專(zhuān)利名稱(chēng)：轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控的新系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞中核酸表達(dá)的新組合物和方法。本發(fā)明更具體地適于控制體外及體內(nèi)神經(jīng)細(xì)胞中的核酸表達(dá)。
控制細(xì)胞中的核酸表達(dá)在生物技術(shù)的所有領(lǐng)域中都有巨大的吸引力。這樣可以在體外或離體改善重組蛋白的表達(dá)條件、對(duì)基因功能或調(diào)節(jié)的研究、病毒顆粒的生產(chǎn)、用于植入體內(nèi)之細(xì)胞的制備等。在體內(nèi)，這可以改善動(dòng)物模型的特性、更精確地研究化合物的生物利用度或毒性或基因的功能、或更有效地控制化合物的生產(chǎn)，例如治療或疫苗目的的化合物。本發(fā)明的組合物和方法可用于所有這些生物技術(shù)領(lǐng)域。
現(xiàn)有技術(shù)中已提出了各種途徑試圖控制基因表達(dá)。這特別涉及利用具有組織特異性的載體或轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子。但這些系統(tǒng)不總具有所期望的特異性，特別是在體內(nèi)，而且它們不能在時(shí)間上控制表達(dá)。
Gossen等(PNAS 89(1992)5547；Science 268(1995)1766)描述了一種復(fù)雜的系統(tǒng)，其一方面利用四環(huán)素調(diào)控的反式激活蛋白tTA，另一方面利用tTA敏感的啟動(dòng)子。雖然提供了時(shí)間上調(diào)控表達(dá)方面的優(yōu)點(diǎn)，迄今報(bào)道的這種系統(tǒng)總有一些缺陷限制其應(yīng)用。這些缺陷特別是細(xì)胞毒性、所觀察到的表達(dá)滲漏、需要使用兩種載體等。
本發(fā)明現(xiàn)提供一種與現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)相比穩(wěn)定性、特異性和易操縱性改善的受控新表達(dá)系統(tǒng)。
因此，本發(fā)明的第一方面涉及含有如下元件的基因構(gòu)建體，所述元件的性質(zhì)和特定布置能保證基因表達(dá)的嚴(yán)格控制。
本發(fā)明的另一方面涉及含有這些遺傳構(gòu)建體的載體，特別是病毒載體。
本發(fā)明的另一方面涉及用本發(fā)明遺傳構(gòu)建體或載體遺傳修飾的細(xì)胞、含有這些細(xì)胞的組合物、以及它們用于體外、離體或體內(nèi)生產(chǎn)目的產(chǎn)物的應(yīng)用。
本發(fā)明的另一方面涉及在體外、離體或體內(nèi)細(xì)胞中受控表達(dá)核酸的方法和組合物，特別是在神經(jīng)細(xì)胞中。本發(fā)明的另一方面還涉及在體內(nèi)受控轉(zhuǎn)移和表達(dá)核酸的方法，包括體內(nèi)植入(或移植)用本發(fā)明構(gòu)建體或載體遺傳修飾的細(xì)胞(特別是神經(jīng)祖細(xì)胞)。
本發(fā)明更具體地描述一種基于使用tTA并具有改善特性的新的受控表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)在腺病毒的情形下特別有效，能在體外及體內(nèi)有效和受調(diào)節(jié)地表達(dá)，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中。
本發(fā)明的另一個(gè)目的更具體地涉及一種核酸，其特征在于它包含a)含中等啟動(dòng)子控制下之四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白tTA編碼核酸的第一區(qū)，和b)含tTA敏感性啟動(dòng)子控制下之目的核酸的第二區(qū)，其中a)和b)兩個(gè)區(qū)以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置。
更優(yōu)選，本發(fā)明的核酸另外包含置于a)和b)兩個(gè)區(qū)之間的第三個(gè)區(qū)c)，其限制a)和b)區(qū)間的轉(zhuǎn)錄干擾。
本發(fā)明實(shí)際上基于，證明了這種構(gòu)建體特別在控制體內(nèi)基因表達(dá)、特別是控制神經(jīng)細(xì)胞中表達(dá)的有利特性。本發(fā)明還表明這些構(gòu)建體的有利特性部分來(lái)自各種遺傳元件的選擇和其間的布置。
因此，在本發(fā)明核酸的a)區(qū)中，用于控制反式激活蛋白tTA基因表達(dá)的啟動(dòng)子是一種中等啟動(dòng)子?！爸械葐?dòng)子”在本發(fā)明中指本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)為其活性水平中等的啟動(dòng)子，即活性低于強(qiáng)啟動(dòng)子。更具體地講，本發(fā)明中的中等啟動(dòng)子是能使得以生理水平表達(dá)的非病毒啟動(dòng)子。
因此，與現(xiàn)有技術(shù)(Gossen等，PNAS 89(1992)5547)中描述的系統(tǒng)不同(其中所用啟動(dòng)子是強(qiáng)病毒啟動(dòng)子(特別是hCMV))，本發(fā)明的構(gòu)建體使得以對(duì)哺乳動(dòng)物非毒性的水平組成性合成反式激活蛋白tTA。申請(qǐng)人現(xiàn)證明在細(xì)胞中保持中等水平的tTA可以獲得對(duì)基因表達(dá)的精細(xì)得多的調(diào)節(jié)，特別是在神經(jīng)細(xì)胞中。
更優(yōu)選地，所用啟動(dòng)子是一種細(xì)胞啟動(dòng)子，即來(lái)自在細(xì)胞中表達(dá)之基因的啟動(dòng)子。有利地，該啟動(dòng)子的來(lái)源(衍生)細(xì)胞與待引入該遺傳構(gòu)建體的細(xì)胞來(lái)自相同的物種。因此，當(dāng)本發(fā)明的構(gòu)建體用于在動(dòng)物中引入核酸時(shí)，所用的中等細(xì)胞啟動(dòng)子優(yōu)選衍生自該相同動(dòng)物種的細(xì)胞，或衍生自相關(guān)或相近物種的細(xì)胞。當(dāng)然，可能利用衍生自不同生物的啟動(dòng)子，例如一種鼠啟動(dòng)子用于人體中的表達(dá)，只要所用的啟動(dòng)子是功能性的。
更優(yōu)選，所用的啟動(dòng)子是一種組成型中等細(xì)胞啟動(dòng)子。本申請(qǐng)實(shí)際上表明，當(dāng)所用啟動(dòng)子是組成型時(shí)獲得本發(fā)明系統(tǒng)的最佳特性，組成型即保證細(xì)胞中存在并維持穩(wěn)定的tTA水平。
適于本發(fā)明的組成型中等細(xì)胞啟動(dòng)子的具體實(shí)例特別為遍在型啟動(dòng)子如3-磷酸甘油酸激酶(PGK)、二氫葉酸還原酶(DHFR)或延伸因子1α(EF1α)的內(nèi)務(wù)(“管家”)基因的啟動(dòng)子。其他可用于本發(fā)明的中等細(xì)胞啟動(dòng)子是組織特異性啟動(dòng)子，如對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)特異的GFAP(“神經(jīng)膠質(zhì)特異性原纖維酸性蛋白”)基因的啟動(dòng)子，對(duì)神經(jīng)元特異的NSE(“神經(jīng)元特異性烯醇化酶”)基因啟動(dòng)子，對(duì)心肌特異的β-肌動(dòng)蛋白、β-珠蛋白、MHCα(“瞳孔縮小重鏈α”)基因的啟動(dòng)子，或復(fù)合啟動(dòng)子如NRSE-PGK型。
