專利名稱：與免疫應答有關的新穎多肽的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及與T淋巴細胞活化有關的多肽。具體地說，本發(fā)明涉及T淋巴細胞共同刺激多肽，編碼這些多肽的核酸，用于制備這些多肽的表達載體和宿主細胞，以及用于治療與免疫抑制和免疫活化有關的疾病的組合物和方法。
背景技術：
要產(chǎn)生適當?shù)腡淋巴細胞(T細胞)免疫應答，必須通過抗原呈遞細胞(APC)提供給T細胞兩個信號。第一，如果要決定特異性，抗原必須經(jīng)由主要組織相容性復合體(MHC)呈遞給T細胞受體(TCR)。第二，不須依賴抗原的共同刺激信號必須通過APC上的B7族成員與T細胞上的CD28蛋白的銜接來遞送。生產(chǎn)性免疫應答導致增殖、分化、克隆擴充、和效應或功能。在沒有第二個共同刺激信號的情況下，T細胞經(jīng)歷持久的抗原特異性無效應性狀態(tài)，稱之為無反應性。
T細胞引發(fā)免疫應答，介導抗原特異性效應子功能，并通過分泌細胞因子調節(jié)其他白細胞的活性。T細胞受體(TCR)將T細胞與其他淋巴細胞區(qū)別開來，并且當其在MHC的范圍內通過APC呈遞時可以僅結合抗原。特定T細胞的功能活性可以與膜抗原諸如CD4和CD8的表達聯(lián)系起來。例如，CD4+T細胞通常起T輔助細胞(TH)的作用，并且是MHC類別II限制性的；而CD8+細胞通常起細胞毒性T細胞(Tc)的作用，并且是MHC類別I限制性的。
先前已確定的有效的T細胞共同刺激多肽包括名為B7.1的多肽(Freeman等，J.Immunology(免疫學雜志)143，2714-2722(1989)，F(xiàn)reeman等，Jour.Expt.Med.(實驗醫(yī)學雜志)174，625-31(1991))和名為B7.2的多肽(Freeman等，Science(科學)262，909-911(1993)，和Freeman等，Jour.Expt.Med.(實驗醫(yī)學雜志)178，2185-2192(1993))，(或者分別是CD80和CD86)。這些多肽或者是誘導的，或者組成性表達于各種APC上，并且分別是T細胞上CD28和CTLA-4的膜結合配體。CD28(Aruffo和Seed，Proc.Natl.Acad.Sci.(國家科學院院報)84，8573-8577(1987)和Gross等，J.Immun.(免疫學雜志)144，3201-3210(1990))在靜息T細胞上表達，并介導正的共同刺激信號。CTLA-4(Brunet等，Nature(自然)328，267-270(1987)和Dariavach等，Eur.Jour.Immun.(歐洲免疫學雜志)18，1901-1905(1988))表達是隨著T細胞的活化誘導的，并負向調節(jié)CD28信號，因為其對B7.1和B7.2有更高的結合親和力。沒有CTLA-4基因的小鼠顯示出非常高的T細胞濃度，因為在缺乏CTLA-4的情況下有關增殖信號的切斷機理削弱了。這種表現(xiàn)型清楚地證明了CTLA-4共同刺激蛋白具有對T細胞增殖的主要抑制作用。缺乏CD28或B7.1或B7.2的小鼠具有較輕程度的表現(xiàn)型，表明可能存在用于T細胞共同刺激的另外的路徑。
對于用CD28/CTLA-4路徑作為調節(jié)T細胞活化和增殖的手段這一點人們一直相當感興趣。含有與人Fc融合的CTLA-4的細胞外部分的嵌合蛋白具有強免疫抑制作用，并且已在各種各樣的臨床環(huán)境中進行了研究。對B7.1和B7.2蛋白的抗體也已就免疫抑制范圍內的類似表現(xiàn)進行了評估?？笴TLA-4抗體已顯示了促進T細胞活化的效用。此外，B7.1和B7.2基因治療在癌癥的免疫治療方面顯示出極大的前途。
迄今為止，CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2都與單T細胞共同刺激路徑有關。被賦予通過調節(jié)T細胞共同刺激來調制免疫應答的能力后，它將有希望鑒別相同的其他成員或可在調節(jié)宿主T細胞功能和免疫應答中具有有益性能的分離的T細胞共同刺激路徑。
因此，本發(fā)明的一個目的是提供用于刺激T細胞活性和/或增殖的新穎多肽。本發(fā)明的另一個目的是使用這些新穎多肽來預防和治療T細胞介導的免疫疾病。
發(fā)明概述出乎意料地，現(xiàn)已確定了T細胞共同刺激路徑的兩種新穎多肽。這些多肽代表看來似乎與由先前所述的蛋白CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2組成的路徑不同的獨特的共同刺激路徑中的配體-受體對。這些多肽被稱之為CD28相關蛋白-1或CRP1，和B7相關蛋白-1或B7RP1。
本發(fā)明提供了編碼CRP1和B7RP1多肽以及相關多肽的核酸分子。本發(fā)明的分離核酸分子包含選自下列成員的核苷酸序列a)、

圖1A中顯示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；b)、編碼圖1A中顯示的殘基1-200或21-200的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；
c)、編碼與圖1A中顯示的多肽至少約70％相同的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；d)、(a)、(b)或(c)任一個的天然產(chǎn)等位變體或可變剪接變體；e)、與(a)、(b)或(c)任一個互補的核苷酸序列；f)、編碼至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少約10、15、20、25、50、75、100或大于100個核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在嚴格條件下與(a)-(g)任何之一雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明還提供了包含選自下列成員的核苷酸序列的分離核酸分子a)、圖2A(SEQ ID NO6)或圖3A(SEQ ID NO11)或圖12A(SEQ IDNO16)中顯示的核苷酸序列；b)、編碼圖2A(SEQ ID NO6)中顯示的殘基1-322或殘基47-322的多肽或者圖3A(SEQ ID NO11)中顯示的殘基1-288或殘基19-288、20-288、21-288、22-288、24-288或28-288的多肽的核苷酸序列；或者編碼圖12A中顯示的殘基1-302或殘基19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28-302的多肽的核苷酸序列；c)、編碼與圖2A(SEQ ID NO6)或圖3A(SEQ ID NO11)或圖12A(SEQ ID NO16)中顯示的多肽至少約70％相同的多肽的核苷酸序列；d)、(a)、(b)或(c)任一個的天然產(chǎn)等位變體或可變剪接變體；e)、與(a)、(b)或(c)任一個互補的核苷酸序列；f)、編碼至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少約10、15、20、25、50、75、100或大于100個核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在嚴格條件下與(a)-(g)任何之一雜交的核苷酸序列。
本發(fā)明的主題還涉及CRP1和B7RP1多肽以及相關多肽。本發(fā)明提供了包含選自下列成員的氨基酸序列的分離多肽a)、圖1A中顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；b)、圖1A(SEQ ID NO2)中顯示的包含位于殘基21上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；
c)、圖1A(SEQ ID NO2)中顯示的包含至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物(ortholog)；和e)、(a)、(b)或(d)的等位變體或可變剪接變體。
本發(fā)明還涉及包含選自下列成員的氨基酸序列的分離多肽a)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)或圖12A(SEQ IDNO17)中顯示的氨基酸序列；b)、圖2A(SEQ ID NO7)中顯示的包含位于殘基47上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或圖3A(SEQ ID NO12)中顯示的包含位于殘基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或圖12A(SEQ ID NO17)中顯示的包含位于殘基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)或圖12A(SEQ IDNO17)中顯示的包含至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位變體或可變剪接變體。
本發(fā)明還包括用于生產(chǎn)多肽的表達載體和宿主細胞，與CRP1和B7RP1多肽結合以及與相關多肽結合的抗體，和用于檢測B7RP1和B7RP1相關多肽與CRP1和CRP1相關多肽的結合的測定法。本發(fā)明還涉及包含CRP1或CRP1相關多肽和B7RP1或B7RP1相關多肽的藥物組合物。本發(fā)明還提供了用于鑒別與CRP1或B7RP1相互作用的化合物的方法，以及用于確定這些化合物是否是CRP1或B7RP1活性的激動劑或拮抗劑的測定法。
CRP1和B7RP1多肽與T細胞共同刺激和增殖有關。CRP1和B7RP1多肽、其選擇性結合劑、以及其激動劑和拮抗劑，可以用于診斷、預防和治療與T細胞反應的控制有關的疾病。
CRP1和B7RP1多肽、其選擇性結合劑、以及其激動劑和拮抗劑，可以用于診斷、預防和治療免疫疾病，或者用于刺激不足的免疫應答，或者減少或抑制過度或不適當?shù)拿庖邞稹Ｃ庖呒膊】梢杂蒚細胞直接或間接介導。
本發(fā)明提供了治療、預防或改善T細胞介導疾病的方法，包括對動物給藥CRP1或B7RP1多肽。本發(fā)明還提供了診斷動物的T細胞介導疾病或對T細胞介導疾病的敏感性的方法，包括測定CRP1或B7RP1多肽表達的存在或量；和基于多肽表達的存在和量診斷T細胞介導疾病或對T細胞介導疾病的敏感性的方法。一般說來，T細胞介導疾病是可以由T細胞直接或間接介導的免疫疾病。動物優(yōu)選是哺乳動物，更優(yōu)選為人。本發(fā)明還提供了鑒別與CRP1或B7RP1多肽結合的檢驗分子的方法，包括使多肽與檢驗化合物接觸并測定多肽與檢驗化合物的結合伸展。該方法可以用于鑒別CRP1和/或B7RP1多肽的激動劑和拮抗劑。
CRP1和/或B7RP1多肽的拮抗劑可以用作許多適應癥用的免疫抑制劑，包括自身免疫疾病(諸如類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡)，中毒性休克綜合征，骨髓和器官移植，炎性腸疾病，因輸血導致的同種致敏，和移植物抗宿主疾病的治療。此外，拮抗劑可以用作T細胞依賴性B細胞介導的適應癥包括哮喘和變態(tài)反應、以及抗體介導的自身免疫用的抑制劑。CRP1和/或B7RP1多肽的激動劑可以用于但不限于腫瘤監(jiān)測和切除中的T細胞活化。
本發(fā)明的拮抗劑包括抗體或其片段，它們能與B7RP1反應或者與B7RP1或B7RP1的胞外域結合，其中抗體減少或消除B7RP1與CRP1的結合。在一個實施方案中，抗體選擇性地與人B7RP1或其胞外域結合。屬于拮抗劑的抗體或其片段部分或完全抑制B7RP1的免疫共同刺激活性。在優(yōu)選的實施方案中，抗體是單克隆抗體并且可以是鼠的、人的、嵌合的或人源化的。
本發(fā)明進一步提供了調節(jié)B7RP1與CRP1的相互作用的方法，包括對動物給藥CRP1的選擇性結合劑或B7RP1的選擇性結合劑或二者。在一個實施方案中，選擇性結合劑是與B7RP1結合的抗體并且減少或消除B7RP1與CRP1的結合。本發(fā)明還提供了調節(jié)由B7RP1介導的免疫共同刺激的方法，包括對動物給藥B7RP1的選擇性結合劑。該選擇性結合劑優(yōu)選與B7RP1結合的抗體并部分或完全抑制由B7RP1介導的免疫共同抑制。
本發(fā)明還提供了調節(jié)動物體內的T細胞活化或增殖的方法，包括對動物給藥編碼CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。例如，編碼B7RP1多肽的核酸分子可以在基因治療中用于增強響應各種腫瘤的T細胞活化。
本發(fā)明還包括轉基因的非人哺乳動物，其包含編碼CRP1或B7RP1多肽的核酸分子。CRP1或B7RP1核酸以允許CRP1或B7RP1多肽的表達和循環(huán)濃度增加的方式引入到哺乳動物體內。該轉基因非人哺乳動物優(yōu)選嚙齒動物，更優(yōu)選小鼠或大鼠。
附圖的描述圖1、A).鼠CRP1的DNA和氨基酸序列(mCRP1)。預測的CRP1的信號序列在氨基端加了下劃線，實驗確定的前肽切割位點由星號指示。預測的跨膜序列向羧基端加了下劃線。B).鼠CRP1蛋白序列(mCRP1)與鼠CD28(mCD28)的氨基酸序列對比。
圖2、A).鼠B7RP1的DNA和氨基酸序列(mB7RP1)。預測的B7RP1的信號序列在氨基端加了下劃線，實驗確定的前肽切割位點由星號指示。預測的跨膜序列向羧基端加了下劃線。B).B7RP1蛋白序列(mB7RP1)與鼠CD80(mCD80)的氨基酸序列對比。
圖3、A).推定人B7RP1(hB7RP1)的蛋白質編碼區(qū)的結構和序列。hB7RP1的預測信號序列在氨基端加了下劃線。預測的信號肽切割位點用星號標記。預測的跨膜序列向羧基端加了下劃線。B).推定的成熟hB7RP1蛋白質與成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白質的氨基酸序列對比。
圖4、A).來自用pcDNA3/CRP1-Fc轉染的293T細胞的可溶性CRP1-Fc融合蛋白的表達。如圖中所示在10％PAGE凝膠上加載并分離歸一化體積的細胞裂解物或條件培養(yǎng)基。用于細胞伴隨的(細胞裂解物)和分泌的(培養(yǎng)液)Fc融合蛋白的表達的細胞裂解物和細胞培養(yǎng)上清液的蛋白質印跡分析。初級抗體是山羊抗人Fc抗體(Pierce化學公司，Rockford，IL.)。B).來自用pcDNA3/B7RP1-Fc轉染的293T細胞的可溶性B7RP1-Fc融合蛋白的表達。在10％PAGE凝膠上加載并分離20μl的歸一化細胞裂解物或培養(yǎng)上清液。如(A)中所述進行蛋白質印跡分析。
圖5、CRP1-Fc和B7RP1-Fc融合蛋白與COS-7細胞中表達的膜結合蛋白的相互作用。COS-7細胞用pcDNA3/CRP1、pcDNA3/B7RP1、或單獨的pcDNA載體瞬時轉染。CH0 D細胞用psDRα/hCD28轉染并穩(wěn)定地表達人CD28(hCD28)。表達膜結合CRP1、B7RP1或hCD28的細胞如圖所示一排排地表示在面板的左側。Fc融合蛋白用如圖所示一列列地表示在面板上部的平板結合細胞溫育。溫育后，將細胞洗滌，使用抗人Fc抗體和ACAS(粘著細胞分析和分選；ACAS Ultima，Meridian Instruments，Inc.，Okemos，MI)分析檢測結合Fc融合蛋白。
圖6、B7RP1的受體(推定的，CRP1)在活化CD4+和CD8+T細胞上的表達的FACS(熒光活化細胞分檢器)分析。小鼠脾細胞用PMA和離子霉素活化12小時。B7RP1-Fc融合蛋白、對照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用細胞溫育，洗滌，隨后用顯示在每個面板底部的山羊抗人Fc-FITC綴合抗體(GaHuFc-FITC)溫育。加入顯示在每個面板左側的細胞標志抗體(T細胞標志CD4和CD8的)PE綴合的、或同種型對照抗體(大鼠同種型)PE綴合的、或PBS(未染色)。
圖7、B7RP1在B細胞上的表達的FACS(熒光活化細胞分檢器)分析。CRP1的配體(推測的，B7RP1)在小鼠脾細胞上的表達的熒光細胞計量分析。CRP1-Fc融合蛋白、對照Fc蛋白(Mock-Fc)或PBS(未染色)用細胞溫育，洗滌，隨后用顯示在每個面板底部的山羊抗人Fc-FITC綴合抗體(GaHuFc-FITC)溫育。加入顯示在每個面板左側的CD45R的PE綴合細胞標志抗體(CD45R是B細胞標志)或同種型對照抗體(大鼠同種型)或PBS(未染色)。
圖8、mCRP1配體在腹膜巨噬細胞上的表達的FACS分析。腹膜細胞首先根據(jù)它們的光散射性能分成亞群(面板A)。巨噬細胞由于它們強大的向前(FSC)和向側面(SSC)散射光的能力以及由于它們對巨噬細胞的標記-F4/80抗原的陽性染色而在5區(qū)(R5)中鑒別出來(面板B)。6區(qū)(R6)中的巨噬細胞在它們對F4/80抗原染色強度小并且發(fā)現(xiàn)能被CRP1-Fc融合蛋白染色(推測是由于它們對B7RP1的表達)的基礎上挑選出來。
圖9、使用B7RP1-Fc融合蛋白對T細胞增殖的抑制。來自小鼠脾細胞的T細胞用圖底部所示的遞增濃度的伴刀豆凝集素A(Con A)活化。將mCRP1-Fc、mB7RP1和mB7.2-Fc融合蛋白在不存在(沒有加入)或存在Con A的條件下加入到來自脾細胞的富集T細胞中。200,000個細胞用于在96孔平板中進行的T細胞增殖測定。細胞用圖例中所示的培養(yǎng)基(沒有加入)或Fc融合蛋白溫育。42小時后，細胞用H-胸苷脈沖處理6小時，然后采收并摻入確定的放射性。表示出來自一式三份樣本的平均CPM和標準偏差。
圖10、A).來自對照小鼠#10的正常腸系膜淋巴結，顯示了該淋巴結的皮質、副皮質和髓質。蘇木精-曙紅(H&E)染劑，40x放大率。B).來自有顯著的濾泡增生(FH)、副皮質擴張和髓索增生(MH)的WXll小鼠#40的顯著增大的腸系膜淋巴結。H&E，40x。C).來自對照小鼠#10的腸系膜淋巴結的髓索(MC)和髓竇(MS)的閉合。注意主要由與帶有肉樣巨噬細胞的髓竇相鄰的小淋巴細胞組成的小髓索。H&E，400x。D).來自WXll小鼠#40的腸系膜淋巴結的髓索(MC)和髓竇(MS)的閉合。注意由大量帶有偶然拉塞爾小體細胞(箭頭)的血漿細胞組成的顯著變厚的髓索。H&E，400x。E).來自對照小鼠#10的正常的脾，顯示了帶有小動脈周淋巴鞘(PALS)的紅髓和白髓區(qū)域，100x。插圖帶有小淋巴細胞、巨噬細胞和偶然血漿細胞的圍繞白髓的邊緣區(qū)的閉合，400x。F).來自WXll小鼠#6的脾，帶有增大的白髓區(qū)域，包括PALS和濾泡(箭頭)，100x。插圖帶有大量血漿細胞和偶然拉塞爾小體的邊緣區(qū)的閉合，400x。G).來自對照小鼠#25的帶有派伊爾結的回腸，有由兩個次級濾泡側面相接形成的濾泡間區(qū)(箭頭)，40x。H).來自WXll小鼠#32的帶有派伊爾結的回腸，有具有明顯生發(fā)中心和濾泡間組織(箭頭)的顯著增大的濾泡，40x。
圖11、A).來自對照小鼠#5的正常腸系膜淋巴結，顯示了該淋巴結的皮質、副皮質和髓質。蘇木精-曙紅(H&E)染劑，40x放大率。B).來自有顯著的濾泡增生(頂部外皮質中的次級濾泡行)、副皮質擴張(中間)和髓索增生(底部)的WXll小鼠#33的顯著增大的腸系膜淋巴結。H&E，40x。C).來自帶有抗B220抗體(B細胞標志)的對照小鼠#10的腸系膜淋巴結的免疫組織化學染色。注意強烈(褐色)染色的皮質區(qū)和細小的髓索。免疫染色使用抗生物素蛋白-生物素復合物(ABC)免疫過氧化物酶法進行(DAB色原，蘇木精復染劑)，40x。D).來自帶有抗B220抗體的WXll小鼠#33的腸系膜淋巴結的免疫組織化學染色。注意強烈染色的皮質濾泡和髓索(盡管髓索中的成熟血漿細胞對B220是陰性的)，40x。E).來自帶有抗CD3抗體(T細胞標志)的對照小鼠#10的淋巴結的免疫組織化學染色。注意該淋巴結的副皮質區(qū)的免疫染色，40x。F).來自帶有抗CD3抗體的WXll小鼠#33的淋巴結的免疫組織化學染色。注意該淋巴結的增大的、強烈染色的副皮質區(qū)，40x。
圖12、A).編碼人B7RP1(hB7RP1)區(qū)的蛋白質的結構和序列。hB7RP1的預測信號序列在氨基端加了下劃線。預測的信號肽切割位點用星號標記。預測的跨膜序列向羧基端加了下劃線。B).推定的成熟hB7RP1蛋白質與成熟的鼠B7RP1(mB7RP1)蛋白質的氨基酸序列對比。
