專利名稱：傳染性法氏囊病病毒(ibdv)主要宿主保護(hù)性抗原(vp2)基因生產(chǎn)vp2蛋白法及其基因工程的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種VP2基因及真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)VP2蛋白的方法以及VP2基因工程疫苗。
傳染性法氏囊病病毒(IBDV)感染雛雞誘發(fā)免疫抑制，死亡率可高達(dá)100％，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。防治IBDV的經(jīng)典疫苗是弱毒苗和滅活苗，弱毒苗的最大缺點(diǎn)是其潛在的傳染性和致病性，而滅活苗的免疫效果不太穩(wěn)定。飛速發(fā)展的生物技術(shù)促進(jìn)了IBDV基因工程疫苗的研制。人們利用多種真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)IBDV主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)以制備IBDV基因工程疫苗Macreadie等(Macreadie I G,Vaughan P R,Chapman A J,Makern N M,Jagadish M N,Heine M N,Ward H G,Fahey K J.& Azad A A.Passive Protectionagainst infectious bursal disease virus by viral VP2 expressed in yeast.Vaccine,1990,8:549-552)用酵母細(xì)胞表達(dá)的VP2粗提液制成注射疫苗，Bayliss等(Bayliss C D,Perters R W,Cook J KA,Reece RL,HowesK,Binns M N.& Boursnell M E G.A recombinant fowlpox virus thatexpresses the VP2 antigen of infectious bursal disease virus inducesprotection against mortality caused by the virus.Archives of Virology,1991,120:193-205)用重組禽痘病毒表達(dá)的VP2制成注射疫苗，Vakharia等(Vakharia V N,Snyder D B,He J,Edwards G H,Savage P K.& Mengel-Whereat S A.Infectious bursal disease virus structuralproteion in chickens.Journal of General Virology,1993,74∶1210-1206)、Dybbing等(Dybbing J K.& Jackwood D J.Antigenic andimmunogenic properties of baculovirus expressed infectious bursaldisease viral proteins.Avian Diseases,1998,42:80-91)利用重組苜蓿銀紋夜蛾核型多角體病毒AcNPV在Sf細(xì)胞中表達(dá)的VP2制成注射疫苗，Darteil等(Darteil R,Bublot M,Laplace E,Bouguet J-F,AudonnetJ-C.& Riviere M.Herpesvirus of Turkey Recombinant Virusesexpressing infectious bursal disease virus(IBDV)VP2 immunogen induceprotection against an IBDV virulent challenge in chickens.Virology,1995,211∶481-490)用重組火雞皰疹病毒表達(dá)的VP2制成注射疫苗，Sheppard等(Sheppard M,Werner W.& Tsatas D.Fowl adenovirusrecombinant expressing VP2 of infectious bursal disease virus induceprotective immunity against bursal disease.Archives of Virology,1998,143:915-930)用重組禽腺病毒表達(dá)的VP2制成注射疫苗，Heine等(Heine H G.& Boyle D B.Infectious bursal disease virus structuralprotein VP2 expressed by a fowlpox virus recombinant Confer protectionagainst disease in chickens.Archives of Virology,1993,131:277-292)用禽痘病毒表達(dá)的VP2制成注射疫苗。這些在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)的VP2均能提供不同程度的免疫保護(hù)，但是由于大量培養(yǎng)細(xì)胞成本昂貴，條件設(shè)備要求嚴(yán)格，技術(shù)難度較大，因此限制了表達(dá)蛋白在免疫防治IBDV的實(shí)際應(yīng)用。