因此，本發(fā)明的中等啟動(dòng)子有利地為這樣的細(xì)胞啟動(dòng)子，其保證組成性、遍在性或局限于某些組織或細(xì)胞類(lèi)型的表達(dá)，優(yōu)選能獲得生理水平的表達(dá)。PGK啟動(dòng)子(或其變體)的應(yīng)用代表本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案。下文給出的實(shí)施例表明，該啟動(dòng)子的應(yīng)用可以保持目的核酸在引入構(gòu)建體后體內(nèi)表達(dá)至少一個(gè)月。在此期間沒(méi)有觀察到表達(dá)目的核酸之細(xì)胞數(shù)目的任何減少。這種表達(dá)穩(wěn)定性代表了本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)系統(tǒng)相比重要的優(yōu)勢(shì)。而在植入用強(qiáng)啟動(dòng)子(RSV病毒的LTR啟動(dòng)子)控制下編碼β-半乳糖苷酶的腺病毒感染的神經(jīng)祖細(xì)胞時(shí)，植入后至少一個(gè)月內(nèi)觀察到表達(dá)水平的明顯下降。這表明在穩(wěn)定性方面本發(fā)明的有利特性，這出人意料地與使用中等啟動(dòng)子指導(dǎo)tTA基因表達(dá)有關(guān)。
本發(fā)明構(gòu)建體的另一重要特征在于a)和b)兩區(qū)的布置。例如，這兩個(gè)區(qū)域最好(i)以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置，(ii)被限制其轉(zhuǎn)錄干擾的c)區(qū)分隔開(kāi)。
本申請(qǐng)首次表明，為了獲得本發(fā)明系統(tǒng)的更好的效力(即更好地控制表達(dá))，將a)和b)兩個(gè)盒子以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置特別有利。這些結(jié)果是相當(dāng)出人意料的，因?yàn)榻?jīng)常發(fā)現(xiàn)當(dāng)兩個(gè)盒子以相反方向放置時(shí)能更好地控制表達(dá)。而在本發(fā)明中，當(dāng)兩盒子方向相同時(shí)似乎沒(méi)有發(fā)生任何表達(dá)滲漏，甚至在腺病毒的情形中亦如此，而已報(bào)道反平行方向構(gòu)建體的這種表滲漏(Kojima等，Biochem.Biophys.Res.Commun 238(1997)569)。
另外，為了進(jìn)一步改善本發(fā)明構(gòu)建體的特性，在上述a)和b)兩個(gè)區(qū)之間引入一個(gè)限制a)和b)之間轉(zhuǎn)錄干擾的第三個(gè)區(qū)c)特別有利?！稗D(zhuǎn)錄干擾”指a)區(qū)的啟動(dòng)子對(duì)b)核酸轉(zhuǎn)錄的任何影響及反過(guò)來(lái)b)對(duì)a)的影響。更具體地講，“轉(zhuǎn)錄干擾”指b)區(qū)分離時(shí)和與a)區(qū)功能性連接時(shí)可能存在的表達(dá)差異。一種這樣的c)區(qū)優(yōu)選含有轉(zhuǎn)錄終止子，優(yōu)選UMS序列。UMS序列(上游小鼠序列)是一種基因組序列，發(fā)現(xiàn)于鼠c-mos基因的上游(McGeady等，Dna 5(1986)289)。該序列可作為轉(zhuǎn)錄終止子。本發(fā)明現(xiàn)證明這些序列可以有利地用于控制體內(nèi)基因表達(dá)的效率，特別是在神經(jīng)系統(tǒng)中，更具體在腺病毒的情形中。
本發(fā)明的系統(tǒng)因此依賴(lài)于同一核酸中兩個(gè)盒子(區(qū)域)的存在，一個(gè)在可調(diào)節(jié)的條件下表達(dá)能激活表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，在第二個(gè)盒子中為目的核酸。因此在第二個(gè)盒子中(b)區(qū))，選擇與本發(fā)明基因構(gòu)建體適配的轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子很重要。在b)區(qū)中所用的啟動(dòng)子是對(duì)反式激活蛋白tTA敏感的啟動(dòng)子，即在所述反式激活蛋白存在時(shí)活性提高的啟動(dòng)子。從結(jié)構(gòu)角度看，這樣的啟動(dòng)子在其序列中或距其序列的一個(gè)功能性距離處至少含有一個(gè)tTA因子結(jié)合位點(diǎn)(Gossen等，1992)。該結(jié)合位點(diǎn)或操縱區(qū)(Op或tetOp)例如可以具有圖6中所示序列或其功能性變體。變體例如可以是通過(guò)突變、缺失或加入一個(gè)或多個(gè)堿基對(duì)被遺傳修飾但保留反式激活蛋白tTA結(jié)合能力的序列。優(yōu)選地，這些修飾至少含有圖6中所示序列的10％。另外，Op序列可以以一個(gè)或多個(gè)拷貝存在于b)區(qū)中，例如1-10個(gè)、優(yōu)選3-10個(gè)、更優(yōu)選3-8個(gè)拷貝。在一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，b)中所用啟動(dòng)子包含7個(gè)操縱序列。為了很好地控制目的核酸的表達(dá)，更優(yōu)選(極力推薦)b)中所用啟動(dòng)子具有很弱的基礎(chǔ)活性，甚至沒(méi)有。這樣，該啟動(dòng)子的活性只有在tTA存在時(shí)才能觀察到，因此調(diào)控很?chē)?yán)格。最好b)中所用的啟動(dòng)子是對(duì)反式激活蛋白tTA敏感的最小啟動(dòng)子。“最小”的特征指啟動(dòng)子的基礎(chǔ)活性很弱，甚至沒(méi)有。這樣的啟動(dòng)子通常包含對(duì)轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子功能必不可少的最少元件(例如TATA盒)，而沒(méi)有天然與例如其啟動(dòng)子強(qiáng)度或其調(diào)節(jié)相關(guān)的其它區(qū)域。這種啟動(dòng)子可以通過(guò)缺失和/或添加元件(“沉默子”)從不同類(lèi)型的啟動(dòng)子制得。b)中優(yōu)選的啟動(dòng)子是在無(wú)tTA時(shí)基本無(wú)活性、在有反式激活蛋白tTA時(shí)被激活、并在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子?！盎緹o(wú)活性”指沒(méi)有按常規(guī)技術(shù)可檢測(cè)到的產(chǎn)物表達(dá)(多肽)，常規(guī)技術(shù)特別指酶測(cè)定、免疫組織化學(xué)技術(shù)、微透析或HPLC。該術(shù)語(yǔ)不排除通過(guò)PCR或其他很敏感的檢測(cè)技術(shù)可檢測(cè)到的mRNA的存在，但其濃度水平實(shí)際停留在非顯著水平。
b)中所用啟動(dòng)子可以是天然來(lái)源的，可以有不同的特性。所用啟動(dòng)子的選擇實(shí)際上取決于所追求的應(yīng)用和目的基因。因此，該啟動(dòng)子例如可以來(lái)自強(qiáng)的或弱的、遍在性的或組織/細(xì)胞特異的、或生理狀態(tài)或病生狀態(tài)特異的(活性取決于細(xì)胞分化狀態(tài)或細(xì)胞周期的某些階段)的啟動(dòng)子。所述啟動(dòng)子可以源自真核細(xì)胞、原核細(xì)胞、病毒、動(dòng)物、植物、人工合成或源自人等。啟動(dòng)子的具體實(shí)例是CMV立即早期基因啟動(dòng)子、TK、GH、EF1-α、APO等啟動(dòng)子或人工啟動(dòng)子。為了用于本發(fā)明，這些啟動(dòng)子被改造成“最小”，即依賴(lài)于tTA的存在。為此，可以用酶消化來(lái)源啟動(dòng)子并測(cè)定其活性，優(yōu)選在與一個(gè)或多個(gè)Op序列功能性連接后測(cè)定其活性。tetOp序列的數(shù)目以及其相對(duì)于所選擇啟動(dòng)子的距離可以由本領(lǐng)域技術(shù)人員調(diào)裝，以便所述啟動(dòng)子的表達(dá)是嚴(yán)格tTA依賴(lài)性的。優(yōu)選，b)中所用啟動(dòng)子是巨細(xì)胞病毒(CMV)(優(yōu)選人CMV，hCMV)立即早期基因的最小啟動(dòng)子，如Corti等(Neuroreport 7(1996)1655)中所述，后者作為參考文獻(xiàn)引入本文。
