專利名稱：用于制備核黃素的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種用于借助微生物制備核黃素的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體。
維生素B2，也被稱為核黃素，是人體和動(dòng)物體必需的。在缺乏維生素B2時(shí)，會(huì)出現(xiàn)口腔粘膜和咽粘膜發(fā)炎，口角開裂，皮膚褶皺處瘙癢和發(fā)炎以及皮膚損傷，結(jié)膜炎，減弱的視覺銳度和角膜濁度。對(duì)于嬰兒和兒童可能出現(xiàn)生長(zhǎng)停止和體重減輕。因此，維生素B2特別是作為維生素缺乏時(shí)的維生素制劑以及作為飼料添加劑在經(jīng)濟(jì)上具有意義。此外，它同樣可以作為食品染料，特別是在蛋黃醬、冰淇淋和布丁等中使用。
核黃素地制備或者按照化學(xué)或者按照微生物方法進(jìn)行。在化學(xué)制備方法中，一般在多步驟工序中核黃素作為純的最終產(chǎn)物獲得，然而其中同樣必須使用相對(duì)昂貴的原料如D-核糖。因此，考慮核黃素的化學(xué)合成僅用于這樣的應(yīng)用目的，例如在人類醫(yī)學(xué)，這對(duì)于純的核黃素是必需的。
除核黃素的化學(xué)制備方法外的其它方法是通過微生物制備該物質(zhì)。核黃素的微生物制備方法特別適合于這種情況，即其中不需要該物質(zhì)具有高的純度。此外，另一種情況是當(dāng)核黃素作為添加劑被用于飼料產(chǎn)品中。在這種情況下，核黃素的微生物制備方法的優(yōu)點(diǎn)在于，在一步工序中即可獲得該物質(zhì)。同樣可以使用生長(zhǎng)的原始材料例如植物油作為微生物合成的原材料。
通過真菌如或假囊酵母屬的發(fā)酵制備核黃素是已知的(The MerckIndex,Windholz等,eds.Merck&Co.,1183頁，1983,A.Bacher,F.Lingens,Augen.Chem.1969,393頁)；但是酵母，如念珠菌屬或酵母菌屬，和細(xì)菌如梭狀芽孢桿菌屬也適合于核黃素制備。
此外，例如在US05231007中描述了借助于酵母famata念珠菌屬的制備方法。
核黃素過量生產(chǎn)的菌株例如描述在EP405370、GB1434299、DE3420310和EP0821063中，其中通過核黃素生物合成基因的轉(zhuǎn)變由枯草桿菌獲得該菌株。但是原核基因不適合于用真核細(xì)胞如啤酒糖酵母或棉桃阿舒氏囊霉菌屬制備重組體的核黃素的方法。因此，根據(jù)WO93/03183，從真核細(xì)胞，即從啤酒糖酵母中分離出用于核黃素生物合成的特異基因，以便為在真核細(xì)胞的生產(chǎn)性生物體中核黃素的重組體制備作好制備。然而，當(dāng)不能充分對(duì)特定的參與核黃素生物合成的酶提供底物時(shí)，對(duì)于核黃素的生產(chǎn)，該重組體制備方法沒有或只獲得有限的成功。
1967年Hanson(HansonAM,1967，在《微生物技術(shù)》中，Peppler,HJ,222-250頁，紐約)發(fā)現(xiàn)，加入氨基酸甘氨酸可以調(diào)節(jié)棉桃阿舒氏囊霉菌屬的核黃素的形成。然而，該方法存在缺陷，因?yàn)楦拾彼崾且环N非常昂貴的原材料。基于該理由，人們致力于通過突變的產(chǎn)生來使核黃素的生產(chǎn)達(dá)到最佳化。
由德國(guó)專利說明書19525281已知一種制備核黃素的方法，其中溫育微生物，它對(duì)阻礙異檸檬酸酯裂解酶的活性物質(zhì)有抵抗作用。
由德國(guó)專利公開說明書19545468.5-41已知另一種微生物制備核黃素的方法，其中產(chǎn)生的微生物提高了核黃素的異檸檬酸酯裂解酶的活性或異檸檬酸酯的基因表達(dá)。但是，同樣與該方法相比，仍然需要進(jìn)一步使核黃素的制備達(dá)到最佳化。
因此，本發(fā)明的目的是提供一種用于核黃素微生物制備的單核或多核有機(jī)體，優(yōu)選微生物體，它們使核黃素形成的進(jìn)一步最佳化成為可能。特別地，應(yīng)該提供一種生物體，其在節(jié)約原材料的條件下適合于制備核黃素，并因此使生產(chǎn)成為可能，與迄今為止的現(xiàn)有技術(shù)相比，它是經(jīng)濟(jì)的。首先該生物體與到目前為止的生物體相比應(yīng)該使核黃素的加快形成成為可能，而無需添加甘氨酸。