本發(fā)明的目的在于提供一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種大規(guī)模、低成本生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)蛋白的方法。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是在此基礎(chǔ)上提供價(jià)格低廉、使用簡便且有效的IBDV基因工程疫苗。
本發(fā)明提供的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因，其核苷酸序列如說明書附圖中的

圖1。
本發(fā)明提供的生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)蛋白的方法為它以家蠶或蛹表達(dá)上述基因蛋白，并包括如下步驟(1)．將VP2基因克隆到家蠶核型多角體病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體上獲得重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體，(2)．將步驟(1)所說的重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體DNA與經(jīng)修飾的線性化家蠶核型多角體病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，體內(nèi)重組產(chǎn)生帶有該VP2基因的重組家蠶核型多角體病毒，(3)．多輪空斑純化步驟(2)所說的重組病毒，(4)．用步驟(3)所說的重組病毒感染家蠶幼蟲(或蛹)，體內(nèi)表達(dá)VP2蛋白。
本發(fā)明提供的IBDV基因工程疫苗可以是一種注射疫苗它包括所述的感染重組病毒的家蠶幼蟲的血淋巴和免疫佐劑，家蠶血淋巴免疫佐劑=1∶1～3(V∶V)。
所述的免疫佐劑可以是免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)、礦物油、弗氏不完全佐劑等。
本發(fā)明提供的IBDV基因工程疫苗也可以是一種口服疫苗所述的感染重組病毒的家蠶幼蟲的血淋巴干粉的無菌水溶液或生理鹽水溶液，血淋巴干粉的濃度為20～150mg/ml。
本發(fā)明與現(xiàn)有IBDV VP2表達(dá)方法相比具有以下優(yōu)點(diǎn)(1)家蠶馴養(yǎng)在中國已有幾千年的歷史，隨著家蠶人工飼養(yǎng)技術(shù)的建立，現(xiàn)已能在無菌條件下年四季不間斷地進(jìn)行大規(guī)模飼養(yǎng)；(2)家蠶幼蟲(和蛹)的表達(dá)成本與目前的培養(yǎng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)相比低100～1000倍，每條家蠶幼蟲對VP2的表達(dá)量相當(dāng)于100mlTC-100完全培養(yǎng)基(10％胎牛血清)培養(yǎng)的BmN細(xì)胞的VP2表達(dá)量，每條蠶的成本低于0.1元人民幣，而細(xì)胞培養(yǎng)成本則不低于50元人民幣；(3)表達(dá)生產(chǎn)設(shè)備簡單，易于操作，家蠶幼蟲經(jīng)家蠶核型多角體病毒感染、于室溫飼養(yǎng)4～8天即可收集蠶血淋巴，低速離心去雜質(zhì)即可得到VP2粗蛋白；(4)家蠶核型多角體病毒對人、禽、畜無侵染性，是較為安全的表達(dá)系統(tǒng)。
本發(fā)明提供的基因工程疫苗，其VP2蛋白無需純化，因而生產(chǎn)方法簡單，成本低廉。口服基因工程疫苗，可與飼料混合使用，非常方便，避免了注射免疫所容易產(chǎn)生的疾病傳染及雞群不安。
下面結(jié)合附圖、附表及實(shí)施例對本發(fā)明作詳細(xì)描述。
圖1本發(fā)明提供的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因序列。
圖2本發(fā)明提供的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因在家蠶細(xì)胞中表達(dá)的Western印跡。
圖3本發(fā)明提供的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因在春蠶和秋蠶幼蟲中的表達(dá)。
圖4本發(fā)明提供的IBDV注射及口服基因工程疫苗免疫雛雞群后，被免疫雞群血清中IBDV中和抗體效價(jià)變化曲線。
圖5為服用正常蠶血雞群攻毒其法氏囊組織病理切片。
圖6本發(fā)明提供的IBDV注射基因工程疫苗免疫雛雞群后，被免疫雞群法氏囊組織病理切片。