本發(fā)明可根據(jù)所希望的應(yīng)用用于不同目的核酸的表達(dá)。因此，在b)區(qū)中，目的核酸最好是編碼目的蛋白或多肽的核酸。在本發(fā)明的目的產(chǎn)物中，更具體地可以舉出酶，血液衍生物，激素如生長(zhǎng)激素，細(xì)胞因子，淋巴因子白介素、干擾素、TNF等(法國(guó)專(zhuān)利9203120號(hào))，生長(zhǎng)因子如血管生成因子、例如VEGF或FGF，神經(jīng)遞質(zhì)或其前體或合成酶(酪氨酸羥化酶TH)，營(yíng)養(yǎng)因子，特別是用于治療神經(jīng)變性疾病、有神經(jīng)系統(tǒng)損傷之創(chuàng)傷、或視網(wǎng)膜變性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子BDNF、CNTF、NGF、IGF、GMF、αFGF、NT3、NT5、HARP/多能營(yíng)養(yǎng)蛋白，或骨生長(zhǎng)因子，造血因子等，肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白或小肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白(法國(guó)專(zhuān)利9111947號(hào))，編碼凝血因子的基因第VII、VIII、IX因子，自殺基因(胸苷激酶，胞嘧啶脫胺酶)，參與細(xì)胞周期的蛋白如p21、或其他依賴(lài)性激酶的抑制性蛋白、Rb、Gas-1、Gas-6、Gas-3、Gad45、Gad153、細(xì)胞周期蛋白A、B、D，或限制平滑肌中細(xì)胞增殖的GAX蛋白(治療再狹窄)，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的蛋白或其他腫瘤抑制蛋白如p53、Bax、BclX-s、Bad或Bc12和Bc1X-1的任何其他拮抗劑，血球蛋白或其他蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的基因，參與脂代謝之蛋白的基因，選自A-I、A-II、A-IV、B、C-I、C-II、C-III、D、E、F、G、H、J和apo(a)的載脂蛋白，代謝酶如脂蛋白脂酶、肝脂酶、卵磷脂膽固醇?；D(zhuǎn)移酶、7α膽固醇羥化酶、磷脂酰酸性磷酸酶，或脂肪轉(zhuǎn)移蛋白如膽固醇酯的轉(zhuǎn)移蛋白和磷脂的轉(zhuǎn)移蛋白，HDL結(jié)合蛋白，或選自LDL受體、殘余乳糜微粒受體和清除劑受體的受體等。
在目的產(chǎn)物中，強(qiáng)調(diào)抗體、單鏈抗體的可變片段(ScFv)或具有識(shí)別能力的任何其他抗體片段的免疫治療應(yīng)用是重要的，例如用于治療感染性疾病、腫瘤(抗RAS、抗-p53或抗GAP抗體)、自身免疫疾病如斑形硬化(抗獨(dú)特型抗體)。
其他目的蛋白(非限制性地)為可溶性受體，如用于抗HIV治療的可溶性CD4受體或TNF的可溶性受體，用于治療肌無(wú)力的乙酰膽堿的可溶性受體；底物肽或酶抑制劑，或受體或粘附蛋白的拮抗或激動(dòng)劑肽如用于治療哮喘、血栓形成和再狹窄人工的、化學(xué)的或截短的蛋白。在重要的目的激素中，可以舉出用于糖尿病的胰島素、生長(zhǎng)激素和降鈣素。
所述核酸還可以是反義基因或序列，其在靶細(xì)胞中的表達(dá)可以控制細(xì)胞基因的表達(dá)或mRNA的轉(zhuǎn)錄。這種序列例如可以在靶細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄成細(xì)胞mRNA的互補(bǔ)RNA，并阻止其翻譯成蛋白質(zhì)，見(jiàn)歐洲專(zhuān)利140308號(hào)中描述的技術(shù)。治療基因還可以含有編碼核酶的序列，后者可選擇性破壞靶RNA(歐洲專(zhuān)利321201號(hào))。
所述核酸還可以含有編碼抗原性、能在人或動(dòng)物中造成免疫應(yīng)答的肽的一個(gè)或多個(gè)基因。在該具體實(shí)施方案中，本發(fā)明可以制備疫苗，或進(jìn)行用于人或動(dòng)物的免疫治療，特別是抗微生物、病毒或癌的治療。這特別關(guān)系到E-B病毒、HIV病毒、乙型肝炎病毒(歐洲專(zhuān)利185573號(hào))、偽狂犬病病毒、“合胞體形成病毒”、及其它病毒的特異性抗原肽，或腫瘤的特異性抗原如MAGE蛋白(歐洲專(zhuān)利259212號(hào))。
所述核酸還可以編碼細(xì)胞毒性產(chǎn)物，特別是條件性細(xì)胞毒性(如胸苷肌酶，胞嘧啶脫胺酶等)。
其他有意義的基因特別報(bào)道于Mc Kusick，V.A.Mendelian(Inheritance in man，catalogs of autosomaldominant，autosomal recessive，and X-linked phenotypes，第8版，John Hopkins University Press(1988))和Standbury，J.B.等(The metabolic basis of inherited disease，第5版，McGraw-Hill(1983))。這些有意義的基因包括參與氨基酸、脂類(lèi)和其他細(xì)胞成分代謝的蛋白質(zhì)。
另外，b)區(qū)還可以在目的核酸的3′含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子。最后，所述核酸可以包含多個(gè)編碼區(qū)，任選地由IRES分隔開(kāi)，從而產(chǎn)生多個(gè)目的產(chǎn)物。
由于本發(fā)明構(gòu)建體特別適于調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)中的表達(dá)，目的核酸更優(yōu)選編碼神經(jīng)遞質(zhì)或其前體或合成酶(酪氨酸羥化酶TH)，營(yíng)養(yǎng)因子，特別是用于治療神經(jīng)變性疾病、有神經(jīng)系統(tǒng)損傷的創(chuàng)傷、或視網(wǎng)膜變性的神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子。
在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種核酸，其特征在于它含有a)在PGK基因啟動(dòng)子控制下含有四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白(tTA)的編碼核酸的第一區(qū)，和b)在經(jīng)修飾含有1-10、優(yōu)選3-8、特別是7個(gè)tetOp序列的最小CMV啟動(dòng)子控制下含有目的核酸、特別是編碼人酪氨酸羥化酶的核酸的第二區(qū)，c)含有UMS序列的第三區(qū)，其中a)和b)兩區(qū)域以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置。
本發(fā)明核酸可以是DNA或RNA，特別是基因組DNA(gDNA)或互補(bǔ)DNA(cDNA)。本發(fā)明的核酸可以按本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)制備，例如涉及核酸的合成、文庫(kù)篩選、連接、酶切、擴(kuò)增、克隆等，如實(shí)施例中所述(見(jiàn)Maniatis等)。a)、b)和c)三個(gè)區(qū)可以分別合成，然后以功能性方式組裝，即以相同的轉(zhuǎn)錄方向。a)和b)區(qū)之間的距離是可變的，只要不損害本發(fā)明構(gòu)建體的效力。例如，這些區(qū)域可以間隔例如0-3000bp，一般0-1000bp，最好至少500bp。a)和b)區(qū)間的該距離一般由c)區(qū)(當(dāng)其存在時(shí))的長(zhǎng)度和所用載體的克隆容量決定。這易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)調(diào)整。本發(fā)明的核酸可以含有各種來(lái)源的元件，特別是來(lái)自原核、真核(動(dòng)物、植物、病毒等)、合成或半合成的核酸。
