對那些含甘氨酸作為填充劑以及那些采用甘露醇的制劑是有用的。它還被認為也適用于那些利用本發(fā)明其它填充劑的制劑。
實施例3
一般認為為了生產(chǎn)出具有可接受的餅狀物外形以及玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的凍干產(chǎn)品，含有氯化鈉的凍干藥用制劑的填充劑，如甘氨酸或甘露醇，可能需要被結(jié)晶。因此發(fā)展了下列適合可結(jié)晶填充劑的改進的凍干方法。
表7a--冷凍步驟
表7b--冷凍步驟
在冷凍步驟中，溫度的改變以約0.5℃/分鐘至1℃/分鐘的速率進行。一般認為步驟的時程較長也有效。
首次冷凍步驟之前，使溫度在約2℃至8℃之間保持約1小時，目的是使所有管形瓶達到大約相同的溫度。此后使凍干機冷凍至-5℃。首次冷凍步驟應(yīng)在低于-30℃的溫度下進行，優(yōu)選低于-35℃，并且更優(yōu)選在約-40℃。在此之后，首次退火步驟應(yīng)在-30℃和-19℃之間進行，更優(yōu)選在約-25℃和-28℃之間(如果甘氨酸是填充劑)或在-21℃和-24℃之間(如果甘露醇是填充劑)，最優(yōu)選的溫度是在-23℃和-26℃之間，一般認為可結(jié)晶填充劑在此溫度下結(jié)晶，至少部分結(jié)晶。無論如何，對于含有甘露醇和精氨酸的制劑不推薦低于約-27℃的范圍。該步驟優(yōu)選進行約3小時。
首次退火步驟之后，溫度被降低，優(yōu)選至低于-50℃并且更優(yōu)選低于-55℃，持續(xù)約1小時。一般認為制劑中的氯化鈉在這時形成核晶。
二次退火步驟中，藥用制劑的溫度上升至約-30℃和-39℃之間，并且對于含甘露醇的組合物優(yōu)選至約-33℃而對于含甘氨酸的組合物優(yōu)選-36℃。相信在這時出現(xiàn)NaCl晶體的生長，至少是部分晶體生長。這個步驟優(yōu)選進行約4小時。在此之后，凍干機溫度降低至約-50℃，優(yōu)選持續(xù)約1小時，以便降低制劑的溫度。
在隨后的冷凍-干燥步驟中，溫度的改變以約0.1℃/min至0.5℃/min的速度發(fā)生。當凍干機壓力降低至約65mTorr后，溫度上升至約-32℃和-35℃之間進行初次干燥。制劑中冰晶在此溫度下升華。這個步驟進行最多約100小時，或直到絕大部分的冰已經(jīng)從制劑中升華。絕大部分的冰已經(jīng)升華的時間點可以，例如，采用露點傳感器檢測，當其讀數(shù)降低時(回折點)表明冰升華的終止。
初次干燥后，溫度上升至+40℃，優(yōu)選速率約為0.2℃/min，開始二次干燥以進一步從制劑中除去水分。此溫度優(yōu)選保持約3小時。在第一步之后進行第二步和第三步的二次干燥步驟，其溫度上升到約+45℃保持約3小時再到約+50℃保持3小時以上，以使凍干餅的水分減少到2％以下(w/w)。
實施例4
為特別考察組氨酸對于含甘氨酸或甘露醇作為填充劑的凍干因子VIII組合物的影響而進行另一項研究。采用非轉(zhuǎn)向熱流(Non-reversing heat floW)(改進的DSC，mDSC)檢測這些填充劑在冷凍期間的結(jié)晶過程。測定結(jié)晶溫度以及從結(jié)晶放熱反應(yīng)測定總結(jié)晶熱。升溫過程中NaCl低共熔體熔化的吸熱表現(xiàn)被用于確定NaCl結(jié)晶過程。在mDSC中，結(jié)晶程度采用全熱流信號由制劑熔化的焓對純NaCl溶液熔化的焓的比率確定。此外，進行X-光衍射分析以測定凍干制劑中的結(jié)晶程度。
當組氨酸濃度低于20mM時對甘氨酸的結(jié)晶沒有顯著影響，50mM組氨酸降低甘氨酸的結(jié)晶程度。精制的NaCl結(jié)晶放熱在含甘氨酸制劑的冷卻過程中沒有被發(fā)現(xiàn)。然而，加熱過程中低共熔體熔化吸熱表明在冷卻至-50℃以下以及在-30℃、-35℃和-40℃下退火之后NaCl被結(jié)晶(＞50％)。在含甘氨酸的制劑中，含50mM組氨酸可阻礙NaCl結(jié)晶。其后，為達到相應(yīng)的結(jié)晶度，這些制劑的退火時間增加了3倍。
然而，20mM組氨酸對含甘氨酸制劑中的NaCl的結(jié)晶影響極小。在冷凍-干燥研究中，視覺觀察到含有50mM組氨酸的含甘氨酸制劑中凍干餅的坍塌。X-光粉末衍射數(shù)據(jù)表明含組氨酸樣品中NaCl結(jié)晶度減低。含甘露醇制劑中，一般有83％-90％的在-40℃和-45℃間的冷卻期間結(jié)晶且無須退火。而含20mM組氨酸的制劑在冷凍過程中受到抑制的NaCl結(jié)晶，退火可以產(chǎn)生約40％的NaCl結(jié)晶。
因此，在含可結(jié)晶填充劑，如甘氨酸或甘露醇，以及NaCl的制劑中，含有組氨酸可能降低NaCl的結(jié)晶程度。盡管這在某些情況下導(dǎo)致凍干過程中形成的餅狀物的坍塌，但在這些制劑中使用相對較低濃度的組氨酸可以減少這種影響。不過，含35mM和50mM濃度的組氨酸能夠形成可接受的餅狀物。在基于甘露醇和甘氨酸的制劑中，組氨酸作為緩沖劑還可能優(yōu)于HEPES，因為已經(jīng)觀察到采用HEPES比類似量的組氨酸使Tg’降低程度更大。