本發(fā)明的目的是通過單核細(xì)胞或多核細(xì)胞生物體解決的，該生物體具有這樣改變的甘氨酸物質(zhì)代謝，以致在無外加的甘氨酸下它的核黃素合成效率至少是與野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895的核黃素合成效率相同，其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895是在標(biāo)準(zhǔn)條件下在加入6克/升的額外的甘氨酸下培養(yǎng)的。
在標(biāo)準(zhǔn)條件下的培養(yǎng)是指在120RpM和30℃下，在500毫升具有二塊擋板的振動(dòng)式燒瓶中進(jìn)行溫育。每個(gè)燒瓶中使用的介質(zhì)是50毫升的或者具有10克/升葡萄糖或者具有10克/升大豆油的10克/升的酵母抽提物的溶液。在相同的條件下采用1％的16h培養(yǎng)物進(jìn)行接種。
所力求達(dá)到的胞內(nèi)甘氨酸物質(zhì)代謝的改變的目標(biāo)可以借助于已知的生物體的菌株改善的方法實(shí)現(xiàn)。也就是說在最簡(jiǎn)單的情況下，應(yīng)該借助于篩選在微生物中進(jìn)行常規(guī)選擇之后制備相應(yīng)的菌株。同樣，可利用接著進(jìn)行選擇的突變。這里該突變不但可以借助于化學(xué)而且可以借助于物理誘變完成。另一方法是選擇和接著進(jìn)行重組的突變。最后應(yīng)該借助于基因處理制備本發(fā)明的生物體。
根據(jù)本發(fā)明這樣改變生物體，即它產(chǎn)生比維持其新陳代謝所需量大的胞內(nèi)甘氨酸。根據(jù)本發(fā)明，胞內(nèi)甘氨酸產(chǎn)生的提高優(yōu)選是這樣實(shí)現(xiàn)的，即制備一種生物體，其中提高了蘇氨酸醛縮酶的酶活性。舉例來說可如此實(shí)現(xiàn)，通過改變催化中心，提高物質(zhì)的轉(zhuǎn)化或者借助于酶抑制劑的作用抵消提高的物質(zhì)轉(zhuǎn)化。同樣可以通過酶合成的加快例如通過基因擴(kuò)增或者通過因子分離(其阻遏酶生物合成)來提高蘇氨酸醛縮酶的酶活性。
根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選通過內(nèi)蘇氨酸醛縮酶基因的突變提高內(nèi)蘇氨酸醛縮酶的活度。這樣的突變或者不采用常規(guī)方法進(jìn)行，例如通過紫外線照射或者引起突變的化學(xué)藥品，或者借助于基因技術(shù)方法，例如缺失、插入和/或核苷酸交換來進(jìn)行。
蘇氨酸醛縮酶基因表達(dá)可以通過蘇氨酸醛縮酶基因復(fù)制的插入和/或通過調(diào)節(jié)因子的擴(kuò)增(其對(duì)蘇氨酸醛縮酶基因表達(dá)起積極影響)實(shí)現(xiàn)。特別地通過增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄信號(hào)使調(diào)節(jié)元素的擴(kuò)增優(yōu)選在轉(zhuǎn)錄平面上進(jìn)行。此外，例如通過m-RNA穩(wěn)定性的改善同樣可以使轉(zhuǎn)錄的增強(qiáng)成為可能。
為了提高基因復(fù)制數(shù)目，例如可以在基因結(jié)構(gòu)或在載體中插入蘇氨酸醛縮酶基因，其優(yōu)選包括歸入蘇氨酸醛縮酶基因的調(diào)節(jié)基因序列，特別是增強(qiáng)基因表達(dá)的那些。接著通過產(chǎn)生核黃素的微生物轉(zhuǎn)化包含蘇氨酸醛縮酶基因的基因結(jié)構(gòu)。
根據(jù)本發(fā)明，同樣可以通過促進(jìn)劑的替換獲得蘇氨酸醛縮酶的超量表達(dá)。因此交替地通過基因復(fù)制的插入或通過促進(jìn)劑的替換獲得較高的酶活性是可能的。然而，同樣地可以通過同時(shí)進(jìn)行促進(jìn)劑的替換和基因復(fù)制的插入獲得所希望的酶活性改變。
因?yàn)槠渲羞@樣改變的生物體有限地影響蘇氨酸，所以在使用本發(fā)明的細(xì)胞時(shí)要求輔助地加入蘇氨酸。改善的吸收和蘇氨酸幾乎定量地反應(yīng)使得甘氨酸令人驚奇地加快了核黃素的形成，而迄今為止通過輔助加入甘氨酸是不能實(shí)現(xiàn)的。另外，有機(jī)體的內(nèi)蘇氨酸形成例如可以通過消除天門冬氨酸激酶的抗反饋性來提高。
蘇氨酸醛縮酶基因優(yōu)選從微生物，特別優(yōu)選從真菌中分離出。因此，阿舒氏囊霉菌屬的真菌又是優(yōu)選的。最優(yōu)選棉桃阿舒氏囊霉菌屬。
