專利名稱：：重組細胞的制備方法發(fā)明的領(lǐng)域本發(fā)明涉及一種能表達至少一種氨基酸序列的重組細胞的制備方法。本發(fā)明具有廣泛應(yīng)用性，包括用于制造具有穩(wěn)定性及可表達高產(chǎn)量的所需蛋白的重組哺乳類細胞。一般而言，有二種方法可被用來增加哺乳類細胞的異種核酸表達。其一為藉由如抗藥性擴增細胞篩選技術(shù)以增加該異種核酸的拷貝數(shù)量。其二為藉由如重組技術(shù)向該核酸中增加一種或更多有益控制元素，以增加細胞內(nèi)該核酸的表達。參見Kaufman，R.J.及P.A.sharp于1982年發(fā)表的“分子生物期刊”(J.Mol.Biol159601)；Sambrook等人于1989年發(fā)表的“分子克隆”(MolecularCloning)(第2版)、及Ausubel等人于1989年發(fā)表的“分子生物近期報告”(CurrentProtocolsinMolecularBiology)(JohnWiley&Sons，NewYork)。特別是對于抗藥性擴增，已有報告提出它涉及到二種基因的細胞轉(zhuǎn)化，其中一種基因為編碼標(biāo)的氨基酸序列，如異種蛋白質(zhì)；另一種基因為編碼選擇性基因標(biāo)記(selectablegenemarker)，如二氫葉酸還原酶(DHFR)。在該基因標(biāo)記為DHFR的情形下，將轉(zhuǎn)化細胞在選擇氨甲蝶呤(MXT)藥物之存在下培養(yǎng)。一般該MXT的細胞毒性可藉由上述DHFR的表達而予以顯著地移除。轉(zhuǎn)化細胞得以存活，是因其增加(擴增)DHFR拷貝數(shù)量至足夠高的數(shù)量。而編碼所需氨基酸序列的核酸序列亦被擴增，因此能以高表達該所需氨基酸的序列。參見前述的Kaufman，R.J.與P.A.Sharp文獻。然而，抗藥性擴增及相關(guān)技術(shù)已普遍認(rèn)知它具有若干缺點。例如，使用該技術(shù)會產(chǎn)生絕大多數(shù)的重組哺乳類細胞系(cellline)相當(dāng)耗時，且需耗費數(shù)月之久。另外，已知當(dāng)欲擴增異種核酸時，將負(fù)向影響到標(biāo)準(zhǔn)核酸定序的方法。另外，當(dāng)需要面臨長期嚴(yán)格的篩選壓力時，很難維持足量的核酸拷貝數(shù)量。對于細胞篩選策略上，篩選期間的延長會增加費用，例如制備異種蛋白質(zhì)以做為醫(yī)藥用途時，還會出現(xiàn)一些涉及法律規(guī)定等問題，除此之外，借助抗藥性擴增并無法增加特定異種核酸的表達量，而使該核酸產(chǎn)生量不足以供研究或商業(yè)所需。另外關(guān)于抗藥性擴增的問題也包含經(jīng)克隆細胞系的基因不穩(wěn)定性，這樣的問題亦非常顯著。例如，此方法常常制造出來自不穩(wěn)定基因的擴增所產(chǎn)生的重組細胞，如形成雙微小染色體(doubleminutechromosomes)。當(dāng)去除具篩選藥物時，這些細胞可能喪失所需的特性。參見Kaufman，R.J等人于1985年發(fā)表的“分子細胞生物學(xué)”(Mol.Cell.Biol.51750)所引證的參考文獻。除此之外，大部份抗藥性擴增技術(shù)最佳應(yīng)用上需使用高特異性的細胞、載體及/或細胞生長條件。例如，大部份方法使用到以特殊方式基因操作處理的宿主細胞。這種突變細胞并不適于某些應(yīng)用上。如前述的困難度涉及DHFR及MTX的抗藥性擴增作用即無法適當(dāng)作用于帶有正常DHFR基因的細胞上，而要移除該正常基因功能時常需經(jīng)過耗時費力的處理。參見Wigler等人于1980年發(fā)表的(美國)國家科學(xué)研究院會刊[PNAS(USA)]3567，及Urlaub與Chasin于1980年發(fā)表的(美國)國家科學(xué)研究院會刊774216。有關(guān)使用于特殊載體及生長條件的DHFR/MTX擴增方法，已披露若干缺點。參見如上文所提及的Kaufman與Sharp發(fā)表的文獻；及Schimke，R.于1984年發(fā)表的“細胞”(Cell，37705)。以及美國專利號5,686,263、4,956,288、5,585,237和其中的參考文獻。因此對于能制造富變化性的重組細胞、及制造具基因穩(wěn)定性重組細胞系等方法，相當(dāng)具有實用性。特別是需要一種制造能顯著降低或避免使用到高特異性的細胞、載體及/或細胞生長條件等重組哺乳類細胞系的方法。更需要一種由可制備高產(chǎn)量標(biāo)的氨基酸序列，如異種蛋白質(zhì)的方法制得的重組哺乳類細胞。本發(fā)明更尤其涉及一種可生成具基因穩(wěn)定性及可高量表達至少一種標(biāo)的氨基酸序列的重組哺乳類細胞系的方法。本發(fā)明的一個實施例，是藉由將第一個編碼氨基酸序列的載體導(dǎo)入宿主細胞中以實質(zhì)增強該氨基酸序列的表達。該第一載體包含至少一個可選擇的基因，典型稱為第一選擇序列(firstselectablesequence)；其經(jīng)可操縱聯(lián)結(jié)在編碼氨基酸序列片段上。另外，該第一載體視需要可編碼多個氨基酸序列的拷貝。該第一載體若需要可以經(jīng)一次(單次)或一次以上(多次)方式導(dǎo)入宿主細胞中。然后于有益于表達氨基酸序列的條件下培養(yǎng)該宿主細胞，并分離出可在第一高表達量下表達氨基酸序列的重組細胞系(第一高表達細胞)。本方法進一步包含將編碼氨基酸序列的第二載體導(dǎo)入該第一高表達細胞中。該第二載體可與該第一載體相同或不同，并可視需要編碼多個氨基酸序列之拷貝物。該第二載體若需要可以經(jīng)一次(單次)或經(jīng)一次以上(多次)方式導(dǎo)入至該第一高表達細胞中。在有益于表達氨基酸序列的條件下培養(yǎng)該含第二載體的重組細胞，并分離出可在第二高表達量表達氨基酸序列的細胞(第二高表達細胞)。如上所論，目前已知經(jīng)事先細胞篩選處理過的細胞系，特別是抗藥擴增技術(shù)處理過的細胞系具有若干缺點。特別是包擴基因不穩(wěn)定性，及需要使用高特異性細胞、載體及/或生長條件。本方法明顯地克服上述缺點，提供可制備高產(chǎn)量氨基酸序列的，具有基因穩(wěn)定性的細胞系。更進一步地講，本方法一般較現(xiàn)有技術(shù)更具有靈活性，并對廣泛載體具兼容性。幾乎所有可經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞皆可使用于本發(fā)明，包括絕大多數(shù)的初級、二級或經(jīng)培養(yǎng)的哺乳類細胞。本方法若需要亦宜于眾多具選擇性或非選擇性的生長條件下提供特殊的可經(jīng)轉(zhuǎn)染的哺乳類細胞的生長。借助直接或間接篩選可高表達氨基酸序列重組細胞系，而使本發(fā)明更具靈活性。例如，本發(fā)明的一個實施例中，可經(jīng)選擇至少一個由載體編碼的細胞表面標(biāo)記，間接選擇該重組哺乳類細胞。經(jīng)本發(fā)明的細胞表面標(biāo)記的篩選，可促進有效分離出可高量表達該氨基酸序列的細胞系。如文中討論的那樣，得到的細胞系具有基因穩(wěn)定性，并可減少或除去在細胞系制造上使用高特異性細胞、載體及/或生長條件。本發(fā)明另一特別實施例中，第二高表達量實質(zhì)上較該第一表達量高出至少約2至10倍或更多。用以決定氨基酸序列如蛋白質(zhì)的方法為本項領(lǐng)域熟知，并包含如抗體反應(yīng)性等相關(guān)技術(shù)。在更特別的實施例中，本方法進一步包括將可編碼氨基酸序列的第三載體導(dǎo)入該第二高表達細胞中，然后使該細胞接受有益于在比第二表達量更高的第三表達量表達氨基酸序列的條件。分離出在第三表達量表達氨基酸序列的細胞而制備細胞系(第三高表達細胞)。該第三載體優(yōu)選編碼至少一種標(biāo)的氨基酸序列，并且可與第一或第二載體(或二者)相同或不同。若需要該第三載體可以經(jīng)一次(單次)或經(jīng)一次以上(多次)方式導(dǎo)入該第二高表達細胞中。相對第一或第二高表達細胞，該第三高表達細胞典型上表現(xiàn)出具有增高的氨基酸序列表達。在本發(fā)明的另一特別實施例中，本方法進一步包含將至少一個編碼氨基酸序列的載體導(dǎo)入該第三高表達細胞中，優(yōu)選導(dǎo)入一個這種載體，并使該細胞接受有益于在比第三表達量更高的情況下表達氨基酸序列的條件。該方法進一步包括至少重復(fù)一次該導(dǎo)入及接受該等條件，優(yōu)選于約2次到10次之間或更多，以分離出在比第三高表達細胞更高表達量的表達氨基酸序列的細胞系。至于該重復(fù)操作步驟的次數(shù)，可由一些參數(shù)條件訂定，但特別以視所需要的表達量來制定更好。在另一實施例中，在有益于選擇出該第一載體的條件下培養(yǎng)該宿主細胞的步驟，又包括將宿主細胞生長于具選擇性的培養(yǎng)基中。優(yōu)選的是，該選擇性培養(yǎng)基包含至少一種藥物，且通常該藥物可用以篩選該第一可選擇序列。文中披露的載體，優(yōu)選包含選擇性核酸序列，如該第一及第四載體，其一般系編碼可選擇地氨基酸序列?？捎脕砗Y選載體的藥物其敘述與實例如下所述。常常優(yōu)選的情況是將第二或第三載體(或二者)與至少一種其它的載體(文中有時稱為“第四”或“第五”載體)，一起共同導(dǎo)入細胞中，而所述的其它載體編碼至少一種可選擇序列，特別是細胞表面蛋白質(zhì)的選擇性細胞表面標(biāo)記。更令人驚訝地發(fā)現(xiàn)，共同導(dǎo)入編碼選擇性細胞表面標(biāo)志載體時，可以促進產(chǎn)生能高表達所需氨基酸的十分有用的重組哺乳類細胞系。例如發(fā)現(xiàn)若依據(jù)本發(fā)明共同導(dǎo)入該載體，可于生成細胞系的同時，減少或完全不使用高特異性的細胞、載體及/或生長條件。除此之外，本發(fā)明方法有利于制備基因穩(wěn)定性的重組細胞。本方法另一實施例中，將第二載體導(dǎo)入第一高表達細胞中的步驟，還包括將第四載體導(dǎo)入該細胞。如文中討論的那樣，該第四載體是編碼至少一種選擇性序列(文中稱為“第二”選擇序列)，優(yōu)選為具選擇性的細胞表面標(biāo)記。該第四載體可與本方法的其它載體相同，但大部份情形下，該第四載體不同于任何或所有該等載體。在另一實施例中，該第四載體包括操縱聯(lián)結(jié)至編碼標(biāo)的氨基酸序列片段的第二選擇序列。在更特別的實施例中，本方法還包含將細胞生長在含有至少一種可用以篩選該第二選擇序列的藥物的培養(yǎng)基中。第四載體可編碼細胞表面標(biāo)記的實施例中，該方法優(yōu)選進一步包含以層析法、細胞淘洗法(cellpanning)、流式細胞計量術(shù)(flowcytometry)、免疫沉淀、抗體結(jié)合的至少一種方法分離出可表達選擇性細胞表面標(biāo)的的細胞。一般而言，該分離技術(shù)之一可用于分離可表達細胞表面標(biāo)記的細胞。經(jīng)過分離，可獲得由載體編碼的可高表達氨基酸序列的細胞系。本方法另一實施例中，將第三載體導(dǎo)入第二高表達細胞中的步驟，還包括將第五載體導(dǎo)入該細胞。在特定實施例中，該第五載體編碼至少一種選擇性序列(文中稱為“第三”選擇序列)。該第五載體可相同或不同于本文中披露的任一載體。在更佳的實施例中，第五載體包含若需要可操縱聯(lián)結(jié)于編碼氨基酸序列片段的第三選擇序列。此細胞接著接受易于在比第二表達量高的第三表達量下表達該氨基酸序列的條件。優(yōu)選的是，此方法還包括使細胞生長在含有至少一種藥物及優(yōu)選一種篩選第三可選擇序列的藥物的選擇性培養(yǎng)基中。