本發(fā)明還涉及含有如上所定義核酸的任何載體。這可以是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何載體，如質(zhì)粒、粘粒、噬菌體、YAC、HAC、轉(zhuǎn)座子、附加體、病毒等。本發(fā)明優(yōu)選的一類(lèi)載體是病毒載體，例如腺病毒、腺伴隨病毒、皰疹病毒、痘苗病毒、或一些逆轉(zhuǎn)錄病毒(特別是慢病毒)。特別優(yōu)選對(duì)神經(jīng)細(xì)胞、特別是神經(jīng)祖細(xì)胞有趨向性的病毒。對(duì)此，本發(fā)明中特別優(yōu)選的載體是腺病毒。
用于實(shí)施本發(fā)明的腺病毒最好是缺陷性重組病毒，即其基因組包含外源核酸、不能在細(xì)胞中自主復(fù)制。更優(yōu)選，本發(fā)明的腺病毒是至少E1和E2區(qū)全部或部分缺陷的。
這還可以是第3代缺陷性重組腺病毒，即E1和E4區(qū)全部或部分缺陷，可能還有E3區(qū)缺陷。
本發(fā)明的具體方案中，使用帶有影響如下區(qū)域全部或功能部分之缺失的腺病毒—E1、E4和E3，—E1、E4和E2，—E1、E4、E2和E3，—以上區(qū)域以及編碼腺病毒晚期功能之基因(L1-L5)的全部或部分，或—整個(gè)病毒編碼區(qū)。
在文獻(xiàn)中大量報(bào)道了腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)。對(duì)此，腺病毒Ad5的基因組已被完全測(cè)序，并可在數(shù)據(jù)庫(kù)中得到(特別見(jiàn)GeneBankM73260)。同樣，已對(duì)其他腺病毒基因組(Ad2、Ad7、Ad12、狗腺病毒(CAV-2等)的部分、甚至全部測(cè)序。另外，缺陷性重組腺病毒的構(gòu)建也已在文獻(xiàn)中有描述，例如，專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/08152、WO95/02697和WO 96/22378描述了E1和E4區(qū)中的不同缺失。同樣，專(zhuān)利申請(qǐng)WO 96/10088描述了帶有l(wèi)va2基因修飾的載體，WO 94/26914描述了動(dòng)物來(lái)源的腺病毒，WO 95/29993描述了涉及腺病毒E2區(qū)的缺失。
用于本發(fā)明的重組腺病毒最好含有影響E1a和E1b區(qū)的基因組E1區(qū)中的缺失。作為一個(gè)具體的實(shí)例，可以提到涉及如下核苷酸的缺失454-3328；382-3446或357-4020(參照Ad5基因組)。
另外，E4區(qū)中的缺失優(yōu)選涉及全部開(kāi)放讀碼框架，例如33466-35535或33093-35535的缺失，或僅缺失E4區(qū)的一部分(例如ORF6或ORF3)，如專(zhuān)利申請(qǐng)WO 95/02697和WO 96/22378中所述，這些專(zhuān)利申請(qǐng)引入本文作為參考。
對(duì)于還缺乏晚期功能(“最小”載體)或缺乏整個(gè)編碼區(qū)(“無(wú)腸”載體)的腺病毒，其構(gòu)建已由例如Parks等，PNAS 93(1996)p.13565和Lieber等，J.Virol.70(1996)p.8944報(bào)道。
本發(fā)明的核酸可以插入在重組腺病毒的不同位點(diǎn)上?？梢圆迦朐贓1、E3或E4區(qū)中，取代缺失的序列或額外加入。還可以插入在病毒順式生產(chǎn)的必需序列(ITR序列和衣殼化序列)以外的其他位點(diǎn)。
另外，重組腺病毒可以是人或動(dòng)物來(lái)源的。關(guān)于人源腺病毒，優(yōu)選C組中的那些，特別是2型腺病毒(Ad2)、5型腺病毒(Ad5)；或腺病毒7(Ad7)或腺病毒12(Ad12)。在動(dòng)物來(lái)源的多種腺病毒中，優(yōu)選來(lái)自狗的腺病毒，特別是腺病毒CAV2的所有株[例如manhattan株或A26/61株[ATCC VR-800]。其他動(dòng)物來(lái)源的腺病毒特別見(jiàn)于專(zhuān)利申請(qǐng)WO 94/26914中，后者作為參考文獻(xiàn)引入本文。
重組腺病毒在衣殼化細(xì)胞系中生產(chǎn)，即能夠反式補(bǔ)充重組腺病毒基因組中缺陷的一個(gè)或多個(gè)功能的細(xì)胞系。在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的衣殼化細(xì)胞系中，例如可以提到293細(xì)胞系，其中整合了腺病毒基因組的一部分。更準(zhǔn)確地講，293細(xì)胞系是一種人胎腎細(xì)胞系，含有5型腺病毒(Ad5)基因組的左端(約11-12％)，包括左側(cè)ITR、衣殼化區(qū)、E1區(qū)(包括E1a和E1b)、pIX蛋白編碼區(qū)和pIVa2蛋白編碼區(qū)的一部分。該細(xì)胞系能夠反式補(bǔ)充E1區(qū)缺陷的(即缺少E1區(qū)的全部或部分)重組腺病毒，并能產(chǎn)生高滴度病毒原種。該細(xì)胞系還能夠在有效溫度(32℃)下產(chǎn)生另外含有熱敏感性E2突變的病毒原種。也已報(bào)道了一些其他能補(bǔ)充E1區(qū)的細(xì)胞系，特別是基于人肺癌細(xì)胞A549(WO94/28152)或基于人成視網(wǎng)膜細(xì)胞的那些(Hum.Gen.Ther.(1996)215)。另外還報(bào)道了能夠反式補(bǔ)充腺病毒多種功能的細(xì)胞系。具體講，可以舉出補(bǔ)充E1和E4區(qū)的細(xì)胞系(Yeh等，J.Virol.Vol.70(1996)p559-565；Cancer Gen.Ther.2(1995)322；Krougliak等，Hum.Gen.Ther.6(1995)1575)和補(bǔ)充E1和E2區(qū)的細(xì)胞系(WO 94/28152，WO 95/02697，WO 95/27071)或衍生自這些細(xì)胞并可用于產(chǎn)生最小腺病毒的細(xì)胞系，特別是由于它們還表達(dá)參與這種病毒構(gòu)建的位點(diǎn)特異性重組酶活性。
一般通過(guò)將病毒DNA引入衣殼體細(xì)胞，然后約2或3天后(腺病毒的動(dòng)力學(xué)周期為24-36小時(shí))裂解這些細(xì)胞的方法生產(chǎn)重組腺病毒。為了實(shí)施該方法，引入的病毒DNA可以是完整的重組病毒基因組，任選地在細(xì)菌(WO 96/25506)或在酵母中(WO 95/03400)構(gòu)建，并轉(zhuǎn)染到細(xì)胞中。還可能涉及一種用于感染衣殼化細(xì)胞系的重組病毒。病毒DNA還可以以片段的形式被引入，該片段每個(gè)帶有重組病毒基因組的一部分，并有同源性區(qū)域，使得在引入衣殼化細(xì)胞中后通過(guò)不同片段間的同源重組重建重組病毒的基因組。
在細(xì)胞裂解后，可以通過(guò)任何已知技術(shù)分離重組病毒顆粒，例如氯化銫梯度離心或?qū)游龇?。?zhuān)利申請(qǐng)F(tuán)R 9608164中報(bào)道了一種替代方法，該申請(qǐng)引入本文作為參考。
本發(fā)明的另一個(gè)目的涉及含有如上所定義載體、優(yōu)選如上所定義缺陷重組腺病毒的組合物。在該實(shí)施方案中，本發(fā)明組合物可以含有不同量的重組腺病毒，這易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)具體的應(yīng)用(例如體外、離體或體內(nèi))來(lái)調(diào)節(jié)，一般而言，組合物含有105-1015p.v.、優(yōu)選107-1012p.v.的重組腺病毒。術(shù)語(yǔ)p.v.指組合物中存在的病毒顆粒的數(shù)目。
本發(fā)明的載體和組合物可用于直接在體外或體內(nèi)向細(xì)胞中轉(zhuǎn)移并有控制地表達(dá)核酸，或用于在細(xì)胞中引入核酸以便將其植入(移植)體內(nèi)。
本發(fā)明的另一目標(biāo)涉及含有如上所定義核酸或載體的任何細(xì)胞。優(yōu)選，該細(xì)胞為哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。在一個(gè)特別優(yōu)選的方案中，該細(xì)胞是一種神經(jīng)細(xì)胞，特別是神經(jīng)祖細(xì)胞。這種細(xì)胞群例如是人神經(jīng)祖細(xì)胞，如Buc等(Neurobiol.Dis.2(1995)37)所述。