為了分離基因，所有其細(xì)胞包括用于形成蘇氨酸醛縮酶的序列的其它生物體、植物和動(dòng)物細(xì)胞均在考慮范圍中?；虻姆蛛x可以通過蘇氨酸醛縮酶基因中有缺陷的突變體的同源或異源互補(bǔ)作用或者通過同源探測(cè)或具有同源基因的PCR進(jìn)行。最后，為了進(jìn)行亞克隆，通過合適的具有限制酶的片斷在尺寸上將互補(bǔ)質(zhì)粒的插入減低至最小。在被假定的基因編序和識(shí)別之后，通過融合PCR進(jìn)行配合精確的亞克隆。攜帶這樣獲得的片斷作為插入片斷的質(zhì)粒被引入蘇氨酸醛縮酶基因缺陷突變體中測(cè)試蘇氨酸醛縮酶基因的功能。最后官能結(jié)構(gòu)被用于轉(zhuǎn)化核黃素產(chǎn)物(Produzentenz)。
在分離和編序之后，獲得具有核苷酸序列的蘇氨酸醛縮酶基因，其用于編碼上述氨基酸序列或其等位變體。等位變體特別地包括通過核苷酸的缺失、插入和取代由相應(yīng)序列獲得的衍生物，其中還保持了蘇氨酸醛縮酶活性。在附圖2b中給出核苷酸1至1149的相應(yīng)序列。
將核苷酸-1231至-1的核苷酸序列或上述序列的啟動(dòng)子或者基本上起相同作用的DNA序列接在蘇氨酸醛縮酶基因之前。這樣例如可以將啟動(dòng)子接在基因之前，通過一種或多種核苷酸交換，通過插入和/或通過缺失使啟動(dòng)子與具有上述核苷酸序列的啟動(dòng)子不同，并且不會(huì)影響啟動(dòng)子的功能和活性。此外，通過改變它們的序列可以提高它們的活性或者完全被活性啟動(dòng)子替換。
此外，將調(diào)節(jié)基因序列和調(diào)節(jié)基因附加在蘇氨酸醛縮酶基因上，其特別地提高蘇氨酸醛縮酶基因的活性。所以例如可以在蘇氨酸醛縮酶基因上附加所謂的增強(qiáng)子，它們通過RNA聚合酶和DNA之間改善的相互作用來影響提高的蘇氨酸醛縮酶基因表達(dá)。
具有或者無前接啟動(dòng)子的蘇氨酸醛縮酶基因和具有或無調(diào)節(jié)基因的蘇氨酸醛縮酶基因可以前接和/或后接一個(gè)或多個(gè)DNA序列，這樣在基因結(jié)構(gòu)中獲得基因。通過蘇氨酸醛縮酶基因的克隆獲得質(zhì)粒和載體，其包含蘇氨酸醛縮酶基因并適合于轉(zhuǎn)化核黃素產(chǎn)物。通過轉(zhuǎn)化獲得的細(xì)胞包括以復(fù)制形式存在的基因，也就是附加地復(fù)制在染色體上，這里通過在基因組的任意位置上的同源重組使基因復(fù)制一體化。
部分或完全在細(xì)胞內(nèi)形成甘氨酸的本發(fā)明的目可以這樣實(shí)現(xiàn)，即制備生物體，其中至少部分阻斷甘氨酸在細(xì)胞內(nèi)分解。正如上面所描述的一樣，這樣的突變可以不采用常規(guī)方法通過物理或化學(xué)誘變，而是例如通過紫外線照射或者突變引起的化學(xué)藥品，或者借助于基因技術(shù)方法來進(jìn)行。
根據(jù)本發(fā)明，提高細(xì)胞內(nèi)甘氨酸形成的目的優(yōu)選通過改變絲氨酸羥甲基轉(zhuǎn)移酶的基因改變而實(shí)現(xiàn)。這樣的改變例如是通過突變例如在結(jié)構(gòu)基因中的插入、缺失或取代實(shí)現(xiàn)，或者通過因此結(jié)合的調(diào)節(jié)元素例如啟動(dòng)子和轉(zhuǎn)錄因子實(shí)現(xiàn)。
根據(jù)本發(fā)明，令人驚奇地發(fā)現(xiàn)，突變體是抗甘氨酸抗代謝物的。優(yōu)選地，涉及這樣的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，它們是抗α-氨基甲基膦酸和/或α-氨基磺酸的。
同樣，這點(diǎn)可以例如通過突變體的選擇來實(shí)現(xiàn)，其中該突變體被蘇氨酸結(jié)構(gòu)模型β-羥基-突變體交換和/或在蘇氨酸和/或賴氨酸模型上進(jìn)行交換。
因此，根據(jù)本發(fā)明可使用的突變體同樣可以通過相應(yīng)的選擇來制備。因此這樣的抗性單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的制備應(yīng)該通過常規(guī)篩選方法實(shí)現(xiàn)，例如它們?cè)谖⑸飳W(xué)中是常用的。
當(dāng)至少部分地阻斷細(xì)胞內(nèi)形成的甘氨酸輸出到介質(zhì)中時(shí)，在描述的生物體的條件下可以進(jìn)一步加速核黃素的形成。在最簡(jiǎn)單的情況下，對(duì)此補(bǔ)加甘氨酸就足夠了。另外，可以通過基因的破裂消除負(fù)責(zé)輸出的載體。
此外，可以通過改變乙醇酸鹽的物質(zhì)交換例如通過提高乙醇酸鹽氨基轉(zhuǎn)移酶的活性來實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)甘氨酸濃度的提高。另一種可能性是使由二氧化碳和氨合成細(xì)胞內(nèi)甘氨酸最佳化。