圖13、A).編碼人CRP1(hCRP1)區(qū)的蛋白質的結構和序列。hCRP1的預測信號序列在氨基端加了下劃線。預測信號肽切割位點用星號標記。預測的跨膜序列向羧基端加了下劃線。B).hCRP1蛋白質與鼠CRP1(mCRP1)蛋白質的氨基酸序列對比。
圖14、CRP-1在靜息記憶細胞上。來自6-7月齡小鼠的靜息脾細胞使用由FITC綴合抗人Fc抗體和CD44(圖14A)、CD45RB(圖14B)或CD69(圖14C)的PE綴合抗體標記的B7RP-1-Fc進行二重染色。
圖15、經(jīng)由B7RP-1-Fc融合蛋白的T細胞共同刺激。A).由不同數(shù)量的B7RP-1-Fc(密實正方形)、B7.2-Fc(密實圓圈)或OPG-Fc融合蛋白對照(空心正方形)與抗CD3抗體聯(lián)合誘導的T細胞增殖。融合蛋白以不同濃度用于涂敷預先用抗人Fc FAb2(12.5μg/ml)和抗CD3抗體(0.9μg/ml)涂敷的96孔平板。B7RP-1-Fc和B7.2-Fc以劑量依賴方式共同刺激T細胞不超過0.3μg/ml，此時達到最大效應。B).由B7RP-1-Fc(密實正方形)、B7.2-Fc(密實圓圈)、非融合Fc(空心正方形)或無Fc(空心圓圈)與抗CD3抗體(0.85μg/ml)聯(lián)合并在不同濃度的兔抗B7RP-1-Fc多克隆抗體的存在下誘導的T細胞增殖。Fc融合蛋白以0.3μg/ml的濃度使用并如上所述結合到平板上。通過皮下注射在佐劑中乳化的抗原提出針對純化B7RP-1-Fc的抗B7RP-1-Fc抗體，然后進行親和純化?？贵w加入細胞之前用Fc融合蛋白溫育30分鐘?？笲7RP-1-Fc抗體以劑量依賴方式特異性抑制由B7RP-1-Fc誘導的T細胞增殖。
圖16、CRP-1-Fc和B7RP-1-Fc蛋白質對小鼠的膠原誘導關節(jié)炎的發(fā)生率(A)和嚴重程度(B)的影響。易受膠原誘導關節(jié)炎影響的B10.RIII小鼠在尾巴的根部用存在于CFA中的10μg豬II型膠原免疫接種。小鼠接受100μg融合蛋白，每周兩次。Fc融合蛋白和對照PBS治療顯示在圖例中。
圖17、B7RP-1-Fc轉基因小鼠的近側結腸。(A).來自對照小鼠#53F(雌性)的正常近側結腸，顯示了帶有粘膜、粘膜下層、肌層和漿膜的腸壁。蘇木精-曙紅(H&E)染劑，40x放大率。(B).來自有顯著的腺肥大、裂隙潰瘍和透壁炎癥的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#111F的彌漫增厚的近側結腸。H&E，40x。(C).來自有多灶性裂隙潰瘍和透壁炎癥的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#111F的近側結腸的下部動力圖(如面板B中所示)。H&E，20x。(D).來自B7RP-1-Fc轉基因小鼠#111F的裂隙潰瘍和肥大性結腸腺的閉合(顯示在上面的面板B和C中)。注意有粘液膿性滲出物的腔。H&E，100x。(E).具有被巨噬細胞、淋巴細胞和少數(shù)嗜中性白細胞圍繞的多核巨細胞的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#112F的粘膜下層中的肉芽腫性炎癥的閉合。H&E，400x。(F).具有位于粘膜腺下方的與淋巴細胞、血漿細胞和少數(shù)嗜中性白細胞混合的上皮樣巨噬細胞的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#112F的粘膜中的肉芽腫性炎癥的閉合。H&E，400x。
圖18、B7RP-1-Fc轉基因小鼠的遠側結腸。(A).來自對照小鼠#53F(雌性)的正常遠側結腸，顯示了帶有粘膜、粘膜下層、肌層和漿膜的腸壁各層。蘇木精-曙紅(H&E)染劑，40x放大率。(B).來自有顯著的腺肥大和增生和散在濾泡膿腫的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#111F(雌性)的彌漫增厚的遠側結腸。H&E，40x。(C).來自有顯著的腺肥大和增生的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#55M(雄性)的彌漫增厚的遠側結腸。H&E，40x。(D).來自有肥大性結腸腺、局灶性淋巴樣聚集物和許多濾泡膿腫的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#112F(雌性)的彌漫增厚的遠側結腸。H&E，40x。(E).來自帶有抗CD3抗體(T細胞標志)的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#112F的遠側結腸的免疫組織化學染色。注意淺表粘膜和結腸淋巴組織斑的免疫染色。H&E，40x。(F).具有濾泡膿腫(箭頭)和由B220+B細胞組成的淋巴樣聚集物(插圖)的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#112F的結腸粘膜的閉合。H&E，100x。
圖19、B7RP-1-Fc轉基因小鼠的小腸。(A).來自對照小鼠#53F(雌性)的正常十二指腸，顯示了腔、絨毛和粘膜的濾泡以及下面的粘膜下層、肌層和漿膜。蘇木精-曙紅(H&E)染劑，40x放大率。(B).來自有顯著的濾泡肥大和增生和固有層中輕度淋巴漿細胞浸潤的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#51F(雌性)的彌漫增厚的十二指腸。H&E，40x。(C).來自對照小鼠#53F(雌性)的正?？漳c，顯示了空腸粘膜中正常長度的絨毛和濾泡。H&E，40x放大率。(D).來自有局部廣延的濾泡肥大和增生的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#51F(雌性)的顯著增厚的空腸粘膜。H&E，40x。(E).來自對照小鼠#53F(雌性)的正常回腸，顯示了回腸粘膜中正常長度的絨毛和濾泡。H&E，40x放大率。(F).來自絨毛局灶性損失和鈍化的B7RP-1-Fc轉基因小鼠#231M(雄性)的回腸粘膜的輕度萎縮。H&E，40x。
圖20、B7RP-1-Fc融合蛋白抑制了小鼠體內的腫瘤生長。將Meth A肉瘤細胞真皮內植入到Balb/C小鼠的腹部。在植入后的第7、10、14和17天時，小鼠用載體(深色菱形)或鼠B7RP-1-Fc(灰色三角形，實施例7)治療。如實施例20中所述，在指示的植入的那些天中測量腫瘤的體積。監(jiān)測腫瘤的生長直到第28天。每組有8只小鼠。
圖21、經(jīng)由人B7RP-1-Fc的T細胞共同刺激。用抗CD3和人B7RP-1Fc涂敷96孔平板，并如實施例21中所述培養(yǎng)和收獲1×105T細胞/孔(＞98％CD3+)。A).在不同濃度的抗CD3初始刺激下由單獨的抗CD3(密實圓圈)、0.5μg/ml B7RP-1Fc(密實三角形)、0.5μg/ml OPG-Fc(空心圓圈)和5μg/ml抗CD28(空心三角形)誘導的共同刺激。數(shù)據(jù)顯示，B7RP-1-Fc將抗CD3致敏T細胞共同刺激到了與使用抗CD28抗體共同刺激所達到的類似水平。所顯示的數(shù)據(jù)是來自用從三個正常供體分離的T細胞產(chǎn)生的若干實驗中的一個典型實驗的一式三份孔中的摻入[3H]TdR均值+/-SD。B).經(jīng)由CRP-1-Fc對B7RP-1-Fc共同刺激的劑量依賴性抑制。T細胞在用0.3μg/ml的抗CD3和0.5μg/ml的B7RP-1-Fc涂敷的孔中培養(yǎng)。連續(xù)稀釋濃度的CRP-1-Fc(密實圓圈)或OPG-Fc(空心圓圈)在加入T細胞之前用B7RP-1-Fc預溫育30分鐘。數(shù)據(jù)顯示，CRP-1-Fc以劑量依賴性方式抑制了B7RP-1誘導的共同刺激。以抑制百分數(shù)對CRP-1-Fc或OPG-Fc蛋白質濃度作圖。所顯示的數(shù)據(jù)是在一式三份孔中完成的三個實驗的摻入[3H]TdR均值+/-SD，并且是用兩個正常供體產(chǎn)生的實驗的典型。C).經(jīng)由CHO人B7RP-1細胞的共同刺激。T細胞從外周血液中純化，并在單獨的抗CD3(密實圓圈)、1×104CHO載體對照細胞(空心圓圈)或1×104CHO B7RP-1細胞(密實三角形)的存在下用不同濃度的抗CD3培養(yǎng)，如實施例22中所述。數(shù)據(jù)顯示，膜結合B7RP-1共同刺激T細胞的生長到了與使用B7RP-1-Fc融合蛋白觀察到的類似水平。所顯示的數(shù)據(jù)是一式三份培養(yǎng)物的均值+/-SD，并且是用兩個正常供體產(chǎn)生的結果的典型代表。D).細胞因子產(chǎn)生。如(圖21A)中所述培養(yǎng)T細胞，在48小時(黑條)和72小時(灰條)時收集上清液。數(shù)據(jù)表明，由B7RP-1-Fc共同刺激細胞產(chǎn)生的IL-2的量(上圖)與由用抗CD3和對照Fc刺激的細胞產(chǎn)生的量類似，但顯著低于由抗CD28共同刺激細胞產(chǎn)生的量。數(shù)據(jù)還表明，B7RP-1-Fc共同刺激增強了IL-10(中圖)和IFN-γ(下圖)的產(chǎn)生。
發(fā)明的詳細描述本發(fā)明提供了在本文中稱之為CRP1和B7RP1的新穎多肽，它們包含與T細胞活化有關的受體-配體對。從用小鼠腸上皮內細胞制備的文庫鑒別出編碼這些多肽的cDNA并在與CD28和CTLA-4多肽(關于CRP1)或B7.1和B7.2多肽(關于B7RP1)的同源性的基礎上進行篩選。
CD28相關蛋白質-1或CRP1，據(jù)預測是帶有位于氨基端的信號序列和胞外域、跨膜結構域和羧基端胞內域的I型跨膜蛋白(圖1)。全長CRP1蛋白質的成熟形式為180個氨基酸。預測前導序列大約跨越氨基酸殘基1-20(相對于起始甲硫氨酸)，該成熟蛋白質的胞外域大約包括殘基21-145(實施例1)。預測的跨膜結構域大約跨越殘基146-163，胞內域包括大約殘基164-200。氨基端胞外域與具有保守推定分子內和分子間鍵合半胱氨酸的Ig環(huán)類似。另外，先前已知對于B7.1和B7.2與CD28和CTLA-4的結合非常重要的“MYPPPY”基元也是部分保守的。
CD28和CTLA-4是弱同源性的，例如鼠CD28和CTLA-4之間有26％氨基酸相同。CRP1與鼠CD28有19％氨基酸相同，CRP1與鼠CTLA-4有14％相同。但是，鼠CD28、CTLA-4和CRP1之間的決定性半胱氨酸殘基保存在殘基42、63、83、109和137處(相對于CRP1蛋白質中的起始甲硫氨酸，參見圖1A)。在CRP1、CD28和CTLA-4中，近似成熟蛋白質長度和相對于羧基端的跨膜區(qū)的位置也類似。
人CRP1是具有圖13A中所示核苷酸和氨基酸序列的跨膜蛋白質。預測的前導序列大約跨越殘基1-19或約殘基1-20。預測的成熟氨基端在殘基20或21處。優(yōu)選地，成熟氨基端在21位。胞外域從任何一個預測成熟氨基端跨越到約氨基酸殘基140，跨膜結構域跨越約殘基141-161，而胞內域跨越約殘基162-199。人CRP1蛋白質與鼠蛋白質有69％相同，相應的核苷酸序列為77％相同。人CRP1的序列報道于Hutloff等，Nature(自然)397，263-266(1999)。
B7相關蛋白質-1或B7RP1，據(jù)預測是帶有位于氨基端的信號序列和胞外域、跨膜結構域和羧基端胞內域的I型跨膜蛋白質(圖2A)。全長B7RP1蛋白質的成熟形式為276個氨基酸。預測前導序列大約跨越氨基酸殘基1-46(相對于起始甲硫氨酸)，成熟蛋白質的胞外域大約包括殘基47-279(實施例3)。預測的跨膜結構域大約跨越殘基280-298，胞內域包括殘基299-322。與B7.1和B7.2類似，B7RP1的胞外域包含兩個Ig環(huán)。
B7.1和B7.2是弱同源性的，例如鼠B7.1和B7.2之間有24％氨基酸相同。B7RP1與鼠B7.1有20％氨基酸相同，B7RP1與鼠B7.2有19％相同。但是，鼠B7.1、B7.2和B7RP1之間的決定性半胱氨酸殘基保存在殘基62、138、185和242處(相對于B7RP1蛋白質中的起始甲硫氨酸，參見圖2A)。在mB7RP1、B7.1和B7.2中，近似成熟蛋白質長度和相對于羧基端的跨膜區(qū)的位置也類似。
人B7RP1也是具有Ig環(huán)結構所必需的在胞外域中的保守半胱氨酸殘基的跨膜蛋白質。預測前導序列包括如圖3A中顯示的約殘基1-18、1-19、1-20、1-21、1-23或1-27。預測的成熟氨基端可以在殘基19、20、21、22、24或28任何一處。優(yōu)選氨基端在19位。胞外域從任何一個成熟氨基端跨越到約氨基酸殘基259。預測跨膜結構域跨越約殘基259-274。胞內域包括殘基275-302。全長人B7RP1核苷酸和氨基酸序列顯示在圖12A中。人B7RP1與鼠蛋白質約43％相同。
CRP1和B7RP1彼此結合，但CRP1不可檢測地與B7RP1相關蛋白B7.2結合；B7RP1沒有顯示可檢測地與CRP1相關CD28或CTLA-4結合(實施例8)。B7RP1顯示調節(jié)了T細胞增殖，推測是通過B7RP1與CRP1受體的相互作用(實施例11)。因此，CRP1和B7RP1代表了調節(jié)T細胞增殖和活化的新穎路徑。
B7RP1與CRP1的相互作用可以用免疫共同刺激和T細胞增殖和活化能增加或減少這樣的方式來調節(jié)。作為實例，針對鼠B7RP1培養(yǎng)的抗B7RP1單克隆和多克隆抗體阻斷了B7RP1/CRP1相互作用，也阻斷了由B7RP1-Fc融合蛋白誘導的T細胞增殖(參見實施例17)。人CRP-1-Fc融合蛋白阻斷了由人B7RP-1-Fc誘導的人T細胞增殖(實施例21)。此外，加入CRP1-Fc融合蛋白延遲了類風濕性關節(jié)炎小鼠模型的關節(jié)炎癥狀的發(fā)作(參見實施例18)。B7RP-1/CRP-1共同刺激也可通過加入B7RP-1-Fc融合蛋白或此路徑的其他激活劑來增加(實施例20)。
核酸分子術語“分離核酸分子”是指沒有至少一個天然相聯(lián)的污染核酸分子的核酸分子，優(yōu)選實質沒有任何其他污染哺乳動物核酸分子。
術語“等位變體”是指占據(jù)生物體染色體上所給出部位的基因的若干可能的天然產(chǎn)備擇形式之一。
術語“剪接變體”是指由RNA轉錄物中內含子序列的可變加工產(chǎn)生的核酸分子，通常是RNA。
術語“高嚴格條件”指的條件是(1)采用低離子強度和高溫洗滌，例如，O.1 X SSC(0.015M NaCl/0.0015M檸檬酸鈉)0.1％NaDodSO4(SDS)，50℃下，或者(2)在雜交過程中采用變性劑諸如甲酰胺，例如，50％(體積/體積)甲酰胺加上0.1％牛血清白蛋白/0.1％Ficoll/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩沖劑加上5XSSC(750mM NaCl，75mM檸檬酸鈉)，在42℃下。高嚴格條件的另一個例子是50％甲酰胺，5 x SSC，50mM磷酸鈉(pH6.8)，0.1％焦磷酸鈉，5xDenhardt溶液，超聲處理過的鮭精DNA(50μg/ml)，0.1％SDS，和10％葡聚糖硫酸脂，在42℃下，并在42℃下用0.2 x SSC和0.1％SDS洗滌。
術語“中等嚴格條件”所指的條件包括使用比上述條件嚴格性低的洗滌溶液和雜交條件(例如溫度和離子強度)。中等嚴格條件的例子是諸如下述條件在包含20％甲酰胺、5 x SSC、50mM磷酸鈉(pH7.6)、5 xDenhardt溶液、10％葡聚糖硫酸酯和20μl/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中在37℃下溫育過夜，接著在約37-50℃下用1 x SSC洗滌濾器。熟練技術人員將根據(jù)需要確定怎樣調節(jié)溫度、離子強度和其他參數(shù)以適應諸如探針長度等因素。
重組DNA技術方法列于Sambrook等(分子克隆實驗室手冊，冷泉港實驗室出版社，冷泉港，NY(1989))和/或Ausubel等編寫的(分子生物學中的流行方案，Green Publishers Inc.和Wiley&Sons，NY(1994))，它們都整個結合在此作為參考。
本發(fā)明提供了編碼CRP1和B7RP1多肽的分離核酸分子。還提供了是片段、等位變體、剪接變體或者序列與編碼CRP1和B7RP1多肽的分子互補的核酸分子。還包括與編碼CRP1或B7RP1的分子至少約70％相同或者在中等或高嚴格條件下與編碼CRP1或B7RP1的分子雜交的核酸分子。這些核酸分子可以是cDNA、基因組DNA、RNA或部分或完全合成的核酸分子。在優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的核酸分子與編碼CRP1或B7RP1的核酸分子至少約75％、80％、85％、90％或95％相同。
編碼CRP1或B7RP1多肽的基因或cDNA或其片段可以得到，例如通過基因組或cDNA文庫的雜交篩分或PCR擴增。用于篩分該文庫的探針或引物可以在來自相同或相關基因族的其他已知基因或基因片段的序列信息的基礎上產(chǎn)生，例如在CRP1或B7RP1相關多肽中發(fā)現(xiàn)的保守基元諸如半胱氨酸殘基的保守陣列。另外，已從一種物質中鑒別出編碼CRP1或B7RP1多肽的基因時，該基因的全部或部分可以用作探針來從其他種物質鑒別同源基因。探針或引物可以用于從據(jù)信表達CRP1或B7RP1基因的不同組織來源篩分cDNA文庫。
當寡核苷酸探針用于篩分cDNA或基因組文庫時，可以使用下列兩種高嚴格溶液之一。第一種是6 X SSC加上0.05％焦磷酸鈉，在35℃-62℃下，溫度取決于寡核苷酸探針的長度。例如，14個堿基對的探針在35-40℃下洗滌，17個堿基對的探針在45-50℃下洗滌，20個堿基對的探針在52-57℃下洗滌，而23個堿基對的探針在57-63℃下洗滌。當背景非特異性結合顯得高時，可以將溫度升高2-3℃。第二種高嚴格溶液利用氯化四甲銨(TMAC)來洗滌寡核苷酸探針。一種嚴格洗滌溶液是3MTMAC、50mM Tris-HCl，pH8.0和0.2％SDS。使用該溶液時的洗滌溫度是探針長度的函數(shù)。例如，17個堿基對的探針在約45-50℃下洗滌。
另一種制備編碼CRP1或B7RP1多肽的基因或其片段的方式是使用熟練技術人員熟知的方法進行化學合成，諸如Engels等(Agnew.Chem.Intl.Ed.，28716-734(1989))描述的方法。這些方法包括，尤其是用于核酸合成的磷酸三酯法、亞磷酰胺法和H-膦酸酯法。用于這種化學合成的優(yōu)選方法是使用標準亞磷酰胺化學的聚合物支持合成。一般說來，編碼CRP1或B7RP1多肽的DNA將有數(shù)百個核苷酸長。長于約100個核苷酸的核酸可以使用這些方法合成為若干個片段。這些片段然后可連接在一起形成全長CRP1或B7RP1多肽。通常，編碼多肽氨基端的DNA片段將具有編碼甲硫氨酸殘基的ATG。該甲硫氨酸可以或不可以呈遞在CRP1或B7RP1多肽的成熟形式上，這取決于宿主細胞中產(chǎn)生的多肽是否是計劃從該細胞中分泌的。
編碼生物活性多肽的CRP1或B7RP1核酸分子、片段和/或不是它們自己的衍生物仍然可以在診斷性測定中用作雜交探針來定性或定量檢驗哺乳動物組織或體液樣品中CRP1或B7RP1 DNA或相應RNA的存在。
在一些情況下，可能希望制備天然產(chǎn)CRP1或B7RP1多肽的核酸和/或氨基酸變體。當引物具有所需點突變時，核酸變體可以使用定點誘變、PCR擴增或其他合適的方法生產(chǎn)(參見Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上，有關誘變技術的描述)。使用Engels等(同上)描述的方法的化學合成也可以用于制備這類變體。也可以使用熟練技術人員已知的其他方法。
優(yōu)選的核酸變體包括含有已為所給宿主細胞中CRP1和B7RP1多肽的最佳表達改變的密碼子的那些。特定密碼子變化將取決于蛋白質和宿主細胞的選擇。在一種情況下，這種“密碼子優(yōu)化”可以通過選擇在所給宿主細胞中優(yōu)選用于高度表達基因的密碼子來進行?？梢允褂糜嘘P高度表達的細菌基因的優(yōu)選密碼子的加入密碼子頻率表諸如“Ecohigh.Cod”的計算機算法，其由威斯康星大學Package 9.0版，Genetics Computer Group，Madison，WI提供。其他有用的密碼子頻率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。其他優(yōu)選的變體是編碼如下所述(例如，其中天然產(chǎn)氨基酸側鏈的電荷或極性通過用不同氨基酸置換沒有實質改變)與野生型相比保守氨基酸變化的那些，和/或計劃產(chǎn)生新的糖基化和/或磷酸化位點的那些，或計劃刪除現(xiàn)有糖基化和/或磷酸化位點的那些。