另外，優(yōu)選的第五載體還包含編碼可選擇細胞表面標(biāo)記(其可相同或不同于由第四載體編碼的細胞表面標(biāo)記)的序列。若需要，可選擇的細胞表面標(biāo)記可操縱聯(lián)結(jié)于編碼氨基酸序列的片段。該方法較好又包含以層析、細胞淘洗法、流式細胞計量術(shù)、免疫沉淀、抗體結(jié)合中至少一種方法分離出由第五載體編碼的，可表達選擇性細胞表面標(biāo)記的細胞，以視需要來分離這些由第四或第五載體(或二者)表達的可表達細胞表面標(biāo)記的細胞。經(jīng)過分離操作，可獲得由載體編碼的可高表達氨基酸序列的重組細胞系。本發(fā)明更特別的第二高表達細胞一般比第一高表達細胞可表達至少約2倍或更多的氨基酸序列，其是藉標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定量技術(shù)如定量凝膠電泳法、層析法及免疫技術(shù)如Western免疫印跡法)、連接免疫吸收分析技術(shù)(ELISA)及抗體反應(yīng)來決定。更特別是藉抗體反應(yīng)性測定時，第二高表達細胞比第一高表達細胞表達約3至約40倍的氨基酸序列。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)序列定量技術(shù)測定時，特別有興趣的第三高表達細胞一般比第二高表達細胞表達至少約2倍以上的氨基酸序列。更特別者，以抗體反應(yīng)性測定時，該第三高表達細胞比第二高表達細胞而表達約3倍至約40倍的氨基酸序列。本方法更特別的實施例中，第一、第二、或第三載體各可獨立編碼第一抗藥基因(文中有時稱為基因標(biāo)記)、選擇性細胞表面標(biāo)記及第二抗藥基因。此實施例中，各載體經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于標(biāo)的氨基酸序列的片段。另外，該第四及第五載體各可獨立分別編碼第三抗藥基因及其它細胞表面標(biāo)記。該第一、第二及第三抗藥基因分可視需要互相為相同或不同。有關(guān)抗藥基因及選擇性細胞表面標(biāo)記的更詳細敘述如下。如本發(fā)明所敘述的，先篩選適當(dāng)?shù)牟溉轭愃拗骷毎?，而不需要使用高特異性載體或生長條件以最適表達異種蛋白質(zhì)。優(yōu)選的是哺乳類宿主細胞不表達異種蛋白質(zhì)至可測量的劑量。然而于某些情況，適當(dāng)?shù)牟溉轭愃拗骷毎芽杀磉_蛋白質(zhì)如同種蛋白質(zhì)至基礎(chǔ)量(backgroundlevel)(ie，basal)。在此情況下，本發(fā)明可應(yīng)用在提高比基礎(chǔ)量還高的同種蛋白質(zhì)的表達?；蛘撸痉椒ㄒ嗫捎糜谔岣咚璁惙N蛋白質(zhì)或多胎序列的細胞表達。更特別的哺乳類宿主細胞由下列提供。將第一載體導(dǎo)入哺乳類宿主細胞后，于對第一載體具選擇性的生長培養(yǎng)基中分離出第一高表達細胞。第二高表達細胞的生成是由將編碼氨基酸序列的第二載體導(dǎo)入第一高表達細胞中而完成的。在一個實施例中，第一及第二載體編碼異種蛋白質(zhì)的一個拷貝物，且二者大致上相同。導(dǎo)入該第二載體時，同時導(dǎo)入另一編碼選擇性細胞表面標(biāo)記的載體(“第四”載體)。在有益于選擇出細胞表面標(biāo)記的條件下分離出該第二高表達細胞，并可視需要包含將該細胞生長于此具選擇性的培養(yǎng)基中。此實施例中，于篩選細胞表面標(biāo)記時，亦篩選出由第一及第二載體編碼的，而且可高度共表達(co-expression)該所需氨基酸序列。因此，此實例可明顯減少使用高特異性宿主細胞、載體及生長培養(yǎng)基來篩選細胞。本發(fā)明可用以廣泛制備重組細胞，且特別是能高表達至少一種所需氨基酸序列、或部份氨基酸序列，例如功能性蛋白質(zhì)片段的哺乳類細胞系。例如，本發(fā)明方法可用于表達免疫標(biāo)的的氨基酸序列，如免疫球蛋白鏈(重鏈或輕鏈)或其功能性片段。更特別的標(biāo)的氨基酸將于下文討論。本發(fā)明與先前細胞篩選技術(shù)、特別是公知的抗藥性擴增方法相比，更具有顯著的優(yōu)點。例如上文所論，在大部份抗藥性擴增方法應(yīng)用上，一般需使用高特異性的細胞系、載體及生長條件。而在許多情形下，這些細胞已經(jīng)由遺傳工程操作來阻斷它對藥物的抗藥性，因而不常表現(xiàn)出良好的細胞生長特性。再者，該細胞可能較難以制備及/或維持，并且特別不適用于許多特殊的細胞篩選計劃。本發(fā)明提供可生成重組細胞系的方法，而減少使用或不使用這些高特異性細胞系。再者，本方法可借助將異種核酸導(dǎo)入宿主細胞基因體來強化重組細胞系的基因穩(wěn)定性，減少或通?？赏耆苊庑纬筛叨炔环€(wěn)定的染色體。本發(fā)明可提供其他優(yōu)點，例如，本方法與先前的重組哺乳類細胞生成方法相比更具靈活性，而且可廣泛用于哺乳類表達載體。相反，大多數(shù)的先前細胞篩選技術(shù)如抗藥性擴增，適用于高特異性的載體上。因此，目前已知許多抗藥性擴增技術(shù)的載體，因太大而難以操作處理。此外，許多先前細胞篩選技術(shù)使用的最適載體，因其專屬性質(zhì)而通常無法于需要時得到。本發(fā)明則可提供可與廣泛的哺乳類表達載體兼容的方法來解決上述問題。如文中所述，本文所敘述的至少一種載體可編碼標(biāo)的氨基酸的部份序列。如文中所示，對于特殊的完整長度(full-length)的異種蛋白質(zhì)而言，第一載體可編碼該蛋白質(zhì)的第一部份及第二載體、第三、第四及第五載體的至少一個載體可編碼該蛋白質(zhì)的其它相同或不同的部份。本實施例中，載體所編碼的蛋白質(zhì)序列的總數(shù)(totality)實質(zhì)上同于蛋白質(zhì)之全長。其它實施例中，第一載體(或任何其它載體)可編碼該全長蛋白質(zhì)，及至少一個他種載體(如第二、第三或第四載體)可編碼此蛋白質(zhì)的特殊部份。而剩余載體可使用于，例如視需要導(dǎo)入蛋白質(zhì)序列的額外部份或甚至可導(dǎo)入全長蛋白質(zhì)序列。本方法導(dǎo)入標(biāo)的氨基酸序列部份而提供許多優(yōu)點。例如，本方法可用于提供一個或多個氨基酸序列部份的高度控制擴增方法。即，含有完整序列的該氨基酸序列的特殊部份，在此其它序列擴增之前或同時可在特殊的細胞(如，第一或第二高表達細胞)中擴增。本發(fā)明因此提供一個或甚至數(shù)個標(biāo)的氨基酸序列的連續(xù)及同步表達(sequential&coordinateexpression)。如其更特別的描述，第一載體可編碼多重-亞單位蛋白(同種或異種)的第一亞單位，而第二載體可編碼該相同蛋白的第二亞單位。本實例中，編碼第一亞單位的第一載體導(dǎo)入宿主細胞中，而篩選出第一高表達細胞。編碼第二亞單位的第二載體導(dǎo)入該第一高表達細胞，篩選出表達該第一及第二亞單位的第二高表達細胞。例如，若該多重-亞單位蛋白為二聚體時，于可增強第一及第二次單位表達之條件下，該第一高表達細胞中特別形成該蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明尤其可用于在連續(xù)及高度控制的亞單位表達條件下的多重-亞單位蛋白的組合及其穩(wěn)定度分析。本發(fā)明特別對免疫標(biāo)的蛋白，如免疫球蛋白、特別是免疫球蛋白重鏈與輕鏈等的連續(xù)及高度控制組合上特別有用。一般而言，本發(fā)明提供擴增過程的明確彈性度與控制，促進實現(xiàn)多重-亞單位蛋白質(zhì)組合計劃的完成。例如，該方法可應(yīng)用于增強亞單位的制造，如可于細胞內(nèi)達到預(yù)定的高表達量。相反的，大部份先前技術(shù)且特別如抗藥性擴增技術(shù)，實質(zhì)上具有較低之靈活度，并且不提供亞單位組合的控制。另一方面，本發(fā)明提供細胞系，特別是由本方法制得的重組哺乳類細胞系。該細胞系具有基因穩(wěn)定性，并經(jīng)特別篩選以高表達出氨基酸序列或其部份。本發(fā)明方法特別提供篩選出可高表達至少一種異種蛋白的重組哺乳類細胞。本發(fā)明的特殊方法亦提供許多其他優(yōu)點。例如可以比其它包含大部份先前的藥物擴增方法更短時間內(nèi)完成的篩選方法生成重組哺乳類細胞系[(有時稱之為“高產(chǎn)量細胞系”(“highproducingcelllines”)或相關(guān)用語)]。除此之外，與大多數(shù)先前的方法相比，本方法使用較少的細胞操作步驟制備出具高產(chǎn)量的細胞系，因此可降低人工及培養(yǎng)基材料的費用。文中披露的所有文件全部并入以參考。非限制性的實施例用來說明本發(fā)明。圖1A及圖1B為本發(fā)明所使用的載體說明圖示。圖1A中為載體pJAIgG4TF編碼嵌合式抗組織因子(TF)重鏈與輕鏈免疫球蛋白。圖1B為載體pDRHK編碼與人類免疫球蛋白k常數(shù)區(qū)融合的單鏈HLA-DR2/MBP分子。圖2為于T25組織培養(yǎng)瓶靜態(tài)培養(yǎng)下大量制備的重組嵌合式抗-TF抗體的圖示。這種可制造大量抗-TF抗體的重組細胞系，是經(jīng)連續(xù)三次轉(zhuǎn)染后分離。此高產(chǎn)量重組細胞系分別命名為H9G12、3D2A9及A11B5。圖3為在生物反應(yīng)器中高量制備重組嵌合式抗-TF的圖示?？芍圃齑罅靠?TF抗體的重組細胞系，是經(jīng)連續(xù)三次轉(zhuǎn)染后分離。第一次及第三次轉(zhuǎn)染后分離的高產(chǎn)量重組細胞系分別命名為H9G12及A11B5。圖4為在T25組織培養(yǎng)瓶靜態(tài)培養(yǎng)下大量制造的重組sc-DR2/MBP-Cκ的圖示?？芍圃齑罅縮c-DR2/MBP-Cκ融合蛋白的重組細胞系經(jīng)連續(xù)三次轉(zhuǎn)染后分離。此高產(chǎn)量重組細胞系分別命名為A5B4、DR2H4及B9。發(fā)明詳述如上所述，本發(fā)明提供廣泛適用的細胞制備方法，特別是重組細胞系的制備方法，特別是提供具有基因穩(wěn)定性、以及可制備高表達同種或異種標(biāo)的蛋白的重組哺乳類細胞系的制備方法。如文中所述，本發(fā)明相當(dāng)具有靈活性、可使用于能生產(chǎn)高表達量蛋白質(zhì)的高度實用細胞系，可明顯避免使用高度特殊的細胞、載體及/或生長條件。本發(fā)明亦額外提供可制備高表達量蛋白質(zhì)的重組哺乳類細胞系。一般而言，本發(fā)明最佳應(yīng)用可藉由使用已知的操作技術(shù)來完成。例如公知有下列技術(shù)DNA分離技術(shù)、表達DNA的載體之裝配與篩選、核酸純化與分析、制備重組載體DNA的特殊方法、使用限制性酶DNA裂解技術(shù)、連接DNA、使用穩(wěn)定或瞬時方式將包含載體DNA的DNA導(dǎo)入宿主細胞技術(shù)、用選擇或非-選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)宿主細胞技術(shù)、用以篩選及維持穩(wěn)定或瞬間表達DNA的宿主細胞方法。一般參見Sambrook等人及Ausubel等人的上述參考文獻。本發(fā)明一方面提供一種生成重組哺乳類細胞系的新方法。該重組哺乳類細胞系有時將稱為“高產(chǎn)量”(“highproducing”)細胞系或相關(guān)用語。