對(duì)此，本發(fā)明一個(gè)具體實(shí)施方案包括用含如上所定義核酸的重組腺病毒遺傳修飾的神經(jīng)祖細(xì)胞。
本發(fā)明還涉及含有如上所述細(xì)胞的組合物。
本發(fā)明還涉及如上所定義的核酸或載體或組合物制備用于體內(nèi)表達(dá)目標(biāo)核酸的組合物的應(yīng)用。
本發(fā)明還涉及如上所定義核酸或載體或組合物制備用于體內(nèi)在神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)目的核酸的組合物的應(yīng)用。
在一個(gè)具體方案中，本發(fā)明涉及一種在神經(jīng)系統(tǒng)中有控制地表達(dá)核酸的方法，包括在主體神經(jīng)系統(tǒng)中植入如上所定義的細(xì)胞，通過(guò)給予該主體四環(huán)素或四環(huán)素類(lèi)似物控制表達(dá)。
本發(fā)明的組合物可以有不同的形式，如溶液、凝膠、粉末等。組合物一般呈溶液形式，優(yōu)選為無(wú)菌溶液，例如等滲鹽水溶液(磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、氯化鈉、氯化鉀、氯化鈣、或氯化鎂等，或這些鹽的混合物)，或?yàn)楦山M合物，特別是凍干品，根據(jù)情況加入無(wú)菌水或生理鹽水可以構(gòu)成溶液。也可以使用其他賦形劑，例如水凝膠。該水凝膠可以從任何生物相容性非細(xì)胞毒性聚合物(均聚或異聚)制備。這樣的聚合物例如已在專(zhuān)利申請(qǐng)WO 93/08845中描述。另外，本發(fā)明的組合物可以裝在任何適當(dāng)類(lèi)型的裝置中，如小管、安瓿、小袋、注射器、小圓底瓶等。
如上所述，本發(fā)明的組合物可以在體外、離體或體內(nèi)使用。
對(duì)于體外或離體應(yīng)用，可以在適當(dāng)?shù)难b置(板、盒、袋等)中在如上所定義載體的組合物存在下直接培養(yǎng)細(xì)胞。對(duì)于這種應(yīng)用，含有腺病毒的組合物可以以每細(xì)胞10-1000p.v.、優(yōu)選100-2000p.v.的感染復(fù)數(shù)(MOI)使用。
對(duì)于體內(nèi)應(yīng)用，可以配制本發(fā)明的組合物，以便能以表皮、口服、胃腸外、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮下、眼內(nèi)、透皮、腫瘤內(nèi)等途徑給藥。在此應(yīng)用中，特別是對(duì)于細(xì)胞組合物，所用的組合物最好含有104-106細(xì)胞，更優(yōu)選105-106個(gè)細(xì)胞。另外，植入的組合物優(yōu)選含有高密度的細(xì)胞(約每微升105-106個(gè))。實(shí)施例中所示結(jié)果，實(shí)際上表明，高密度細(xì)胞的應(yīng)用有利于移植物的留存和所植入細(xì)胞的存活。另一方面，為了更有利于體內(nèi)移植物的存活，還可能同時(shí)或預(yù)先(甚至隨后)給予一種或多種免疫抑制化合物/治療(Neuroscience 78(1997)685)。
為此，本發(fā)明還涉及體內(nèi)轉(zhuǎn)移核酸的方法，包括給予如上所述的組合物。本發(fā)明可以用于例如動(dòng)物，以建立病理模型、研究基因的調(diào)節(jié)，或用于人體，以研究標(biāo)記、生物利用度，或用于醫(yī)療目的。
為了調(diào)控表達(dá)，本發(fā)明組合物最好含有四環(huán)素或能夠?qū)Ψ词郊せ畹鞍譼TA活性起作用的任何四環(huán)素類(lèi)似物。一種這樣的類(lèi)似物例如由強(qiáng)力霉素構(gòu)成(Kistner等，PNAS 93(1996)10933)?？捎糜诒景l(fā)明的其他類(lèi)似物例如見(jiàn)于Alvarez等(Gene Ther.4(1997)993)，后者引入本文作為參考。類(lèi)似物的用量易于由本領(lǐng)域技術(shù)人員根據(jù)所用類(lèi)似物和構(gòu)建體而確定。例如，O.1ng/ml劑量的強(qiáng)力霉素足以在體外完全阻斷本發(fā)明構(gòu)建體中核酸的表達(dá)。
本發(fā)明特別適于治療(即部分或完全減退)神經(jīng)變性疾病，尤其是帕金森氏病(MP)。MP是一種以黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元進(jìn)行性喪失為特征的疾病。進(jìn)行了L-DOPA(L-多巴)治療以圖控制該病的癥狀，但其效力隨著疾病的進(jìn)展而下降。本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N治療該病的有利的替代方法，其中引入?yún)⑴c體內(nèi)多巴胺合成的基因(酪氨酸羥化酶，TH)。用多巴胺能化合物進(jìn)行的長(zhǎng)期藥物治療試驗(yàn)表明，這些治療誘導(dǎo)一種不受調(diào)控的全身化作用，在多數(shù)病例中導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的很令人不安的波動(dòng)。本發(fā)明特別適合于這類(lèi)狀態(tài)，因?yàn)樗芫_地局部控制L-多巴的合成，這對(duì)獲得能生理再現(xiàn)多巴胺能刺激復(fù)雜機(jī)制的運(yùn)動(dòng)反應(yīng)是必需的。
本申請(qǐng)將在下述實(shí)施例中做詳細(xì)描述，這些實(shí)施例應(yīng)視為說(shuō)明性的而限制性的。


圖1含本發(fā)明核酸的腺病毒基因組的結(jié)構(gòu)示意圖，顯示了反向末端重復(fù)序列(ITR)和衣殼化序列(4)。pIX代表編碼腺病毒蛋白IX的序列。
圖2圖2A以不同的MOI用腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染人神經(jīng)祖細(xì)胞。所顯示的數(shù)值為四個(gè)實(shí)驗(yàn)的平均值。
圖2B和2CTH在人神經(jīng)祖細(xì)胞中的體外生產(chǎn)，以MOI＝140感染后7天通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)法測(cè)定。圖2B無(wú)處理，圖2C是在感染后立即開(kāi)始到第7天用強(qiáng)力霉素(10ng/ml)處理。放大倍數(shù)為360(圖B)和220(圖C)。
圖3在第O天(感染后第5.5天)加入(a)或收回(b)強(qiáng)力霉素(5ng/ml)后，腺病毒AdPGK.tet.hTH1(MOI＝40)感染的培養(yǎng)物中hTH活性消失(a)和再現(xiàn)(b)的動(dòng)力學(xué)。在第0天未處理的培養(yǎng)物中的hTH活性確定為100％。(c)不同劑量的強(qiáng)力霉素對(duì)hTH表達(dá)的影響，在感染后第11天測(cè)定。
圖4腺病毒AdPGK.tet.hTH-1(MOI＝40)感染的人神經(jīng)祖細(xì)胞紋狀體內(nèi)植入物中，與TH的免疫反應(yīng)性，在(a)未處理動(dòng)物和(b)每天用強(qiáng)力霉素處理的動(dòng)物15μm大腦恒冷箱切片上，用抗TH免疫組織化學(xué)法測(cè)定。(a)和(b)的紫色標(biāo)記揭示存在與洋地黃毒苷標(biāo)記之a(chǎn)lu探針雜交的人細(xì)胞，與偶聯(lián)有堿性磷酸酶的抗洋地黃毒苷抗體保溫，然后用特異性底物顯色。放大倍數(shù)為110。
圖5腺病毒AdPGK.tet.hTH1(MOI＝40)感染的人神經(jīng)祖細(xì)胞移植物中的TH免疫反性性，在(a)未處理動(dòng)物和(b)每天用強(qiáng)力霉素處理的動(dòng)物15μm大腦恒冷箱切片上，用抗TH免疫組織化學(xué)法和用S35標(biāo)記的HTH-1特異性反義寡核苷酸原位雜交法測(cè)定。切片用甲酚紫反染。放大倍數(shù)為450。
圖6tTA基因(A)、UMS序列(B)、Op序列(C)和CMV最小啟動(dòng)子(D)的核苷酸序列。