圖7本發(fā)明提供的IBDV口服基因工程疫苗免疫雛雞群后，被免疫雞群法氏囊組織病理切片。
圖8為本發(fā)明提供的IBDV注射及口服基因工程疫苗免疫保護(hù)的統(tǒng)計(jì)分析表。
2．取一經(jīng)DEPC處理過的新的0.5ml eppendorf管加入含1ug步驟1所說的HZ96基因組RNA溶液，補(bǔ)加水至12ul,100℃水浴變性5min，冰淬滅5min，6個(gè)核苷酸(是否有確定的名稱，是否可以寫出)隨機(jī)引物反轉(zhuǎn)錄(Reverse transcription,RT)合成第一鏈cDNA，以引物5’AA ATCGATG ACA AAC CTG CAA GAT CAAACC C3’和5’AA AAGCTT A GGC AGC TCT TGC TTT TCC 3’進(jìn)行第一次聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain reaction,PCR)，反應(yīng)程序如下94℃預(yù)變性2min,94℃ 1min,57℃ 1.5min,72℃ 1.5min，共進(jìn)行35個(gè)循環(huán)，72℃保溫延伸10min。
3．以步驟2所說的PCR產(chǎn)物為模板，以引物5’AAA AGATCT ATGCCA ACA ACC GGA CCG GCG TCC 3’(AGATCT為核酸內(nèi)切酶BglⅡ的酶切位點(diǎn))和5’AA AAGCTT A CGC GGC TCG AGC AGT TCCTGA AGC 3’(AAGCTT為核酸內(nèi)切酶HindⅢ的酶切位點(diǎn))進(jìn)行巢式PCR，反應(yīng)程序如下94℃預(yù)變性2min,94℃ 1min,60℃ 1.5min,72℃ 1.5min，共進(jìn)行30個(gè)循環(huán)，72℃保溫延伸10min。
4核酸內(nèi)切酶BglⅡ和HindⅢ雙酶切步驟(3)所說的PCR產(chǎn)物，并克隆到載體pBlue script SK(已商品化)的BamHⅠ和HindⅢ位點(diǎn)中，獲得重組載體pBlVP2，并對此外源片段進(jìn)行序列分析。
含pBIVP2的宿主細(xì)胞在中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，編號為CGMCC NO.0447參照圖1本發(fā)明提供的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因序列。
(二)．將步驟(一)所說的重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體DNA與經(jīng)修飾的線性化家蠶核型多角體病毒Bm-BacPAK6 DNA(胡建新，家蠶核型多角體病毒同源重復(fù)區(qū)復(fù)制功能及重組病毒表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建和改進(jìn)，博士論文，1994，中國科學(xué)院上海生化所)共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，體內(nèi)重組產(chǎn)生帶有該VP2基因的重組家蠶核型多角體病毒在25cm2細(xì)胞培養(yǎng)瓶中接入2×106個(gè)家蠶卵巢BmN細(xì)胞，28℃保溫4-6hr使細(xì)胞貼壁，取-0.5ml eppendorf管加入0.2ug修飾的家蠶核型多角體病毒Bm-BacPAK6 DNA和1.0ug轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA，加滅菌H2O至終體積50ul，輕輕混勻，另取-0.5ml eppendorf管加入6ul脂質(zhì)體Dorsper(1ug/ul)和44ul HBS液，輕輕混勻，然后將上述50ul DNA溶液加入至脂質(zhì)體管中，輕輕混勻；室溫放置15min，將培養(yǎng)瓶中貼壁BmN細(xì)胞的培養(yǎng)上清吸去，用無血清1×TC-100每次4ml洗細(xì)胞3次，除去原培養(yǎng)基中的FBS成份，在培養(yǎng)細(xì)胞中加2ml無血清1×TC-100培養(yǎng)基，然后將100ul Dorsper/DNA混合液滴加到細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，輕輕搖動(dòng)培養(yǎng)瓶，使脂質(zhì)體分布均勻。細(xì)胞內(nèi)重組產(chǎn)生帶有IBDVVP2基因的重組家蠶核型多角體病毒。28℃培養(yǎng)6天后收集培養(yǎng)細(xì)胞上清用于空斑純化重組病毒。