而用于細胞系制備氨基酸序列量中的“高量”(“highlevel”)及“高產(chǎn)量”或類似者，是指由本方法的細胞系制備的氨基酸序列量，相比親代(parental)細胞或親代細胞株，高出至少約2倍，且較好高出其約3倍至約40倍或更多(某些異種序列不存在于親代細胞系內(nèi))。本文中由重組細胞系制備的特別氨基酸序列量的測定方法，為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的，它包括層析方法；如蛋白質(zhì)凝膠電泳，及免疫技術(shù)，如Western印跡及ELISA。更特別的是，凝膠電泳法包含使用香豆司藍(Coumassieblue)或銀染色法來檢測及定量蛋白質(zhì)或勝肽序列。抗體反應(yīng)性分析為優(yōu)選的蛋白質(zhì)定量法。該“抗體反應(yīng)性”是指介于指定抗體與由細胞或細胞系制備的氨基酸序列之間的特異性結(jié)合。該名詞進一步表示介于氨基酸序列[其上的抗原決定部位(epitope)]與不與其它分子結(jié)合之抗體間形成特殊專一配對；該測定是本領(lǐng)域公知的如西方(Western)印跡法、ELISA、RIA、凝膠移動性轉(zhuǎn)移分析、免疫分析、競爭性分析、飽和度分析或其它適當(dāng)?shù)陌被嵝蛄薪Y(jié)合分析。一般可參考Harlow及Lane的“抗體實驗手冊”[ALaboratoryManual，GSHPublications，N.Y.(1988)]中披露有關(guān)于上述及其它相應(yīng)的分析。該“親代”是用以表示宿主細胞或細胞系的“祖先”(ancestor)，而其可用于制備后續(xù)的細胞系。親代細胞的說明是為用于制備第一高表達細胞的適當(dāng)宿主細胞。該第一高表達細胞又可為用于制備第二高表達細胞的親代細胞系。若無其它說明，細胞系為來自單一祖先細胞的細胞克隆群。制備細胞系的方法為公知的，并包含熟知的連續(xù)稀釋技術(shù)?？蓞⒖忌衔乃械腁usubel等人所列參考文獻。依據(jù)本發(fā)明之一目的，將包含至少一種選擇性序列及優(yōu)選為一種經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于編碼該蛋白片段的選擇性序列(第一選擇序列)的第一載體導(dǎo)入細胞內(nèi)，而獲得可增強表達特定氨基酸序列的哺乳類宿主細胞。在細胞培養(yǎng)、分離出可以第一高表達量表達蛋白質(zhì)細胞(第一高表達細胞)后，再將編碼蛋白質(zhì)的第二載體導(dǎo)入該第一高表達細胞內(nèi)。一般優(yōu)選為導(dǎo)入該第二載體時伴隨導(dǎo)入另一載體(如，第四載體)，此另一載體可編碼至少一種且優(yōu)選為一種選擇性細胞表面標(biāo)記。然而，其它實施例中，第二載體可同時編碼蛋白質(zhì)及至少一種細胞表面標(biāo)記，優(yōu)選為此標(biāo)記中的一種。細胞接受有利于在比第一表達量高的第二表達量下表達氨基酸序列的條件。優(yōu)選的情況可篩選出至少一種細胞表面標(biāo)記，并且不需使用高特異性的細胞、載體及生長條件。然后分離出可在第二表達量表達蛋白質(zhì)的細胞系，以制備第二高表達細胞。文中披露的“分離”特異性的細胞或細胞系，意指經(jīng)過純化處理達到至少約80％至95％(w/w)的均一性(homogenity)的細胞。大部份用途中，以高純度的純化細胞如至少約98％至99％均一性者(w/w)更佳。純化后，細胞可應(yīng)用于如細胞轉(zhuǎn)染或可應(yīng)用已知的連續(xù)稀釋細胞系技術(shù)等的后續(xù)技術(shù)操作。如文中所論，該第一及/或第二載體可視需要以經(jīng)一次(單次)或經(jīng)一次以上(多次)方式導(dǎo)入細胞中，優(yōu)選為介于約2次至約20次之間，更佳為介于約2次至5次。至于選擇一次或多次導(dǎo)入該第一及/或第二載體于細胞中，則可由數(shù)個參數(shù)，如指定所需的加強氨基酸序列表達量及標(biāo)的的特殊氨基酸序列量來決定。更佳的實施例中，用于篩選第二高表達細胞的條件亦包括篩選至少一個細胞表面標(biāo)記，且優(yōu)選為一個細胞表面標(biāo)記，而該標(biāo)記由被共同導(dǎo)入第一高表達細胞內(nèi)的其中一個載體所編碼。如文中討論，這些載體可為第四或第五載體。須強調(diào)本方法的此實施例較之先前表達系統(tǒng)如抗藥性擴增技術(shù)具更顯著的改進。例如，借助共同將載體導(dǎo)入細胞中的方式，經(jīng)由篩選細胞表面標(biāo)記而選擇出第二高表達細胞，而許多可能產(chǎn)生的問題已于前述討論過。更重要的是本發(fā)明連續(xù)導(dǎo)入第一及第二載體方式可增加表達產(chǎn)生氨基酸序列的量，高于氨基酸序列的總和?！鞍被嵝蛄小币话阒赣?0種氨基酸內(nèi)的任何氨基酸所構(gòu)成的聚合物，而與氨基酸大小無關(guān)。雖然該名詞于文中用以表示蛋白質(zhì)，但應(yīng)了解除非特別說明，該名詞包含多肽和肽。此氨基酸序列可編碼完整長度的蛋白質(zhì)(有關(guān)于表達細胞的異種或同種蛋白質(zhì))或其部份如功能性片段。更特殊的氨基酸序列如下所述。特別優(yōu)選的氨基酸序列為免疫球蛋白的重鏈、輕鏈、或其功能性片段。該應(yīng)用于氨基酸序列的“功能性片段”，是指氨基酸序列中的至少一個片段中具有至少一個完整長度氨基酸序列的活性。關(guān)于蛋白質(zhì)序列，該等活性包含特異性結(jié)合及酶活性。由適當(dāng)分析法測定的優(yōu)選功能性片段具有至少約70％的完整長度蛋白質(zhì)活性，或更優(yōu)選的是介于約80％至95％者。該“經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)”是指于功能性關(guān)系中的多核苷酸組件的聯(lián)結(jié)。當(dāng)核酸與另一核酸置于功能性關(guān)系中，依據(jù)本發(fā)明，該核酸即為“經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)”。特別是，該經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)的序列可位于相同細胞內(nèi)的相同或不同載體上。例如，當(dāng)啟動子或增強子經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于該特殊密碼序列時，則該啟動子或增強子能影響特殊密碼序列的轉(zhuǎn)錄。即例如經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)是指經(jīng)聯(lián)結(jié)的DNA序列為鄰近者；并且當(dāng)需要結(jié)合二種蛋白質(zhì)密碼區(qū)時，該經(jīng)聯(lián)結(jié)的DNA序列為鄰近且位在密碼讀取框架內(nèi)。然而在有些情況下，經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)的序列可位于不同的載體上。如所說明的那樣，編碼多重亞單位蛋白質(zhì)的一個亞單位的載體序列，是經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于編碼該蛋白質(zhì)的另一亞單位的另一載體序列(結(jié)合伙伴，bindingpartner)。本發(fā)明方法可有效并高度適用于廣泛的宿主細胞，特別是適合做組織培養(yǎng)的宿主細胞。典型的是，該宿主細胞為真核者，優(yōu)選為在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基制備中具良好生長特性的哺乳類細胞。大體上，本發(fā)明可使用幾乎任一非-微生物細胞，不論它是否已事先經(jīng)轉(zhuǎn)化，只要能高量表達所需氨基酸序列者皆適用。上述各類細胞為本領(lǐng)域所公知，包含CHO、CV-1、HeLa及其它細胞。一般可參考上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的參考文獻；以及美國菌種培養(yǎng)物保藏中心(AmericanTissueTypeCultureCollection)(10801UniversityBoulerard，Manassas，Virginia)。由上述及以下的范例更顯而易見，廣泛的載體以及特別是哺乳類表達載體，皆可使用于本發(fā)明。所謂特別載體一般包含作為自我復(fù)制的適當(dāng)調(diào)節(jié)序列，優(yōu)選為可在所需宿主細胞或細胞系中篩選出?！拜d體”更特別定義為能將任一標(biāo)的的核酸序列導(dǎo)入宿主細胞中，并能表達該標(biāo)的核酸序列者。該標(biāo)的核酸序列優(yōu)選可編碼上述氨基酸序列的所有部份或其重要部份。合適的載體可包含但不受限于直鏈核酸序列、質(zhì)粒、粘粒(cosmid)、噬菌粒(phagemid)、游離體(episomes)以及外染色體DNA。另外還包括病毒DNA及病毒RNA。特別是該載體可為重組DNA。本文中“表達”(expression)或“基因表達”(geneexpression)是指制備該標(biāo)的核酸序列蛋白質(zhì)產(chǎn)物，包括DNA轉(zhuǎn)錄及RNA轉(zhuǎn)錄的翻譯?？墒褂糜诒景l(fā)明的更特別的載體包括至少一種具選擇性核酸序列，通常為一個序列。就說明目的而言，選擇性序列有時表示當(dāng)該序列編碼細胞內(nèi)序列時的具選擇性基因標(biāo)記(或相關(guān)術(shù)語)，或為當(dāng)該序列編碼細胞表面蛋白質(zhì)時的細胞表面標(biāo)記(或相關(guān)術(shù)語)。很明顯，廣泛種類的由載體編碼的選擇性序列者可兼容適用于本發(fā)明。優(yōu)選的載體可促進含有被共同導(dǎo)入載體或其它載體的細胞或細胞篩選，可由廣泛的技術(shù)包括曝露在細胞毒性藥性作用下的細胞實際存活率來達成。一般可參考SouthernP.J.等人于1982年的分子應(yīng)用概論[(J.Mol.Appl.Gen1∶327)、上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的參考文獻。例如，本發(fā)明中使用的選擇性基因標(biāo)記說明，對某些營養(yǎng)變異型真核細胞(auxotrophiceukarytoticcell)，如中華大頰鼠卵巢(CHO)細胞而言，包括DHFR、氨基糖苷抗生素G418，潮霉素B[hygromycinB](hmB)]、新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II基因(neo)、嘌呤霉素(puromycin)、及腺嘌呤脫氨酶基因(adenosinedeaminasegene)等。在某些情形下，經(jīng)載體編碼的所需氨基酸序列可自行作為充分的選擇性標(biāo)記、或者可正向影響該選擇性標(biāo)記的功能。在該氨基酸序列可自行編碼該選擇性標(biāo)記的情況下，則載體不需包括另一不同的選擇性標(biāo)記?？蓞⒖糞outhernP.J.等人于1983年發(fā)表的“分子生物雜志”)(J.Mol.Biol.150∶1)、上文所列的Sambrook等人及Ausubel等人的參考文獻，及文中披露中有關(guān)基因標(biāo)記的其它參考文獻。如文中所論，該選擇性核酸序列可編碼合適的細胞表面標(biāo)記，特別是細胞表面蛋白質(zhì)。