實(shí)施例I.材料和方法1.腺病毒AdPGK.tet.HTH-1的構(gòu)建含有四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白(tTA)和人巨細(xì)胞病毒最小啟動(dòng)子(PhCMV)的編碼序列的DNA片段通過(guò)用酶Xho I和Sca I消化從質(zhì)粒pUMS-luc(Corti等，Neuroreport 7(1996)1655)中切出，并插入在BglII/Cla I酶消化的穿梭質(zhì)粒pCMVlucIX(由M.C.Geoffroy提供)中。獲得載體ptetIX。含后邊接有SV40病毒多腺苷酸化信號(hào)的人酪氨酸羥化酶(hTH-1)cDNA(Grima B.等，Nature 1987，326707-711)的BglII/HindIII片段插入在ptetIX載體的Cla I和EcoRV位點(diǎn)之間，生成載體ptetIX hTH-1。在載體ptetIXhTH中控制tTA表達(dá)的人巨噬細(xì)胞立即早期啟動(dòng)子(phCMV)被替換為鼠磷酸甘油酸激酶(PGK)基因的遍在型啟動(dòng)子(Adra等，Gene 1987；60-65)。將含有PGK啟動(dòng)子的Xho I/Spl I片段連在載體ptetIXhTH-1的Spe I和Spl I位點(diǎn)之間，生成質(zhì)粒pPGKtetIXhTH-1。為了進(jìn)行同源重組(Stratford等，J.Clin.Invest.(1992)626)，將載體pPGKtetIXhTH-1用Xmn I線(xiàn)性化并與腺病毒Adβgal的Cla I大片段共轉(zhuǎn)染到能反式補(bǔ)充E1區(qū)的293細(xì)胞系中。通過(guò)板上實(shí)驗(yàn)將重組腺病毒AdPGK.tet.hTH-1純化兩次。通過(guò)在293細(xì)胞中擴(kuò)增獲得了病毒原種，在氯化銫梯度上純化、然后在Sephadex柱上純化。在293細(xì)胞上板上滴定測(cè)定的病毒滴度為3.5×1010pfu/ml。
2.人神經(jīng)祖細(xì)胞的增殖和培養(yǎng)按已報(bào)道的方法(Buc等，Neurobiol.10(1995)37)獲取人胎腦原代細(xì)胞并在補(bǔ)有堿性FGF的無(wú)血清培養(yǎng)中繁殖。
3.人神經(jīng)祖細(xì)胞的感染為了進(jìn)行體外研究，將細(xì)胞以6-7×105個(gè)細(xì)胞/孔的密度接種在12孔組織培養(yǎng)板上，并與病毒以所選擇的感染復(fù)數(shù)(MOI)在400μl無(wú)血清的已知成分培養(yǎng)液(DS-FM)中培養(yǎng)。6小時(shí)后，除去上清液并用等體積的DS-FM更換。在感染后的不同時(shí)間，收集并離心(4000RPM，5分鐘)細(xì)胞，將沉淀物-80℃冷凍，待用于酶試驗(yàn)(Reinhardt等，生命科學(xué)(life Science)，(1986)21-85)。
為了移植，將細(xì)胞以5×106細(xì)胞/板的密度接種在直徑6cm的組織培養(yǎng)板上，并以40pfu/細(xì)胞的MOI與病毒AdPGK.tet.hTH-1一起保濕6小時(shí)。感染的當(dāng)天，如前人所述(Sabaté等，Nature Genetics，9(1995)256)回收細(xì)胞，以每微升4×105細(xì)胞的密度重懸于DS-FM培養(yǎng)基中，在整個(gè)移植操作過(guò)程中保持在冰上。
4.大腦內(nèi)的損傷和移植在大腦內(nèi)移植前5-6周，如前人所述(Horellou等，Neuron 5(1990)，393)以立體定位方式在成年Sprague-Dawley大鼠(Chaarles-River)的中紋狀體左上多巴胺能通道中注射6-羥基多巴胺(6-OHDA)。在麻醉下給16只大鼠進(jìn)行植入，用800μl/kg氯胺酮(UVA)和Rompun(Bayer)的1∶1混合物麻醉。在受損紋狀體的以下立體定位坐標(biāo)的2個(gè)位點(diǎn)，每處用10μl Hamilton注射器注射1μl細(xì)胞懸液前囟前(AB)+0.7，中線(xiàn)外側(cè)(LM)+2.5，硬腦膜表面腹側(cè)(V)5；及AB+1.5，LM-2.5，V5(起始線(xiàn)固定于0)。每天給動(dòng)物注射10mg/kg的環(huán)孢菌素。
5.原位雜交和免疫組織化學(xué)移植后4周，如前人所述(Sabaté，同上)灌注動(dòng)物。回收大腦并在4％pfa中固定，在PBS培養(yǎng)基、20％蔗糖中保存。隨后，獲得15μm的切片。
使用以帶洋地黃毒苷尾的核苷酸標(biāo)記的人alu特異性引物(5′-XTTgCAgTgAgCCgAgATCgCgCC-3′)雜交，從而檢測(cè)人細(xì)胞。在初始變性步驟(攪拌下95％甲酰胺、0.1×SSC中75℃20分鐘)后，如前人所述(Dumas等，J.Chem.Neuroanat.5(1992)11)處理切片。使用S35標(biāo)記的針對(duì)人TH第一外顯子的寡核苷酸(5′-TgCCTgCTTggCgTCCAgCTCgACA-3′)在移植物中檢測(cè)到了人TH-1的RNA。雜交條件與Lanèce等(J.Neurochem.66(1996)1819)所述的相同。對(duì)于免疫組織化學(xué)法，切片按常規(guī)技術(shù)處理。
II.結(jié)果1.在本發(fā)明調(diào)控系統(tǒng)控制下編碼人TH-1之腺病毒(AdPGK.tet.hTH-1)的制備為了從僅一個(gè)腺病毒載體獲得hTH-1轉(zhuǎn)基因的受控表達(dá)，修改了原先基于使用兩種載體的四環(huán)素tet-關(guān)閉負(fù)調(diào)控系統(tǒng)。將對(duì)四環(huán)素敏感的反式激活蛋白tTA和人TH-1的cDNA插入了E1和E3區(qū)缺失的腺病毒Ad5的框架中。在載體AdPGK.tet.hTH-1中，tTA的表達(dá)處于磷酸甘油酸激酶(PGK)鼠基因的遍在型啟動(dòng)子控制之下，而人TH的轉(zhuǎn)錄受tTA敏感的最小啟動(dòng)子(CMV啟動(dòng)子)的控制。在tTA和CMV啟動(dòng)子之間插入了UMS序列，以限制這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄單元之間的轉(zhuǎn)錄干擾。2.AdPGK.tet.hTH-1對(duì)人神經(jīng)祖細(xì)胞的感染體外受控表達(dá)為了確定腺病毒Ad PGK.tet.hTH-1能否導(dǎo)致人神經(jīng)祖細(xì)胞中活性TH的合成，以不同的感染復(fù)數(shù)感染了細(xì)胞(圖2a)。所得結(jié)果表明，被感染細(xì)胞中的TH活性根據(jù)所用載體的劑量而提高，這證明腺病毒Ad PGK.tet.hTH-1是功能性的。
在該腺病毒感染的細(xì)胞中研究了用強(qiáng)力霉素調(diào)控hTH-1基因表達(dá)的可能性。當(dāng)在感染后立即向培養(yǎng)液中加入(10ng/ml)該抗生素時(shí)，在任何時(shí)刻都沒(méi)能檢測(cè)到任何TH活性，甚至在最高病毒劑量下亦如此。另外，沒(méi)有檢到任何具有TH免疫反應(yīng)性的細(xì)胞(圖2b和2c)。
隨后檢查了在已表達(dá)該轉(zhuǎn)基因的細(xì)胞中基因表達(dá)被隨后中止的可能性。為此，在感染后5.5天向培養(yǎng)基中加入了強(qiáng)力霉素，此時(shí)細(xì)胞中已可檢測(cè)到TH活性。所得結(jié)果表明，酶活性逐步下降，在加入強(qiáng)力霉素后5.5天幾乎完全消失(圖3a)。因此，TH-1基因在本發(fā)明條件下在人神經(jīng)祖細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄可以被很有效地負(fù)調(diào)控。
為了檢驗(yàn)是否可能重新誘導(dǎo)該轉(zhuǎn)基因的活性，在從感染細(xì)胞的培養(yǎng)基中收回強(qiáng)力霉素后追蹤TH活性(圖3d)。所得結(jié)果表明，在這些細(xì)胞中TH活性逐步提高，這表明強(qiáng)力霉素對(duì)轉(zhuǎn)基因的抑制是可逆的。