編碼CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以使用標準連接技術插入合適的表達或擴增載體中。一般選擇在所用的特定宿主細胞中是功能性的載體(即，該載體與宿主細胞機構是相容的，以便可以發(fā)生基因的擴增和/或基因的表達)。編碼CRP1或B7RP1多肽的基因、cDNA或其片段可以在原核細胞、酵母、昆蟲(桿狀病毒系統(tǒng))和/或真核宿主細胞中擴增/表達。宿主細胞的選擇將部分取決于CRP1或B7RP1多肽或其片段是否將被糖基化和/或磷酸化。如果是，則優(yōu)選酵母、昆蟲或哺乳動物宿主細胞。
一般，在任何一個宿主細胞中所用的表達載體將含有用于質粒保持和克隆和插入核苷酸序列的表達的序列。這類序列統(tǒng)稱為“側翼序列”，將包括啟動子和其他調節(jié)元件諸如增強子、復制元件起點、轉錄終止元件、含有供體和受體剪接位點的完全內含子序列、信號肽序列、核糖體結合位點元件、聚腺苷酸化序列、用于插入編碼要表達的多肽的核酸的多接頭區(qū)和選擇性標記元件。這些元件中的每一個將在下面進行討論?？蛇x地，該載體可以含有“尾端”序列，即，位于CRP1或B7RP1多肽編碼序列的5′或3′端的寡核苷酸分子；該寡核苷酸分子編碼聚組氨酸(諸如六組氨酸)或其他“尾端”諸如FLAG、HA(血凝素流感病毒)或myc，有可從商業(yè)上獲得的它們的抗體。這種尾端一般隨著多肽的表達而融合到多肽上，并且可以充當從宿主細胞親和純化CRP1或B7RP1多肽的方式。例如，親和純化可以通過柱色譜法使用針對尾端親和基質的抗體完成?？蛇x地，該尾端隨后可以通過各種方式諸如使用某些肽酶從純CRP1或B7RP1多肽上除去。
人免疫球蛋白鉸鏈和Fc區(qū)可以由本領域中的技術人員融合到CRP1或B7RP1多肽的N端或C端。隨后該Fc融合蛋白可以通過使用A蛋白親和柱純化。已知免疫珠蛋白Fc區(qū)顯示出長的體內藥動學半衰期，且融合到Fc區(qū)的蛋白質已發(fā)現(xiàn)顯示出比未融合的相應物實質更長的體內半衰期。而且，融合到Fc區(qū)允許分子二聚和/或多聚合，這對于某些分子的生物活性是有用的。
側翼序列可以是同源的(即，來自與宿主細胞相同的物種和/或菌株)，異源的(即，來自宿主細胞物種或菌株以外的物種)，雜交體(即，來自一個以上來源的側翼序列的組合物)，合成的，或者它可以是天然CRP1或B7RP1核酸側翼序列。如此，側翼序列的來源可以是任何單細胞的原核或真核生物、任何有脊椎或無脊椎生物、或者任何植物，條件是該側翼序列在宿主細胞機構中是功能性的，并且可以被其激活。
用于本發(fā)明載體中的側翼序列可以通過本領域中公知的若干方法中的任何一種得到。一般，在此處有用的、除了CRP1或B7RP1核酸側翼序列以外的側翼序列將通過作圖和/或通過限制內切酶消化事先鑒別出來，并且因此可從適當?shù)慕M織來源使用合適的限制內切酶分離出來。在有些情況下，側翼序列的全核苷酸序列可以是已知的。此時，該側翼序列可以使用上面所描述的核酸合成或克隆方法進行合成。
若側翼序列的所有或只有一部分是已知的，它可以使用PCR和/或通過篩選帶有來自相同或其他物種的合適的寡核苷酸和/或側翼序列片段的基因組文庫而得到。
若側翼序列是未知的，含有側翼序列的DNA片段可以從可能含有例如編碼序列或者甚至是另一種或另一些基因的大量DNA中分離。分離可以通過限制內切酶消化使用一種或多種仔細選擇的酶來分離適當?shù)腄NA片段而完成。消化后，所需片段可以通過瓊脂糖凝膠純化、Qiagen柱或熟練技術人員已知的其他方法進行分離。用于實現(xiàn)此目的的合適的酶的選擇對于本領域普通技術人員將是顯而易見的。
復制元件起點一般是商業(yè)上購得的原核表達載體的一部分，并且有助于宿主細胞中載體的擴增。在有些情況下，載體擴增到一定的拷貝數(shù)對于CRP1或B7RP1多肽的最佳表達是重要的。如果選定的載體不含復制起點，可以在已知序列的基礎上化學合成一個，并將其連接到載體中。
轉錄終止元件一般位于CRP1或B7RP1多肽編碼序列的3′端，并起終止CRP1或B7RP1多肽轉錄的作用。通常，原核細胞中的轉錄終止元件是接著多T序列的富含G-C的片段。雖然該元件容易從文庫中克隆或者甚至作為部分載體從商業(yè)上購得，但它也可使用核酸合成方法諸如上面描述的那些容易地合成。
選擇性標記基因元件編碼在選擇培養(yǎng)基中生長的宿主細胞的存活和生長所必需的蛋白質。一般選擇標記基因編碼這樣的蛋白質(a)為原核宿主細胞提供對抗生素或其他毒素例如氨芐青霉素、四環(huán)素或卡那霉素等的抗性的，(b)補充細胞的營養(yǎng)缺陷的；或者(c)提供不能從復合培養(yǎng)基中獲得的必要營養(yǎng)素的。優(yōu)選的選擇性標記是卡那霉素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因和四環(huán)素抗性基因。
核糖體結合元件，常叫做SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)，通常是mRNA的翻譯起始所必需的。該元件一般位于啟動子的3′和要合成的CRP1或B7RP1多肽的編碼序列的5′端。SD序列是不同的，但一般是多嘌呤(即，具有高A-G含量)。已經(jīng)鑒別出許多SD序列，每個都可使用上面列出的和在原核載體中使用的方法容易地合成。
在希望從宿主細胞分泌CRP1或B7RP1多肽的情況下，可以用信號序列指導多肽從宿主細胞的輸出。CRP1或B7RP1跨膜結構域也通過突變或缺失而滅活，以防止對宿主膜的附著。一般說來，信號序列位于CRP1或B7RP1基因或cDNA的編碼區(qū)，或正好位于CRP1或B7RP1基因編碼區(qū)的5′端。已鑒別出許多信號序列，它們中在選定的宿主細胞中具功能性的任何一個可以用于結合CRP1或B7RP1基因或cDNA。因此，信號序列可以是與CRP1或B7RP1基因或cDNA同源或異源的，并且可以是與CRP1或B7RP1多肽基因或cDNA同源或異源的。此外，信號序列可以使用上面描述的方法化學合成。
在大多數(shù)情況下，多肽經(jīng)由信號肽的存在從宿主細胞分泌將導致氨基端甲硫氨酸從該多肽去除。
在許多情況下，CRP1或B7RP1基因或cDNA的轉錄通過載體中一個或多個內含子的存在而增加；當CRP1或B7RP1多肽在真核宿主細胞、特別是哺乳動物宿主細胞中產(chǎn)生時尤其是這樣。所用的內含子可以是天然產(chǎn)生于CRP1或B7RP1基因中的，尤其當所用的基因是全長基因組序列或其片段時。若內含子不是天然產(chǎn)生于基因中的(就大多數(shù)cDNA來說)，則內含子可以從另外的來源得到。內含子關于5′側翼序列和CRP1或B7RP1基因的位置通常是重要的，因此內含子必須被有效地轉錄。如此，當插入表達載體中的CRP1或B7RP1基因是cDNA分子時，內含子的優(yōu)選位置是轉錄起始部位的3′端和聚腺苷酸轉錄終止序列的5′端。最好內含子將位于cDNA的一側或另一側(即，5′或3′)，以便它不會中斷此編碼序列。來自任何來源包括任何病毒、原核生物和真核生物(植物或動物)的任何內含子都可用于實施本發(fā)明，只要其與要插入的宿主細胞相容。此處還包括合成內含子。可選地，載體中可以使用一個以上內含子。
當要使用的載體中不存在上面列出的一個或多個元件時，可以單獨得到它們并連接到載體中。用于得到每個元件的方法是熟練技術人員熟知的。
優(yōu)選的用于實施本發(fā)明的載體是與細菌、昆蟲和哺乳動物宿主細胞相容的那些。這類載體包括，特別是pCRII、pCR3和pcDNA3.1(InvitrogenCompany，San Diego，CA)，pBSII(Stratagene Company，La Jolla，CA)，pET15b(Novagen，Madison，WI)，pGEX(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)，pEGFP-N2(Clontech，Palo Alto，CA)，pETL(BlueBacII；Invitrogen)，和pFastBacDual(Gibco/BRL，Grand Island，NY)。
當載體已構建成且編碼全長或截短的CRP1或B7RP1多肽的核酸分子已插入到該載體的適當部位后，完成的載體可以插入到合適的宿主細胞中用于擴增和/或多肽表達。
宿主細胞可以是原核宿主細胞(諸如大腸桿菌)或者是真核宿主細胞(諸如酵母細胞、昆蟲細胞或脊椎動物細胞)。宿主細胞當在合適的條件下培養(yǎng)時可以合成CRP1或B7RP1多肽，它們隨后可從培養(yǎng)基中收集(如果宿主細胞將它們分泌到培養(yǎng)基中)，或者直接從生成它們的宿主細胞收集(如果它們未被分泌)。收集后，CRP1或B7RP1多肽可以使用諸如分子篩色譜法、親和色譜法等方法純化。
用于CRP1或B7RP1多肽生產(chǎn)的合適的宿主細胞的選擇將取決于多種因素，諸如所需的表達水平，活性所需的多肽修飾諸如糖基化或磷酸化，或容易折疊到生物活性分子中。
合適的細胞或細胞系可以是哺乳動物細胞，諸如中國倉鼠卵巢細胞(CHO)、人胚胎腎(HEK)293或293T細胞、或3T3細胞。合適的哺乳動物宿主細胞和轉化、培養(yǎng)、擴增、篩選以及產(chǎn)物生成和純化的方法的選擇是本領域中已知的。其他合適的哺乳動物細胞系是猴COS-1和COS-7細胞系，以及CV-1細胞系。其他例舉性的哺乳動物宿主細胞包括靈長目動物細胞系和嚙齒動物細胞系，包括轉化細胞系。正常的二倍體細胞、從原始組織的體外培養(yǎng)得到的細胞株、以及初級外植體也是合適的。候選細胞可以是選擇基因基因型缺損的，或者可以含有顯性開放選擇基因。其他合適的哺乳動物細胞系包括但不限于小鼠成神經(jīng)細胞瘤N2A細胞，HeLa，小鼠L-929細胞，來自瑞士Balb-c或NIH小鼠的3T3細胞系，BHK或HaK倉鼠細胞系。
類似地用作宿主細胞的是細菌細胞。例如，大腸桿菌的不同菌株(例如HB101，DH5a，DH10和MC1061)在生物技術領域中是眾所周知的宿主細胞?？莶菅堪麠U菌、假單胞桿菌、其他芽胞桿菌、鏈霉菌等的不同菌株也可以用于此方法。
本領域技術人員已知的許多酵母細胞株也可以作為宿主細胞用于本發(fā)明多肽的表達。
另外，需要時，在本發(fā)明方法中可以利用昆蟲細胞系統(tǒng)。這類系統(tǒng)記載于例如Kitts等(Biotechniques(生物技術)14810-817(1993))，Lucklow(Curr.Opin.Biotechnol.，4564-572(1993))和Lucklow等(J.Virol.(病毒學雜志)674566-4579(1993))。優(yōu)選的昆蟲細胞是Sf-9和Hi5(Invitrogen，Carlsbad，CA)。
表達載體“轉化”或“轉染”到選定的宿主細胞中可以使用象氯化鈣、電穿孔、微注射、脂質轉染或DEAE-葡聚糖法等這樣的方法完成。所選的方法將部分是要使用的宿主細胞類型的函數(shù)。這些方法以及其他合適的方法是熟練技術人員熟知的，并且記載于例如Sambrook等(同上)中。
用表達載體轉化或轉染的宿主細胞可以使用熟練技術人員熟知的標準培養(yǎng)基培養(yǎng)。培養(yǎng)基通常將含有細胞生長和存活所必需的所有營養(yǎng)素。合適的用于培養(yǎng)大腸桿菌細胞的培養(yǎng)基是例如Luria肉湯(LB)和/或Terrific肉湯(TB)。合適的用于培養(yǎng)真核細胞的培養(yǎng)基是RPMI 1640，MEM，DMEM，它們所有都可以根據(jù)所培養(yǎng)的特定細胞系的需要添加血清和/或生長因子。合適的用于昆蟲培養(yǎng)的培養(yǎng)基是根據(jù)需要添加了yeastolate、水解乳白蛋白和/或胎牛血清的Grace培養(yǎng)基。
通常，只用于轉化細胞的選擇性生長的抗生素或其他化合物作為補充物加入培養(yǎng)基中。要使用的化合物將取決于轉化宿主細胞的質粒上存在的選擇性標記元件。例如，若選擇性標記元件是卡那霉素抗性的，則加入到培養(yǎng)基中的化合物將是卡那霉素。
宿主細胞中產(chǎn)生的CRP1或B7RP1多肽的量可以使用本領域中已知的標準方法來評估。這類方法包括但不限于蛋白質印跡分析，SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，非變性凝膠電泳，HPLC分離，免疫沉淀，和/或活性分析諸如DNA結合凝膠移動試驗。
如果CRP1或B7RP1多肽已計劃從宿主細胞分泌，則大多數(shù)多肽可以在細胞培養(yǎng)基中找到。以這種方式制備的多肽一般將不具有氨基端甲硫氨酸，因為它在從細胞分泌的過程中被除去了。不過，如果CRP1或B7RP1多肽沒有從宿主細胞分泌，它將存在于細胞質和/或核中(對于真核宿主細胞)或存在于胞質溶膠中(對于革蘭氏陰性菌宿主細胞)，并且可以有氨基端甲硫氨酸。
CRP1或B7RP1多肽從溶液的純化可以使用各種技術完成。如果多肽已被合成使得它含有位于其羧基端或氨基端的尾端諸如六組氨酸(CRP1或B7RP1/hexaHis)或其他小肽諸如FLAG(Eastman Kodak Co.，New Haven，CT)或myc(Invitrogen，Carlsbad，CA)，則它基本上可以通過使加尾的多肽通過親和柱而以一步操作純化，其中柱基質對尾端或直接對該多肽具有高親和力(即，特異性識別CRP1或B7RP1多肽的單克隆抗體)。例如，聚組氨酸結合對鎳的主要親和力和特異性，因此鎳的親和柱(諸如Qiagen鎳柱)可以用于CRP1或B7RP1/polyHis的純化(參見例如，Ausubel等編寫的《分子生物學中的流行方案》第10.11.8節(jié)，John Wiley&Sons，New York(1993))。
當制備的CRP1或B7RP1多肽沒有尾端附著時，且沒有可利用的抗體時，可以使用其他眾所周知的純化方法。這類方法包括但不限于離子交換色譜法，分子篩色譜法，HPLC，非變性凝膠電泳結合凝膠洗脫，和制備等電聚焦(“Isoprime”機器/技術，Hoefer Scientific)。在有些情況下，可以結合使用這些技術中的兩種或多種來提高純度。
如果預期CRP1或B7RP1多肽將主要在細胞內發(fā)現(xiàn)，則胞內物質(包括革蘭氏陰性菌的包涵體)可以使用熟練技術人員已知的任何標準技術從宿主細胞中提取出來。例如，宿主細胞可以通過弗氏壓碎器、勻化和/或超聲處理后離心而裂解，以釋放出周質/細胞質的內含物。
如果CRP1或B7RP1多肽已在胞質溶膠中形成包涵體，則該包涵體經(jīng)?？山Y合到內和/或外細胞膜上并由此在離心后將主要在顆粒物質中發(fā)現(xiàn)。該顆粒物質然后可在pH極值下處理或在還原劑諸如二硫蘇糖醇的存在下在堿性pH下或在三羧乙基膦的存在下在酸性pH下用離液劑諸如去污劑、胍、胍衍生物、脲或脲衍生物處理，以釋放、破碎和溶解包涵體。現(xiàn)在為可溶形式的多肽然后可使用凝膠電泳、免疫沉淀等進行分析。如果希望分離CRP1或B7RP1多肽，分離可以使用標準方法完成，諸如下面列出的那些和記載于Marston等(Meth.Enz.(酶學方法學)182264-275(1990))中的。在有些情況下，CRP1或B7RP1多肽分離后可能不是生物活性的。用于將多肽“重折疊”或轉變?yōu)槠淙壗Y構并生成二硫鍵的各種方法可以用于還原生物活性。這類方法包括使溶解多肽在特定濃度的適宜離液劑的存在下與pH通常在7以上的溶液接觸。在大多數(shù)情況下，重折疊/氧化溶液還將含有還原劑或特定比例的還原劑和相應的氧化形式，以產(chǎn)生特定的氧化還原電位，使得在蛋白質的半胱氨酸橋的形成中發(fā)生二硫化物穿梭。一些常用的氧化還原對包括半胱氨酸/胱胺，谷胱甘肽(GSH)/二硫基雙GSH，氯化銅，二硫蘇糖醇(DTT)/二噻烷DTT，2-巰基乙醇(bME)/二硫-b(ME)。在許多情況下，需要共溶劑來增加重折疊的效率，用于此目的的更多普通試劑包括甘油、不同分子量的聚乙二醇、和精氨酸。
CRP1或B7RP1多肽、其片段和/或衍生物也可以通過化學合成法(諸如固相肽合成)制備，可使用本領域中已知的技術諸如下列文獻中記載的那些Merrifield等(J.Am.Chem.Soc.(美國化學會會志)852149(1963))，Houghten等，(Proc Natl Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)825132(1985))和Stewart & Young(Solid Phase PeptideSynthesis(固相肽合成)，Pierce Chemical Co.，Rockford，IL(1984))。合成的這些多肽的氨基端上可以有或沒有甲硫氨酸。化學合成的CRP1或B7RP1多肽或片段可以使用這些參考文獻中記載的方法進行氧化，以形成二硫鍵。CRP1或B7RP1多肽或片段預期具有可比得上重組產(chǎn)生的或從天然來源純化的CRP1或B7RP1多肽的生物活性，并因此可以與重組或天然CRP1或B7RP1多肽互換使用。
多肽術語“CRP1或B7RP1多肽”指的是具有圖1A(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)所示的氨基酸序列的多肽以及本文中描述的所有相關多肽。相關多肽包括等位變體、剪接變體、片段、衍生物、置換、缺失和插入變體、融合多肽、和直向同源物。這些相關多肽可以是成熟多肽，即，缺乏信號肽的多肽。CRP1或B7RP1多肽可以有或沒有氨基端甲硫氨酸，這取決于它們的制備方式。
術語“CRP1或B7RP1多肽片段”指的是小于圖1A(SEQ ID NO2)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽的全長氨基酸序列的肽或多肽。這樣的片段可以來自于在氨基端的截短、在羧基端的截短和/或多肽序列內部的缺失。制備的這種CRP1或B7RP1多肽片段可以有或沒有氨基端甲硫氨酸。此外，CRP1或B7RP1多肽片段可以是天然產(chǎn)剪接變體、其他剪接變體和由天然產(chǎn)體內蛋白酶活性產(chǎn)生的片段。優(yōu)選的CRP1或B7RP1多肽片段包括可溶形式的CRP1或B7RP1，其缺乏功能性跨膜結構域并包含CRP1或B7RP1的部分或全部胞外域。
術語“CRP1或B7RP1多肽變體”指的是其氨基酸序列與圖1A(SEQID NO2)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)中列出的CRP1或B7RP1多肽氨基酸序列相比含有一個或多個氨基酸序列置換、缺失和/或增加的CRP1或B7RP1多肽。這些CRP1或B7RP1多肽變體可以從相應的CRP1和B7RP1多肽核酸分子變體制備，它們具有因此與CRP1或B7RP1多肽的DNA序列不同的DNA序列。
本文中所用的術語“CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是已通過例如加入一個或多個水溶性聚合物、N-聯(lián)或O-聯(lián)糖類、糖、磷酸酯和/或其他這類分子進行了化學修飾的CRP1或B7RP1多肽、其變體或片段，其中這些分子不是天然附著到野生型CRP1或B7RP1多肽的。衍生物還包括天然附著到CRP1或B7RP1多肽的一個或多個化學基團的缺失。
本文中所用的術語“生物活性CRP1或B7RP1多肽”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽片段”、“生物活性CRP1或B7RP1多肽變體”和“生物活性CRP1或B7RP1多肽衍生物”指的是具有至少一個CRP1或B7RP1的活性特征的CRP1或B7RP1多肽。一個活性是B7RP1對CRP1的結合。另一個活性是CRP1或B7RP1刺激T細胞增殖和/或活化的能力。
術語“直向同源物”指的是與從某物種鑒別的多肽相對應的多肽。例如，小鼠和人B7RP1多肽被認為是直向同源物。
術語“成熟氨基酸序列”指的是缺乏前導序列的多肽。
術語“分離多肽”是指在其天然環(huán)境中沒有發(fā)現(xiàn)至少一個污染多肽的多肽，且最好基本上沒有任何其他污染哺乳動物多肽。
如本領域中公知的，術語“相同”是兩個或多個核酸分子或兩個或多個多肽的序列之間的關系，是通過對比序列確定的。在本領域中，“相同”也意味著多肽或核酸分子序列之間的序列相關性程度，根據(jù)具體情況，通過核苷酸或氨基酸序列串之間的比較確定。“相同”測量的是兩個或多個序列之間同一匹配的百分數(shù)，通過特定計算機程序(即“算法”)進行間隙序列對比。