總而言之，已發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明目的優(yōu)選是通過加快細(xì)胞內(nèi)甘氨酸的合成，至少部分阻斷甘氨酸的分解，至少部分阻止從細(xì)胞中輸送甘氨酸，改變乙醇酸鹽物質(zhì)交換和使由二氧化碳和氨合成甘氨酸最佳化來解決的?？梢越惶娴?、累積地或隨意組合地使用這些解決方法。
通過在培養(yǎng)介質(zhì)中加入甘氨酸可以進(jìn)步加快核黃素的形成。
根據(jù)本發(fā)明獲得的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體是任意的可用于生物技術(shù)方法的細(xì)胞。對(duì)此例如是真菌、酵母、細(xì)菌以及植物和動(dòng)物細(xì)胞。根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選是真菌的轉(zhuǎn)化細(xì)胞，特別優(yōu)選阿舒氏囊霉菌屬真菌。因此棉桃阿舒氏囊霉菌屬是特別優(yōu)選的。
下面進(jìn)一步借助于實(shí)施例描述本發(fā)明，但是本發(fā)明并不是只限于實(shí)施例的內(nèi)容。
實(shí)施例1
抗α-氨基甲基膦酸(AMPS)的突變體的選擇
借助于紫外線光誘變棉桃阿舒氏囊霉菌的孢子。施于裝有70mMα-氨基甲基膦酸的平板上。如下觀察對(duì)核黃素形成的抑制，即無抑制劑的真菌形成黃色菌落，含抑制劑的真菌形成白色菌落。因此，零星地產(chǎn)生黃色也就是說抗抑制劑的生物體。以這種方式獲得抗性菌株AMPS-NM-01。
對(duì)具有200mM AMPS的平板所進(jìn)行的試驗(yàn)表明，與仍然完全是白色的初始菌株相反該菌株仍然具有黃色菌落顏色。深層培養(yǎng)中無甘氨酸的突變體形成的核黃素與含甘氨酸的野生型相同(參見附圖1)。
野生型和突變體的特異酶活性的檢驗(yàn)結(jié)果表明，絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶的活性降低至50％(附圖7)。因?yàn)橥ㄟ^13C-示蹤蘇氨酸的營(yíng)養(yǎng)可以表明，由甘氨酸形成絲氨酸(絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶可以催化絲氨酸的形成)(表1)，所以可以通過甘氨酸向絲氨酸中的排出的減少來解釋加快的核黃素形成。
按照表1使用的極限培養(yǎng)基總結(jié)如下
溶液AKH2PO4 200 g/l pH6.7含KOH
(100倍)
溶液BNH4Cl 15g/l
(10倍) 天冬酰胺 5 g/l
NaCl 2 g/l
MgSO4×7H2O4 g/l
MnSO4×H2O 0.5 g/l
CaCl2×2H2O0.4 g/l
肌醇 1.0 g/l
煙酰胺2.5 g/l
酵母抽提物2 g/l
C-源 葡萄糖或大豆油2.5 g/l
為了制備培養(yǎng)基，簡(jiǎn)單地在濃縮溶液B中加入碳源，并通過高壓滅菌器滅菌。在培養(yǎng)基冷卻之后，加入1/100體積分離的高壓滅菌的溶液A。
實(shí)施例2
從棉桃阿舒氏囊霉菌中分離GLY1-基因
為了分離用于蘇氨酸醛縮酶的基因，在氟赤蘚酸抗體上選擇之后，用棉桃阿舒氏囊霉菌的基因庫轉(zhuǎn)化啤酒糖酵母YM13F(SHM1∷HIS3shm2∷LEO2gly1∷URA3)甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變體。該基因庫由被Sau3A部分吸收的基因組DNA組成，經(jīng)密度梯度離心從該DNA中分離出尺寸為8-16kb的片斷，并且壓在用BamH1斷開的載體Yep352中。首先在尿嘧啶原養(yǎng)型上選擇轉(zhuǎn)化體。在第二步驟中，在復(fù)制平板培養(yǎng)之后，在甘氨酸原養(yǎng)型上進(jìn)行選擇。從約70,000尿嘧啶原養(yǎng)型克隆中可以分離出25甘氨酸原養(yǎng)型克隆。轉(zhuǎn)化體的治愈以及通過分離質(zhì)粒的再轉(zhuǎn)化表明，互補(bǔ)作用被質(zhì)粒編碼。在甘氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型酵母菌屬菌株中未檢測(cè)到蘇氨酸醛縮酶活性時(shí)(＜0.1mU/mg蛋白質(zhì))，在用分離的基因庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的菌株中可以測(cè)量到明顯的酶活性(25mU/mg蛋白質(zhì))。表明互補(bǔ)作用的亞克隆的3.7kb HindⅢ-片斷被編序(附圖2)。來自啤酒糖酵母的同源基因GLY1中的一種被發(fā)現(xiàn)用于編碼蘇氨酸醛縮酶。