為了確定抑制基因表達(dá)所需的最低抗生素劑量，感染后立即將細(xì)胞與不同濃度的強(qiáng)力霉素保溫(圖3c)。當(dāng)0.01ng/ml量的TH活性可以被檢測(cè)到時(shí)，0.1ng/ml的抗生素濃度足以阻止TH活性的出現(xiàn)。3.向大腦中移植腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染的人神經(jīng)祖細(xì)胞體內(nèi)表達(dá)調(diào)控本實(shí)施例證明本發(fā)明系統(tǒng)，特別是腺病毒感染的人神經(jīng)祖細(xì)胞調(diào)節(jié)體內(nèi)人TH表達(dá)的能力，以及本發(fā)明系統(tǒng)尤其經(jīng)強(qiáng)力霉素調(diào)節(jié)該體內(nèi)表達(dá)的能力。將細(xì)胞用腺病毒AdPGK.tet.hTH-1感染，然后植入在大鼠的紋狀體中，該紋狀體已通過(guò)注射毒素6-OHDA造成了多巴胺能通道的單側(cè)損傷。為了有利于移植物的留存，給每只動(dòng)物移植高密度(4×105/μl)懸浮的大量細(xì)胞(8×105)。移植后，不處理動(dòng)物(n＝8)或用強(qiáng)力霉素(水中1mg/ml)每天處理(n＝8)。移植后四周，將大鼠處死，分析大腦中TH的表達(dá)。
用針對(duì)人alu特異性重復(fù)序列的寡核苷酸原位雜交證明，在所有檢測(cè)的大腦中含有人細(xì)胞的存活移植物(圖4a)。在用強(qiáng)力霉素處理的動(dòng)物和未處理的動(dòng)物間，沒(méi)有觀察到移植物大小或外觀上的任何差異。
未處理動(dòng)物中的移植物具有強(qiáng)TH免疫反應(yīng)性(圖4a)。移植物中表達(dá)HT的細(xì)胞數(shù)估計(jì)在5-10％之間。移植后在無(wú)血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天的細(xì)胞中相似的百分比也具有TH免疫反應(yīng)性。這些結(jié)果清楚地表明，在與體外相同的條件下基因在體內(nèi)表達(dá)。
而在接受強(qiáng)力霉素的移植動(dòng)物中沒(méi)有檢測(cè)到任何對(duì)TH免疫活性的細(xì)胞(圖4b)。因此，強(qiáng)力霉素有效地抑制了移植物中免疫組織化學(xué)可檢測(cè)量TH的出現(xiàn)。
為了確定強(qiáng)力霉素的效應(yīng)是否反映在轉(zhuǎn)錄水平對(duì)遺傳表達(dá)的嚴(yán)格控制，用TH-1信使RNA特異的寡核苷酸對(duì)切片進(jìn)行原位雜交。未處理動(dòng)物中的移植物被強(qiáng)烈標(biāo)記。該標(biāo)記與免疫反應(yīng)性細(xì)胞共同定位(圖5a)。相反，在被處理動(dòng)物的移植物中設(shè)檢測(cè)到任何特異性標(biāo)記(圖5b)。
結(jié)論，可以說(shuō)由人神經(jīng)祖細(xì)胞移植引入的腺病毒情形下，本發(fā)明系統(tǒng)中轉(zhuǎn)基因的轉(zhuǎn)錄被強(qiáng)力霉素有效抑制。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)名稱(chēng)RHONE-POULENC RORER SA(B)街道Raymand Aron大道20號(hào)(C)城市安東尼(E)國(guó)家法國(guó)(F)郵編92165(H)傳真33155717291(ii)發(fā)明名稱(chēng)轉(zhuǎn)基因表達(dá)調(diào)控的新系統(tǒng)(iii)序列數(shù)1(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)載體類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PetentIn Release#1.0，#1.30版(EPO)(2)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度2502堿基對(duì)(B)類(lèi)型核苷酸(C)鏈數(shù)單鏈(D)構(gòu)型線(xiàn)性(ii)分子類(lèi)型cDNA(iii)假擬否(iv)反義否(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞-tTA(A)(B)位置1..1040(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞-UMS(B)(B)位置1041..2069(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞-7 OP(C)(B)位置2069..2362(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞-1 OP(B)位置2070..2110(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞-CMV最小啟動(dòng)子(D)(B)位置2363..2502(xi)SEQ ID NO.1的序列描述CTCGAGGAGC TCGAATTCAT ATGTCTAGAT TAGATAAAAG TAAAGTGATT AACAGCGCAT60TAGAGCTGCT TAATGAGGTC GGAATCGAAG GTTTAACAAC CCGTAAACTC GCCCAGAAGC120TAGGTGTAGA GCAGCCTACA TTGTATTGGC ATGTAAAAAA TAAGCGGGCT TTGCTCGACG180CCTTAGCCAT TGAGATGTTA GATAGGCACC ATACTCACTT TTGCCCTTTA GAAGGGGAAA240GCTGGCAAGA TTTTTTACGT AATAACGCTA AAAGTTTTAG ATGTGCTTTA CTAAGTCATC300GCGATGGAGC AAAAGTACAT TTAGGTACAC GGCCTACAGA AAAACAGTAT GAAACTCTCG360AAAATCAATT AGCCTTTTTA TGCCAACAAG GTTTTTCACT AGAGAATGCA TTATATGCAC420TCAGCGCTGT GGGGCATTTT ACTTTAGGTT GCGTATTGGA AGATCAAGAG CATCAAGTCG480CTAAAGAAGA AAGGGAAACA CCTACTACTG ATAGTATGCC GCCATTATTA CGACAAGCTA540TCGAATTATT TGATCACCAA GGTGCAGAGC CAGCCTTCTT ATTCGGCCTT GAATTGATCA600TATGCGGATT AGAAAAACAA CTTAAATGTG AAAGTGGGTC CGCGTACAGC CGCGCGCGTA660CGAAAAACAA TTACGGGTCT ACCATCGAGG GCCTGCTCGA TCTCCCGGAC GACGACGCCC720CCGAAGAGGC GGGGCTGGCG GCTCCGCGCC TGTCCTTTCT CCCCGCGGGA CACACGCGCA780GACTGTCGAC GGCCCCCCCG ACCGATGTCA GCCTGGGGGA CGAGCTCCAC TTAGACGGCG840AGGACGTGGC GATGGCGCAT GCCGACGCGC TAGACGATTT CGATCTGGAC ATGTTGGGGG900ACGGGGATTC CCCGGGTCCG GGATTTACCC CCCACGACTC CGCCCCCTAC GGCGCTCTGG960ATATGGCCGA CTTCGAGTTT GAGCAGATGT TTACCGATGC CCTTGGAATT GACGAGTACG1020GTGGGTAGGG GGCGCGAGGA TCTCAGATTT GTGCATACAC AGTGACTCAT ACTTTCACCA1080ATACTTTGCA TTTTGGATAA ATACTAGACA ACTTTAGAAG TGAATTATTT ATGAGGTTGT1140CTTAAAATTA AAAATTACAA AGTAATAAAT