(三)．多輪空斑純化步驟(二)所說的重組病毒分別接種1×106BmN細(xì)胞于若干個(gè)35mm培養(yǎng)皿中，貼壁生長4-6hr。用新鮮1×TC-100完全培養(yǎng)基10倍梯度稀釋步驟(二)所說的細(xì)胞上清病毒液，然后用不同稀釋度100、10-1、10-2、10-3的病毒感染液1ml置換上述各平皿中的培養(yǎng)基，感染1hr后吸棄感染液，將預(yù)先溶解并保溫于37℃的2％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠與保溫于37℃的2×TC100完全培養(yǎng)基按體積比1∶1混合均勻(培養(yǎng)基終濃度為1×，瓊脂糖凝膠終濃度為1％)。在每個(gè)培養(yǎng)皿中各鋪2ml，待凝膠凝固后，將平皿倒置，28℃培養(yǎng)。4天后，顯微鏡檢可以發(fā)現(xiàn)病毒感染形成的空斑。用tip頭將空斑位置的凝膠挑出，加入含200ul TC100完全培養(yǎng)基的0.5ml eppendorf管中浸泡12hr左右。取50ul該病毒液感染鋪于96孔板的BmN細(xì)胞。感染三天后觀察有無病毒感染癥狀以判斷原先挑斑是否正確，若正確，四天后可根據(jù)有無LacZ基因的表達(dá)等表型來初步判定所挑空斑中是否含有重組病毒。取100ul病毒侵出液，接種鋪于25cm2培養(yǎng)瓶中的BmN細(xì)胞，進(jìn)行下一輪空斑篩選。經(jīng)過3-4輪空斑篩選純化，得到不雜有親代病毒的重組病毒。
(四)．用步驟(三)所說的純化重組家蠶核型多角體病毒感染家蠶幼蟲(或蛹)，大規(guī)模生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)蛋白。
參照圖2。用重組家蠶核型多角體病毒以5pfu的感染復(fù)數(shù)感染單層家蠶細(xì)胞，96小時(shí)后收集細(xì)胞，作SDS-PAGE電泳，Western印跡檢測到了兩種不同分子量的蛋白質(zhì)52kD和38kD，克隆的IBDV HZ96 VP2基因編碼52kD蛋白質(zhì)，而成熟VP2蛋白的分子量為37～40kD，說明此重組家蠶核型多角體病毒能在家蠶細(xì)胞中表達(dá)VP2基因。圖中1表示Proteins Marker；2及4表示Lysate of BmNcells infected with rBac VP2-1；3及5表示Lysate ofBmN cells infectedwithBacPAK。
參照圖3。用30ul接種針于家蠶幼蟲皮下節(jié)間膜接種步驟(三)所說的純化重組家蠶核型多角體病毒，于接種后3,4,5,6,7,8天收集蠶血淋巴，5000rpm低速離心10min取上清，0.05％Triton-X100裂解細(xì)胞，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)測定VP2在家蠶幼蟲中的表達(dá)，結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)所用秋蠶在接種后第7天表達(dá)VP2達(dá)到最大值，而春蠶則在第4天達(dá)到最大值。
其生產(chǎn)方法為收集上述家蠶的血淋巴，3000rpm低速離心5min收集上清，將該上清與免疫佐劑在1∶1～3(V∶V)的范圍中的任意比例混勻即可，例如1∶2。
本實(shí)施例描述了本發(fā)明提供的IBDV基因工程疫苗的其中一種。它為口服疫苗它為以上所述的感染重組病毒的家蠶幼蟲的血淋巴干粉的無菌水溶液或生理鹽水溶液，血淋巴干粉的濃度為20～150mg/ml，例如50mg/ml。
其生產(chǎn)方法為收集上述家蠶的血淋巴，冷凍干燥成干粉，無菌水或生理鹽水溶解制成口服疫苗，血淋巴干粉的濃度為20～150mg/ml，例如50mg/ml。
參照圖4。用注射IBDV基因工程疫苗皮下注射接種非免疫雛雞，每只0.5ml，疫苗中家蠶血淋巴與免疫佐劑如弗氏不完全佐劑1∶2，兩周后加強(qiáng)免疫，收集首次免疫后第10,13,21,28,37天血清；用口服IBDV基因工程疫苗以每只雛雞喂服1ml疫苗，干粉濃度為50mg/ml，隔天喂服10次，收集首次喂服免疫后第10,13,21,28,37天血清；按以下方法測定上述血清中的IBDV中和抗體效價(jià)9日齡非免疫胚在無菌條件下，用剪刀剪成小塊，去除眼、內(nèi)臟和爪；用MEM液清洗二次，移至消化瓶繼續(xù)剪成糊狀，加入4倍量0.25％胰酶消化液，37℃水浴消化30min，用MEM洗二次，洗去胰酶消化液，加入細(xì)胞培養(yǎng)液(8％FBS+2％青霉素+2％鏈霉素+MEM液，pH7.0～7.2)，搖勻，紗布過濾，用細(xì)胞培養(yǎng)液將雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)細(xì)胞濃度稀釋至1～1.5×106個(gè)細(xì)胞/ml MEM培養(yǎng)液，細(xì)胞以每孔180ul培養(yǎng)于96孔板中；用MEM液2倍稀釋收集的免疫雞血清，待96孔板中的CEF細(xì)胞長成單層后，將稀釋的雞血清滴加到CEF細(xì)胞孔中，每一種稀釋梯度滴加5孔CEF細(xì)胞，然后往每孔加入100 TCID50 IBDV JD1株(由浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院保存)，根據(jù)CEF細(xì)胞的病理學(xué)效應(yīng)(Reed-Muench法)計(jì)算血清中的病毒中和抗體效價(jià)，將效價(jià)的幾何平均數(shù)(GMT)的變化繪制成圖4，從圖中可以看出在首次注射和口服免疫后的第10天即可檢測到較高的中和抗體水平，然后逐漸升高，在首次免疫后第37天分別達(dá)到1∶4211.4和1∶3118.9，而正常蠶血免疫組和健康對照組幾乎檢測不到被免疫雞群血清中的IBDV中和抗體。