該細胞表面標(biāo)記的范例包括細胞表面受體、醣蛋白、碳水化合物、蛋白質(zhì)、脂蛋白質(zhì)、主要組織兼容性復(fù)合物(MHC/HLA)、抗體、抗原或其功能性片段。更特別的細胞表面標(biāo)記包括免疫標(biāo)的的醣蛋白，如典型的T-細胞表面上的CD(分化群組)醣蛋白，諸如包括CD2、CD3、CD4、CD8及LFA-1。更特殊的標(biāo)的糖蛋白為CD4分子，特別是該分子的功能性片段?？蓞⒖加蒊nVitrogen公司提供的CaptureTecTM系統(tǒng)。如上文討論及下面的示例中，可表達特殊細胞表面標(biāo)記的細胞可經(jīng)由一種或不同技術(shù)的組合加以分離，例如包括以層析、細胞掏盤洗選法、流式細胞記錄儀、抗體結(jié)合或免疫沉降方式等至少一種方式分離出細胞。優(yōu)選的方法為如下討論的有關(guān)磁性選擇(magneticselection)的層析法。該“功能性片段”用于定義選擇性細胞表面標(biāo)記，是指如CD4醣蛋白的標(biāo)記部份可做為與另一免疫分子如類似單株抗體的抗體做特異性結(jié)合。上述該名詞是指包括可編碼功能性片段的核酸序列。一般而言，一旦選擇合適的選擇性序列后，該選擇性序列經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于一個或更多的調(diào)節(jié)序列，因此經(jīng)編碼之氨基酸序列可定位于載體；如鄰近于啟動子。如上述方法中，可加速表達所需氨基酸序列。曾預(yù)期一些氨基酸序列如異種或同種蛋白質(zhì)含有自己的細胞或組織的特殊啟動子。更包含可作為為適當(dāng)?shù)那皩?dǎo)區(qū)(leader)的調(diào)節(jié)序列，及聚腺苷酸化序列。在本發(fā)明的一個更特別的實施例中，氨基酸序列的表達視需要可為單-或二-順反子。例如，當(dāng)啟動子經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于選擇性核酸序列及標(biāo)的氨基酸序列二者時，該表達為單順反子；啟動子/經(jīng)編碼氨基酸序列/選擇性核酸序列；啟動子/選擇性核酸序列/經(jīng)編碼氨基酸序列等。另外，二順反子表達則來自從不同啟動子表達氨基酸；例如啟動子/經(jīng)編碼氨基酸序列或選擇性核酸序列。如文中討論，本方法可兼容適用于各種載體。當(dāng)需要增強表達時，該載體典型上編碼該氨基酸序列(或若干該序列)。優(yōu)選的載體形式有時稱為表達盒。在一實施例中，該表達盒一般包括在含有載體宿主細胞或細胞系中具有功能作用的啟動子；操縱子(operator)；核糖體激活部位；氨基酸序列；及足量的3’部份，其3’部份編碼多腺苷酸化作用信號，以加速細胞分泌出氨基酸序列的作用。優(yōu)選的終止子為來自SV40之多聚腺苷酸化序列。如視需要，載體的表達盒或其它適當(dāng)部份可包括近氨基序列5’-端的信號序列，以加速該序列之后的翻譯處理。至少一種合適的基因標(biāo)記或細胞表面載體可視需要定位于載體上。包括表達盒的更特殊的合適載體示例，為包括下列的DNA載體(i)在大腸桿菌(E.Coli)內(nèi)的復(fù)制功能性起點(ori)，(ii)選擇性基因標(biāo)記(抗生素抗性基因，如Amp，Tet，Neo或Kan抗性)。(iii)強力病毒啟動子如巨細胞病毒(cytomeglovirus，CMV)啟動子及任意的CMV增強子元素，(iv)Ig-CL免疫球蛋白輕鏈恒定區(qū)領(lǐng)頭序列，(v)標(biāo)的氨基酸序列，(vi)連接Ig-CL外顯子(exon)的完整長度的Ig-CL內(nèi)含子(intron)，(vii)生長激素的多聚腺苷酸化序列，如牛生長激素(bgh)多聚腺苷酸(polyA)序列，及(viii)編碼選擇性真核標(biāo)記DNA，如強力病毒啟動子[(如猿猴病毒40(simian40，SV40)啟動子)]，該啟動子是經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于抗生素抗性基因，并經(jīng)融合至病毒多聚腺苷酸化序列中(如SV40polyA序列)。另外，除第(vi)項連接于Ig-CL外顯子的完整長度Ig-CL內(nèi)含子外，該DNA載體可包括上述所有第(i)項至第(v)項、及第(vii)項至第(viii)項。例示的Ig-CL領(lǐng)頭序列為小鼠kappa前導(dǎo)區(qū)。該完整長度Ig-CL內(nèi)含子與外顯子實例為完整長度的Ck基因。需要增強表達的氨基酸序列可為宿主細胞自然產(chǎn)生的任一蛋白質(zhì)或多肽序列，包括異種蛋白質(zhì)或同種(內(nèi)生性)蛋白質(zhì)。大部情況下，該氨基酸序列為真核蛋白質(zhì)，包含但不限于，較大的氨基酸序列如多重亞單位蛋白質(zhì)的亞單位或功能性片段。更特定的氨基酸序列包含酶、免疫球蛋白、T-細胞受體、MHC/HLA分子(第I類及第II類)或其片段等。另外的特定蛋白質(zhì)包括生長因子、凝血因子、細胞因子例如纖溶酶原激活物、組織因子(TF)、胰島素、哺乳類生長激素、促紅細胞生成素、IgE、尿激酶1、2、3或其片段等。本發(fā)明進一步可與其它已知、部份已知、或未知的氨基酸序列(包含編碼新穎基因序列者)互相兼容。各種不同的氨基酸序列可見于，如基因銀行(Genbank)(美國國家醫(yī)藥圖書館，38A，8No5，RockvillePike，Bethesda，MD20894)，而該網(wǎng)址為http//www.ncbi.nlm.nih.gov。文中討論的特殊載體分子量可由公知技術(shù)如瓊脂凝膠電泳法來測定分子量大小，且視標(biāo)的需要而施行不同的技術(shù)。然而，大部份合適的載體及特別適合的DNA載體分子量為至少約5kb，特別以介于約5kb至約35kb之間或更高。特殊氨基酸序列的分子量可由標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)定量技術(shù)，如聚丙烯醯胺凝膠電泳法測定?；蛘咴摲肿恿恳嗫捎珊怂嵝蛄懈拍罘g的對應(yīng)核酸序列的分子量加以估計決定。在大多數(shù)的應(yīng)用上，編碼氨基酸序列的核酸分子量大小可足以編碼介于約500至約300,000道爾頓大小之的蛋白質(zhì)或多肽，而優(yōu)選為介于約15至200,000道爾頓。本發(fā)明可使用的更特殊載體示例如下，如pJAIgG4Tf.A8，pDRHK、及pMACS，亦可參照圖1A及圖1B。特別是，該pDRHK載體依據(jù)布達佩斯條約寄存于美國菌種培養(yǎng)物保藏中心(ATCC)，其地址已記載在前文中。該DNA載體于1997年九月十七日寄存于美國菌種培養(yǎng)物保藏中心，保藏號碼為第20924號(AccessionNO.209274)。該pDRHK載體為哺乳類表達載體，它含有CMV啟動子、小鼠IgCKappa前導(dǎo)肽、克隆區(qū)、小鼠kappa內(nèi)含子，及人類kappa常數(shù)區(qū)外顯子序列。前文所述，本發(fā)明特征包括連續(xù)重組操作處理，涉及到連續(xù)及共同的載體導(dǎo)入方式，以產(chǎn)生能高量表達氨基酸序列的重組哺乳類細胞系。而載體導(dǎo)入可由許多方法完成，包含逆轉(zhuǎn)錄病毒轉(zhuǎn)移、病毒感染，由鈣-、微脂粒-、或聚凝胺-調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染、生物性轉(zhuǎn)移(biolistictransfer)、或其它已知的技術(shù)等。更佳的導(dǎo)入方法包括可適用于哺乳類細胞的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染，如電穿透方法。然而，于某些應(yīng)用上可使用瞬時載體導(dǎo)入方式以提供具基因穩(wěn)定的重組細胞系。本發(fā)明的特征為，適宜哺乳類宿主細胞如CHO，以合適載體分別經(jīng)一次(單次)或至少二次(多次)轉(zhuǎn)染，而該載體包含至少一種選擇性標(biāo)記，及可編碼至少一種標(biāo)的的異種蛋白質(zhì)。在更特定的實施例中，該宿主細胞以載體轉(zhuǎn)染，該載體包含操縱聯(lián)結(jié)至片段的第一選擇序列(基因標(biāo)記)，而該片段經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于經(jīng)編碼的蛋白質(zhì)。許多轉(zhuǎn)染方法可應(yīng)用在將載體導(dǎo)入宿主細胞，如標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染，或脂轉(zhuǎn)染(lipofection)技術(shù)。該經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細胞接著進行選擇性生長條件，而可分離出第一高表達細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞的分離方法可參照前文所列的Sambrook等人前述文獻、Ausubel等人前述文獻，及Wigler于1979年發(fā)表的(美國)國科學(xué)研究院會刊(76∶1376)的參考文獻。分離第一高表達細胞且可視需要由一個或組合標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)來特性化。例如一種方法為將CHO細胞以編碼新霉素基因標(biāo)記(可提供G418抗性)的載體轉(zhuǎn)染，而該載體系經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于蛋白質(zhì)序列，如編碼免疫球蛋白的序列，特別是編碼抗體的序列。該可表達蛋白質(zhì)序列的經(jīng)轉(zhuǎn)染宿主細胞系在微量滴定組織培養(yǎng)盤中以標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)(如，限制稀釋及生長)來加以克隆。細胞培育約數(shù)天至數(shù)星期或更久后，典型上將出現(xiàn)單一菌落。較好于額外操作處理過程僅使用單一菌落?？捎萌我灰褟V被人接受的方法如標(biāo)準(zhǔn)免疫方法，特別是ELISA分析，來篩選出具高產(chǎn)量力的菌株。優(yōu)選為ELISA分析法，因其可最佳地用來檢測及定量抗體生成。優(yōu)選的高產(chǎn)量細胞為ELISA分析中實質(zhì)上可制備出的最高量抗體者。更佳為在每毫升培養(yǎng)基中可制備出約0.5至約20微克抗體的第一高產(chǎn)量細胞。而特別最佳者為在每毫升培養(yǎng)基中可制備約1至約5微克抗體的第一高產(chǎn)量細胞。該第一高產(chǎn)量細胞特別經(jīng)進一步操作處理而增加編碼蛋白質(zhì)序列的核酸細胞復(fù)制數(shù)量。此實例的特殊目標(biāo)，為制造出具基因穩(wěn)定性的能制造抗體的細胞株。一實施例中，第一高產(chǎn)量細胞是經(jīng)由如電穿透作用而進一步以二種不同載體轉(zhuǎn)染。該載體其一為編碼蛋白質(zhì)序列者，另一為編碼適當(dāng)細胞表面標(biāo)記如糖蛋白且尤其是CD4或其片段者。可參考圖1A。市面上可購買之編碼CD4的優(yōu)選載體為pMACS載體(參考下述)。此實例中，轉(zhuǎn)染物經(jīng)特定抗體或可能與細胞表面蛋白特異性結(jié)合的其適合的抗原結(jié)合片段處理。