術語“相似性”是指相關概念，但與“相同”形成對照，相似性的量度包括相同匹配和保守置換匹配。由于保守置換應用于多肽而不用于核酸分子，因此相似性只涉及多肽序列對比。如果兩個多肽序列有例如10/20相同的氨基酸，且剩余部分全是非保守置換，則相同百分數(shù)和相似性百分數(shù)都將是50％。如果在相同的例子中，有5個以上的位置有保守置換，則相同百分數(shù)仍然是50％，但相似性百分數(shù)將是75％(15/20)。因此，在有保守置換的情況下，兩個多肽序列之間的相似性程度將高于這兩個序列之間的相同百分數(shù)?！氨Ｊ亍卑被岽嫖镌谙挛闹袇⒄毡鞩進行描述。在表I的基礎上，保守氨基酸代替物是從相同組中選擇的替換氨基酸，例如，堿性、酸性、無荷極性和非極性組。例如，精氨酸的保守氨基酸代替物將是賴氨酸和組氨酸。
相同和相似性可以利用已知方法容易地計算出，包括但不限于下列文獻中描述的那些Computational Molecular Biology(計算分子生物學)，Lesk，A.M.編輯，Oxford University Press，New York，1988；BiocomputingInformatics and Genome Projects(生物計算信息學和基因組測序計劃)，Smith，D.W.編輯，Academic Press，New York，1993；Computer Analysis of Sequence Data(序列數(shù)據(jù)的計算機分析)，第1部分，Griffin，A.M.和Griffin，H.G.編輯，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology(分子生物學中的序列分析)，vonHeinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer(序列分析引物)，Gribskov，M.和Devereux，J.編輯，M.Stockton Press，New York，1991；以及Carillo，H.和Lipman，D.，SIAMJ.Applied Math.(SIAM應用數(shù)學雜志)481073(1988)。
優(yōu)選的測定相同和/或相似性的方法是計劃給出所檢驗序列之間的最大匹配。將測定相同和相似性的方法編纂成公眾可獲得的計算機程序。優(yōu)選的用于測定兩個序列之間的相同和相似性的計算機程序方法包括但不限于GCG程序包，包括GAP(Devereux，J.等，Nucleic AcidsResearch(核酸研究)12(1)387(1984)；Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，BLASTP，BLASTN和FASTA(Atschul，S.F.等，J.Molec.Biol(分子生物學雜志)215403-410(1990).BLAST X程序是公眾可從國家生物技術信息中心(NCBI)和其他來源獲得的(BLAST手冊，Altschul，S.等，NCB NLM NIH Bethesda，MD 20894；Altschul，S.等，J.Mol.Biol(分子生物學雜志)215403-410(1990)。眾所周知的Smith Waterman算法也可以用于測定相同性。
作為實例，使用計算機算法GAP(Genetics Computer Group，University of Wisconsin，Madison，WI)，將要測定序列相同百分數(shù)的兩個多肽進行排列，使它們各自的氨基酸最佳匹配(“配對廣度”，利用算法測定)。將裂隙缺口損失(計算為3X平均對角線；“平均對角線”是所使用的對比矩陣的對角線的平均數(shù)；“對角線”是通過特定對比矩陣賦予每個完美氨基酸配對的得分或數(shù)值)和裂隙伸展損失(通常是裂隙缺口損失的1/10倍)，以及對比矩陣諸如PAM 250或BLOSUM 62與算法聯(lián)合使用。標準對比矩陣(關于PAM250對比矩陣，參見Dayhoff等，載于蛋白質序列和結構圖譜，第5卷，附錄3(1978)；關于BLOSUM 62對比矩陣，參見Henikoff等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(美國國家科學院院報)8910915-10919(1992))也由算法使用。
優(yōu)選的用于多肽序列對比的參數(shù)包括以下這些算法Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)48443-453(1970)對比矩陣BLOSUM 62，來自Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)8910915-10919(1992)裂隙損失12裂隙長度損失4相似性閾值0GAP程序與上述參數(shù)一起使用。上述參數(shù)是使用GAP算法進行多肽對比的默認參數(shù)(再加上末端裂隙沒有損失)。
優(yōu)選的用于核酸分子序列對比的參數(shù)包括以下這些算法Needleman和Wunsch，J.Mol Biol.(分子生物學雜志)48443-453(1970)對比矩陣匹配＝+10，不匹配＝0裂隙損失50裂隙長度損失3GAP程序也與上述參數(shù)一起使用。上述參數(shù)是用于核酸分子對比的默認參數(shù)。
本領域技術人員也可以使用其他例舉性的算法、裂隙缺口損失、裂隙伸展損失、對比矩陣、相似性閾值等，包括Program Manual(程序手冊)，Wisconsin Package，第9版，1997年9月中列出的那些。要作出的特定選擇將取決于要進行的具體對比，諸如DNA與DNA、蛋白質與蛋白質、蛋白質與DNA；以及此外，該對比是否是序列對之間的(在這種情況下GAP或BestFit一般是優(yōu)選的)或者是一個序列與一個大序列資料庫之間的(在這種情況下FASTA或BLASTA是優(yōu)選的)。
至少約70％相同的多肽與野生型CRP1或B7RP1多肽相比一般將有一個或多個氨基酸置換、缺失和/或增加。在優(yōu)選實施方案中，多肽將與CRP1或B7RP1多肽有約75％、80％、85％、90％或95％相同。通常，天然殘基的代替物將是丙氨酸或保守氨基酸，以便對該多肽的總凈電荷、極性或疏水性影響較小或沒有影響。保守代替物列在下表I中。
表I保守氨基酸代替物堿性精氨酸賴氨酸組氨酸酸性谷氨酸天門冬氨酸無荷極性谷氨酰胺天門冬酰胺絲氨酸蘇氨酸酪氨酸非極性 苯丙氨酸色氨酸半胱氨酸甘氨酸丙氨酸纈氨酸脯氨酸甲硫氨酸亮氨酸正亮氨酸異亮氨酸本發(fā)明提供了CRP1或B7RP1多肽衍生物。在一個實施方案中，其中CRP1或B7RP1多肽與聚合物相連的化學修飾的CRP1或B7RP1多肽組合物包括在本發(fā)明的范圍內。所選的聚合物一般是水溶性的，以便其附著的蛋白質不會在含水環(huán)境諸如生理環(huán)境中沉淀。所選聚合物通常經(jīng)修飾具有單一活性基，諸如用于酰化的活性酯或用于烷基化的醛，以便聚合程度在本發(fā)明方法中可以加以控制。聚合物可以是任何分子量的，并且可以是支鏈或無支鏈的。本發(fā)明范圍內包括聚合物的混合物。優(yōu)選地，為了最終產(chǎn)物制劑的治療應用，聚合物將是藥學上可接受的。
水溶性聚合物或其混合物可以從下列成員中選擇，例如聚乙二醇(PEG)，一甲氧基-聚乙二醇，葡聚糖，纖維素，或其他糖基聚合物，聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇，丙二醇均聚物，聚環(huán)氧丙烷/環(huán)氧乙烷共聚物，聚氧乙基化多元醇(例如甘油)和聚乙烯醇。
對于?；磻x聚合物應當具有單一活性酯基。對于還原烷基化，所選聚合物應當具有單一活性醛基。優(yōu)選的活性醛是聚乙二醇丙醛，它是水穩(wěn)定的，或者是其一C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(參見美國專利No.5,252,714)。
CRP1或B7RP1多肽的聚乙二醇化(pegylation)可以利用本領域中已知的任何一種聚乙二醇化反應進行，例如在下列參考文獻中描述的那些Focus on Growth Factors(生長因子聚焦)34-10(1992)；EP0154316；和EP0401384。優(yōu)選地，聚乙二醇化經(jīng)由與如下所述的活性聚乙二醇分子(或類似活性水溶性聚合物)的?；磻蛲榛磻M行。
特別優(yōu)選用于此處的水溶性聚合物是聚乙二醇，簡寫為PEG。如本文中所用，聚乙二醇的意思包括已用于衍生其他蛋白質的任何形式的PEG，諸如一(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。
一般說來，化學衍生化可以在用于使生物活性物質與活性聚合物分子反應的任何適宜條件下進行。制備聚乙二醇化CRP1和B7RP1多肽的方法通常將包括以下步驟(a)、讓多肽與聚乙二醇(諸如PEG的活性酯或醛衍生物)在使CRP1或B7RP1多肽附著上一個或多個PEG基的條件下進行反應，和(b)、得到反應產(chǎn)物。一般，用于?；磻淖罴逊磻獥l件將在已知參數(shù)和所需結果的基礎上決定。例如，PEG蛋白質的比值越大，聚乙二醇化產(chǎn)物的百分數(shù)就越大。
通常，可以通過給藥CRP1或B7RP1聚合物綴合物得到減輕或調制的病況包括本文中有關非綴合CRP1或B7RP1多肽描述的那些。但是，此處公開的綴合物與非衍生分子相比可以有另外的活性、生物活性增強或降低、或其他特性諸如半衰期增加或減小。
CRP1或B7RP1多肽、片段、變體、和衍生物可以單獨使用、一起使用或者與其他藥物組合物聯(lián)合使用。如果對所治療的適應癥合適，CRP1或B7RP1多肽、片段、變體和衍生物可以與細胞因子、生長因子、抗生素、抗炎藥和/或化療劑聯(lián)合用藥。
本發(fā)明提供了CRP1或B7RP1的選擇結合劑。選擇結合劑是指對CRP1或B7RP1具有特異性的分子，可包括蛋白質、肽、核酸、糖類、脂質或小分子量化合物。選擇結合劑與CRP1或B7RP1相互作用并依次調節(jié)CRP1與B7RP1的結合。在一個實施方案中，選擇結合劑部分或完全阻斷CRP1對B7RP1的結合并部分或完全抑制CRP-1或B7RP-1的至少一個生物活性，諸如免疫共同刺激活性。在另一個實施方案中，選擇結合劑是抗體。該抗體可以是具有與CRP1或B7RP1的免疫反應性的，并優(yōu)選具有與B7RP1的免疫反應性。在本發(fā)明的又一個實施方案中，與B7RP1反應的抗體結合到B7RP1上的表位上，使得與CRP1的結合被部分或完全阻斷，且B7RP1的至少一個生物活性諸如免疫共同刺激活性被部分或完全抑制。術語完全抑制意味著沒有出現(xiàn)進一步的抑制增加。
CRP1或B7RP1多肽、片段、變體和/或衍生物可以使用本領域中的已知方法用于制備抗體。因此，與CRP1或B7RP1多肽反應的抗體以及這類抗體的活性片段也包括在本發(fā)明的范圍內。抗體可以是多克隆的、單克隆的、重組的、嵌合的、單鏈和/或雙特異性的。一般，抗體或其片段將是人類來源的，或者將是“人源化”的，即，對其進行制備使對患者給藥時防止或最小化對抗體的免疫反應。抗體片段可以是與本發(fā)明的CRP1和B7RP1多肽反應的任何片段，諸如Fab、Fab’，等。本發(fā)明還提供了雜交瘤，它是通過下列步驟產(chǎn)生的將任何CRP1或B7RP1多肽或其片段作為抗原呈遞給選出的哺乳動物，接著將該哺乳動物的細胞(例如脾細胞)與某種癌細胞融合，以通過已知技術制造無限增殖化細胞系。用于產(chǎn)生這類細胞系和指向本發(fā)明的人CRP1或B7RP1多肽的所有或部分的抗體的方法也包括在本發(fā)明內。
本發(fā)明的單克隆抗體包括“嵌合”抗體，其中一部分重鏈和/或輕鏈與從特定物種得到的或屬于特定抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或類似，而該鏈的剩余部分與從另一個物種得到的或屬于另一個抗體類或亞類的抗體中的相應序列相同或類似，以及這類抗體的片段，只要它們顯示出所需的生物活性(美國專利No.4,816,567；Morrison等，Proc.Natl.Acad.Sci.(國家科學院院報)81，6851-6855(1985))。
在一個優(yōu)選的實施方案中，嵌合抗-CRP1或B7RP1抗體是“人源化”抗體。用于人源化非人抗體的方法是本領域中眾所周知的。通常，人源化抗體具有一個或多個從非人來源引入其中的氨基酸殘基。人源化可以按照本領域中的已知方法(Jones等，Nature(自然)321，522-525(1986)；Riechmann等，Nature(自然)332，323-327(1988)；Verhoeyen等，Science(科學)239，1534-1536(1988))，通過用人抗體的相應區(qū)取代嚙齒動物的互補性決定區(qū)(CDRs)來完成。
本發(fā)明也包括完全人抗-CRP1或抗-B7RP1抗體。這類抗體可以通過免疫接種能在沒有內源性免疫球蛋白產(chǎn)生的條件下產(chǎn)生人抗體的所有組成成分的轉基因動物(例如小鼠)的CRP1或B7RP1抗原而生成。參見，例如Jakobovits等，Proc.Natl.Acad.Sci.(國家科學院院報)90，2551-2555(1993)；Jakobovits等，Nature(自然)362，255-258(1993)。人抗體也可以在噬菌體展示文庫中產(chǎn)生(Hoogenboom等，J.Mol.Biol.(分子生物學雜志)227，381(1991)；Marks等，J.Mol.Biol.222，581(1991)。
本發(fā)明的選擇結合劑可以用于調節(jié)CRP1對B7RP1的結合，并調節(jié)由CRP1和B7RP1介導的至少一種生物活性諸如免疫共同刺激。這類選擇結合劑的例子是與CRP1或B7RP1有免疫反應性的抗體。這些抗體可以用于醫(yī)療，諸如用于抑制CRP1和B7RP1多肽對其結合配偶體的結合。這些抗體還可用于體內和體外診斷目的，諸如以標記形式用于檢測體液或細胞樣本中CRP1和B7RP1多肽的存在。
藥物組合物和給藥本發(fā)明的范圍內包括CRP1或B7RP1多肽的藥物組合物。這類組合物可包含與藥學上可接受的載體混合的治療有效量的多肽或片段、變體或衍生物。在優(yōu)選的實施方案中，藥物組合物包含可溶形式的CRP1或B7RP1多肽，它們包括CRP1或B7RP1的部分或全部胞外域。一般說來，CRP1和B7RP1多肽治療化合物將以包含純多肽、片段、變體或衍生物連同一種或多種生理上可接受的載體、賦形劑或稀釋劑的組合物形式給藥。載體物質可以是注射用水，優(yōu)選添加對哺乳動物給藥的溶液中常用的其他物質。中性緩沖鹽水或與血清白蛋白混合的鹽水是例舉性的適宜載體。優(yōu)選地，使用合適的賦形劑(例如蔗糖)將產(chǎn)物配制成凍干物。根據(jù)需要也可包括其他標準載體、稀釋劑和賦形劑。其他例舉性組合物包含約pH7.0-8.5的Tris緩沖劑，或約pH4.0-5.5的乙酸鹽緩沖劑，它們還可包括山梨糖醇或其合適的取代物。
CRP1或B7RP1藥物組合物可以腸胃外給藥。另一方面，該組合物可以靜脈注射或皮下注射給藥。當系統(tǒng)給藥時，用于本發(fā)明的治療組合物可以是無熱原的、胃腸外可接受的水溶液形式。這類藥學上可接受的蛋白質溶液制劑，適當?shù)乜紤]到pH、等滲性、穩(wěn)定性等等，在本領域的技術范圍內。
用于實施本發(fā)明的CRP1和B7RP1多肽組合物的治療制劑可以通過將具有所需純度的選定組合物與可選的生理上可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑(Remington藥物科學，第18版，A.R.Gennaro編輯，MackPublishing Company(1990))混合制備成凍干藥餅或水溶液形式儲存?zhèn)溆?。可接受的載體、賦形劑或穩(wěn)定劑對接受者來說是無毒的，優(yōu)選在所用的劑量和濃度下是惰性的，并且包括緩沖劑諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽或其他有機酸；抗氧劑諸如抗壞血酸；低分子量多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水聚合物諸如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸諸如甘氨酸、谷氨酰胺、天門冬酰胺、精氨酸或賴氨酸；單糖、二糖和其他糖類，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑諸如EDTA；糖醇諸如甘露糖醇或山梨糖醇；成鹽抗衡離子諸如鈉；和/或非離子表面活性劑諸如吐溫、pluronics或聚乙二醇(PEG)。
要用于醫(yī)療的CRP1或B7RP1多肽組合物的有效量將取決于例如治療目的，諸如使用CRP1和B7RP1多肽所針對的適應癥，給藥途徑，和患者的病情。因此，對于治療學家來說將需要根據(jù)需要來調整劑量和變更給藥途徑，以獲得最佳治療效果。典型的每日劑量范圍可以是從約0.1μg/kg至最多100mg/kg或更高，這取決于上面提到的各種因素。一般，臨床醫(yī)師將給藥該組合物直至達到了所需效果時的劑量。因此組合物可以作為單劑給藥，或者作為兩劑或多劑(可以含有或不含相同量的CRP1或B7RP1多肽)在一定時間內給藥，或者作為連續(xù)輸液劑經(jīng)植入裝置或導管給藥。
進行了進一步的研究后，將形成關于治療不同患者的不同病情時的適宜劑量水平的信息，并且普通技術人員在考慮了治療內容、所治療的疾病類型、受治療者的年齡和健康狀況后將能夠確定合適的給藥劑量。
要用于體內給藥的CRP1或B7RP1多肽組合物必須是無菌的。通過無菌濾膜過濾就可容易地實現(xiàn)這一點。當組合物被冷凍干燥時，使用這些方法滅菌即可以在冷凍干燥和重新構成之前進行，也可以在之后進行。用于腸胃外給藥的組合物一般將以凍干形式或溶液形式儲存。
治療組合物一般放置到具有無菌進入孔的容器中，例如，靜脈內溶液袋或帶有可通過皮下注射針刺入的塞子的小瓶。
組合物的給藥途徑符合已知方法，例如口服、注射或靜脈滴注、腹膜內注射、大腦內(實質內)注射、腦室內注射、肌內注射、眼內給藥、動脈內給藥或損害內給藥途徑，或者通過緩釋系統(tǒng)或可以可選地涉及使用導管的植入裝置給藥。需要時，組合物可以通過輸液、濃注或通過植入裝置連續(xù)給藥。
另一方面或另外，組合物可以通過植入到膜、海綿、或CRP1和B7RP1多肽已被吸收到其上的其他適宜物質的受影響區(qū)域中而局部給藥。
當使用植入裝置時，該裝置可以植入到任何適宜的組織或器官中，CRP1或B7RP1多肽可以直接通過該裝置經(jīng)由藥團、或經(jīng)由連續(xù)給藥、或經(jīng)由導管利用連續(xù)輸液而釋放。CRP1或B7RP1多肽可以以緩釋制劑給藥。合適的緩釋制劑的例子包括成型顆粒形式的半透聚合物基質，例如薄膜或微膠囊。緩釋基質包括聚酯、水凝膠、聚交酯(U.S.3,773,919，EP 58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸脂的共聚物(Sidman等，Biopolymers(生物高分子)22547-556(1983))、聚(2-羥乙基-甲基丙烯酸酯)(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.，15167-277(1981)和Langer，Chem.Tech.，1298-105(1982))、乙烯基乙酸乙烯酯(Langer等，同上)或聚-D(-)-3-羥基丁酸(EP 133,988)。緩釋組合物還可包括脂質體，它可以用本領域中已知的若干方法中的任何一種方法制備(例如，Eppstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)823688-3692(1985)；EP 36,676；EP 88,046；EP 143,949)。
在有些情況下，希望以來自體內方式使用CRP1或B7RP1多肽組合物。此時，令已從患者體內取出的細胞、組織或器官接觸CRP1或B7RP1多肽組合物，之后再將該細胞、組織和/或器官植回到患者體內。