實(shí)施例3
在棉桃阿舒氏囊霉菌中GLY1-基因的超量表達(dá)
為了超量表達(dá)GLY1基因，在表達(dá)載體pAG203中克隆它(參見WO9200379)。在該質(zhì)粒中，該基因受TEF-啟動(dòng)子和TEF終止子的控制(附圖3)。在棉桃阿舒氏囊霉菌中使G418抗性基因作為選擇標(biāo)記。在用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化棉桃阿舒氏囊霉菌和接著分離單孢子克隆之后，因?yàn)殒咦邮菃魏撕蛦伪扼w的，所以測(cè)量原始提取物中蘇氨酸醛縮酶的活性。與用空質(zhì)粒pAG203轉(zhuǎn)化的菌株比較在A.g.p.AG203GLY1的情況下，不但在葡萄糖上生長(zhǎng)而且在大豆油上生長(zhǎng)時(shí)均可以測(cè)量到至少10倍的超量表達(dá)(附圖4)。
實(shí)施例4
通過GLY1-超量表達(dá)和蘇氨酸的營(yíng)養(yǎng)加快核黃素的形成
為了試驗(yàn)在細(xì)胞中形成的蘇氨酸是否限制由過量壓出的蘇氨酸醛縮酶形成甘氨酸，在培養(yǎng)基中加入蘇氨酸。在加入6克/升蘇氨酸時(shí)，在作為A,g.pAG203GLY1的碳源的葡萄糖上的生長(zhǎng)時(shí)，核黃素的形成比加入6克/升甘氨酸的約大一倍(附圖5)。用野生型和用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的對(duì)照菌株未表現(xiàn)出這樣的效果。培養(yǎng)基中氨基酸的分析表明，在GLY1-過量壓出時(shí)，營(yíng)養(yǎng)的52mM蘇氨酸還剩約6mM，并且令人驚奇地，2mM的甘氨酸濃度提高至42mM。該結(jié)果表明，通過蘇氨酸限制甘氨酸的形成，過量壓出蘇氨酸醛縮酶具有官能作用，細(xì)胞內(nèi)形成的甘氨酸作用比細(xì)胞外營(yíng)養(yǎng)的高并且通過真菌細(xì)胞輸出大量的甘氨酸。
實(shí)施例5
甘氨酸輸出的抑制
如果在大豆油上而不是如實(shí)施例4一樣在葡萄糖上栽培蘇氨酸醛縮酶過量壓出的菌株A.g.pAG203GLY1，那么在蘇氨酸營(yíng)養(yǎng)時(shí)核黃素的形成沒有被加快，但其超過使用甘氨酸的(附圖6)。但是培養(yǎng)基的分析表明，蘇氨酸分解至約13mM。同樣不可以進(jìn)行蘇氨酸中的限制。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞內(nèi)甘氨酸從2提高至約44mM。所有形成的甘氨酸從真菌中輸出進(jìn)入培養(yǎng)基中。該輸出通過在培養(yǎng)基中加A．-H-氨酸來抑制，在同時(shí)加入蘇氨酸下在明顯加快的核黃素形成中起作用(表2)。為了避免加入的甘氨酸只對(duì)加快的生產(chǎn)負(fù)責(zé)，在對(duì)照物中加入如此多的甘氨酸，如在用甘氨酸和蘇氨酸進(jìn)行的試驗(yàn)中，最后出現(xiàn)甘氨酸。該檢驗(yàn)結(jié)果表明，細(xì)胞內(nèi)形成的甘氨酸比細(xì)胞外的甘氨酸的活性高。
實(shí)施例6
通過選擇D．羥基正纈氨酸抗性突變體來加快核黃素的形成
因?yàn)椴坏K氨酸轉(zhuǎn)化成甘氨酸，而且蘇氨酸合成作為第一次限制甘氨酸的形成，所以在抗性突變體之后借助于蘇氨酸模型研郊．羥基．正纈氨酸。在瓊脂平板上，包括2．SmMlB-羥基正纈氨酸的極限培養(yǎng)基明顯地抑制放射生長(zhǎng)。在菌落變化時(shí)形成能更好生長(zhǎng)的自發(fā)突變體。通過孢子的分離和再選擇產(chǎn)生穩(wěn)定的突變體，其在極限培養(yǎng)基β-羥基正纈氨酸上比起始菌株明顯更好地生長(zhǎng)(附圖8)。核黃素形成的研究表明生產(chǎn)率明顯提高。這樣具有大豆油的極限培養(yǎng)基中菌株UNY-TB-25產(chǎn)生41±1leg／1核黃素，而起始菌株僅產(chǎn)生18+_3mgq核黃素。同樣衍生物HNV-TB-29的生產(chǎn)率明顯加快至116±4mg／1，而其原始菌株Ita-GS-01僅產(chǎn)生62±10m剛。