該細胞的“基因穩(wěn)定性”是指該細胞實質(zhì)上無基因體重排過程，包含異種核酸。特別可避免的重排物包含雙微小染色體。本發(fā)明方法與將該異種核酸導(dǎo)入宿主細胞基因體相比，以強化到最大的基因穩(wěn)定度。用來檢測可表達來自載體之一的細胞表面蛋白質(zhì)的細胞與由其它載體編碼的蛋白質(zhì)序列的細胞二者間的特異性結(jié)合方法有許多種，包括標(biāo)準(zhǔn)免疫技術(shù)如層析技術(shù)，特別為包括磁性珠的管柱層析法。該方法中，可抗細胞表面蛋白質(zhì)的抗體為共價性附著在該磁性珠上，因此可藉由將細胞與磁性珠置于磁性環(huán)境下，來分離出任一可表達細胞表面蛋白質(zhì)的細胞。接著從管柱中移出結(jié)合細胞，并于微量滴定組織培養(yǎng)盤中培養(yǎng)。視需要，可將細胞生長于具選擇性培養(yǎng)基中，如補充G418之培養(yǎng)基?？山鍞?shù)種技術(shù)分離出第二高產(chǎn)量細胞。例如特別方法中，細胞置于培養(yǎng)基孔洞中生長一段時間，以充分制造抗體并釋出于培養(yǎng)基中。將適合的抗Fc部位的抗-個體遺傳型抗體涂覆于該微量滴定組織培養(yǎng)皿孔洞中，再加入細胞培養(yǎng)基。該包含高量抗體的培養(yǎng)基可由標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)加以檢測，如公知使用標(biāo)記有如辣根過氧化酶(HRP)的適宜二級抗體的夾心法分析技術(shù)。優(yōu)選的第二高產(chǎn)量細胞的分離，是由辨識培養(yǎng)盤中細胞數(shù)量對高抗體生成的速率。此分析方法詳細說明于下且尤其包含了ELISA檢測方式。優(yōu)選為在約24小時內(nèi)每106細胞可制造出約0.1至約10微克或更多抗體的第二高產(chǎn)量細胞。更佳的范圍為在24小時內(nèi)每106細胞可制造出約1至約5微克抗體者。如文中討論，又優(yōu)選為相對于第一高產(chǎn)量細胞可制造出高出約3倍至約40倍或更多抗體的第二高產(chǎn)量細胞。而抗體反應(yīng)性為此測定的優(yōu)選方法。該第二高表達細胞，可進一步經(jīng)轉(zhuǎn)染來分離出可表達較多量蛋白質(zhì)的細胞系，如第三高表達細胞。例如，為了增加第二高表達細胞的抗體制造，用以轉(zhuǎn)染該第一高表達細胞的二種載體將再應(yīng)用來共-轉(zhuǎn)染該第二高表達細胞。優(yōu)選的轉(zhuǎn)染法為電穿透法，但若需要也可應(yīng)用其它感染方法。這種可制造出增加抗體量的高產(chǎn)量細胞，可經(jīng)由前文提到的CD4表達細胞的磁性管柱層析法分離出此高產(chǎn)量細胞。視需要，該細胞可生長在非選擇性或選擇性培養(yǎng)基，如補充G418的培養(yǎng)基。優(yōu)選的高產(chǎn)量細胞可制造最大抗體量，是由辨識培養(yǎng)皿中細胞數(shù)量對高抗體生成率來決定。本實施例中，經(jīng)選擇的細胞株優(yōu)選連續(xù)稀釋，并應(yīng)用公知方法在微量滴定組織培養(yǎng)盤中生長。約數(shù)天至數(shù)星期或更久后，該抗體的制備可由適當(dāng)?shù)拿庖呒夹g(shù)如ELISA加以測試。而具高抗體制造率的克隆經(jīng)進一步擴增，優(yōu)選為約24小時每106細胞可制備出約1至約100微克或更多抗體的克隆，更佳為24小時每106細胞可制造出于約15至約50微克抗體的克隆。另外亦可優(yōu)選為可制造出相對于第二高產(chǎn)量細胞高出約2倍至約10倍或更多抗體的克隆。符合上述標(biāo)準(zhǔn)的經(jīng)選擇克隆，優(yōu)選的是依標(biāo)準(zhǔn)方法連續(xù)稀釋。約數(shù)天至數(shù)星期或更久后，單一克隆可由適當(dāng)?shù)拿庖叻椒ㄈ鏓LISA測試其抗體制備情況。而具有最高產(chǎn)量克隆(第三高表達細胞)是由下述靜態(tài)培養(yǎng)方法選擇制備。優(yōu)選的第三高表達細胞在每毫升培養(yǎng)液中可制造約20至約200微克抗體。更優(yōu)選的是每毫升培養(yǎng)液可制造約50至150微克抗體，最好的是每毫升培養(yǎng)液可制造約100微克。亦優(yōu)選為可制造出相對于第二高產(chǎn)量細胞高出約3倍至約40倍或更多抗體的第三高產(chǎn)量細胞，此數(shù)量是依據(jù)抗體反應(yīng)性測定的。另外，也可優(yōu)選為可制造出相對于第一高產(chǎn)量細胞高出約10倍至約200倍抗體的第三高產(chǎn)量細胞，此數(shù)量是依據(jù)抗體反應(yīng)性測定的。適宜抗體的特定實例，為pJAIgG4TF，A8載體編碼的抗-TF抗體，如圖1A所示。由本文中所述方法制造的高產(chǎn)量細胞系，具有廣泛的實用性，可應(yīng)用于如商業(yè)、研究及醫(yī)藥領(lǐng)域。例如，已發(fā)現(xiàn)由該方法制造出的高產(chǎn)量細胞，特別適用于商業(yè)規(guī)格蛋白質(zhì)序列。如文中所述，下列實施例為應(yīng)用中空纖維生物反應(yīng)器以大量制造蛋白質(zhì)序列的方法(如，每毫升的毫克量)。本發(fā)明特別的實施例中，該制造出的重組哺乳類細胞系可產(chǎn)生大量的MHC復(fù)合體，特別是重組MHC單鏈及異二聚體復(fù)合體。該復(fù)合體記載在如1995年2月1日申請的美國申請?zhí)?8/382,454、1996年1月31日申請的，申請?zhí)?8/596,387，及于1996年2月15日公布的PCT申請WO96/04314號參考文件中，這些文獻所披露的內(nèi)容供本文參考。特別是記載在審理中的美國申請?zhí)?8/382,454、08/596,387及公布的PCT申請?zhí)朩O96/04314中的包括共價性聯(lián)結(jié)肽的各種單鏈MHC融合復(fù)合體。例如，為制造出可高表達所需單鏈MHC復(fù)合體的重組哺乳類細胞，適合的哺乳類宿主細胞如CHO是以適合的載體轉(zhuǎn)染一次(單一)或一次以上(多次)。該載體分別包含至少一種如上文定義的選擇性標(biāo)記，以及至少一種編碼單鏈復(fù)合體片段。優(yōu)選實施例中，該單鏈復(fù)合體為第二類，但于某些情形中第一類單鏈復(fù)合體較適用。該宿主細胞優(yōu)選以編碼單鏈復(fù)合體(其經(jīng)操縱聯(lián)結(jié)于選擇性標(biāo)記)的適合載體轉(zhuǎn)染?？衫酶鞣N轉(zhuǎn)染方法，如標(biāo)準(zhǔn)磷酸鈣調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)染，或脂轉(zhuǎn)染技術(shù)。經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞接著生長在選擇性條件下，使得可分離出第一高表達細胞。經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞的分離方法可參照前文所述的Sambrook等人、Ausuel等人的參考文獻，以及Wigler于1979年發(fā)表在PNAS第76冊第1376頁的參考文獻。在更特殊的方法中，該載體包括選擇性基因標(biāo)記，如操縱聯(lián)結(jié)至單鏈MHC復(fù)合體的新霉素。該宿主細胞優(yōu)選以電穿透方式轉(zhuǎn)染，而可表達融合蛋白質(zhì)序列的經(jīng)轉(zhuǎn)染的宿主細胞，可經(jīng)由微滴定組織培養(yǎng)皿中限制性稀釋的方式來做無性繁殖。經(jīng)由數(shù)天至數(shù)星期或更長的細胞培養(yǎng)，采集該經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞，并稀釋于非選擇性或選擇性培養(yǎng)基中，如添加G418的培養(yǎng)基中。如上述方法測試其上清液，其實施例如下。高產(chǎn)量克隆是經(jīng)選擇并經(jīng)培養(yǎng)放大，采集選擇出的克隆經(jīng)并生長數(shù)天至數(shù)星期或更長時間，以分離出第一高產(chǎn)量細胞。較好第一高產(chǎn)量細胞于每毫升培養(yǎng)液中制造約1至100毫微克融合蛋白質(zhì)。更好第一高產(chǎn)量細胞于每毫升制造約10至約50毫微克融合蛋白質(zhì)。制備單鏈MHC融合蛋白質(zhì)的第一高產(chǎn)量細胞，經(jīng)由下述方法進一步操作處理。該第一高產(chǎn)量細胞是經(jīng)由二種載體進一步以如電穿透予以共-轉(zhuǎn)染，此二種載體中其一可編碼單鏈融合蛋白質(zhì)，另一個可編碼適宜細胞表面蛋白質(zhì)，如醣蛋白及特別是CD4。編碼CD4的優(yōu)選的載體為市面上可購得的pMACS載體(如下文)。該轉(zhuǎn)染物隨后以特異性抗體或其可特異性結(jié)合細胞表面蛋白質(zhì)的適宜抗原結(jié)合片段加以處理。特異性結(jié)合可以用各種方法檢測，然而，優(yōu)選的是使用含磁性珠粒的柱式層析法。經(jīng)結(jié)合的細胞接著自管柱移除，并于微滴定組織培養(yǎng)盤中生長。而第二高產(chǎn)量細胞可生長在非選擇性或選擇性培養(yǎng)基，如添加G418的培養(yǎng)基中。若需要，可制得第二高產(chǎn)量細胞的靜態(tài)培養(yǎng)基。優(yōu)選的是第二高產(chǎn)量細胞在每毫升培養(yǎng)液中制造出約50至約500毫微克的融合蛋白質(zhì)。更優(yōu)選的是該第二高產(chǎn)量細胞每毫升制造出約100至200毫微克融合蛋白質(zhì)。為進一步增加單鏈MHC復(fù)合體的制備，該第二高產(chǎn)量細胞可再經(jīng)轉(zhuǎn)染。一方法中，該第二高產(chǎn)量細胞經(jīng)由載體混合物予以共-轉(zhuǎn)染。該載體混合物為編碼單鏈MHC融合蛋白的載體及另一個攜帶有選擇性核酸序列并對藥物如博羅霉素(puromycin)或其它適合藥物具有抗性的載體的混合物。該共-轉(zhuǎn)染視需要可經(jīng)由任一種適當(dāng)方法，如電穿透方法進行。于數(shù)天至數(shù)星期或更久的細胞培育后，采集該細胞，并重新懸浮于添加博羅霉素培養(yǎng)基中。目視見到具抗性菌落生成后，藉ELISA測試培養(yǎng)液的融合蛋白質(zhì)生成。自可產(chǎn)生高產(chǎn)量蛋白質(zhì)的克隆制得靜態(tài)培養(yǎng)液。優(yōu)選的第三高產(chǎn)量細胞于每毫升制造出約500至約5000毫克微克的融合蛋白質(zhì)，更佳為該第三高產(chǎn)量細胞子每毫升中制造出約1000至2000毫微克的蛋白質(zhì)。若需要，該適合的第三高產(chǎn)量細胞可經(jīng)進一步亞克隆(subclone)改善重組蛋白質(zhì)的表達。優(yōu)選方法為限制性稀釋克隆法。另一優(yōu)選方法為24小時內(nèi)每毫升制造約100至約1000毫微克融合蛋白質(zhì)的第三高產(chǎn)量細胞克隆。特佳的是24小時內(nèi)每毫升制造出約200至500毫微克融合蛋白質(zhì)的克隆。編碼單鏈MHC復(fù)合體的載體實施例為圖1B所示的pBRHK載體。該載體系編碼sc-DR2/MBP單鏈第二類MHC復(fù)合體。本方法可依實際需要而加以變化。