實施例5
在另一項研究中評價了一些活性因子VIII制劑的物理性質(zhì)，其含有七種侯選的穩(wěn)定劑和五種填充劑。除填充劑和穩(wěn)定劑外，下表8中列舉的所有制劑(制劑11除外)含有10mM Tris·HCl、200mM NaCl、0.02％吐溫-80、4mM CaCl2且pH為7.0。制劑11含有10mM Tris·HCl、0.02％吐溫-80，及4mM CaCl2，并且pH也是在7.0。pH測定全部在環(huán)境溫度下進行。
表8
通過冷凍-干燥顯微鏡檢測定的坍塌溫度以及DSC測定的熱轉(zhuǎn)變(transition)被用于預(yù)測冷凍-干燥的行為。DSC、X-光粉末衍射以及偏振光顯微術(shù)也被用于測定凍干樣品的結(jié)晶度。還評價了重新配制時間以及樣品外觀。所有這些測定的結(jié)果概括在下表9中。
表9
*山梨糖醇和甘氨酸的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度＜10℃。DSC掃描范圍不包括此范圍內(nèi)的溫度。
n/c＝不清楚
Tpc＝冷凍-干燥顯微鏡檢中發(fā)生部分坍塌的溫度
Tc＝冷凍-干燥顯微鏡檢中發(fā)生完全坍塌的溫度
Tg＝玻璃化轉(zhuǎn)變溫度
除甘露醇賴氨酸外，所有制劑均呈現(xiàn)出適當?shù)奈锢韺W(xué)外觀。賴氨酸干擾甘露醇及甘氨酸的結(jié)晶，這導(dǎo)致玻璃化轉(zhuǎn)變溫度降低和凍干餅的坍塌。
實施例6
上述表8中描述的因子VIII組合物被放置在-70℃、25℃、40℃和50℃下貯存不同時間長度以評價它們的穩(wěn)定性。因子VIII的活性水平在2周、1月、2月、和3月后評價，而此結(jié)果被概括在下表10中。其中兩種樣品，一種采用甘露醇作為填充劑和山梨糖醇作為穩(wěn)定劑，而另一種采用甘露醇作為填充劑和甘油作為穩(wěn)定劑，呈現(xiàn)出較差的穩(wěn)定性。其余制劑都呈現(xiàn)出穩(wěn)定因子VIII的能力。
表10
實施例7
基于在實施例5和實施例6所述研究過程中獲得的資料判定，包含下表11所示賦形劑的侯選制劑應(yīng)當有進一步的改善。
表11
以這些參數(shù)為基礎(chǔ)，開發(fā)下列特定制劑
表1權(quán)利要求
1.一種因子VIII組合物，所述組合物在配制時不加入白蛋白，除因子VIII外還包括下列制劑賦形劑
4％至10％的填充劑，其選自甘露醇、甘氨酸和丙氨酸；
1％至4％的穩(wěn)定劑，其選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸；
1mM至5mM的鈣鹽；
100mM至300mM NaCl；和
維持pH在約6和8之間的緩沖劑。
2.權(quán)利要求1的因子VIII組合物，其還包含一種表面活性劑。
3.權(quán)利要求2的因子VIII組合物，其中所述表面活性劑選自聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80、普盧蘭尼克F68、和玻雷吉35。
4.權(quán)利要求3的因子VIII組合物，其中所述表面活性劑是聚山梨醇酯80，并且其中所述聚山梨醇酯80的存在量低于0.1％。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-4的因子VIII組合物，其中所述表面活性劑的存在量約為0.03％。
6.根據(jù)權(quán)利要求1-5的因子VIII組合物，其中所述緩沖劑選自Tris、BIS-Tris丙烷、組氨酸、PIPES、MOPS、HEPES、MES和ACES的試劑。
7.權(quán)利要求6的因子VIII組合物，其中所述緩沖劑包括Tris。
8.權(quán)利要求7的因子VIII組合物，其中Tris的存在量約為20mM。
9.權(quán)利要求6的因子VIII組合物，其中所述緩沖劑包括約10mM至約50mM的組氨酸。
10.權(quán)利要求9的因子VIII組合物，其中組氨酸的存在量約為25mM。
11.根據(jù)權(quán)利要求1-10的因子VIII組合物，其還包括抗氧化劑。
12.權(quán)利要求11的因子VIII組合物，其中所述抗氧化劑是谷胱甘肽。
13.權(quán)利要求12的因子VIII組合物，其中所述谷胱甘肽的存在量在約0.05mg/ml至約1.0mg/ml之間。
14.根據(jù)權(quán)利要求1-13的因子VIII組合物，其中所述填充劑的存在量約為8％。
15.根據(jù)權(quán)利要求1-14的因子VIII組合物，其中所述填充劑為甘露醇。
16.根據(jù)權(quán)利要求1-14的因子VIII組合物，其中所述填充劑為甘氨酸。