附圖1在具有10克／升大豆油作為碳源的全培養(yǎng)基(Vollmedium)上生長(zhǎng)之后，在6克例．甘氨酸存在或不存在下，棉桃阿舒氏囊霉菌株ATCCl0895(野生型，WT)和AMPS抗體突變體AMPS-MN-01的核黃素的形成。測(cè)量值來源于三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。
附圖2a在棉桃阿舒氏囊霉菌基因組中的Sly 1-Lokus?？寺B7．1和GB2&9以及3．7kb HinaU亞E隆GB-26-9—6補(bǔ)充啤酒糖酵母突變體。GB-26-9-6完整地編序GB7．1以補(bǔ)充GLYl的C．末端。
附圖2b棉桃阿舒氏囊霉菌GLYl-基因的核苷酸序列和由此導(dǎo)出的氨基酸序列以及置于二側(cè)的核苷酸序列。
附圖3用于超量表達(dá)棉桃阿舒氏囊霉菌中GLYl-基因的載體pAG203GLYl結(jié)構(gòu)的示意圖。
附圖4在含10克/升大豆油的全培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間，棉桃阿舒氏囊霉菌野生型(實(shí)心符號(hào))和A.g.pAG203GLY1(空心符號(hào))關(guān)于生長(zhǎng)、核黃素形成和蘇氨酸醛縮酶的特異活性的對(duì)比。附圖5在含10克/升葡萄糖作為碳源和補(bǔ)充甘氨酸或蘇氨酸的HA全培養(yǎng)基上培時(shí)，棉桃阿舒氏囊霉菌菌株ATCC10895(野生型)、pAG203和pAG203GLY1的生長(zhǎng)和核黃素形成。該表表明在培養(yǎng)之前和之后各自培養(yǎng)基中甘氨酸和蘇氨酸0的濃度。給出的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差是三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果。附圖6在含10克/升葡萄糖作為碳源和補(bǔ)充甘氨酸或蘇氨酸的HA完整培養(yǎng)基上培養(yǎng)時(shí)，棉桃阿舒氏囊霉菌菌株ATCC10895(野生型)、pAG203和pAG203GLY1的生長(zhǎng)和核黃素形成。該表表明在培養(yǎng)之前和之后各自培養(yǎng)基中甘氨酸和蘇氨酸的濃度。給出的平均值和標(biāo)準(zhǔn)偏差是三個(gè)獨(dú)立試驗(yàn)的結(jié)果。附圖7在含10克/升大豆油的全培養(yǎng)基中培養(yǎng)期間，棉桃阿舒氏囊霉菌野生型(實(shí)心符號(hào))和AMPS抗體突變體AMPS-NM-01關(guān)于生長(zhǎng)、核黃素形成和蘇氨酸醛縮酶、絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶和谷氨酸乙醛酸氨基轉(zhuǎn)移酶的特異活性的對(duì)比。測(cè)量值來源于三個(gè)獨(dú)立的試驗(yàn)。附圖8β-羥基-正纈氨酸對(duì)野生型(W)和HNV-TB-25(H)在具有極限培養(yǎng)基(包括2.5克/升葡萄糖和2.5mMβ-羥基-正纈氨酸)的瓊脂平板上的棉桃阿舒氏囊霉生長(zhǎng)的影響。
序列
T TGCCATTAAT GACCGGGAGC CTGAAGGTGT -1201
GTGATGAACA AGCCAGTCTT CCCCGCGCGT CGCCAACTGC TCGTCATATA ATCCCGGAAA -1141
AGCTCGCATT AGGTGAAATT TTTCTTAGGA ATTACATCTG CTACTGACAA AACTAAGTAA -1031
AAGCTCCGAT AGGTAGCCGT GCTGCCGAGC ACCTGCCTAA TACACGCAGG CGCCATACAC -1021
TATTTAAGCA CAATGTTATC GCCCCGCAGC TTGAGGTATT CCTGGTCGAT GCCAGGTGTC-961
ATAGGCTTGA TCACCAGCGA GTAGACCTCA CTATTGTAGA AGCGCAGCCC GTTGCTGGGG-901
GACTTGTAGC GCGCCTTGAG CCCCGTGATG TCGCAGTAGC GTTTCACGGG ATACTGCGAT-841
GGTGGCGCCT GAATGTTGAA GTATGTCAGC TTCGTGCGCC CTGCGTCACG CCCGGCTTCC-781
GACTGTGCCT CTGTCGTGAG CCGTTTCCAC TCGTCTGTCA GAAGCTGACG TGTCGGCTTG-721
TGGCGGCGCG TGGGTTTCTT CCACGTGGGC GACTTGAAGT CGCTACGACT GGTATCATTA-661