例如，本發(fā)明特別包括下列實施例(1)以攜帶有抗藥基因的表達載體的轉(zhuǎn)染，(2)以表達載體及可瞬時表達細胞表面標(biāo)記的載體共-轉(zhuǎn)染，及(3)以該表達載體及攜帶有不同抗藥性基因的載體共-轉(zhuǎn)染。本文中討論的細胞選擇步驟可用于特別方案的實施。本發(fā)明亦可用于可編碼標(biāo)的的特殊重組蛋白質(zhì)，如編碼二種多肽序列(免疫球蛋白重鏈及輕鏈)的表達載體，使細胞再轉(zhuǎn)染。優(yōu)選的表達涉及到二種多肽鏈的協(xié)調(diào)表達。本文中討論的特定方法及其它方法具有廣泛適用性質(zhì)，包括促進細胞的選擇及篩選。本發(fā)明進一步以下列實施例加以敘述。該實施例僅助于了解本發(fā)明，而非用以限制本發(fā)明。實施例一高產(chǎn)量重組抗-組織因子(TF)抗體的CHO細胞的再-轉(zhuǎn)染。1.載體特性稱為pJAIgG4TF.A8(圖1)的載體經(jīng)過構(gòu)建而表達哺乳類細胞的嵌合式抗組織因子(TF)免疫球蛋白質(zhì)重鏈與輕鏈。進行起始的瞬時轉(zhuǎn)染實驗以測試來自pJAIgG4TF.A8載體的抗體表達情況。使用Qiagen公司的lipofectin試劑以瞬時轉(zhuǎn)染COS細胞。簡言之，將2.5×105細胞/孔(cell/well)接種于六孔培養(yǎng)盤中并于37℃培育24小時。將2微克pJAIgG4TF.A8DNA與100微升IMDM混合。為了制造脂質(zhì)復(fù)合體，將10微升脂質(zhì)加至該DNA溶液中。振動混合該混合液，并于室溫下培育5分鐘。當(dāng)DNA形成脂質(zhì)復(fù)合體時，以PBS洗滌該細胞。將DNA-脂質(zhì)混合物與600微升10％SSM[添加10％小牛血清(FBS)的CellGroIMDM培養(yǎng)基(MediaTech出品)]混合，并加入至經(jīng)洗滌的細胞中。將該細胞與脂質(zhì)復(fù)合體于37℃，10％CO2下培育3小時。以PBS洗滌此經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，添加2毫升10％SSM，并于37℃及10％CO2下培養(yǎng)72小時。取該培養(yǎng)液上清液以測試生成的抗體。2.試抗體生成的ELISA為檢測人類IgG4抗體的存在，開發(fā)出人類HC/Kappa-特異性夾心ELISA。簡言之，將100微升的1微克/毫升的山羊抗-人類IgG-Fc(Fab)的R5緩沖液(10mMTris-HCl，pH8.5)涂覆于Maxisorp96孔培養(yǎng)盤上(NUNC出品)，并于4℃下培育過夜。以R55緩沖液(2mM咪唑，7.5mMNaCl，0.02％Tween-20)洗滌一次該培養(yǎng)盤孔，以塑料薄膜覆蓋該培養(yǎng)孔并于4℃下貯存待用。為分析抗體的產(chǎn)生，移除R55，并加入100微升的轉(zhuǎn)染物的上清液至該經(jīng)覆蓋的培養(yǎng)盤孔。37℃30分鐘后，以R55緩沖液洗滌6次，然后再加入100微升的1∶800稀釋(含10％FBS之PBS)的抗人類kappa鏈-HRP抗體(SouthemBiotech出品)。將該培養(yǎng)盤置于37℃下培養(yǎng)后，以400微升的R55緩沖液洗滌6次。為檢測探針抗體(probeantibody)的存在，于4分鐘內(nèi)加入100微升的1倍ABTS基質(zhì)(Kirkegaad&Perry實驗室出品)，接著添加100微升ABTS驟冷緩沖液(Kirkegaard&Perry實驗室出品)。在405nm讀取吸光率。以純化的人類IgG4蛋白質(zhì)做為正對照組。此分析法結(jié)果顯示，此抗-TFIgG4抗體是由pJAIgG4TF.A8載體瞬時轉(zhuǎn)染COS細胞所產(chǎn)生者。3.測試抗體特異性的ELISA為特別檢測抗體與人類組織因子的結(jié)合，開發(fā)出第二夾心式(ELISA)。于4℃下以100微升含500毫微克/毫升重組人類-TF的R65緩沖液(100mM碳酸氫鈉，pH8.2)涂覆Maxisorp96孔培養(yǎng)盤上，并置放過夜。次日以R55緩沖液洗滌該培養(yǎng)盤、覆蓋該培養(yǎng)盤并于4℃下貯存待用。為檢測抗-TF抗體的生成，移除R55并加入100微升經(jīng)轉(zhuǎn)染物的上清液至此經(jīng)覆蓋的培養(yǎng)盤孔內(nèi)。于37℃30分鐘后，以R55緩沖液洗滌該培養(yǎng)孔6次，然后再加入100微升1∶800稀釋(含10％FBS之PBS)的抗-人類Kappa鏈-HRP(SouthemBiotech出品)。將該培養(yǎng)盤置于37℃下培育后，以400微升R55緩沖液洗滌6次。為見檢測探針抗體的存在，于4分鐘內(nèi)加入100微升1倍的ABTS基質(zhì)，接著加入100微升ABTS驟冷緩沖液。在405nm讀取吸光率。以純化的小鼠H36.D2抗-TF蛋白質(zhì)做為正對照組。此分析結(jié)果顯示，該抗-TFIgG4抗體是由pJAIgG4TF.A8載體瞬時轉(zhuǎn)染COS細胞所產(chǎn)生者。4.CHO細胞的起始穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為生成可表達重組抗-TF抗體的穩(wěn)定細胞系，將CHO.K1細胞以pJAIgG4TF.A8載體轉(zhuǎn)染。簡言之，100微克的pJAIgG4TF.A8DNA經(jīng)由PvuI酶，于37℃下消化4小時后而成直鏈化。將CHO.K1細胞(ATCCCLL-61)稀釋至濃度為1.25×107細胞/毫升。并將800微升的細胞加入0.4厘米的電穿孔量杯(cuvette)內(nèi)并于冰上培育10分鐘。加入25微克的pJAIgG4TF.A8DNA，與細胞混合并培育10分鐘。于960μF及250V下電穿透該細胞。然后將細胞置于冰上培育10分鐘，將細胞懸浮液加入含10毫升10％SSM的T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，于37℃及10％CO2下過夜培育。24小時后，以胰蛋白酶-PBS培育并采集該細胞，將細胞重新懸浮于PBS中，并以1∶9、1∶27、1∶81稀釋比稀釋于添加有G418的培養(yǎng)基。將此經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞以100微升/孔鋪于96孔盤培養(yǎng)盤中，并于37℃及10％CO2下培育。如上述測試轉(zhuǎn)染后細胞培養(yǎng)液上清液的抗體生成情況。陽性克隆(Positiveclone)經(jīng)選擇并培養(yǎng)放大。由1∶27稀釋比的培養(yǎng)盤中之第H列、第9行中選擇出克隆H9，作為高抗體產(chǎn)量克隆。經(jīng)限制稀釋法克隆該細胞系。簡言之，將經(jīng)選擇的克隆于PBS中稀釋至1000細胞/毫升。于10％SSM中做成一系列的1∶10稀釋以獲得1細胞/毫升。由該等稀釋度，以100微升/孔鋪于96孔平底培養(yǎng)盤，并于37℃及10％CO2下培育。于培育三日后，各孔中添加100微升/孔的10％SSM。三星期后，單一克隆開始出現(xiàn)。以ELISA僅測試單一克隆的抗體生成。具有高抗體產(chǎn)量的克隆經(jīng)擴增并選擇。選克隆H9g12作為最高產(chǎn)量的克隆，并于靜態(tài)培養(yǎng)下分析其抗體產(chǎn)量。經(jīng)選擇的克隆經(jīng)胰蛋白酶培養(yǎng)而采集，重新懸浮于10毫升10％SSM中使其濃度為1×105細胞/毫升，并加入T-25組織培養(yǎng)瓶中。于37℃及10％CO2下培養(yǎng)該細胞21天，或達到80％細胞死亡率為止。將該細胞懸浮液離心，取其上清液以ELISA分析測試其Ab的產(chǎn)量。H9g12克隆的最高抗體產(chǎn)量為3.5微克/毫升。5.CHO-H9g12細胞系的穩(wěn)定再-轉(zhuǎn)染。開發(fā)出本方法以加入較多標(biāo)的基因拷貝數(shù)量至穩(wěn)定的Ab-產(chǎn)量細胞系的基因體內(nèi)。為進行此方法，將克隆H9g12以抗-人類TFmega載體pJAIgG4TF.A8以及pMACS的混合載體共-轉(zhuǎn)染。該pMACS載體可瞬時表達膜結(jié)合CO4蛋白質(zhì)。為了共-轉(zhuǎn)染此H9g12細胞系，將1.25×107細胞/毫升細胞懸浮液800微升加入0.4厘米的電穿孔量杯內(nèi)，并于冰上培育10分鐘。將3∶1摩爾比的pJAIgG4TF.A8載體及pMACSDNA(40微升的1微克/毫升以PvuI酶直鏈化的pJAIgG4TF.A8，以及5微升1微克/毫升超螺旋pMACS)的混合物加入細胞中。于冰上培養(yǎng)10分鐘后，于960μF及250V下電穿透該細胞。于37℃下培育該細胞10分鐘，再將細胞稀釋于含10毫升10％SSM的T25培養(yǎng)瓶中，并于37℃及10％CO2下培養(yǎng)72小時，以瞬時表達CD4蛋白質(zhì)。此時，于室溫下以5毫升PBE(含二乙胺四乙酸之PBS溶液)處理細胞直到可分離該細胞。細胞經(jīng)洗滌一次并重新懸浮于380微升的PBE中，并以80微升的經(jīng)細胞表面-表達的人類CD4分子具特異性的抗體標(biāo)記。該抗體共價結(jié)合于磁性珠粒上，于4℃培養(yǎng)15至20分鐘后，將此由抗體標(biāo)記的細胞加入磁性層析柱中?？捎谄浔砻婵杀磉_CD4的轉(zhuǎn)染后細胞預(yù)期可結(jié)合至此磁性柱上。而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞則由1毫升PBE溶液洗經(jīng)該柱。將層析柱從磁場中移出、加入1毫升PBE流經(jīng)該層析柱而自該柱洗出此經(jīng)結(jié)合的細胞。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液199毫升稀釋該表達CD4的細胞，并平鋪于96孔平底培養(yǎng)盤，于37℃及10％CO2下培育該培養(yǎng)盤。為測試抗體生成，如上述將100微升1微克/毫升的山羊抗-人類IgG-Fc(Fab)(Pierce出品)涂覆于Maxisorp96孔培養(yǎng)盤上(NUNC出品)。于測試前24小時，更換該經(jīng)再-轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基。經(jīng)24小時，將5毫升經(jīng)感染細胞的上清液加至95微升10％FBS-PBS中。加入經(jīng)稀釋的上清液至經(jīng)涂覆的培養(yǎng)盤孔上，并于37℃培育60分鐘。以R55緩沖液洗滌該培養(yǎng)盤孔6次，如上述方法使用抗-人類Kappa鏈抗體-HRP(SouthemBiotech出品)以測試存在于上清液內(nèi)的重組抗體。純化的人類IgG4蛋白質(zhì)(Biodesign出品)做為正對照組，用以建立抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線?？寺∵x擇是藉比較抗體生成率對細胞數(shù)目而完成。簡言之，此高產(chǎn)量菌株是以胰蛋白酶處理并計數(shù)之。由經(jīng)計算的抗體產(chǎn)率及細胞數(shù)目，決定出微克抗體/106細胞/24小時的數(shù)值，將此高產(chǎn)量克隆經(jīng)由24孔/培養(yǎng)盤擴增培養(yǎng)放大，此經(jīng)選擇的克隆命名為3D2。