17.根據(jù)權(quán)利要求1-16的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑的存在量約為2％。
18.根據(jù)權(quán)利要求1-17的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是蔗糖。
19.根據(jù)權(quán)利要求1-17的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是精氨酸。
20.根據(jù)權(quán)利要求1-17的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是海藻糖。
21.根據(jù)權(quán)利要求1-20的因子VIII組合物，其中所述NaCl的存在量為約200mM至約250mM。
22.權(quán)利要求21的因子VIII組合物，其中所述NaCl的存在量約為225mM。
23.根據(jù)權(quán)利要求1-22的因子VIII組合物，其中所述鈣鹽是氯化鈣。
24.根據(jù)權(quán)利要求1-23的因子VIII組合物，其中所述組合物為凍干形式。
25.一種因子VIII組合物，所述組合物配制時不加入白蛋白，除因子VIII外，還包括下列制劑賦形劑
2％至6％的羥乙基淀粉；
1％至4％的穩(wěn)定劑，其選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸；
1mM至5mM的鈣鹽；
100mM至300mM NaCl；以及
維持pH在約6和8之間的緩沖劑。
26.權(quán)利要求25的因子VIII組合物，包括約4％的羥乙基淀粉。
27.根據(jù)權(quán)利要求25-26的因子VIII組合物，包括約200mM的NaCl。
28.根據(jù)權(quán)利要求25-27的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑的存在量約為2％。
29.根據(jù)權(quán)利要求25-28的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是蔗糖。
30.根據(jù)權(quán)利要求25-28的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是精氨酸。
31.根據(jù)權(quán)利要求25-28的因子VIII組合物，其中所述穩(wěn)定劑是海藻糖。
32.一種因子VIII組合物，所述組合物在配制時不加入白蛋白，除因子VIII外，還包括下列制劑賦形劑
300mM至500mM NaCl；
1％至4％的穩(wěn)定劑，其選自蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸；
1mM至5mM鈣鹽；和
維持pH在約6和8之間的緩沖劑。
33.權(quán)利要求32的組合物，其中NaCl的存在量約為400mM。
34.根據(jù)權(quán)利要求1-33中任何一項的因子VIII組合物在制備治療血友病的藥物中的用途。
35.一種改進的凍干含可結(jié)晶填充劑和NaCl的含水藥用制劑的方法，其中所述方法包括下列步驟
(a)在低于約-35℃的溫度下冷凍含水藥用制劑；
(b)使藥用制劑在約-30℃至約-19℃之間退火；
(c)使藥用制劑的溫度降低到約-50℃以下；
(d)使藥用制劑在約-30℃至約-39℃之間退火；然后
(e)冷凍-干燥該藥用制劑。
全文摘要
不以白蛋白配方的因子VIII組合物，其包括因子VIII及下列制劑賦形劑4％至10％的選自一組包括甘露醇、甘氨酸和丙氨酸的填充劑；1％至4％的選自一組包括蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM的鈣鹽；100mM至300mM NaCl；以及使pH保持在約6和8之間的緩沖劑。此外，該制劑可以包括2％至6％的羥乙基淀粉；1％至4％的選自一組包括蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM的鈣鹽；100mM至300mM NaCl；以及使pH保持在約6和8之間的緩沖劑。在另一種實施方案中，該制劑可以包括300mM至500mM NaCl；1％至4％的選自一組包括蔗糖、海藻糖、棉子糖和精氨酸的穩(wěn)定劑；1mM至5mM的鈣鹽；和緩沖劑。
文檔編號A61K47/20GK1399560SQ0080630
公開日2003年2月26日 申請日期2000年2月22日 優(yōu)先權(quán)日1999年2月22日
發(fā)明者M·貝斯曼, E·比約恩松, F·雅梅, R·卡施, M·皮拉, S·徹薩洛夫, J·卡彭特 申請人:巴克斯特國際有限公司, 康涅狄格州大學(xué)