在另外一些情況下，CRP1或B7RP1多肽可以通過下列方法釋放向患者體內植入某些已使用諸如本文中描述的那些方法進行了基因工程改造的細胞，以表達和分泌多肽、片段、變體或衍生物。這類細胞可以是動物或人細胞，并且可以是從患者自己的組織或從另外的人或非人來源得到的?？蛇x地，這些細胞可以是無限增殖化的。但是，為了減少發(fā)生免疫反應的可能性，優(yōu)選將這些細胞包膠囊，以避免周圍組織的浸潤。膠囊化材料一般是生物相容的、半滲透性的聚合外殼或膜，以允許蛋白質產(chǎn)物釋放但阻止細胞通過患者的免疫系統(tǒng)或通過來自周圍組織的其他有害因素遭到破壞。
用于細胞的膜膠囊化的方法是熟練技術人員熟知的，且膠囊化細胞的制備和它們向患者體內的植入可以不經(jīng)不適當?shù)膶嶒灳涂赏瓿?，參見，例如美國專?,892,538；5,011,472和5,106,627。用于膠囊化活細胞的系統(tǒng)描述于PCT WO91/10425(Aebischer等)。用于配制各種其他緩釋或控釋裝置諸如脂質體載體、生物腐蝕顆?；蛑榱５募夹g也是本領域技術人員已知的，且描述于例如美國專利No.5,653,975。膠囊化或未膠囊化的細胞可以植入到患者的合適的身體組織或器官中。
如上所討論，希望用一個或多個CRP1或B7RP1多肽、變體、衍生物和/或片段處理細胞制劑。這可以通過使包括T細胞的細胞諸如骨髓細胞與多肽、變體、衍生物或片段直接接觸來完成，其中這些多肽、變體、衍生物或片段為可滲透細胞膜的形式。例如，包括T細胞的細胞可以與B7RP1多肽接觸以激活T細胞功能，并將如此處理過的細胞植入到患者體內。
另一方面，可以采用基因治療。其中可以應用基因治療的一種方式是使用可以是與組成型或誘導型啟動子可操作地相連的CRP1或B7RP1基因(編碼CRP1或B7RP1多肽的基因組DNA、cDNA和/或合成DNA，或其片段、變體或衍生物)來形成“基因治療DNA構成物”。啟動子可以是與內源CRP1或B7RP1基因同源或異源的，只要它在將要向其中插入構成物的細胞或組織類型中是活性的。該基因治療DNA構成物的其他組分可以根據(jù)需要可選地包括計劃用于位點特異性整合的DNA分子(例如用于同源重組的內源側翼序列)、組織特異性啟動子、增強子或沉默子、能給母細胞提供選擇性優(yōu)點的DNA分子、用作標記來鑒別轉化細胞的DNA分子、負選擇系統(tǒng)、細胞特異性結合劑(例如用于細胞導向的)、細胞特異性內化因子、和增強通過載體的表達的轉錄因子以及使得載體能夠制造的因子。
該基因治療DNA構成物然后可引入到患者的細胞中(來自體內或體內的)。用于引入基因治療DNA構成物的一種方法是通過病毒載體。通常在基因治療中用于釋放基因治療DNA構成物的合適的病毒載體包括但不限于腺病毒、腺伴隨病毒、單純性皰疹病毒、慢病毒、乳頭狀瘤病毒、和逆轉錄病毒載體。這些載體中的一些，諸如逆轉錄病毒載體，將把基因治療DNA構成物釋放到患者細胞的染色體DNA中，且該基因治療DNA構成物可以整合到該染色體DNA中；其他載體將起游離基因的作用，而該基因治療DNA構成物將保留在細胞質中。基因治療載體的使用描述于例如美國專利5,672,344、5,399,346。
不使用病毒載體而將基因治療DNA構成物釋放到患者細胞中的其他方法包括但不限于脂質體介導的轉移，裸DNA的直接注射，受體介導的轉移(配體-DNA復合物)，電穿孔，磷酸鈣沉淀，和微粒轟擊(例如“基因槍”)。參見美國專利4,970,154，WO96/40958，5,679,559，5,676,954和5,593,875。
另一種通過基因治療增加細胞中內源CRP1或B7RP1多肽表達的方法是將一個或多個增強子元件插入CRP1或B7RP1多肽啟動子，其中該增強子元件可以用于提高CRP1或B7RP1多肽基因的轉錄活性。所用的增強子元件將在希望激活其中的基因的組織基礎上挑選；將選擇已知能在該組織中激活啟動子的增強子元件。例如，如果要在T細胞中“打開”CRP1或B7RP1多肽，可以使用lck啟動子增強子元件。此時，要加入的轉錄元件的功能部分可以使用標準克隆技術插入到含有CRP1或B7RP1多肽啟動子(和可選的載體、5′和/或3′側翼序列等)的DNA片段中。此構成物，被認為是“同源重組構成物”，然后可來自體內或體內引入到所需細胞中。
基因治療可以用于通過修飾內源啟動子的核苷酸序列而減少CRP1或B7RP1多肽表達。這種修飾一般通過同源重組方法完成。例如，含有選定用于滅活的CRP1或B7RP1基因的全部或部分啟動子的DNA分子可以進行改造以除去和/或替換調節(jié)轉錄的啟動子片段。此時，啟動子的轉錄激活物的TATA框和/或結合位點可以使用標準分子生物學技術刪除；這種缺失可以抑制啟動子活性，由此抑制相應CRP1或B7RP1基因的轉錄。啟動子中TATA框或轉錄激活物結合位點的缺失可以通過生成包含CRP1或B7RP1多肽啟動子的所有或相關部分(來自與要調節(jié)的CRP1或B7RP1基因相同或相關的物種)的DNA構成物來完成，其中一個或多個TATA框和/或轉錄激活物結合位點核苷酸經(jīng)由置換、刪除和/或插入一個或多個核苷酸而變異，使得該TATA框和/或激活物結合位點活性降低或可能完全滅活。此構成物一般還將含有與已經(jīng)過修飾的啟動子節(jié)段的天然(內源)5′和3′側翼區(qū)相對應的至少約500個堿基的DNA，可以如上所述將它直接或經(jīng)由病毒載體引入到合適的細胞中(來自體內或體內地)。一般，構成物向細胞的基因組DNA中的整合將經(jīng)由同源重組，其中該啟動子構成物中的5′和3′側翼DNA序列可以用于幫助將修飾啟動子區(qū)通過雜交整合到內源染色體DNA中。
當希望抑制一個或多個CRP1或B7RP1多肽時也可以采用其他基因治療方法。例如，具有與選定CRP1或B7RP1多肽基因的至少一部分互補的序列的反義DNA或RNA分子可以引入細胞中。通常，每個這種反義分子將是與每個選定CRP1或B7RP1基因的起始點(5’端)互補的。當該反義分子然后雜交到相應的CRP1或B7RP1多肽mRNA中時，該mRNA的翻譯被阻止。
另一方面，基因治療可以用于制造一個或多個CRP1或B7RP1多肽的顯性失活抑制劑。在這種情況下，可以制備編碼每個選定CRP1或B7RP1多肽的突變全長或截短多肽的DNA并如上所述使用病毒或非病毒方法將其引入到患者的細胞中。每個這樣的突變體一般計劃它的生物學作用是與內源多肽競爭。
激動劑和拮抗劑本發(fā)明還提供了CRP1或B7RP1的激動劑和拮抗劑，它們調節(jié)二者之一或這兩種分子的活性。激動劑和拮抗劑可以從改變B7RP1對CRP1的結合的檢驗分子中鑒別。
術語“檢驗分子”指的是正就其結合CRP1或B7RP1多肽并由此改變B7RP1對CRP1的結合的能力進行評估的分子。優(yōu)選地，該檢驗分子將與至少約106M的親和常數(shù)結合。
各種測定法可以用于測量B7RP1對CRP1的結合。這些測定法可以用于就其增加或減少B7RP1對CRP1的結合率或結合程度的能力對檢驗分子進行篩選。在一種測定類型中，CRP1多肽、優(yōu)選可溶形式的CRP1諸如胞外域，通過附著到微量滴定板各孔的底部而固定。放射性標記B7RP1和檢驗分子然后可每次一個(無論何種順序)或者同時加入到各孔中。溫育后，各孔可以洗滌并使用閃爍計數(shù)器對放射性計數(shù)，以確定B7RP1結合到CRP1蛋白質的程度。一般，將針對一定濃度范圍內的分子進行檢驗，并且缺乏該檢驗測定的一個或多個元素的一系列對照孔可以用于提高結果評估中的準確度。對此方法的一種改變涉及掉換蛋白質的“位置”，即，將B7RP1固定到微量滴定板的孔中，用檢驗分子和放射性標記CRP1溫育，并測定CRP1結合的程度(參見，例如《分子生物學中的流行方案》第18章，Ausubel等編輯，John Wiley & Sons，NewYork，NY)。
作為進行放射性標記的另一種選擇，可以將CRP1或B7RP1與生物素綴合，然后可使用與酶諸如辣根過氧化物酶[HRP]或堿性磷酸酶[AP]相連的鏈霉抗生物素檢測生物素化蛋白質的存在，可以是進行比色測定，或者是通過鏈霉抗生物的熒光標記。也可以使用與生物素綴合的指向CRP1或B7RP1的抗體，并且可以在用與AP或HRP相連的酶連鏈霉抗生物素溫育后進行檢測。
CRP1和B7RP1也可以通過附著到瓊脂糖珠、丙烯酸珠或其他類型的這種惰性底物上加以固定。該底物-蛋白質復合物可以置于含有互補蛋白質和檢驗化合物的溶液中；溫育后，珠?？梢酝ㄟ^離心沉淀，CRP1和B7RP1之間的結合量可以使用上述方法評定。另一方面，該底物-蛋白質復合物可以固定在層析柱中，檢驗分子和互補蛋白質通過該柱。然后可使用上面所列出的任何一種技術，即放射性標記、抗體結合等等來評定CRP1和B7RP1之間的復合物的形成。
另外一種類型的用于鑒別能增加或減少CRP1/B7RP1復合物形成的檢驗分子的體外測定法是表面胞質基因共振檢測器系統(tǒng)諸如Biacore測定系統(tǒng)(Pharmacia，Piscataway，NJ)。該Biacore系統(tǒng)可以按照制造商的方案進行操作。此測定法主要涉及CRP1或B7RP1與位于檢測器中的包覆葡聚糖的傳感芯片的共價結合。檢驗化合物和其他互補蛋白質然后可以同時或順序注射到含有該傳感芯片的室中，結合的互補蛋白質的量可以在與該傳感芯片的包覆葡聚糖一側實際相聯(lián)系的分子質量變化的基礎上加以評定；分子質量的變化可以通過檢測器系統(tǒng)測量。
在有些情況下，可能希望評估一起用于增加或減少CRP1/B7RP1復合物形成的兩個或多個檢驗化合物。在這些情況下，上述測定法可以容易地通過與第一種檢驗化合物同時或順序加入這類附加檢驗化合物加以修正。該測定法中的其他步驟如上所述。
體外測定法諸如上述那些可以有利地用于迅速篩選大量化合物對CRP1和B7RP1的復合物形成的作用?？梢允惯@些測定法自動化篩選在噬菌體展示、合成肽和化學合成文庫中產(chǎn)生的化合物。
增加或減少CRP1和B7RP1的復合物形成的化合物也可以使用表達這兩種多肽之一的細胞和細胞系在細胞培養(yǎng)物中進行篩選。細胞和細胞系可以從任何哺乳動物得到，但優(yōu)選是來自人的或來自其他靈長目動物、犬或嚙齒動物。B7RP1在表面上與表達CRP1的細胞的結合在存在或不存在檢驗分子的條件下加以評估，結合程度可以通過例如流式細胞儀使用B7RP1的生物素化抗體加以測定。細胞培養(yǎng)物測定法可以有利地用于進一步評估在上述蛋白質結合測定中得分為正的化合物。
治療應用本發(fā)明的多肽、其激動劑和拮抗劑，可以用于調節(jié)T細胞的功能。激動劑和拮抗劑包括調節(jié)CRP1和/或B7RP1活性且或者增加或者減少CRP1或B7RP1蛋白質的至少一種活性諸如與T細胞功能例如T細胞活化有關的一種活性的那些分子。激動劑或拮抗劑可以是輔因子，諸如蛋白質、肽、糖類、脂質或小分子量分子，它們與CRP1或B7RP1相互作用并由此調節(jié)它們的活性?？赡艿亩嚯募觿┗蜣卓箘┌ㄅc可溶形式或膜結合形式的CRP1或B7RP1反應的抗體，它們包含所述蛋白質的部分或所有胞外域。調節(jié)CRP1或B7RP1表達的分子一般包括可作為表達的反義調節(jié)物的編碼CRP1或B7RP1蛋白質的核酸。
CRP1或B7RP1多肽及其激動劑和拮抗劑可以用于治療自身免疫疾病、移植物存活、用于抑制腫瘤細胞生長的免疫細胞活化、T細胞依賴性B細胞介導疾病、和癌癥的基因免疫治療。在一個實施方案中，CRP1和/或B7RP1功能的拮抗劑或抑制劑可以有助于減輕慢性免疫細胞機能障礙性疾病中的癥狀。自身免疫疾病諸如系統(tǒng)性紅斑狼、類風濕性關節(jié)炎、免疫性血小板減少性紫癜(ITP)和牛皮癬可以用CRP-1/B7RP-1的拮抗劑或抑制劑進行治療。此外，慢性炎性疾病，諸如炎性腸疾病(節(jié)段性回腸炎和潰瘍性結腸炎)、突眼性甲狀腺腫、慢性甲狀腺炎和糖尿病，也可以用CRP1/B7RP-1的抑制劑進行治療。如實施例18中所述，在嚙齒動物類風濕性關節(jié)炎疾病模型中，CRP-1-Fc抑制而B7RP-1-Fc增強疾病的發(fā)作。在該模型中的這些相反結果證實了B7RP-1-Fc蛋白質的興奮作用和CRP-1-Fc蛋白質的拮抗作用。結果還闡明了T細胞反應可以如何通過使用這種路徑加以調節(jié)以及這種路徑在類風濕性關節(jié)炎進展中的有效性。此外，如實施例19中所述，體內B7RP-1-Fc的表達刺激了轉基因小鼠體內的炎性腸疾病(IBD)表型。這個實施例證實了B7RP-1/CRP-1在腸內炎癥發(fā)展中的作用。因此，B7RP-1/CRP-1路徑的拮抗劑可以用于治療人IBD。
CRP1或B7RP1的拮抗劑可以作為免疫抑制劑用于骨髓和器官移植，并可以用于延長移植物的存活。這類拮抗劑可以對現(xiàn)有治療提供明顯的好處。骨髓和器官移植治療必須與T細胞介導的宿主對外源細胞或組織的排斥進行抗爭。目前用于抑制T細胞介導的排斥的治療方案涉及用藥物環(huán)孢菌素或FK506進行治療。雖然藥物是有效的，但患者會出現(xiàn)嚴重的副作用，包括肝細胞毒性、腎毒性和神經(jīng)毒性。環(huán)孢菌素/FK506類治療劑的目標是鈣調磷酸酶，這是一種具有遍在表達的磷酸酶。由于CRP1表達限制為T細胞，因此CRP1或B7RP1的抑制劑可以沒有使用現(xiàn)有的免疫治療劑時所觀察到的嚴重的副作用。
CRP1或B7RP1的拮抗劑可以作為免疫抑制劑用于自身免疫疾病，諸如類風濕性關節(jié)炎、牛皮癬、多發(fā)性硬化、糖尿病和系統(tǒng)性紅斑狼瘡。
CRP1/B7RP1介導的共同刺激路徑的拮抗劑也可以用于減輕中毒性休克綜合征、炎性腸疾病、因輸血引起的同種致敏、T細胞依賴性B細胞介導的疾病、和移植物抗宿主疾病的治療。
抗體、包含例如胞外域的可溶性蛋白質、和導致T細胞活化延長或增加的CRP1或B7RP1的其他調節(jié)物可以用于增加對腫瘤的免疫應答。實施例20顯示B7RP-1-Fc可抑制小鼠體內腫瘤細胞的生長。類似地，人B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路徑的其他激活物可以用于增強對抗人腫瘤的免疫應答。一般認為抗腫瘤活性具有強細胞溶解性T淋巴細胞組分。事實上，B7-Fc融合蛋白的抗腫瘤作用(Sturmhoefel等，Cancer Res.(癌癥研究)594964-4972，1999)是由細胞溶解性CD8+T細胞介導的。既然CRP-1也在細胞溶解性CD8+T細胞上表達(實施例9)，在實施例20中證明的抗腫瘤作用就很可能是由于CD8+細胞上B7RP-1-Fc的作用。B7RP-1/CRP-1路徑也可以用于調節(jié)許多其他臨床環(huán)境包括同種移植物移植、移植物抗宿主疾病和自身免疫疾病中的CTL反應。
使用本發(fā)明的B7RP1基因進行的基因治療可以用于癌癥的免疫治療。引入到癌細胞中的B7RP1基因可以將它們轉化到抗原呈遞細胞中，當其被引回到動物體內后可以被免疫細胞的T細胞識別。T細胞對轉染腫瘤細胞的識別導致表達或不表達B7RP1基因的兩種腫瘤細胞被根除。這種免疫治療方法可以用于各種白血病、肉瘤、黑瘤、腺癌、乳癌、前列腺腫瘤、肺癌、結腸癌和其他腫瘤。本發(fā)明包括以類似方式使用B7RP1基因來增強響應各種腫瘤的T細胞活化。
如實施例14所述，表達B7RP1的轉基因小鼠的表型指示B7RP1在抗體生成的控制中是重要的。B7RP1蛋白質活性的激動劑和拮抗劑可以用于治療要求抑制或增強抗體的產(chǎn)生的適應癥。
例如，許多疫苗通過引起有效而特異性的抗體反應起作用。有些疫苗，尤其是針對腸微生物(例如甲型肝炎病毒和沙門氏菌)的那些，可引起短暫的抗體反應。人們希望加強和延長這種反應以提高疫苗的有效性。因此，可溶性B7RP1或CRP1的活化抗體可以用作疫苗佐劑。
抗病毒反應也可以通過B7RP-1/CRP-1路徑的激活物或激動劑得到增強。實施例20中的數(shù)據(jù)顯示B7RP-1-Fc增強了細胞免疫。B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路徑的其他激活物對細胞免疫功能的增強也有助于清除病毒感染細胞。以互補方式，B7RP-1-Fc對體液免疫功能具有影響，如實施例13中的觀測，這可以增強抗體介導的反應，該反應可幫助從體內清除游離病毒。
相反，有許多臨床疾病，通過抑制抗體的產(chǎn)生就可得到改善。過敏癥是一種夸大或不適當?shù)恼Ｓ幸娴拿庖叻磻?，它導致炎癥反應和組織破壞?？贵w介導的過敏反應可能對B7RP1活性抑制劑的拮抗作用特別敏感。變應性、枯草熱、哮喘和急性水腫引起I型過敏反應，這些反應可以被B7RP1活性的蛋白質、抗體或小分子抑制劑抑制。
引起抗體介導的過敏反應的疾病，包括系統(tǒng)性紅斑狼瘡，關節(jié)炎(類風濕性關節(jié)炎、反應性關節(jié)炎、牛皮癬性關節(jié)炎)，腎病(腎小球性腎炎、膜性的、腎小球系膜毛細血管的、局灶性節(jié)段性的、局灶性壞死性的、新月形的、增生性管病)，皮膚疾病(天皰瘡和類天皰瘡、結節(jié)性紅斑)，內分泌病(甲狀腺炎-突眼性甲狀腺腫、慢性甲狀腺炎、胰島素依賴型糖尿病)，各種肺病(尤其是外因性小泡炎)，各種血管病，腹腔疾病，伴有異常IgA生成，許多貧血癥和血小板減少癥，格-巴二氏綜合征，和重癥肌無力，都可用B7RP1拮抗劑進行治療。
此外，淋巴增殖性疾病，諸如多發(fā)性骨髓瘤、瓦爾登斯特倫氏巨球蛋白血癥和冷球蛋白血癥，可以用B7RP1的蛋白質、抗體或小分子拮抗劑抑制。
最后，移植物抗宿主疾病-一種“人造”免疫疾病，可以受益于B7RP1拮抗劑對抗體生成的抑制。
提供下列實施例是為了更全面地闡述本發(fā)明，但不認為是對本發(fā)明范圍的限制。
實施例1CRP1 cDNA和氨基酸序列將雌性C57/Black 6小鼠處死，切下小腸，并除去淋巴集結。將該小腸組織切開并洗滌，以除去粘液和其他碎屑。含有腸上皮內細胞(iIELs)的上皮層通過在添加有1mM二硫蘇糖醇(DTT)的RPMI-1640中在37℃下輕微攪拌20分鐘而釋放。將分離細胞通過100μ濾器，用50mlRPMI-1640洗滌，混合到另外的細胞破碎凝塊中，然后通過40μ過濾器得到單細胞群。這些細胞然后再次用50ml體積的RPMI-1640洗滌，以確保除去殘余的DTT。該組織然后如前所述攪拌和洗滌，使剩余的iIEL聚集。從脂肪細胞分離出iIEL，大多數(shù)上皮細胞在3步Percol梯度，伴有在40％至80％界面的iIEL帶。這些細胞然后用RPMI-1640洗滌兩次，以去除微量的Percol，用CD103(整聯(lián)蛋白αIEL)抗體進行免疫染色，并在FACs Star細胞分選儀上進行分離。這些分選后的細胞然后可用于使用Trizol(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)直接制備總RNA，或者在平板結合活性抗體上活化過夜，其與γ/δTCR、α/βTCR或CD3交聯(lián)。如上所述制備RNA并匯集后用于構建EST cDNA文庫。
cDNA克隆，稱之為smil2-00082-al，含有與CD28同源的核苷酸序列(圖1B)。序列的翻譯和隨后與公共資料庫中已知蛋白質的對比顯示與鼠CD28有19％氨基酸相同(圖1B)。這種低同源性是重要的，因為鼠CD28與鼠CTLA-4僅有26％氨基酸相同。所有被認為對于CD28/CTLA-4族中的分子內和分子間半胱氨酸鍵合來說是決定性的推定半胱氨酸都發(fā)現(xiàn)被保存下來(氨基酸殘基83、109和137；相對于起始甲硫氨酸)。此外，推定可讀框的整個長度以及跨膜域的相對位置都與CD28和CTLA-4的類似。我們把基因CRP1稱之為CD28相關蛋白質-1。
實施例2人CRP1 cDNA的克隆編碼人CRP1蛋白質的核酸序列通過以下方法加以鑒別。從來自正常人類志愿者的外周人血的富集淋巴細胞制備人cDNA文庫。將淋巴細胞純化，紅細胞通過淋巴細胞分離培養(yǎng)基(ICN Pharmaceuticals，Inc.，Costa Mesa，CA)除去。這些細胞然后在含有10ng/ml PMA、500ng/ml離子霉素和CD3的平板結合活化抗體的培養(yǎng)基中活化過夜。利用Trizol法(Gibco/BRL)從活化細胞制備總RNA并通過Dynal珠純化分離聚腺苷酸化RNA。從分離的聚腺苷酸化RNA制備cDNA并按大小挑選出最大的cDNA片段。然后將該大小經(jīng)過選擇的cDNA連接到質粒pSPORT(Gibco/BRL)中。通過篩選該活化淋巴細胞cDNA文庫利用重組噬菌體噬斑或轉化細菌集落雜交方案得到編碼人CRP1蛋白質的DNA(Sambrook等，同上)。該噬菌體或質粒cDNA文庫使用從如實施例1和圖1中描述的鼠CRP1基因克隆得到的放射性標記探針加以篩選。這些探針用于篩選從平板文庫提升的尼龍過濾器。這些過濾器在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS和100μg/ml鮭精DNA中預雜交4小時，然后在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、2XDenhardt溶液、0.5％SDS、100μg/ml鮭精DNA和5ng/ml mB7RPl探針中雜交24小時。印跡在室溫下用2X SSC、0.1％SDS洗滌10分鐘，在50℃下用1X SSC、0.1％SDS洗滌10分鐘，在50℃下用0.2X SSC、0.1％SDS洗滌10分鐘，然后在50℃下用0.2X SSC再次洗滌10分鐘。如實施例1中所述對從任何人CRP1克隆得到的插入片段進行測序和分析。