就限制性稀釋克隆而言，如上所述，以10％SSM連續(xù)稀釋此經(jīng)過選擇的克隆，接種于96孔平底培養(yǎng)盤并培育。三星期后，以ELISA測試單一克隆的抗體產(chǎn)量。此具高抗體產(chǎn)量的克隆經(jīng)擴增，并選擇之。克隆3D2A9顯示數(shù)值為2.58微克抗體/106細胞/24小時，并經(jīng)選擇為最佳克隆。靜態(tài)培養(yǎng)該克隆，分析其抗體產(chǎn)量?？寺?D2A9的靜態(tài)培養(yǎng)，是由添加濃度為2×105細胞/毫升的10毫升10％SSM培養(yǎng)基，于T-25組織培養(yǎng)瓶而開始。于37℃及010％CO2下培育該細胞21天或達到80％細胞死亡率為止。將該細胞懸浮液離心，取其上清液以ELISA測試其抗體產(chǎn)量。克隆3D2A9的最高抗體產(chǎn)量為21微克/毫升。此抗體產(chǎn)量比該第一經(jīng)轉(zhuǎn)染的克隆高7倍。3.第三次穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為進一步增加經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞的抗體產(chǎn)量，克隆3D2A9再次以抗人類TFmega載體pJAIgG4TF.A8以及pMACS混合物共-轉(zhuǎn)染。為了共-轉(zhuǎn)染此細胞系，將1.25×107細胞/毫升細胞懸浮液800微升加入0.4厘米的電穿孔量杯內(nèi)，并于冰上培育10分鐘。將3∶1摩爾比的pJAIgG4TF.A8載體及pMACSDNA(40微升之1微克/毫升PvuI酶直鏈化的pJAIgG4TF.A8以及5微升1微克/毫升的超螺旋pMACS)的混合物加入該細胞中。于冰上培育10分鐘，將細胞于960μF及250V下電穿透該細胞。于37℃下培育該細胞10分鐘，再添加至含10毫升10％SSM的T25培養(yǎng)瓶內(nèi)，并于37℃及10％CO2下培養(yǎng)48小時以瞬時表達CD4蛋白質(zhì)。此時，將此經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞以抗-CD4的磁性珠粒標(biāo)記，及如上述在磁性層析柱上選擇。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液200毫升稀釋該表達CD4的細胞。將該細胞懸浮液鋪于96孔平底培養(yǎng)盤。于37℃及10％CO2下培養(yǎng)該細胞約3星期。如上述，將100微升1微克/毫升的山羊抗-人類IgG-Fc(Fab)(Pierce出品)的R5/緩沖液涂覆于Maxisorp96孔培養(yǎng)盤上(NUNC出品)。為了分析抗體產(chǎn)率，于測試前24小時更換經(jīng)再-轉(zhuǎn)染細胞的培養(yǎng)基。經(jīng)過24小時將5微升經(jīng)感染的細胞的上清液加至95微升的10％FBS-PBS中。該經(jīng)稀釋的上清液加至此經(jīng)涂覆的孔中，并于37℃培育60分鐘。以R55緩沖液洗滌該培養(yǎng)盤孔6次，如上述，用抗-人類Kappa鏈抗體-HRP(SouthemBiotech出品)檢測存在于該上清液內(nèi)的重組抗體。以純化的抗-TF嵌合式抗體作為正對照組，用以建立抗體濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。此測試結(jié)果可選擇出具高抗體產(chǎn)量的克隆，并將該克隆于12孔培養(yǎng)盤中培養(yǎng)擴增。待克隆長滿至達80％培養(yǎng)盤孔，即可測試24小時上清液。此經(jīng)24小時培養(yǎng)的上清液以1∶100稀釋度以ELISA測試。細胞亦經(jīng)計數(shù)，并決定微克/106細胞/24小時抗體產(chǎn)量。依據(jù)此數(shù)值可選擇出最高抗體產(chǎn)量的母克隆(motherclone)A9B11及A9F12。此經(jīng)選擇的克隆，如上述以10％SSM連續(xù)稀釋、接種于96孔平底培養(yǎng)盤中并培育。三星期后以ELISA測試單一克隆的抗體產(chǎn)量。該具高抗體產(chǎn)量的克隆經(jīng)擴增。經(jīng)發(fā)現(xiàn)初級(primary)克隆A9F12C2及A9AIIBS具有最高的抗體產(chǎn)量，為30至40微克抗體/106細胞/24小時。該克隆經(jīng)由靜態(tài)培養(yǎng)放大。A9F12C2克隆的靜態(tài)培養(yǎng)，是由添加10毫升濃度為2×105細胞/毫升的10％SSM培養(yǎng)基稀釋至T-25組織培養(yǎng)瓶內(nèi)而開始的。于37℃及10％CO2下培育該細胞21天或達到80％細胞死亡率為止。將該細胞懸浮液離心，取其上清液以ELISA測試Ab的產(chǎn)量。A9F12C2克隆的最高抗體產(chǎn)量為52微克/毫升，此產(chǎn)量高出該第二經(jīng)轉(zhuǎn)染菌株2倍。此經(jīng)選擇克隆A9F12C12如上述以10％SS連續(xù)稀釋、接種于96孔平底培養(yǎng)盤中并培育。三星期后，以ELISA測試單一克隆的抗體產(chǎn)量。經(jīng)發(fā)現(xiàn)此二級克隆A9F12C12具有最高抗體產(chǎn)率并以靜態(tài)培養(yǎng)放大。該等靜態(tài)培養(yǎng)以如前所述進行。為決定靜態(tài)培養(yǎng)上清液的抗體濃度，取5微升A9F12C2E7細胞上清液加至4995微升的10％PBS中。該稀釋的上清液如上述以抗體ELISA分析嵌合式抗體。以純化的抗-TF嵌合式抗體作為正對照組。此測試結(jié)果顯示A9F12C2E7二級克隆于靜態(tài)培養(yǎng)中具有最高抗體產(chǎn)量為52.6微克/毫升。此經(jīng)選擇之克隆A9F12C2E7如上述以10％SSM連續(xù)稀釋、接種于96孔平底培養(yǎng)盤中并培育。三星期后，以ELISA測試單一克隆的抗體產(chǎn)量。此三級克隆A9F12C2E7B4經(jīng)選擇作為最高抗體產(chǎn)量者并以靜態(tài)培養(yǎng)放大。該靜態(tài)培養(yǎng)以如前所述進行。為決定此靜態(tài)培養(yǎng)上清液的抗體濃度，取5微升A9F12C2E7細胞上清液加至4995微升的10％PBS中。該稀釋的上清液如上述以抗體ELISA分析嵌合式抗體。以純化的抗-TF嵌合式抗體做為正對照組?？寺9F12C2E7B4的最高抗體產(chǎn)量為102.3微克/毫升(第2圖)。此細胞系經(jīng)擴增并冷凍。以濃度為1×106細胞/毫升做成50小瓶而做為起始種子細胞銀行(initialseedcellbank)并于液態(tài)氮中貯存。此細胞系命名為cH36(嵌合式H36)。4.生物反應(yīng)器注射以廠商提供的使用說明裝設(shè)中空纖維生物反應(yīng)器。將經(jīng)選擇的以濃度1×108細胞/毫升重新懸浮于正確容量的30％SSM中并注入生物反應(yīng)器中。依據(jù)廠商使用說明來操作此生物反應(yīng)器。如上述以ELISA測試最高產(chǎn)量。相比第三次經(jīng)轉(zhuǎn)染的初級克隆A11B5的抗體產(chǎn)量為1,100微克/毫升，此第一次轉(zhuǎn)染的初級克隆H9g12的最高抗體產(chǎn)量為70微克/毫升(圖3)。實施例2重組HLA-DR2MHC第二類分子的細胞系的制備方法。1.載體特性稱為PDRHK(圖1B)的載體構(gòu)建成可表達哺物類細胞融合至人類免疫球蛋白Kappa恒定區(qū)的可溶性單鏈HLA-DR2/MBP分子。進行最初瞬間轉(zhuǎn)染實驗以測試來自pDHRK載體的蛋白質(zhì)的表達。使用Qiagen公司的Iipofectin試劑以瞬時轉(zhuǎn)染COS細胞。簡言之，將2.5×105細胞/孔接種于6孔培養(yǎng)盤并于37℃下培育24小時?；旌?微克pDRHKDNA與100微升IMDM。為了制造脂質(zhì)復(fù)合體，將10微升脂質(zhì)加入該DNA溶液中。振動混合該混合液并于室溫下培育5分鐘。當(dāng)DNA形成脂質(zhì)復(fù)合體，以PBS洗滌該細胞。將DNA-脂質(zhì)混合物與600微升10％SSM混合并加入至經(jīng)洗滌的細胞中。將該細胞與脂質(zhì)復(fù)合體于37℃及10％CO2下培養(yǎng)3小時。以PBS洗滌此經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞，添加2毫升之10％SSM，并于37℃及10％CO2下培養(yǎng)72小時。取其上清液以測試重組體DR2/MBP-CK的生成。2.測試sc-DR2/MBP-Cκ生成的ELISA為檢測sc-DRZ/MBP-C6的存在，開發(fā)出人類6/HLA-DR-特異性夾心ELISA。簡言之，將100微升1微克/毫升的山羊抗-人類IgG-Kappa的PBS涂覆于Maxisorp96孔培養(yǎng)盤孔(NUNC出品)，并于4℃培育隔夜培養(yǎng)盤接著以R55緩沖液洗滌一次，以塑料膜覆蓋及于40℃貯存適用。為分析重組體蛋白質(zhì)產(chǎn)量，移除R55并加入100微升經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞上清液至該經(jīng)覆蓋的培養(yǎng)盤孔內(nèi)。于37℃60分鐘后，以R55緩沖液洗滌該培養(yǎng)孔6次，然后加入100微升1∶1000稀釋(含10％FBS的PBS)的與HRP(Anergen出品，ATCCHB-55)共軛的抗HLA-DR抗體L243。于37℃下培育后，以400微升R55緩沖液洗滌6次。為檢測探針抗體的存在，于5分鐘內(nèi)加入100微升1倍ABTS基質(zhì)，再加入100微升ABTS驟冷緩沖液。在405nm讀取吸光率。此分析結(jié)果顯示，此scDR2/MBP-Cκ融合蛋白系由pDRHK載體瞬時轉(zhuǎn)染COS細胞所生成者。3.起始穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為生成可表達此sc-DR2/MBP-Cκ融合蛋白質(zhì)的穩(wěn)定細胞系，將CHO.K1細胞以pDRHK載體轉(zhuǎn)染。簡言之，100微克pDRHKDNA經(jīng)由PvuI于37℃下切割消化4小時，將CHO.K1細胞(ATTCCCL-61)稀釋至濃度為1.25×107細胞/毫升。將800微升的細胞液加入0.4公分的電穿孔量杯內(nèi)并于冰上培育10分鐘。加入20微克的pDRHKDNA并與該細胞液混合，并培育10分鐘。于960μf及250V下電穿透該細胞，然后將細胞置于冰上培育10分鐘，將細胞懸浮液加入含10毫升10％SSM的T25培養(yǎng)瓶內(nèi)及于37℃及10％CO2下過夜培養(yǎng)。待24小時后，以胰蛋白酶-PBS培育而采集該細胞，將細胞重新懸浮于PBS中，并將該細胞液以1∶9、1∶27、1∶81稀釋比稀釋于添加有G418的培養(yǎng)基中，將此經(jīng)轉(zhuǎn)染細胞鋪于96孔培養(yǎng)盤并于37℃及10％CO2下培養(yǎng)。96孔培養(yǎng)盤培養(yǎng)的細胞上清液如上述測試。陽性克隆經(jīng)選擇并培養(yǎng)放大。于1∶27稀釋比的培養(yǎng)盤中的第A列、第5行中選擇出克隆A5，并作為高抗體產(chǎn)量的克隆。細胞系如上述經(jīng)限制稀釋法亞克隆。