CGTGCTGCAA TCGCTCGGAG GTTCTCCATC TGGGGTCCAC GGTCGCTCGT TGATCTGTCT-601
ATCTCGAAAT CCCTGCCCAG ATGTACTCCC ATGTTATCAC GTGACCACAC GCCGTTTTCG-541
TGTGTAGTGA TGCAGATGGT TCTAGAGCAT CACGTGGCTT ACATAGCTTT GTTACATAAT-481
CGATTTTCCG CAGGAGCGTT ACGTCCAACG GTCGTTCTGT GCCAAAAGCA ACAACTGAGC-421
GTCAGGCGGC CGTCTCCCCA GACACGCTCC GCCCCAAACT GAGCTCCACG CGGCCTTCTG-361
TCCGAGTTAA GTTCCTCCCC GCTCGTCAGC ACGGGGTCTT TCGTCGCCTA TCCTCCTGCA-301
GCGTTCGCTA CTGCAGATCG TGAGCAGTGG CACCCGCGAC CAAAAAAAGA AATTATGTTC-241
CTTACGCAAG GAATATGCCT CGCGCCATGC CATCGCAAAG AGTGATGCCG CAGAGGTTGC-181
TTCTGCGAGG CAACTCCTGG GCAATAGGGT GGAAAATTCA GCTTGGGCTT ATATAAAAGA-121
AACCGTTCGA GCTCGTCGGA GCCAGGTGGA AAATTTTTCG TAACGTAGGT AGAGGTTATA -61
GTTAGCGTCA GTCTCTTTTC TGCCAAGCTG CTACAGTTGA CTACAAGTAA CAAACCCAGG -1
ATG AAT CAG GAT ATG GAA CTA CCA GAG GCG TAC ACG TCG GCT TCG AAC 48 1 Met Asn Gln Asp Met Glu Leu Pro Glu Ala Tyr Thr Ser Ala Ser Asn
GAC TTC CGT TCG GAC ACG TTC ACC ACT CCA ACG CGC GAA ATG ATC GAG 96 17 Asp Phe Arg Ser Asp Thr Phe Thr Thr Pro Thr Arg Glu Met Ile Glu
GCT GCG CTA ACG GCG ACC ATC GGT GAC GCC GTC TAC CAA GAG GAC ATC 144 33 Ala Ala Leu Thr Ala Thr Ile Gly Asp Ala Val Tyr Gln Glu Asp Ile
GAC ACG TTG AAG CTA GAA CAG CAC GTC GCC AAG CTG GCC GGC ATG GAG 192 49 Asp Thr Leu Lys Leu Glu Gln His Val Ala Lys Leu Ala Gly Met Glu
GCC GGT ATG TTC TGC GTA TCT GGT ACT TTG TCC AAC CAG ATT GCT TTG 240 65 Ala Gly Met Phe Cys Val Ser Gly Thr Leu Ser Asn Gln Ile Ala Leu
CGG ACC CAC CTA ACT CAG CCA CCA TAT TCG ATT CTT TGC GAC TAC GGT 288 81 Arg Thr Gly Leu Thr Gln Pro Pro Tyr Ser Ile Leu Cys Asp Tyr Arg
GCG CAT GTG TAC ACG CAC GAG GCT GCG GGG TTG GCA ATT TTG TCC CAG 336 97 Ala Mis Val Tyr Thr His Glu Ala Ala Gly Leu Ala Ile Leu Ser Gln
GCC ATG GTG ACA CCT GTC ATT CCT TCC AAC GGC AAC TAC TTG ACT TTG 384113 Ala Met Val Thr Pro Val Ile Pro Ser Asn Gly Asn Tyr Leu Thr Leu
GAA GAC ATC AAG AAG CAC TAC ATT CCT GAT GAT GGC GAC ATC CAC GGT 432129 Glu Asp Ile Lys Lys His Tyr Ile Pro Asp Asp Gly Asp Ile His Gly