實施例3B7RP1 DNA和氨基酸序列cDNA克隆，稱之為smill-00003-g5，含有與B7.1(CD80)和B7.2(CD86)同源的核苷酸序列。序列(圖2A)的翻譯和隨后與公共資料庫中已知蛋白質的對比顯示與鼠B7.1有20％氨基酸相同(圖2B)。這種低同源性是重要的，因為鼠B7.1與鼠B7.2僅有24％氨基酸相同。盡管同源性這樣低，決定性的半胱氨酸殘基仍被保存在該克隆和鼠B7.1和B7.2的可讀框之間，位于殘基62、138、185和242(相對于起始甲硫氨酸，圖2B)。與B7.1和B7.2相比，在該克隆的推定ORF中，近似成熟蛋白質長度和跨膜區(qū)相對于羧基端的位置也類似。我們把基因B7RP1稱之為B7相關蛋白質-1。
實施例4人B7RP1 cDNA的克隆利用Genbank胚細胞同源性調查(GCG，威斯康星大學)使用鼠B7RP1序列(參見圖2)來挽回含有帶有1679bp ORF的4358bp序列的克隆(AB014553)。按照此序列來設計PCR克隆引物。使用HumanLymph Node Marathon-ReadyTMcDNA(Clontech，Palo Alto，CA)按照制造商建議的步驟通過5′和3′RACE得到1313bp的DNA片段。
用于全長人B7RP1的引物2083-75 ACC ATG CGG CTG GGC AGT CCT GGA(SEQ ID NO25)
2083-76 TGG TGA CCT ACC ACA TCC CAC AG(SEQ ID NO26)2083-77 TCC GAT GTC ATT TCC TGT CTG GC(SEQ ID NO27)2083-78 GCT CTG TCT CCG GAC TCA CAG CCC(SEQ ID NO28)2113-29 GTG GCA GCA AAC TTC AGC GTG CCC GTC G(SEQ ID NO29)2113-30 CCC AAC GTG TAC TGG ATC AAT AAG ACG G(SEQ ID NO30)2113-31 GCG TGC TGA GGA TCG CAC GGA CCC CCA G(SEQ ID NO31)引物2083-75和2083-76用于使用RACE方案擴增基因的5′端。引物2083-77、2083-78、2113-29、2113-30和2113-31用于使用RACE方案擴增基因的3′端。
所得核苷酸序列含有開始于甲硫氨酸的288個氨基酸殘基的ORF。預測的成熟人B7RP1氨基酸序列然后與成熟小鼠B7RP1氨基酸序列進行對比(圖3B)，發(fā)現(xiàn)有48％氨基酸相同。這種同源性是重要的，因為各物種之間關于CD80(B7.1)基因的同源性較低，事實上，小鼠和人CD80只有41％氨基酸相同。重要的是，人B7RP1蛋白質保存了Ig環(huán)結構所需要的決定性半胱氨酸殘基(氨基酸殘基16、92、138、194和195，相對于成熟蛋白質，圖3B)。此外，跨膜域的整個長度和位置與人B7RP1同系物一致。
實施例5B7RP1 RNA的表達使用針對B7RP1基因的RNA探針進行RNA原位雜交。成年小鼠組織用4％多聚甲醛固定，用石蠟包埋，并以5μm切片。在原位雜交之前，組織用0.2M HCL預先透化，接著用蛋白酶K消化，并用三乙醇胺和乙酸酐進行乙?；?。切片在55℃下與和小鼠B7RP1序列的核苷酸1-969相對應的969個堿基的33P標記的核糖探針雜交過夜。過量探針通過核糖核酸酶消化除去，接著用鹽濃度逐漸下降的緩沖劑進行一系列洗滌，然后在55℃下用0.1X SSC進行高嚴格洗滌。將載物片浸入Kodak NTB2乳劑中，在4℃下接觸2-3周，發(fā)育，并用蘇木精和曙紅復染色。切片用暗視野和透射光照明進行檢驗，以允許同時對組織形態(tài)學和雜交信號進行評估。
通過原位雜交對B7RP1 RNA的分析顯示，B7RP1 RNA在淋巴組織成熟和淋巴細胞活化的區(qū)域內是高度表達的。B7RP1 RNA表達于胸腺、腸的淋巴集結、脾和淋巴結的淋巴組織中。在這些淋巴組織中的表達證明，B7RP1 RNA一般表達于B細胞和其他APC牽連范圍內。這些區(qū)域包括胸腺的髓質區(qū)、淋巴結的初級濾泡、和淋巴集結的濾泡和圓頂區(qū)。B7RP1 RNA的表達對淋巴組織中的APC牽連區(qū)域是高度特異性的。
對若干非淋巴組織的分析也顯示了B7RP1在APC牽連區(qū)域內的表達。在肺中，B7RP1表達發(fā)現(xiàn)于粘膜下層范圍內，與在抗原加工中的功能一致。在小腸中，B7RP1 RNA發(fā)現(xiàn)于粘膜固有層。特別是，我們發(fā)現(xiàn)了一段受損的肝，這表明了與B7RP1 RNA的表達重疊的淋巴細胞浸潤。B7RP1表達與為響應組織破壞而發(fā)生的淋巴細胞積聚的這種同時發(fā)生有力地顯示了B7RP1與淋巴細胞活化有關。
實施例6CRP1 RNA的表達使用針對CRP1基因的RNA探針進行RNA原位雜交。如實施例5中所述制備小鼠組織。如實施例5中所述進行組織預透化、探針雜交、載物片處理和組織染色。切片在55℃下與和小鼠CRP1序列的核苷酸1-603相對應的603個堿基的33P標記的核糖探針雜交過夜。切片用暗視野和透射光照明進行檢驗，以允許同時對組織形態(tài)學和雜交信號進行評估。
將來自正常小鼠或用噁唑酮處理過的小鼠的淋巴結切片并用于分析CRP1 RNA表達。致敏小鼠淋巴結與正常小鼠淋巴結相比顯示出更大的CRP1 RNA的表達。CRP1的表達是在副皮質中，這是T細胞活躍區(qū)域。因此，CRP1 RNA的表達與T淋巴細胞的表達一致，并隨著T細胞活化上調。
實施例7CRP1-Fc和B7RP1-Fc融合蛋白的表達和純化為了構建用于CRP1-Fc融合蛋白的DNA表達載體，將CRP1的第一氨基端147個氨基酸的編碼序列與人Fc基因(同種型IgG1)的羧基端235個氨基酸的編碼序列符合讀框地融合并連接在pcDNA3的多接頭序列中(pcDNA3/CRP1-Fc)。為了構建用于B7RP1-Fc融合蛋白的DNA表達載體，將B7RP1的第一氨基端269個氨基酸的編碼序列與人Fc基因(同種型IgG1)的羧基端235個氨基酸的編碼序列符合讀框地融合并連接在pcDNA3的多接頭序列中(pcDNA3/B7RP1-Fc)。CRP1和B7RP1的編碼序列含有來自每個蛋白質N端的序列直至但不包括每個蛋白質的推定跨膜區(qū)。293T細胞利用FuGene 6轉染試劑(Roche MolecularBiochemicals，Indianapolis，IN)用pcDNA3/CRP1-Fc或pcDNA3/B7RP1-Fc轉染。4天后，收集條件培養(yǎng)基，F(xiàn)c融合蛋白通過分批色譜法使用A蛋白瓊脂糖(Pharmacia)加以純化。結合到層析柱上的Fc融合蛋白用3柱體積的免疫純溫和洗脫緩沖劑(Immunopure Gentle Elution Buffer)(Pierce)洗脫，然后針對150體積的20mM HEPES、100mM NaCl，pH7.5進行透析。透析蛋白質使用Macrosep離心濃縮液30kD MWCO(Pall Filtron)濃縮，并使用從每個蛋白質的氨基酸序列得到的消光系數(shù)來計算蛋白質的濃度。CRP1-Fc融合蛋白的表達顯示在圖4A中，B7CPR1-Fc融合蛋白的表達顯示在圖4B中。
實施例8作為受體-配體對的CRP1和B7RP1的鑒別為了確定新的蛋白質是否是與含有CD28、CTLA-4、B7.1和B7.2的那些相同的共同刺激路徑的部分，我們采用了細胞表面展示測定。該測定使用ACAS(粘著細胞分析和分選)分析法來分析在細胞中表達的膜結合蛋白質是否與各種Fc融合蛋白相互作用。表達膜結合蛋白質的細胞(顯示在圖5的左側)用Fc融合蛋白(顯示在圖的上部)溫育。
將在帶有10％FBS的DMEM培養(yǎng)基中生長的Cos-7細胞以500,000細胞/孔的濃度鋪在24孔平板中。細胞使用FuGene 6試劑(RocheMolecular Biochemicals，Indianapolis，IN)進行轉染。對于每個轉染來說，將3μl FuGene 6試劑加入到47μl無血清的DMEM培養(yǎng)基中。在室溫下溫育10分鐘后，將該混合物滴加到0.25μg質粒中，然后溫育15分鐘。上述混合物再加入到伴有含10％FBS的0.5ml DMEM的細胞中。這些細胞在37℃下在5％CO2氣氛中溫育。作為對照，將用含有用于人CD28的cDNA的表達質粒穩(wěn)定轉染的CHOD細胞也以500,000細胞/孔的濃度鋪在24孔平板中。
48小時后，除去帶有轉染試劑的培養(yǎng)基，細胞用加有5％FBS的RPMI洗滌兩次。將10-20ng存在于1ml培養(yǎng)基中的純化Fc融合蛋白加入細胞中，其在冰上溫育30分鐘。細胞用加有5％FBS的RPMI洗滌三次，然后用2μl FITC綴合抗人Fc抗體(1mg/ml)再在冰上溫育30分鐘。用RPMI連續(xù)洗滌三次后，細胞用不含酚紅的250μl RPMI培養(yǎng)基覆蓋以用于ACAS分析。
對與不同F(xiàn)c融合蛋白結合的細胞的ACAS分析證明B7RP1蛋白質結合CRP1，而不結合已知共同刺激路徑中的蛋白質CD28或CTLA-4。相反，CRP1與B7RP1相互作用，但不與已知路徑中的組分B7.2作用(參見圖5)。這些結果有力地顯示CRP1和B7RP1代表了一個新的受體-配體對，類似于CD28和B7.2。不過，由于CRP1和B7RP1不與B7.2、CTLA-4或CD28相互作用，所以它們是單獨的并獨立于已知的共同刺激路徑。
實施例9表達B7RP1受體的細胞的鑒別利用B7RP1-Fc融合蛋白通過FACS分析來檢測表達B7RP1受體并推測包括CRP1蛋白質的細胞(參見實施例6)。從雌性C57/Black 6小鼠體內取出脾，在100微米篩網(wǎng)過濾器上研磨以釋放出淋巴細胞，通過70微米濾器，然后用50ml RPMI-1640洗滌。將它們以1500rpm顆?；賾腋∮谛迈r的RPMI中，混合以便破碎凝集細胞，并通過40微米濾器。將要活化的T細胞種植到含有RPMI-1640、5％FBS、1X PSG、PMA、離子霉素的6孔平板中，并在37℃、5％CO2下溫育過夜。12小時后通過目測觀察來檢查T細胞的活化情況。
用于免疫染色的活化脾細胞用PBS、0.5％BSA(Path-ocyte 4，ICNPharmaceuticals)洗滌緩沖劑洗滌，再懸浮，然后等分為100μl體積。酌情加入15μg/ml CRP1-Fc融合蛋白或B7RP1-Fc融合蛋白(1.5μg/樣品)，然后該混合物在冰上溫育30分鐘，同時偶爾混合一下。這些細胞用5.0ml洗滌緩沖劑洗滌兩次。融合蛋白的結合用用于細胞染色的100μl體積的2μg山羊抗人(GaHuFc-FITC)綴合次級抗體顯現(xiàn)。向與PE綴合的細胞標記抗體中加入GaHUFc-FITC，并用對照同種型-PE綴合抗體進行對照顯示(大鼠同種型)。樣品如前所述在冰上溫育并洗滌。通過FACScan分析進行顯示，并控制在淋巴細胞群上。用CD4+抗體和B7RP1-Fc融合蛋白進行二重染色，結果顯示細胞既表達了CD4標記也表達了B7RP1受體，推測為CRP1(圖6)。與此類似，用CD8+抗體和B7RP1-Fc融合蛋白的二重染色證明，細胞既表達了CD8也表達了B7RP1受體(圖6)。我們沒能在滅活脾細胞制劑中可靠地檢測這種二重染色細胞。既然CD4和CD8是T淋巴細胞標記，我們就可假定CRP1在活化CD4+和CD8+T細胞上表達。這些數(shù)據(jù)與來自致敏小鼠淋巴結的T細胞區(qū)域中CRP1 RNA的表達與正常小鼠相比增加這一結果一致(實施例6)。
實施例10表達CRP1配體的細胞的鑒別利用CRP1-Fc融合蛋白通過FACS分析(圖7)來檢測表達CRP1配體并推測包括B7RP1蛋白質的細胞(參見實施例8)。如實施例8中制備脾細胞，只是省略12小時的T細胞活化步驟，細胞直接進行分析。脾細胞用CD45R(B220)標記抗體和CRP1-Fc融合蛋白進行二重染色。檢測細胞表達CD45R B細胞標記和推定CRP1配體(推測包括B7RP1(實施例8))的情況。因此，我們得出結論B7RP1在一種類型的抗原呈遞細胞B細胞上表達。這些數(shù)據(jù)與B7RP1 RNA在各種淋巴組織的B細胞區(qū)域中的表達(實施例5)一致。
B7RP1在腹膜巨噬細胞上的表達的FACS分析(圖8)。通過局部灌洗從正常小鼠采集腹膜細胞并洗滌后用CRP1-Fc融合蛋白或Fc蛋白質對照物溫育，或者用F4/80單克隆抗體(它檢測對巨噬細胞特異性的抗原)或不相關的同種型-匹配對照單克隆抗體溫育。然后細胞再次洗滌并用山羊抗人Fc-FITC綴合抗體溫育。再次洗滌后，細胞在FACS分析器中評定它們的光散射和熒光染色性能。腹膜細胞首先在它們的光散射性能的基礎上區(qū)分為亞群(圖8A)。巨噬細胞由于它們強大的向前(FSC)和向側面(SSC)散射光的能力以及由于它們對巨噬細胞的標記-F4/80抗原的陽性染色而在5區(qū)(R5)中鑒別出來(圖8B)。6區(qū)(R6)中的巨噬細胞在它們對F4/80抗原染色強度小并且發(fā)現(xiàn)能被CRP1-Fc融合蛋白染色的基礎上挑選出來(圖8C)。這些數(shù)據(jù)顯示CRP1配體(有可能包括B7RP1)在專門的抗原呈遞細胞-巨噬細胞上表達。這與CRP1和B7RP1在T淋巴細胞活化中的功能一致。
實施例11B7RP1-Fc融合蛋白對ConA刺激T淋巴細胞的體外抑制活性如實施例8中制備小鼠脾細胞并通過負選擇富集T淋巴細胞(R andD Systems，Inc.，Minneapolis，MN))。200,000個脾細胞用于在96孔圓底平板中的T細胞增殖測定。細胞用培養(yǎng)基(沒有添加物)、如圖9中所示的融合蛋白CRP1-Fc、B7RP1-Fc或B7.2-Fc溫育1小時。培養(yǎng)基(沒有添加物)或Con A以不同濃度加入，如圖9的下部所示。然后細胞在37℃和5％CO2下溫育。42小時后，細胞用3H-胸苷脈沖6小時，收獲并摻入預定的放射性。圖9中表示了來自一式三份樣品的平均CPM和標準偏差。
Fc融合蛋白本身沒有示范明顯的T細胞刺激或抑制活性，但是，在1μg/ml和3μg/ml Con A的存在下，B7RP1-Fc和已知的B7.2-Fc融合蛋白都顯示了明顯的抑制活性(圖9)。在高濃度下(10μg/ml)，Con A刺激導致細胞死亡，推測是通過T細胞的過度激發(fā)。B7RP1-Fc或B7.2-Fc的加入有效地保護了細胞免受高濃度ConA的有害作用。在抑制和保護功能中，B7RP1-Fc蛋白質的作用大于B7.2-Fc蛋白質對ConA刺激細胞的作用。這些數(shù)據(jù)顯示，B7RP1蛋白質有調節(jié)T細胞增殖的功能。
實施例12B7RP1-Fc融合蛋白在轉基因小時體內的系統(tǒng)性釋放實施例7中描述的B7RP1-Fc融合蛋白亞克隆到ApoE-肝特異性表達載體中(Simonet等，J.Clin.Invest.(臨床研究雜志)94，1310-1319(1994)和PCT申請No.US94/11675)。編碼區(qū)使用限制酶Spe I和Not I從pCEP4/B7RP1-Fc上切除，該片段亞克隆到前述ApoE-肝特異性表達載體中的相同部位。所得質粒HE-B7RP1-Fc通過其蛋白質編碼區(qū)和攻擊編碼區(qū)側面的序列測序，以確保它沒有突變。
質粒擴增并通過兩輪CsCl密度梯度離心純化。純化的質粒DNA用限制酶Cla I和Ase I消化，而1.5kb轉基因插入物通過瓊脂糖凝膠電泳純化。該純化片段用5mM Tris，pH7.4和0.2mM EDTA稀釋成1μg/ml的儲備注射溶液。來自BDF1 X BDF1-繁殖小鼠的單細胞胚胎基本上如(Brinster等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美國國家科學院院報)82，4338(1985))所述進行注射，但注射針成斜角并在使用前硅化處理。胚胎在CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)過夜，將15至20個2細胞胚胎轉移到假孕CD1雌性小鼠的輸卵管中。
經(jīng)過定期妊娠后，從在微注射胚胎上的植入得到56個子代。子代通過基因組DNA樣品中的整合轉基因的PCR擴增加以篩選。用于擴增的目標區(qū)是包括在表達載體中的人Apo E內含子的369bp區(qū)。用于PCR擴增的寡核苷酸是5′-GCC TCT AGA AAG AGC TGG GAC-3′(SEQ ID NO32)5′-CGC CGT GTT CCA TTT ATG AGC-3′(SEQ ID NO33)用于PCR的條件是94℃下2分鐘，1個循環(huán)；94℃下1分鐘、63℃下20秒和72℃下30秒，30個循環(huán)。在56個原始子代中，有7個確定為PCR陽性轉基因建立者小鼠。
在12周大時，將9個轉基因建立者(1、2、4、6、8、30、32、33、40號小鼠)和5個對照(5、9、10、25、28號小鼠)處死，進行尸體剖檢和病理學分析?？偧毎鸕NA如(McDonald等，Meth.Enzymol.(酶學方法學)152，219(1987))所述從建立者小鼠和陰性對照同窩小鼠的肝臟中分離。對這些樣品進行Northern印跡分析，以評定轉基因表達的水平。將來自每只動物的大約10μg總RNA通過瓊脂糖電泳變性凝膠分解(Ogden等，Meth.Enzymol.(酶學方法學)152，61(1987))，然后轉移到HYBOND-N尼龍膜(Amersham)上，并用32P dCTP標記的mB7RP1-Fc插入物DNA進行探針探查。在63℃下在ExpressHyb溶液(Clonetech)和2-4×106CPM的標記探針/ml雜交緩沖劑中雜交1小時。雜交后，印跡用2X SSC，0.1％SDS在室溫下洗滌兩次，每次5分鐘，然后用0.1X SSC，0.1％SDS在55℃下洗滌兩次，每次15-20分鐘。放射自顯影法后確定轉基因在建立者和對照同窩小鼠中的表達。
Northern印跡分析顯示，有7個轉基因建立者表達了可檢測水平的轉基因RNA(1、2、6、8、32、33和40號小鼠)。陰性對照小鼠和3個建立者(4、30和31號)沒有表達可檢測水平的RNA。既然B7RP1-Fc融合蛋白確定將要從培養(yǎng)物中的哺乳動物細胞分泌(圖4B和實施例7)，則轉基因mRNA的表達應該是系統(tǒng)性釋放的基因產(chǎn)物水平的指示。
實施例13B7RP1-Fc融合蛋白的生物活性將7只轉基因小鼠(1、2、6、8、32、33和40號小鼠)和5只對照同窩小鼠(5、9、10、25和28號小鼠)處死，使用下述操作進行尸體剖檢和病理學分析安死術之前，檢驗所有動物的鑒定號，然后稱重、麻醉和抽血。儲存血清和全血樣品，用于完全血清化學和血液學面板分析。放射照相術就在利用致死的CO2吸入最終麻醉之后和總解剖之前進行。然后將組織取出并用10％緩沖的Zn-福爾馬林固定，以用于組織學檢查。收集的組織包括肝、脾、胰腺、胃、十二指腸、回腸、淋巴集結、結腸、腎、生殖器官、皮膚、乳腺、骨、腦、心臟、肺、胸腺、氣管、食管、甲狀腺/甲狀旁腺、空腸、盲腸、直腸、腎上腺、白和褐脂組織、坐骨神經(jīng)、骨髓、膀胱、和骨胳肌肉。固定前，測定肝、心臟、胃、腎、腎上腺、脾和胸腺的器官總重。固定后，組織加工到石蠟塊中，并得到3μm的切片。
對B淋巴細胞標記B220和T淋巴細胞標記CD3進行免疫組織化學分析。為了檢測B220或CD3表達，進行福爾馬林固定，石蠟包埋，將4μm切片去石蠟并水合到去離子水中。切片用3％過氧化氫淬火，用蛋白質組件(Lipshaw，Pittsburgh，PA)阻斷，并在B220的大鼠單克隆抗體(Pharmingen，San Diego，CA)中溫育，或者在CD3的兔多克隆抗體(Dako，Carpinteria，CA)中溫育。這些抗體利用生物素化兔抗大鼠或山羊抗兔免疫球蛋白，帶有DAB色原(Biotek，Santa Barbara，CA)的過氧化物酶綴合鏈霉抗生物素(BioGenex，San Ramon，CA)進行檢測。切片用蘇木精復染色。