參照圖6、7。首次注射或喂服免疫后第37天，注射疫苗為家蠶血淋巴與免疫佐劑如礦物油1∶2.5，口服疫苗為血淋巴干粉的濃度為70mg/ml。用中國IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85以點(diǎn)眼攻擊被免疫雞群，強(qiáng)毒IBDV攻擊后第3天，100％的正常蠶血免疫組雞群開始表現(xiàn)典型的傳染性法氏囊病癥狀，20％的口服免疫組雞群表現(xiàn)輕微的傳染性法氏囊病癥狀，而全部注射疫苗免疫雞群及其它80％口服疫苗喂服雞群均未表現(xiàn)傳染性法氏囊病臨床癥狀。取出雞群法氏囊，10％甲醛固定，包埋，切片，HE染色，鏡檢法氏囊組織的病理變化。圖6、7表明在標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85攻擊后第三天未表現(xiàn)傳染性法氏囊病臨床癥狀的免疫雞群法氏囊未發(fā)生病理變化，圖5為服用正常蠶血雞群攻毒其法氏囊組織病理切片。
參照圖8。本發(fā)明提供的注射和口服基因工程疫苗免疫18日齡雛雞，注射疫苗為中家蠶血淋巴與免疫佐劑如ISCOM 1∶1.5，口服疫苗為血淋巴干粉的濃度為120mg/ml。首次注射或喂服免疫后第37天，用中國IBDV標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株BC6/85以點(diǎn)眼攻擊被免疫雞群，3天后撲殺，觀察法氏囊病變情況，稱體重和囊重，計(jì)算囊體比(BBWR)和囊指數(shù)(BBIX)，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。該表說明注射免疫組(組Ⅰ)、口服免疫組(組Ⅱ)的囊體比(BBWR)和囊指數(shù)(BBIX)與正常對照組(組V，不免疫也不攻毒)相比無統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)，正常蠶血免疫攻毒組(組Ⅲ)與非免疫攻毒組(組Ⅳ)相比無統(tǒng)計(jì)差異(P＞0.05)，而組Ⅰ與組Ⅲ或組Ⅳ、組Ⅱ與組Ⅲ或組Ⅳ的囊體比(BBWR)和囊指數(shù)(BBIX)有顯著統(tǒng)計(jì)差異(P＜0.05)。該表的統(tǒng)計(jì)分析表明本發(fā)明提供的注射和口服基因工程疫苗的免疫保護(hù)率分別為100％和80％。
*囊體比(BBWR)=法氏囊重÷雞體重×1000，** 囊指數(shù)(BBIX)=(法氏囊重÷被免疫的雞體重)÷(法氏囊重÷非免疫時(shí)的雞體重)，A Fisher′st-test無顯著差異(P＞0.05)，B Fisher′st-test有顯著差異(P＜0.05)，＋法氏囊輕微損傷，法氏囊中度或嚴(yán)重?fù)p傷。
權(quán)利要求
1．具有下列核苷酸序列的傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因1 atgccaacaa ccggaccggc gtccattccg gacgacaccc tggagaagca cactctcagg61 tcagagacct cgacctacaa tttgactgtg ggggacacag ggtcagggct aattgtcttt121 ctccctggaa tccctggctc aattgtgggt gctcactaca cactgcagag caatgggaac181 tacaagttcg atcagatgct cctgactgcc cagaacctac cggccagtta caactactgc241 aggctagtga gtcggagtct cacagtgagg tcaagcacac ttcctggtgg cgtttatgca301 ctaaacggca ccataaacgc cgtgaccttc caaggaagcc tgagtgaact gacagatgtt361 agctacaatg ggttgatgtc tgcaacagcc aacatcaacg acaaaattgg gaacgtccta421 gtaggggaag gggccaccgt cctcagctta cccacatcat atgatcttgg gtatgtgagg481 cttggtgacc ccattcccgc aatagggctt gacccaaaaa tggtagccac atgtgacagc541 agtgacaggc ccagagtcta caccataact gcagccgatg attaccaatt ctcatcacag601 taccaaccag gtggggtaac aatcacactg ttctcagcca acattgatgc catcacaagc661 ctcagcgttg ggggagagct cgtgtgtcaa acaagcgtcc atggccttgt actgggcgcc721 accatctacc tcataggctt