經(jīng)篩選后此克隆A5B4經(jīng)選擇為最高抗體產(chǎn)量的細胞系，并以靜態(tài)培養(yǎng)培養(yǎng)。該經(jīng)選擇出的克隆是經(jīng)胰蛋白酶處理而采集的，以濃度1×105細胞/毫升重新懸浮于10毫升10％SSM培養(yǎng)基中，并加至T-25組織培養(yǎng)瓶中。于37℃及10％CO2下培養(yǎng)該細胞21天，或達到80％細胞死亡率為止。將該細胞懸浮液離心，取其上清液做ELISA分析測試其重組體DR2生成。以A5B4克隆生成的重組sc-DR2/MBP-C6融合蛋白量為20毫微克/毫升。4.穩(wěn)定再-轉(zhuǎn)染為進行此方法，將克隆A5B4以pDRHK及pMACS的混合物共-轉(zhuǎn)染。將1.25×107細胞/毫升的細胞懸浮液800微升加入至0.40厘米的電穿孔量杯內(nèi)并于冰上培育10分鐘。將3∶1摩爾比的pJAIgG4TF.A8載體及pMACSDNA(30微升的1微克/毫升Pvul-直鏈化的pDRHK，以及5微升的1微克/毫升超螺旋pMACS)的混合物加入細胞中。于冰上培育10分鐘后，于960μF及250V下電穿透該細胞。于37℃下培育該細胞10分鐘，再將細胞稀釋至于含10毫升10％SSM的T-25培養(yǎng)瓶中，并于37℃及10％CO2下培育72小時，以瞬時表達CD4蛋白質(zhì)。此時，于室溫下以5毫升PBE處理細胞，直到可分離細胞。細胞洗滌一次并重新懸浮于380微升的PBE，并以80微升抗體標(biāo)記(該抗體對于經(jīng)由細胞表面-表達的人類CD4分子具有特異性)。該抗體共價結(jié)合在磁性珠粒上。于4℃下培育15至20分鐘后，將此由抗體標(biāo)記的細胞加入至磁性層析柱中?？捎诒砻姹磉_CD4的經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞預(yù)期可結(jié)合至該磁性層析柱中。而未經(jīng)轉(zhuǎn)染的細胞則由1毫升PBE溶液沖洗出該柱。將層析柱從磁場中移出，以1毫升PBE溶液流經(jīng)該柱則可自層析柱洗出此經(jīng)結(jié)合的細胞。以添加G418(1.5毫克/毫升)的10％SSM溶液199毫升稀釋該表達CD4的細胞，并鋪于96孔平底培養(yǎng)盤中，于37℃及10％CO2下培育該細胞。三星期后，96孔培養(yǎng)盤的細胞上清液如上述測試其重組蛋白質(zhì)。陽性菌株經(jīng)選擇并培養(yǎng)放大。經(jīng)選擇克隆DR22為最高產(chǎn)量的克隆，該細胞系冰凍保存。將DR22克隆的冷凍保存瓶于37℃水浴下快速解凍并生長至95％存活率。細胞如上述限制性稀釋克隆而連續(xù)稀釋。細胞生長三星期后，以ELISA測試單一克隆的sc-DR2-Cκ產(chǎn)量。將具最高產(chǎn)量的克隆放大并選擇出。經(jīng)辨認(rèn)克隆SR22-H4為最佳產(chǎn)量的克隆。如上述進行靜態(tài)培養(yǎng)，經(jīng)發(fā)現(xiàn)其重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量量為100毫微克/毫升。5.第三次穩(wěn)定轉(zhuǎn)染為進一步增加重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量，初級克隆DR22-H4與pDRHK及pPUR(Clonetech出品)的混合物共-轉(zhuǎn)染，該載體攜帶了抗博羅霉素的基因。簡言之，將1.25×107細胞/毫升細胞懸浮液800微升加入0.4厘米的電穿孔量杯并于冰上培育10分鐘。將3∶1摩爾比的pDRHK及pMACSDNA(25微升的1微克/毫升以PvuI直鏈化的pDRHK，以及5微升的1微含/毫升以PvuI直鏈化的pPUR)的混合物加入細胞中。于冰上培育10分鐘后，于960μF及250V下電穿透該細胞。于37℃下培養(yǎng)該細胞數(shù)分鐘再加至含10毫升10％SSM的T-25培養(yǎng)瓶中，并于37℃及10％CO2下培育48小時。以胰蛋白酶處理而采集該細胞，離心并將細胞重新懸浮于含G418(1.5毫克/毫升)及博羅霉素(20微克/毫升)的10％SSM中。將細胞鋪于96孔平底培養(yǎng)盤并于37℃及10％CO2下培育。待克隆開始出現(xiàn)，即測試該培養(yǎng)基的重組蛋白質(zhì)。經(jīng)發(fā)現(xiàn)克隆A9及B9為最高產(chǎn)量者，并如上述于靜態(tài)培養(yǎng)下測試。A9的靜態(tài)培養(yǎng)的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量為1,800毫微克/毫升，而B9的靜態(tài)培養(yǎng)的重組蛋白質(zhì)產(chǎn)量為2,108毫微克/毫升。該細胞系是由限制稀釋克隆法亞克隆之，并測試其重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。初級克隆A9D5、A9G4、A9C7、B9H3、B9G4、及B9H5經(jīng)辨認(rèn)為于24小時，其scDR2/MBP-Cκ產(chǎn)率為200至300毫微克/毫升。該克隆于靜態(tài)培養(yǎng)的重組蛋白制備是如上述的方法進行。本發(fā)明已參考其優(yōu)選實施例加以說明。但須知在未脫離本發(fā)明的精神與范圍下，熟知本領(lǐng)域的技術(shù)人員可作修飾或改進。權(quán)利要求1.一種具有能增加氨基酸序列表達的細胞系的制備方法，該方法包括(a)將第一載體導(dǎo)入宿主細胞中，該第一載體包括與編碼該氨基酸序列片段操縱聯(lián)結(jié)的第一選擇序列，(b)于有益于選擇出該第一載體的生長條件下培養(yǎng)宿主細胞，(c)分離出可在第一表達量表達氨基酸序列的細胞(第一高表達細胞)，(d)將編碼該氨基酸序列的第二載體導(dǎo)入以第一表達量表達的細胞中，(e)使細胞接受有益于在比該第一表達量更高的第二表達量表達氨基酸序列的條件，(f)分離出在第二表達量表達氨基酸序列的細胞以制備細胞系(第二高表達細胞)。2.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中該方法進一步包括(g)將編碼該氨基酸序列的第三載體導(dǎo)入該在第二表達量表達的細胞中，及使該細胞接受有益于在比該第二表達量更高的第三表達量表達氨基酸序列的條件下；及(h)分離出在第三表達量表達該氨基酸序列的細胞以制造細胞系(第三高表達細胞)。3.如權(quán)利要求2所述的制備方法方法，其中該方法進一步包括將編碼該氨基酸序列的載體導(dǎo)入該第三高表達細胞中，及使該細胞接受有益于在比該第三表達量更高的表達量表達氨基酸序列的條件下，重復(fù)該導(dǎo)入載體與該接受條件步驟至少一次，以分離出在比該第三高表達細胞更高表達量的表達氨基酸序列高的細胞系。4.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中該第(b)步驟進一步包括將該細胞生長于含有至少一種用以篩選第一選擇序列的藥物的選擇性培養(yǎng)基中。5.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中該第(d)步驟進一步包括將第四載體導(dǎo)入該細胞中，及使該細胞接受有益于在第二表達量表達氨基酸序列的條件。6.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中該第四載體進一步包括第二選擇序列。7.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中該第四載體進一步包括與編碼該氨基酸序列的片段操縱聯(lián)結(jié)的第二選擇序列。8.如權(quán)利要求6所述的制備方法，其中該方法進一步包括將細胞生長于含有至少一種用以篩選第二選擇序列的藥物的選擇性培養(yǎng)基中。9.如權(quán)利要求5所述的制備方法，其中該第四載體進一步包括編碼選擇性細胞表面標(biāo)記的序列。10.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其中該選擇性細胞表面標(biāo)記系操縱聯(lián)結(jié)于編碼該氨基酸序列的片段。11.如權(quán)利要求9所述的制備方法，其中該方法進一步包括以層析、細胞淘洗法、流式細胞計量術(shù)、免疫沉淀或抗體結(jié)合方法中至少一種方法分離出可表達細胞表面標(biāo)記的細胞。12.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中該第(g)步驟進一步包括將第五載體導(dǎo)入該細胞中，及使該細胞接受有益于在第三表達量表達該氨基酸序列的條件。13.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其中該第五載體進一步包括第三選擇序列。14.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其中該第三選擇序列系操縱聯(lián)結(jié)于編碼該氨基酸序列的片段。15.如權(quán)利要求13所述的制備方法，其中該方法進一步包括將細胞生長于含有至少一種用以篩選第三選擇序列的藥物的選擇性培養(yǎng)基中。16.如權(quán)利要求12所述的制備方法，其中該第五載體進一步包括編碼選擇性細胞表面標(biāo)記的序列。17.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其中該選擇性細胞表面標(biāo)記系操縱聯(lián)結(jié)于編碼氨基酸序列的片段。18.如權(quán)利要求16所述的制備方法，其中該方法進一步包括以層析、細胞淘洗法、流式細胞計量術(shù)、免疫沉淀或抗體結(jié)合方法中至少一種方法分離出可表達細胞表面標(biāo)記的細胞。19.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中該第二高表達細胞的氨基酸序列表達量以抗體反應(yīng)性決定，表達出相對于該第一高表達細胞為約3倍至約40倍以上的氨基酸序列表達量。20.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中該第三高表達細胞的氨基酸序列表達量以抗體反應(yīng)性決定，表達出相對于該第二高表達細胞為約3倍至約40倍以上的氨基酸序列表達量。21.如權(quán)利要求1所述的制備方法，其中該氨基酸序列編碼免疫球蛋白的重鏈至輕鏈或其功能性片段。22.如權(quán)利要求2所述的制備方法，其中該載體可各自分別編碼第一抗藥基因、細胞表面標(biāo)記、或第二抗藥基因，及進一步各該載體操縱聯(lián)結(jié)于氨基酸序列。23.一種如權(quán)利要求1、2或3所述的制備方法產(chǎn)生的細胞系。全文摘要本發(fā)明披露重組細胞的制備方法,特別是可增強表達氨基酸序列的重組哺乳類細胞系的制備方法。本發(fā)明亦披露能制造高產(chǎn)量氨基酸序列的重組哺乳類細胞系。本發(fā)明的方法與重組細胞系可適廣泛用途,包括高效大量制備重組蛋白質(zhì)與多肽。文檔編號C12N5/10GK1328605SQ99813873公開日2001年12月26日申請日期1999年11月30日優(yōu)先權(quán)日1998年12月3日發(fā)明者喬治·L·亞瑟維多,彼特·R·羅德申請人:蘇諾爾分子公司