在該研究中，在研究的生命期內報道了正常的臨床征。轉基因小鼠的整體放射照片比得上對照小鼠的照片。轉基因小鼠的全體血液學參數(shù)比得上陰性對照小鼠的參數(shù)，盡管個別小鼠存在偶爾的變化轉基因8號和40號小鼠的血清球蛋白濃度升高(血球蛋白過多)，32號和33號小鼠有在高正常范圍內的球蛋白度并伴有在低正常范圍內的白蛋白度，這是免疫系統(tǒng)的長期抗原刺激中常見的模式。其他轉基因小鼠的器官重量與對照小鼠的沒有明顯差異。
轉基因小鼠中存在下列組織病理學變化轉基因B7RP1-Fc小鼠的腸系膜淋巴結與對照小鼠相比有中到重度的擴大(圖10A-10D；圖11A-11E)。皮質有明顯的濾泡增生，看到擴大的次級濾泡(圖10B-11B)并有主要含有B220+B細胞(圖11D)和少量散在CD3+T細胞(圖11F)的大生發(fā)中心。副皮質(CD3+T細胞)區(qū)也中度增大(圖11B-11F)，髓竇有數(shù)量稍微增加的肉樣巨噬細胞(竇性組織細胞增多病)。淋巴結中最顯著的變化見于髓索，它在B7RP1-Fc轉基因小鼠中通過大量完全分化的血漿細胞而輕度到重度膨脹(圖10D)。在40號轉基因小鼠中，在髓索中也發(fā)現(xiàn)了少量散在拉塞爾小體(即，含有免疫球蛋白的帶有顯著的、大的、圓的、胞質內囊泡的血漿細胞)(圖10D)。有趣的是，其他內部和外周淋巴結(例如子宮頸的、腹股溝的)有暗示系統(tǒng)性應答的活性淋巴增生的類似形態(tài)學特征。這些發(fā)現(xiàn)與伴有體液免疫反應增強的長期、進行性免疫刺激一致，這導致B細胞增殖和最終分化到血漿細胞中。
與對照小鼠相比，B7RP1-Fc轉基因小鼠的脾有不定擴大的白髓面積，伴有特別是與B細胞次級濾泡有關的中度反應性淋巴增生，有顯著的生發(fā)中心和小動脈周T細胞鞘(圖10E-10F)。在B7RP1-Fc轉基因小鼠中的另一個顯著發(fā)現(xiàn)是在圍繞白髓面積的邊緣區(qū)中和在相鄰的紅髓中有較小到輕度的漿細胞增多。6號轉基因小鼠有少量散在的拉塞爾小體(圖10F，插圖)。紅髓有輕度到中度的骨髓外血生成，這比得上在對照小鼠中看到的結果(圖10E)。
B7RP1-Fc轉基因小鼠的小腸淋巴集結與對照小鼠相比有中度到重度的增大(圖10G)，并且有帶有顯著生發(fā)中心的非常大的濾泡，特別是在40號和32號轉基因小鼠中(圖10H)。此外，在變厚的粘膜固有層中的淋巴細胞和血漿細胞的數(shù)量有較小(32號小鼠)到輕度(8號和33號小鼠)的增加(在32號小鼠的回腸中混合有輕度嗜曙紅細胞浸潤)，這出現(xiàn)在小腸中，但更主要是在轉基因小鼠的結腸中。與對照組相比，大腸淋巴樣聚集物(GALT)也稍微更多地出現(xiàn)在一些B7RP1-Fc轉基因小鼠中(特別是8號和2號小鼠)。
通常，所檢查的其他組織，包括胸腺、骨髓、肝、肺、心臟、胰腺、腎、腎上腺、甲狀腺、甲狀旁腺、氣管、生殖器官、膀胱、乳腺、皮膚、骨胳肌肉、外周神經(jīng)、腦、食管、胃、小腸和大腸、骨(股骨/脛骨)、后膝關節(jié)、白和褐脂組織，看起來正常并比得上在對照小鼠中檢測到的背景變化。
來自該研究的數(shù)據(jù)證明，轉基因小鼠中的B7相關蛋白質Fc嵌合體(B7RP1-Fc)的過度表達導致了特征為在脾、外周和內部淋巴結以及腸伴隨淋巴組織中檢測到顯著的反應性淋巴增生的表型，象濾泡增生、T細胞面積膨脹和在有些動物中伴發(fā)血球蛋白過多的顯著漿細胞增多。漿細胞增多伴隨有較高濃度的循環(huán)IgG(轉基因小鼠均值±SD＝597±298mg/ml；對照同窩小鼠209±80mg/ml，n＝7，P＜0.05，t檢驗)，特別是IgG2a(217±100mg/ml比75±29mg/ml，n＝7，P＜0.01，t檢驗)。IgG2a的誘導通常與Th1細胞因子諸如IFN-g相聯(lián)，因此，B7RP-1誘導B細胞和T細胞增殖，并刺激B細胞分化到血漿細胞中和產(chǎn)生免疫球蛋白。
這些變化與伴有在所檢查的所有淋巴器官中導致B細胞刺激、增殖和分化到抗體生成血漿細胞中的免疫系統(tǒng)的體液臂過刺激的持續(xù)系統(tǒng)性免疫應答一致。
我們從在B7RP1-Fc轉基因小鼠中顯示的顯著的淋巴增生得出結論B7RP1蛋白質具有與免疫系統(tǒng)刺激相關的顯著體內生物活性。
實施例14人B7RP1的克隆使用淋巴細胞分離培養(yǎng)基(ICN Pharmaceuticals)從紅細胞分離正常人循環(huán)外周淋巴細胞。然后T細胞在37℃和5％CO2下用10μg/ml平板結合抗CD3抗體(Immunotech，Westbrook，ME)、10ng/ml PMA和500ng/ml離子霉素活化過夜(16小時)。然后使用TRIzol試劑(Gibco BRL)從這些細胞制備總RNA。細胞通過離心顆粒化，每5×106個細胞的細胞顆粒再懸浮于1ml TRIzol試劑并在室溫下溫育5分鐘。然后加入0.2ml氯仿每1ml原始TRIzol試劑。試管用手用力振搖15秒，在室溫下溫育3分鐘，在4℃下以13,000rpm離心15分鐘。離心后，收集含有RNA的澄清的上層水相，樣品RNA通過加入異丙醇沉淀。然后該溶液在室溫下溫育10分鐘，RNA顆?；?，用75％乙醇洗滌，然后在4℃下以15,000rpm離心5分鐘。將顆?？諝飧稍铮賾腋∮跊]有核糖核酸酶的水中，然后等分，并在-80℃下儲存直至后面的使用。
使用cDNA分析和質粒克隆用的SuperScript質粒系統(tǒng)(Gibco BRL)構建文庫。簡言之，將平均大小為2kb的cDNA插入物連接到pSport載體中的Sall/Noti克隆部位。將連接后的質粒電穿孔到Electromax轉化感受態(tài)大腸桿菌(Gibco BRL)中，滴定并以每LB平板15,000克隆的濃度鋪平板(氨芐青霉素100μg/ml)。將300,000克隆提升到集落/菌斑篩選雜交轉移膜上(NEN Life Sciences)，在0.5N NaOH、1.5M NaCl中使其變性5分鐘，然后用下列緩沖劑連續(xù)中和，每次5分鐘1M Tris HCl pH8.0，0.5M Tris HCl pH8.0和1.5M NaCl和2X SSC。然后濾器通過紫外線照射交聯(lián)，并在真空烤箱中在80℃下烤30分鐘。濾器在42℃下用2X SSC充分預洗滌以除去碎屑，然后在42℃下在50％甲酰胺、5X SSPE、5XDenhard溶液、0.5％SDS、100μg/ml鮭精DNA中預雜交2小時。
人淋巴細胞cDNA文庫用圖3A中所示的具有核苷酸1-711的895bpDNA片段、圖3A中的5’直接到起始甲硫氨酸密碼子的167bps和圖3A中的3′直接到711位的17bps加以篩選。該167個堿基對的上游5′序列通過HuB7RP1 cDNA的5′RACE得到(實施例4)并在Eco RI限制酶切位點從TOPO TA載體(Invitrogen，Carlsbad，CA)釋放。該插入物在0.8％瓊脂糖TAE凝膠上純化兩次。DNA凝膠純化試劑盒(Qiagen)用于從瓊脂糖分離DNA插入物。
125ng DNA片段用32P dCTP(Amersham)標記，接著進行Redi-Prime2(Amersham)隨機初期標記系統(tǒng)方案。然后使集落提升濾器在42℃下在以下緩沖劑中與探針雜交過夜50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS、100mg/ml ssDNA。探針的特定活性為2.38×109cpm/μgDNA，以大約2ng標記探針每ml雜交緩沖劑的濃度。將探針除去并保存用于下一輪篩選。然后濾器在室溫下用2X SSC、0.1％SDS洗滌15分鐘，接著在55℃下用1X SSC、0.1％SDS洗滌15分鐘，在60℃下用1X SSC、0.1％SDS洗滌10分鐘。將濾器包裹在塑料中并在-80℃下接觸自體放射照相術膠片過夜，有2個增強篩選。鑒別出三個獨立的陽性克隆。照射與細菌平板對齊，將陽性克隆敲碎、稀釋并重新鋪在含有氨芐青霉素100μg/ml的LB平板上，如前所述生長過夜，如前所述將集落提升、制備和用探針探查。分離出三個獨立的克隆集落，分離DNA，以一式三份測定每個克隆的DNA序列。
人B7RP1蛋白質的全長為302個氨基酸?？缒び虻亩嚯拈L度和相對位置與其他B7族成員一致。人B7RP1基因與小鼠克隆有43％氨基酸相同。這種同源性程度是顯著的，因為小鼠和人CD80蛋白質只有41％相同。顯著保存在小鼠和人基因之間的是在氨基酸37、113、158、215和216位的半胱氨酸殘基。
實施例15人CRP1的克隆利用Genbank胚細胞同源性調查(GCG，威斯康星大學)使用鼠B7RP1序列(參見圖2)來挽回含有顯示出與鼠CRP1基因的高同源性的104bp序列的基因組克隆(Gen Bank Assession NO.AQ022676)。設計PCR克隆引物來重疊該序列。
5′-GCA FAT TTA TGA ATC CCA-3′(SEQ ID NO34)5′-ACT ATT AGG GTC ATG CAC-3′(SEQ ID NO35)使用上述引物，鼠CRP1的151bp DNA片段利用圖1中描述的鼠CRP1質粒和實施例1模板進行PCR擴增。125ng DNA用32PdCTP(Amersham)標記后，實施Redi-Prime 2(Amersham)隨機原始標記系統(tǒng)方案。然后讓來自實施例15中描述的人外周血液文庫的集落提升濾器在41℃下在下列雜交緩沖劑中與探針雜交過夜(15小時)50％甲酰胺、5X SSPE、2X Denhardt溶液、0.5％SDS、100μg/ml ssDNA。探針的特定活性為3.52X109cpm/μg DNA，1.5ng標記探針/ml雜交緩沖劑。將探針拔出并保存用于下一輪篩選。然后濾器在室溫下用2X SSC、0.1％SDS洗滌10分鐘，接著在37℃下用1X SSC、0.1％SDS洗滌7分鐘，在40℃下洗滌7分鐘，在44℃下洗滌7分鐘，然后在50℃下洗滌7分鐘，不斷監(jiān)測濾器釋放標記探針的速率。將濾器用塑料包裹并在-80℃下接觸膠片過夜，有2個增強篩選。該方法顯示了9個可能的獨立陽性克隆。照射與細菌平板對齊，將陽性克隆敲碎，沉積到200μl SOC中，進行2次1∶10連續(xù)稀釋，將來自第二次稀釋的70μl重新鋪在含有氨芐青霉素100μg/ml的LB平板上并如前所述生長過夜。如前所述將集落提升、制備和用探針探查。分離出8個獨立克隆并利用Qiagen小量制備法制備DNA。
得到含有199個氨基酸的可讀框的cDNA克隆(圖13A)。該cDNA克隆含有與實施例1和圖1中描述的鼠CRP1克隆同源性的核苷酸和氨酸。與該人克隆的可讀框相對應的核苷酸與鼠CRP1基因有77％相同。人序列的翻譯和隨后與鼠CRP1蛋白質的對比顯示與鼠蛋白質有69％氨基酸相同(圖13B)。此外，氨基酸114到119之間的基元“FDPPPF”被保存在鼠和人CRP1基因中。該基元與鼠和人CD28中對于B7蛋白質相互作用來說必要的“MYPPPY”基元相對應。此外，在氨基酸42、109和141位上的半胱氨酸也保存下來。這些半胱氨酸對應于CD28和CTLA-4中的半胱氨酸，它們與Ig環(huán)的形成和分子間二硫化物的二聚有關。與鼠CRP1的密切相似，以及與CD28同源性族的結構相似，都顯示這是人CRP1同系物。
實施例16CRP-1在靜息記憶T淋巴細胞上的表達為了研究CRP-1在記憶T細胞上的表達，從6-7月齡的小鼠采集脾T細胞。這些細胞使用通過FITC綴合抗人Fc抗體和CD44、CD45RB或CD69的PE綴合抗體標記的B7RP1-Fc復染色。用B7RP-1-Fc融合蛋白的染色檢測CRP-1蛋白質在這些細胞上的表達。年老小鼠比年輕小鼠顯示出更多的CRP-1+脾T細胞。有趣的是，有顯著數(shù)量的這些細胞具有高CD44(圖14a)和低CD45RB(圖14b)，這是記憶T細胞的典型方式。這些CRP-1+記憶T細胞處于靜息狀態(tài)，因為它們沒有表達活化標記CD69(圖14c)。CRP-1在記憶T細胞上的表達顯示CRP-1對記憶T細胞有共同刺激功能。
實施例17B7RP-1抗體對體外T細胞共同刺激的抑制為了確定B7RP-1蛋白質與T細胞是否在功能上有關聯(lián)，我們在一個體外增殖測定中用B7RP-1-Fc融合蛋白和抗CD3抗體溫育CD3+T細胞。然后使用兔抗小鼠B7RP1單克隆抗體或大鼠抗小鼠B7RP1單克隆抗體來特異性抑制體外B7RP1-Fc共同刺激增殖。
B7RP-1兔多克隆抗血清制備給三只新西蘭白兔(5-81bs.初始重量)肌內注射鼠B7RP1蛋白質。每只白兔在第1天用在等體積Hunters Titer Max完全佐劑中乳化的150μg鼠B7RP1蛋白質免疫接種。用相同操作進行進一步的加強(第14和28天)。通過EIA監(jiān)測抗體效價。第二次加強后，抗血清顯示中等抗體效價。然后從每只動物獲得30ml生產(chǎn)血液。每周重復此操作，持續(xù)6周。多克隆抗體然后用A蛋白瓊脂糖色譜法純化，接著進行負選擇Fc蛋白質親和色譜法和利用B7RP-1-Fc親和色譜法正選擇。
大鼠抗鼠B7RP1單克隆抗體制備如Practical Immunology(實用免疫學)第二版(1980；L.Hudson和F.C.Hay；Blackwell Scientific Publications；St.Louis，MO)中所述產(chǎn)生大鼠抗鼠B7RP1單克隆抗體。簡言之，以4周的間隔給Lou大鼠(Harlan；Indianapolis，IN)腹膜內注射在弗氏佐劑中乳化的muB7RP1-Fc融合蛋白。融合前3天，大鼠用可溶性muB7RP1靜脈注射進行加強。在融合的當天，將動物在二氧化碳下處死并無菌操作取出脾。使用組織細菌分離器生產(chǎn)單細胞懸液。脾細胞和Y3-Ag1.2.3骨髓瘤細胞(美國典型培養(yǎng)物保藏中心；Rockville，MD)均用無血清培養(yǎng)基洗滌，然后通過加入聚乙二醇(PEG 1500；Boehringer Mannheim Biochemicals；Indianapolis，IN)進行融合。細胞用清水沖洗一次，再懸浮于含有血清的培養(yǎng)基中，并鋪到96孔組織培養(yǎng)板中。10到12天后，通過直接酶聯(lián)免疫吸附測定(EIA)測試每個孔中培養(yǎng)基的B7RP1的特異性抗體。將來自各孔的顯示潛在結合的細胞種植到10ml培養(yǎng)物中并在液氮中冷凍。來自各培養(yǎng)物的培養(yǎng)基進一步在流式細胞計量計中和功能T細胞增殖測定中進行檢驗。將通過這些方法確定為可能有價值的那些鋪成單細胞集落，再次利用EIA進行選擇，并維持最后的細胞系用于產(chǎn)生抗體?？贵w通過A蛋白瓊脂糖色譜法從細胞培養(yǎng)基中純化。
T細胞制備和T細胞增殖測定來自C57B1/6小鼠(8-12周齡，雌性，Charles River Laboratories)脾臟的T細胞通過鼠T細胞富集柱(R&D Systems)利用負選擇加以純化。然后這些T細胞或者直接使用，或者如下所述利用抗體和補體裂解進一步純化。將細胞再懸浮于(2.5×106細胞/ml)含有針對鼠CD11b(克隆M1/70)、NK-1.1(克隆PK136)、CD8a(克隆53-6.7)、I-Ab(克隆M5/114.15.2)、CD11c(克隆HL3)和B220抗原(克隆RA3-6B2)的抗體(所有抗體都是10μg/ml并購自Pharmingen)的RPMI培養(yǎng)基中。然后這些細胞在冰上孵化30分鐘，在1200rpm下顆粒化，再懸浮于4∶1體積/體積的RPMI兔補體(Sigma，#S-7764)中并在37℃下再孵化30分鐘。再次將細胞顆?；?，并重復補體處理。鋪平板之前，細胞用含有10％FCS的RPMI洗滌。U形底96孔平板用抗CD3抗體(克隆145-2C11，Pharmingen，以O至1.2μg/ml范圍之間的濃度)和抗人IgG Fab2(Sigma，12.5μg/ml)在4℃下包被過夜，接著在37℃下溫育6-9小時。T細胞(1×105/孔)在沒有或有各種Fc融合蛋白的條件下培養(yǎng)48小時，并在最后的18小時中用1μCi3H-胸苷進行脈沖。對照Fc蛋白質包括OPG和Fc的融合蛋白和非融合Fc蛋白片段。然后收獲細胞并對摻入的放射性計數(shù)。B7RP-1-Fc以劑量依賴方式共同刺激T細胞增殖(圖15a)，而抗B7RP-1-Fc抗體劑量依賴性地特異性抑制這種共同刺激(圖15b)。
實施例18CRP-1/B7RP-1路徑的抑制劑減少了膠原誘導的類風濕性關節(jié)炎的發(fā)作膠原誘導的關節(jié)炎(CIA)是一種與人類的類風濕性關節(jié)炎有許多類似之處的嚙齒動物和靈長目動物的自身免疫性多動脈炎的動物模型。免疫接種異種II型膠原(CII)誘導導致CIA在易感小鼠品系中發(fā)育的對CII的自身免疫反應。帶有H-2r和H-2q的小鼠的同類品系對CIA是高度敏感的。CIA由CII反應性T細胞和抗體的協(xié)同作用介導。將豬CII(Nabozny等《自身免疫》20，51-58(1995))以2mg/ml的濃度溶于0.01N乙酸，然后以1∶1的比例用CFA(Difco)乳化。關節(jié)炎易感性B10.RIII(H-2r)小鼠(Jackson Laboratories，Bar Harbor，ME)在鼠尾底部皮內注射100μl溶液加以免疫。每周對小鼠的關節(jié)炎發(fā)展情況監(jiān)測2-3次。關節(jié)炎嚴重度如下所述使用對每只鼠爪的分級系統(tǒng)來確定0沒有關節(jié)炎；11-3個足趾發(fā)紅或腫脹；2爪子嚴重腫脹；3關節(jié)僵硬。將每個肢體的得分加以總結，得到每只動物的從0至12范圍的嚴重度。
小鼠用100μg(200μl)蛋白質腹膜內注射，每周兩次。用豬CII免疫接種1天后開始進行治療，免疫接種后第52天停止治療。實驗用每10只小鼠組成的治療組進行，得分為1或1以上的動物記為陽性。結果顯示于圖16和表1。
表1CRP-1、B7RP-1、CTLA-4和B7.2 Fc融合蛋白對關節(jié)炎發(fā)作的作用治療組 均值+/-標準偏差，發(fā)作的天數(shù)CTLA4-Fc60.0±0.0CRP1-Fc 48.9±13.2B7.2-Fc 28.4+14.1B7RP1-Fc33.9+16.6PBS 37.7+17.1在用CRP1-Fc融合蛋白治療的小鼠中，關節(jié)炎癥狀的發(fā)作與PBS治療小鼠相比延遲了大約10天。這證明CRP-1/B7RP-1路徑的抑制可以減輕這種類風濕性關節(jié)炎小鼠模型的疾病癥狀。
用B7RP-1-Fc或B7.2-Fc治療的小鼠與PBS治療的對照小鼠相比顯示出更快的疾病發(fā)作(表1和圖16a)并伴有關節(jié)炎嚴重度升高(圖16b)。這指示B7RP-1-Fc融合蛋白增強了T細胞免疫應答。這種活性可以用于在體內產(chǎn)生抗腫瘤免疫性。
CRP-1-Fc和B7RP-1-Fc在這種類風濕性關節(jié)炎的小鼠模型中的相反作用表明可以操作該路徑來增強或抑制疾病進程。用可溶性B7RP-1-Fc對CRP1蛋白質定向增強了疾病，而可溶性CRP-1-Fc與B7RP-1的相互作用抑制了疾病癥狀。
實施例19B7RP-1-Fc誘導轉基因小鼠的炎性腸病表型B7相關蛋白質(B7RP1-Fc)在22-25周齡轉基因小鼠體內的持續(xù)過度表達(實施例12)誘導了醒目的炎性腸病(IBD)的表型，伴有小腸和大腸的明顯增厚和慢性炎癥(小腸結腸炎)以及有些動物的體重減輕。從組織學上看，最嚴重的炎癥變化發(fā)現(xiàn)于近側和遠側結腸，且小腸有較輕微的變化。近側結腸顯著增厚，伴有裂隙潰瘍、透壁炎癥和結腸粘膜肥大，而遠側結腸有彌漫性粘膜肥大(或局灶性糜爛和腺萎縮)，沒有潰瘍。近側小腸有輕度到顯著的粘膜肥大，并伴有較輕微的炎性變化，而遠側小腸(回腸)在有些動物體內有輕度粘膜肥大，在其他小鼠體內有萎縮。腸的變化是最嚴重的，在雌性B7RP-1轉基因小鼠中發(fā)現(xiàn)的結果與此一致，但在該研究中在若干雄性轉基因小鼠中也觀察到了這樣的結果。