CACATTGTAA TGTATTTTGT GTGATACCCA1200GAGGTTTAAG GCAACCTATT ACTCTTATGC TCCTGAAGTC CACAATTCAC AGTCCTGAAC1260TATAATCTTA TCTTTGTGAT TGCTGAGCAA ATTTGCAGTA TAATTTCAGT GCTTTTAAAT1320TTTGTCCTGC TTACTATTTT CCTTTTTTAT TTGGGTTTGA TATGCGTGCA CAGAATGGGG1380CTTCTATTAA AATATTCCAT GGCTTACATT TTTAATGTTT TGTTCTCTTA ATATGTTCAA1440AGCTACTCAA CTTTTATTCC CGAAAAATGT TTACTTTAAT TATTCTAATT TCTTACATAA1500AGCATTGAGG TGCTAACAAT TATATACTAT GTACAAGATG GCAGACTAAA TCATATCATA1560CCATCAAGTA GAAACCTGGA GTTTGGTGAA CTTTGAGTTG TTTATATGTC TCTCCTTTAT1620TGTCTTCTCA AAACCTGTGA TTCTGAAGTC AAAGGGACAC AGCTGTCACA TGAAAAGTGA1680TCACTTATCA CCTGTATGCG TAAAACACCT TACCAAGCAG CTAAGAGGAG TAACTCCTAG1740CCACTTTGAG AAACGTTTTT GAATAAACAG AGCAAGGCTC TTCCCCATTC TCCCAGAGAT1800ATAGCATAAA ACTGAGCGCA TTTTTATAAA ACAAAAAAGG AGGAATGTGT GGTTTGATGG1860CCAGACCCTG AATTTGAGTT CAGCATCTGC TTTTCCATAT TATAGATGGG TACCAGTGAT1920TCTGAGCCAT GTCTATTTCT CCTGACTTTT CCTCTGTTTT CCCACGCTTG CTGATATTTA1980CAGCCGTGGT CATCACAATC ACCTTTGTTC CTTTCTTCCT TCCTCCAACT CTGCATTAAA2040TTCCAGGAAC TTGCTTTCTG TGAAGTCTGA GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA2100AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGTTTAC2160CACTCCCTAT CAGTGATAGA GAAAAGTGAA AGTCGAGTTT ACCACTCCCT ATCAGTGATA2220GAGAAAAGTG AAAGTCGAGT TTACCACTCC CTATCAGTGA TAGAGAAAAG TGAAAGTCGA2280GTTTACCACT CCCTATCAGT GATAGAGAAA AGTGAAAGTC GAGTTTACCA CTCCCTATCA2340GTGATAGAGA AAAGTGAAAG TCGAGCTCGG TACCCGGGTC GAGTAGGCGT GTACGGTGGG2400AGGCCTATAT AAGCAGAGCT CGTTTAGTGA ACCGTCAGAT CGCCTGGAGA CGCCATCCAC2460GCTGTTTTGA CCTCCATAGA AGACACCGGG ACCGATCCAG CC 250權(quán)利要求
1.一種核酸，其特征在于含有a)含中等啟動(dòng)子控制下之四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白(tTA)編碼核酸的第一區(qū)，和b)含tTA敏感性啟動(dòng)子控制下之目的核酸的第二區(qū)，其中a)和b)兩區(qū)以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置。
2.權(quán)利要求1的核酸，其特征在于另外含有置于a)和b)兩區(qū)之間，限制a)和b)兩區(qū)間之轉(zhuǎn)錄干擾的第三區(qū)c)。
3.權(quán)利要求2的核酸，其特征在于c)區(qū)含有一個(gè)轉(zhuǎn)錄終止子，優(yōu)選UMS序列。
4.根據(jù)以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸，其特征在于在a)區(qū)中所述中等啟動(dòng)子是一種細(xì)胞啟動(dòng)子，優(yōu)選組織特異性組成型細(xì)胞啟動(dòng)子。
5.權(quán)利要求4的核酸，其特征在于所述中等細(xì)胞啟動(dòng)子選自PGK、DHFR、EF1α、β-肌動(dòng)蛋白、β-珠蛋白和MHCα基因的啟動(dòng)子。
6.根據(jù)以上權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸，其特征在于在b)區(qū)中所述目的核酸是一種編碼目的蛋白或多肽的核酸。
7.權(quán)利要求6的核酸，其特征在于所述目的蛋白或多肽選自神經(jīng)遞質(zhì)或其前體或合成酶和營(yíng)養(yǎng)因子。
8.根據(jù)上述權(quán)利要求任一項(xiàng)的核酸，其特征在于b)區(qū)中所述啟動(dòng)子是一種在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中有功能的啟動(dòng)子。
9.一種核酸，其特征在于包含a)含PGK基因啟動(dòng)子控制下之四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白(tTA)編碼核酸的第一區(qū)，b)在經(jīng)修飾含1-10個(gè)tetOp序列的最小CMV啟動(dòng)子控制下含有人酪氨酸羥化酶編碼核酸的第二區(qū)，和c)含UMS序列的第三區(qū)，其中a)和b)兩區(qū)以相同的轉(zhuǎn)錄方向放置。
10.含有權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)之核酸的載體。
11.權(quán)利要求10的載體，其特征在于其為一種病毒載體，優(yōu)選腺病毒。
12.含有權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的核酸或權(quán)利要求10的載體的細(xì)胞。
13.權(quán)利要求12的細(xì)胞，其特征在于它是一種哺乳動(dòng)物細(xì)胞，優(yōu)選人細(xì)胞。
14.權(quán)利要求13的細(xì)胞，其特征在于它是一種神經(jīng)細(xì)胞。
15.用含有權(quán)利要求9之核酸的重組腺病毒遺傳修飾的神經(jīng)細(xì)胞。
16.含有權(quán)利要求12-15任一項(xiàng)之細(xì)胞的組合物。
17.權(quán)利要求1-9的核酸或權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求16的組合物制備用于體內(nèi)表達(dá)目的核酸之組合物的用途。
18.權(quán)利要求1-9的核酸或權(quán)利要求10的載體或權(quán)利要求16的組合物制備用于在神經(jīng)系統(tǒng)中體內(nèi)表達(dá)目的核酸之組合物的用途。
全文摘要
本發(fā)明涉及控制細(xì)胞中核酸表達(dá)的新組合物和方法。更具體講,本發(fā)明涉及一種核酸,其特征在于含有:a)含中等啟動(dòng)子控制下之四環(huán)素調(diào)控系統(tǒng)反式激活蛋白(tTA)編碼核酸的第一區(qū),和b)含tTA敏感性啟動(dòng)子控制下之目的核酸的第二區(qū)。本發(fā)明特別適于控制神經(jīng)細(xì)胞中體外或體內(nèi)表達(dá)核酸,例如人酪氨酸羥化酶。
文檔編號(hào)C12N5/10GK1352694SQ99813858
公開(kāi)日2002年6月5日 申請(qǐng)日期1999年11月9日 優(yōu)先權(quán)日1998年11月9日
發(fā)明者J·馬利特, O·科迪 申請(qǐng)人:阿文蒂斯藥物股份有限公司