tgatgggaca gcggtaatca ccagggctgt ggccgcaaac781 aatgggctga cgaccggcac cgacaacctt ttgccattca atcttgtgat tccaacaaac841 gagatgaccc agccaatcac atccatcaaa ctggagatag tgacctccaa aagtggtggt901 caggcagggg atcagatgtc atggtccgca agagggagcc tagcagtgac gatccatggt961 ggcaactatc caggggccct ccgccccgtc acgctagtgg cctacgaaag agtggcaaca1021 ggatccgtcg ttacggtcgc tggggtgagc aacttcgagc tgatcccaaa tcctgaacta1081 gcaaagaacc tggttacaga atacggccga tttgacccag gagccatgaa ctacacaaaa1141 ctgatactga gtgagaggga ccgtcttggc atcaagaccg tctggccaac aagggagtac1201 actgactttc gtgaatactt tatggaggtg gccgacctca actctcccct gaagattgca1261 ggagcattcg gcttcaaaga cataatccgg gccataagga ggatagctgt gccggtggtc1321 tccacattgt tcccacctgc cgctccccta gcccatgcaa ttggggaagg tgtagactac1381 ctgctgggcg atgaggcaca ggctgcttca ggaactgctc gagccgcg
2．一種生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)蛋白的方法，其特征在于它以家蠶或蛹表達(dá)上述抗原基因，并包括如下步驟(1)．將VP2基因克隆到家蠶核型多角體病毒表達(dá)轉(zhuǎn)移載體上獲得重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體，(2)．將步驟(1)所說的重組表達(dá)轉(zhuǎn)移載體DNA與經(jīng)修飾的線性化家蠶核型多角體病毒Bm-bacPAK6(胡建新，家蠶核型多角體病毒同源重復(fù)區(qū)復(fù)制功能及重組病毒表達(dá)系統(tǒng)載體構(gòu)建和改進(jìn)，博士論文，1994，中國科學(xué)院上海生化所)DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，體內(nèi)重組產(chǎn)生帶有該VP2基因的重組家蠶核型多角體病毒，(3)．多輪空斑純化步驟(2)所說的重組病毒，(4)．用步驟(3)所說的重組病毒感染家蠶幼蟲(或蛹)，體內(nèi)表達(dá)VP2蛋白。
3．一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程注射疫苗，其特征在于它包括權(quán)利要求2中所述的感染重組病毒的家蠶幼蟲的血淋巴和免疫佐劑，家蠶血淋巴∶免疫佐劑=1∶1～3(V∶V)。
4．如權(quán)利要求3所述的一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程注射疫苗，其特征在于所述的免疫佐劑是指免疫刺激復(fù)合物(ISCOM)。
5．如權(quán)利要求3所述的一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程注射疫苗，其特征在于所述的免疫佐劑是指礦物油。
6．如權(quán)利要求3所述的一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程注射疫苗，其特征在于所述的免疫佐劑是指弗氏不完全佐劑。
7．一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)基因工程口服疫苗，其特征在于它為權(quán)利要求2中所述的感染重組病毒的家蠶幼蟲的血淋巴干粉的無菌水或生理鹽水溶液，血淋巴干粉的濃度為20～150mg/ml。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)基因以及以家蠶為生物反應(yīng)器生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒主要宿主保護(hù)性抗原的方法,及基因工程注射疫苗和口服疫苗。本發(fā)明方法能夠大規(guī)模、低成本生產(chǎn)傳染性法氏囊病病毒(IBDV)主要宿主保護(hù)性抗原(VP2)蛋白。本發(fā)明疫苗價(jià)格低廉、使用簡便且有效。
文檔編號A61P31/12GK1300850SQ0010577
公開日2001年6月27日 申請日期2000年4月7日 優(yōu)先權(quán)日2000年4月7日
發(fā)明者于漣, 張耀洲, 宋坤華, 金勇豐, 黃耀偉 申請人:浙江大學(xué)