有趣的是我們注意到在近側結腸中發(fā)現(xiàn)的組織學特性包括裂隙潰瘍和伴有多核巨細胞的透壁慢性肉芽腫性炎癥更近似于在人的節(jié)段性回腸炎中而不是潰瘍性結膜炎中看到的那些。從形態(tài)學上看，這種結腸炎也摹擬了在缺乏白介素-10的小鼠中描述的IBD，這導致消瘦、貧血和影響它們的整個腸道的小腸結腸炎(Kuhn等，1993年；Sartor 1995；Leach等，1999年)。正如在IL-10分離小鼠中一樣，B7RP-1-Fc轉基因小鼠中的最初變化由不伴有結腸上皮增生的炎性細胞在粘膜固有層中的輕度、局灶性浸潤組成(實施例13)。在年老小鼠中，受影響的結腸節(jié)段因腺肥大/增生和慢性炎癥而變厚。B7RP-1-Fc小鼠的近側和遠側結腸有中度到重度的結腸炎，伴有炎性腸病(IBD)的組織學特性。近側結腸的受影響的節(jié)段(圖17B-17D)彌漫變厚，這是由于伴有粘膜腺伸長和擴張的顯著的腺上皮肥大和增生引起的(圖17B)，它具有數(shù)量增加的有絲分裂像和罕見的隱窩膿腫，但保留了有粘蛋白的杯狀細胞(圖17D)。粘膜固有層中有彌漫性慢性炎癥，這在有些動物體內透壁延伸到累及腸壁的下層，包括粘膜下層、肌層、漿膜和相鄰腸系膜脂組織(圖17B-17C)。炎性浸潤由淋巴細胞(主要是CD3+、CD44+T細胞)、漿細胞和混合有一些嗜中性白細胞和偶然多核巨細胞(圖17E)的上皮樣巨噬細胞(圖17F)組成，這是慢性肉芽腫性炎癥的特征。粘膜中也存在淋巴樣聚集物(大多數(shù)是B220+細胞，混合有少量CD3+細胞)，并且包圍了粘膜下層和更深的層包括腸系膜脂肪中的較小血管(圖17C)。腔中含有粘液膿性或粘液性滲出物(圖17D)。在這些B7RP-1-Fc轉基因小鼠中發(fā)現(xiàn)了結腸炎的嚴重跡象，有粘膜的多灶性裂隙潰瘍和透壁炎癥(圖17B-17C)。
B7RP-1-Fc轉基因小鼠的遠側結腸也彌漫性變厚和增生，伴有結腸腺伸長、嗜鹼細胞增多和擴張(圖18B-18G)，它們中有些含有隱窩膿腫(圖18D和18F)和粘液。固有層有淋巴細胞的輕度彌漫性炎性浸潤(主要是CD3+、CD44+細胞，特別是在淺層粘膜中；圖18E)，以及漿細胞和混合有一些嗜中性白細胞的上皮樣巨噬細胞的局灶性聚集物。淋巴樣聚集物(主要是B220+細胞；圖18D和18F)也分散在整個粘膜中。B7RP-1-Fc轉基因小鼠的小腸有更多的不定變化，包括伴有固有層中主要是淋巴漿細胞浸潤的輕度到局部顯著的粘膜和隱窩肥大和增生(圖19B和19D有范圍從1∶4到1.5∶1的隱窩/絨毛比值，與對照小鼠的1∶10對比)。粘膜增生在近側小腸包括十二指腸(圖19B)、特別是空腸(圖19D)中最顯著。在大多數(shù)嚴重受影響的小鼠體內隱窩結構是局部混亂和發(fā)育異常的(圖19D)。比較起來，一些小鼠的遠側小腸(回腸)有回腸粘膜的輕度、空隙性絨毛狀萎縮(圖19F)，并伴有絨毛的鈍化、增厚或局部損失(隱窩∶絨毛比為1∶1或更小，代替了正常的比值1∶2)，而其他小鼠有輕度回腸粘膜肥大。
B7RP-1-Fc融合蛋白發(fā)揮作用，激活了對引起與人類節(jié)段性回腸炎非常類似的表型起作用的細胞。這顯示可能是引起節(jié)段性回腸炎中炎癥的原因的細胞被B7RP-1-Fc融合蛋白激活了。因此B7RP-1的可溶性蛋白質、抗體或小分子抑制劑可以用于抑制IBD。
實施例20B7RP-1-Fc融合蛋白抑制小鼠體內腫瘤生長為了檢驗B7RP-1和CRP-1對免疫原性鼠Meth A肉瘤的生長的作用，我們研究了可溶性B7RP1-Fc是否影響B(tài)alb/c小鼠體內建立的MethA肉瘤的生長。
0天時，指數(shù)生長的Meth A肉瘤細胞通過皮內注射0.5百萬細胞而植入到Balb/c小鼠的腹部。第7天，當腫瘤達到～100mm3時，小鼠在第7、10、14和17天時在頸部皮下注射載體(PBS)或B7RP-1-Fc(8mg/kg)進行治療。利用測徑器測量腫瘤的二維直徑并使用公式腫瘤體積＝[{(寬)2x長}/2]估計腫瘤體積(mm3)。檢測腫瘤的生長直到第28天。每組有8只小鼠。
對照腫瘤的Meth A肉瘤生長方式是二相性的緩慢的初始相后是相對迅速的指數(shù)相。在B7RP-1-Fc治療小鼠中，在迅速的指數(shù)期中腫瘤的生長顯著放慢。第28天，對照小鼠和B7RP1-Fc治療小鼠的平均體積分別是1410mm3和580mm3(圖20)。因此，在這種模型中B7RP-1-Fc治療顯著抑制了腫瘤的生長。該數(shù)據(jù)有力地提示了可溶性B7RP-1-Fc蛋白質和B7RP-1/CRP-1路徑的其他激活物在免疫原性腫瘤的治療中的有益的治療功用。
免疫學抗腫瘤活性與細胞溶解性T淋巴細胞(CTL)功能密切相關。一致地，B7RP-1-Fc蛋白在細胞溶解性CD8+T細胞上表達(實施例9，圖6)。這些數(shù)據(jù)有力地支持了B7RP-1對細胞溶解性CD8+T細胞的功能。因此，B7RP-1-Fc或B7RP-1/CRP-1路徑的其他刺激物可以用于增強用于大量非癌相關適應癥的細胞溶解性T細胞和細胞免疫功能。
實施例21人B7RP-1活性的體外抑制為了確定人B7RP-1是否具有正的共同刺激性能，我們在T細胞增殖測定中檢驗了表達人B7RP-1和人B7RP-1-Fc融合蛋白的細胞。人B7RP-1-Fc融合蛋白通過將與氨基酸1至247相對應的基因序列與部分人IgG1基因序列融合來構建(實施例14)。人CRP-1-Fc融合蛋白通過將與氨基酸1至146相對應的基因序列與部分人IgG1基因序列融合來構建(實施例2)。這兩種融合蛋白的構建、表達和純化方法如實施例7中所述進行。B7RP-1-Fc示范了依賴于抗CD3刺激的共同刺激活性(圖21a)。另外，這種活性可以特異性地被可溶性CRP-1-Fc蛋白抑制(圖21b)。使用含有整個編碼序列的表達膜結合人B7RP-1的CHO細胞得到了類似的共同刺激效果(圖21c)。
在上述體外增殖條件下測定人T細胞產(chǎn)生細胞因子的情況。已受激48和72小時的來自T細胞培養(yǎng)物的上清液按照制造商的說明書(BioSource Intemational)利用ELISA分析其IL-2、IL-10和IFN-γ。IFN-γ和IL-10濃度顯著升高；但是，與用CD28共同刺激的情況不同，IL-2沒有顯著的誘導出(圖21d)。如實施例13中所述，升高濃度的IFN-γ-一種Th1細胞因子，與B7RP-1增加IgG2a的功能相關。
體外T細胞共同刺激測定如下進行。高度純化的人T細胞(＞98％CD3+)使用mAb標記磁珠(Miltenyi Biotec)通過新鮮或融化的粘著除盡的PBMC的負選擇加以分離。T細胞(1×105細胞/孔)以一式三份在96孔平板中在200μl/孔RPMI+10％FCS中培養(yǎng)。為了評估B7RP-1-Fc共同刺激，將存在于100μl 1X PBS中的不同濃度的抗CD3(Pharmingen)和10μg/ml抗人IgG Fc(Sigma)通過在4℃下孵化過夜而預先涂敷到U形底的平板上。將未結合的抗CD3和抗人IgG Fc除去，細胞在有或沒有各種濃度的B7RP-1-Fc、OPG-Fc對照或抗CD28(Pharmingen)的條件下進行培養(yǎng)。對于B7RP-1-Fc共同刺激的CRP-1-Fc抑制，T細胞在預先涂敷了0.33μg/ml抗CD3和10μg/ml抗人IgG Fc的孔中、在從10μg/ml開始的連續(xù)稀釋的CRP-1-Fc或OPG-Fc的存在下用0.5μg/ml B7RP-1-Fc培養(yǎng)。為了評估由表達B7RP-1的CHO細胞產(chǎn)生的共同刺激，T細胞在平底平板中、在有或沒有不同量的絲裂霉素C處理過的CHO B7RP-1細胞或CHO載體細胞的條件下、用不同濃度的可溶性抗CD3培養(yǎng)。為了檢驗T細胞增殖情況，在72小時培養(yǎng)物的最后18個小時中，培養(yǎng)物用1μCi/孔[3H]TdR進行脈沖。T細胞增殖通過摻入的[3H]TdR來測定。來自三個隨機供體的一個代表性實驗結果表示為摻入的平均CPM+/-SD。對于細胞因子產(chǎn)生的分析，將細胞培養(yǎng)48和72小時，收集上清液用于ELISA。
這些實驗表明，人B7RP-1的胞外部分，如實施例14中所述，當與人Fc片段融合時，可以在體外共同刺激T細胞。這種共同刺激受到CRP-1-Fc的抑制，并因此證明了人B7RP-1的可溶性抑制劑可以怎樣起作用。體外測定，諸如此處描述的使用人B7RP-1和CRP-1進行的，可以用于篩選B7RP-1/CRP-1活性的抗體、可溶性蛋白、多肽或小分子抑制劑。
***盡管本發(fā)明已根據(jù)優(yōu)選的實施方案進行了描述，但應當理解本領域技術人員將可以進行變化和修改。因此，我們的打算是所附的權利要求書覆蓋所有在所請求保護的本發(fā)明范圍內出現(xiàn)的這類等價變化。
序列表<110>Amgen Inc.<120>與免疫應答有關的新穎多肽<130>A-579-A<140>09/264，527<141>1999-03-08<160>35<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>600<212>DNA<213>小鼠<220><221>CDS<222>互補物((1)..(600))<400> 1atg aag ccg tac ttc tgc cgt gtc ttt gtc ttc tgc ttc cta atc aga48Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg1 5 10 15ctt tta aca gga gaa atc aat ggc tcg gcc gat cat agg atg ttt tca96Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser20 25 30ttt cac aat gga ggt gta cag att tct tgt aaa tac cct gag act gtc144Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val35 40 45cag cag tta aaa atg cga ttg ttc aga gag aga gaa gtc ctc tgc gaa192Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu50 55 60ctc acc aag acc aag gga agc gga aat gcg gtg tcc atc aag aat cca240Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro65 70 75 80atg ctc tgt cta tat cat ctg tca aac aac agc gtc tct ttt ttc cta288Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu85 90 95aac aac cca gac agc tcc cag gga agc tat tac ttc tgc agc ctg tcc336Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser100 105 110att ttt gac cca cct cct ttt caa gaa agg aac ctt agt gga gga tat384Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr115 120 125ttg cat att tat gaa tcc cag ctc tgc tgc cag ctg aag ctc tgg cta 432Leu His Ile Tyr Glu Ser Gln Leu Cys Cys Gln Leu Lys Leu Trp Leu130 135 140ccc gta ggg tgt gca gct ttc gtt gtg gta ctc ctt ttt gga tgc ata 480Pro Val Gly Cys Ala Ala Phe Val Val Val Leu Leu Phe Gly Cys Ile145 150 155 160ctt atc atc tgg ttt tca aaa aag aaa tac gga tcc agt gtg cat gac 528Leu Ile Ile Trp Phe Ser Lys Lys Lys Tyr Gly Ser Ser Val His Asp165 170 175cct aat agt gaa tac atg ttc atg gcg gca gtc aac aca aac aaa aag 576Pro Asn Ser Glu Tyr Met Phe Met Ala Ala Val Asn Thr Asn Lys Lys180 185 190tct aga ctt gca ggt gtg acc tca 600Ser Arg Leu Ala Gly Val Thr Ser195 200<210>2<211>200<212>PRT<213>小鼠<400>2Met Lys Pro Tyr Phe Cys Arg Val Phe Val Phe Cys Phe Leu Ile Arg1 5 10 15Leu Leu Thr Gly Glu Ile Asn Gly Ser Ala Asp His Arg Met Phe Ser20 25 30Phe His Asn Gly Gly Val Gln Ile Ser Cys Lys Tyr Pro Glu Thr Val35 40 45Gln Gln Leu Lys Met Arg Leu Phe Arg Glu Arg Glu Val Leu Cys Glu50 55 60Leu Thr Lys Thr Lys Gly Ser Gly Asn Ala Val Ser Ile Lys Asn Pro65 70 75 80Met Leu Cys Leu Tyr His Leu Ser Asn Asn Ser Val Ser Phe Phe Leu85 90 95Asn Asn Pro Asp Ser Ser Gln Gly Ser Tyr Tyr Phe Cys Ser Leu Ser100 105 110Ile Phe Asp Pro Pro Pro Phe Gln Glu Arg Asn Leu Ser Gly Gly Tyr
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權利要求
1.包含選自下列成員的核苷酸序列的分離核酸分子a)、圖1A中顯示的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；b)、編碼圖1A中顯示的殘基1-200或21-200的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；c)、編碼與圖1A中顯示的多肽至少約70％相同的多肽的核苷酸序列(SEQ ID NO1)；d)、(a)、(b)或(c)任一個的天然產(chǎn)等位變體或可變剪接變體；e)、與(a)、(b)或(c)任一個互補的核苷酸序列；f)、編碼至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少約10、15、20、25、50、75、100或大于100個核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在嚴格條件下與(a)-(g)任何之一雜交的核苷酸序列。
2.包含選自下列成員的核苷酸序列的分離核酸分子a)、圖2A(SEQ ID NO11)或圖3A(SEQ ID NO6)或圖12A(SEQ IDNO16)中顯示的核苷酸序列；b)、編碼圖2A(SEQ ID NO6)中顯示的殘基1-322或殘基47-322的多肽或者圖3A(SEQ ID NO11)中顯示的殘基1-288或殘基19-288、20-288、21-288、22-288、24-288或28-288的多肽或者圖12A中顯示的殘基1-302或殘基19-302、20-302、21-302、22-302、24-302或28-302的多肽的核苷酸序列；c)、編碼與圖2A(SEQ ID NO6)或圖3A(SEQ ID NO11)或圖12A(SEQ ID NO16)中顯示的多肽至少約70％相同的多肽的核苷酸序列；d)、(a)、(b)或(c)任一個的天然產(chǎn)等位變體或可變剪接變體；e)、與(a)、(b)或(c)任一個互補的核苷酸序列；f)、編碼至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的多肽片段的(b)、(c)或(d)的核苷酸序列；g)、包含至少約10、15、20、25、50、75、100或大于100個核苷酸的片段的(a)、(b)或(c)的核苷酸序列；和h)、在嚴格條件下與(a)-(g)任何之一雜交的核苷酸序列。
3.權利要求1或2的核酸分子，其中核苷酸序列是與表達控制序列可操作地相連的。
4.一種宿主細胞，它包含權利要求2的核酸分子。
5.權利要求3的宿主細胞，它是真核細胞。
6.權利要求3的宿主細胞，它是原核細胞。
7.一種生產(chǎn)多肽的方法，它包括使權利要求3的宿主細胞的培養(yǎng)物在合適的培養(yǎng)基中生長和從該培養(yǎng)物分離多肽。
8.用權利要求7的方法生產(chǎn)的多肽。
9.由權利要求1的核酸分子編碼的多肽。
10.由權利要求2的核酸分子編碼的多肽。
11.包含選自下列成員的氨基酸序列的分離多肽a)、圖1A中顯示的氨基酸序列(SEQ ID NO2)；b)、圖1A(SEQ ID NO2)中顯示的包含位于殘基21上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、圖1A(SEQ ID NO2)中顯示的包含至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位變體或可變剪接變體。
12.包含選自下列成員的氨基酸序列的分離多肽a)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)或圖12A(SEQ IDNO17)中顯示的氨基酸序列；b)、圖2A(SEQ ID NO7)中顯示的包含位于殘基47上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或圖3A(SEQ ID NO12)中顯示的包含位于殘基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列，或圖12A(SEQ ID NO17)中顯示的包含位于殘基19、20、21、22、24或28任何之一上的成熟氨基端的成熟氨基酸序列；c)、圖2A(SEQ ID NO7)或圖3A(SEQ ID NO12)或圖12A(SEQID NO17)中顯示的包含至少約25、50、75、100或大于100個氨基酸殘基的氨基酸序列的片段；d)、(a)、(b)或(c)的直向同源物；和e)、(a)、(b)、(c)或(d)的等位變體或可變剪接變體。
13.與權利要求9、10、11或12的多肽特異性結合的抗體或其片段。
14.權利要求11的抗體，它是單克隆抗體。
15.權利要求13的抗體，它是人抗體。
16.權利要求13的抗體，它是人源化或CDR嫁接抗體。
17.權利要求13的抗體或其片段，它結合B7RP1或B7RP1胞外域。
18.權利要求13的抗體或其片段，它抑制B7RP1與CRP1的結合。
19.一種組合物，它包含權利要求9、10、11或12的多肽和藥學上可接受的載體、佐劑、加溶劑、穩(wěn)定劑或抗氧劑。
20.一種多肽，它包含權利要求9、10、11或12的多肽的衍生物。
21.權利要求20的多肽，它是用水溶性聚合物共價修飾的。
22.一種融合多肽，它包含與異源氨基酸序列融合的權利要求9、10、11或12的多肽。
23.權利要求22的融合多肽，其中異源氨基酸序列是IgG恒定結構域或其片段。
24.一種治療、預防或改善T細胞介導疾病的方法，它包括對動物給藥權利要求9、10、11或12的多肽。
25.一種診斷動物的T細胞介導疾病或對T細胞介導疾病的敏感性的方法，它包括a)測定權利要求9、10、11或12的多肽的表達的存在或量；和b)基于多肽表達的存在或量來診斷T細胞介導疾病或對T細胞介導疾病的敏感性。
26.一種鑒別與多肽結合的檢驗分子的方法，它包括a)使權利要求9、10、11或12的多肽與檢驗分子接觸；和b)測定多肽與檢驗分子的結合程度。
27.權利要求26的方法，它進一步包括當多肽與化合物結合時測定其活性。
28.調節(jié)動物體內T細胞活化或增殖的方法，包括對動物給藥權利要求1、2或3的核酸分子。
29.一種轉基因非人哺乳動物，它包含權利要求3的核酸分子。
30.抑制動物體內免疫應答的方法，包括對動物給藥CRP-1或B7RP-1的拮抗劑。
31.權利要求30的方法，其中拮抗劑是結合B7RP-1的抗體。
全文摘要
本發(fā)明公開了與T細胞活化有關的包含受體－配體對的新穎多肽。還公開了編碼所述多肽的核酸分子,以及用于表達其的載體和宿主細胞。這些多肽或其激動劑和拮抗劑用于治療T細胞介導的疾病。
文檔編號A61P3/00GK1346370SQ00805783
公開日2002年4月24日 申請日期2000年1月27日 優(yōu)先權日1999年2月3日
發(fā)明者S·K·約施納加 申請人:安姆根有限公司