GCT CCA ACA AAG GTT ATC TCG TTG GAA AAC ACC TTG CAC GGT ATC ATT 480145 Ala Pro Thr Lys Val Ile Ser Leu Glu Asn Thr Leu His Gly Ile Ile
CAC CCA CTA GAG GAG CTT GTT CGG ATC AAG GCT TGG TGT ATG GAG AAC 528161 His Pro Leu Glu Glu Leu Val Arg Ile Lys Ala Trp Cys Met Glu Asn
GAC CTC AGA CTA CAC TGC GAT GGT GCG AGA ATC TGG AAC GCG TCC GCA 576177 Asp Leu Arg Leu His Cys Asp Gly Ala Arg Ile Trp Asn Ala Set Ala
GAA TCC GGT GTG CCT CTA AAA CAG TAC GGA GAG CTA TTC GAC TCC ATT 624193 Glu Set Gly Val Pro Leu Lys Gln Tyr Gly Glu Leu Phe Asp Ser Ile
TCC ATC TGC TTG TCC AAG TCC ATG GGT GCC CCA ATG GGC TCC ATT GTC 672209 Ser Ile Cys Leu Ser Lys Ser Met Gly Ala Pro Met Gly Ser Ile Leu
GTC GGG TCG CAC AAG TTC ATA AAG AAG GCG AAC CAC TTC AGA AAG CAG720225 Val Gly Ser His Lys Phe Ile Lys Lys Ala Asn His Phe Arg Lys Gln
CAA GGT GGT GGT GTC AGA CAG TCT GGT ATG ATG TGC AAG ATG GCG ATG768241 Gln Gly Gly Gly Val Arg Gln Ser Gly Met Met Cys Lys Met Ala Met
GTG GCT ATC CAG GGT GAC TGG AAG GGC AAG ATG AGG CGT TCG CAC AGA816257 Val Ala Ile Gln Gly Asp Trp Lys Gly Lys Met Arg Arg Ser His Arg
ATG GCT CAC GAG CTG GCC AGA TTT TGC GCA GAG CAC GGC ATC CCA TTG864273 Met Ala His Glu Leu Ala Arg Phe Cys Ala Glu Mis Gly Ile Pro Leu
GAG TCG CCT GCT GAC ACC AAC TTT GTC TTT TTG GAC TTG CAG AAG AGC912289 Glu Ser Pro Ala Asp Thr Asn Phe Val Phe Leu Asp Leu Gln Lys Ser
AAG ATG AAC CCT GAC GTG CTC GTC AAG AAG AGT TTG AAG TAC GGC TGC960305 Lys Met Asn Pro Asp Val Leu Val Lys Lys Ser Leu Lys Tyr Gly Cys
AAG CTA ATG GGC GGG CGT GTC TCC TTC CAC TAC CAG ATA TCT GAG GAG 1008321 Lys Leu Met Gly Gly Arg Val Ser Phe His Tyr Gln Ile Ser Glu Glu
TCC CTT GAG AAG ATC AAG CAG GCC ATC CTA GAG GCG TTC GAG TAC TCG 1056337 Ser Leu Glu Lys Ile Lys Gln Ala Ile Leu Glu Ala Phe Glu Tyr Ser
AAG AAG AAC CCT TAC GAT GAA AAC GGC CCC ACG AAG ATC TAC AGA AGT 1104353 Lys Lys Asn Pro Tyr Asp Glu Asn Gly Pro Thr Lys Ile Tyr Arg Ser
GAG TCC GCT GAC GCT GTG GGT GAG ATC AAG ACC TAC AAG TAT TAA 1149369 Glu Ser Ala Asp Ala Val Gly Glu Ile Lys Thr Tyr Lys TyrGGGATTTCGA TGATGACATG AAAAATTACA TATTGGCACG GCATAGGCAT TGGGTAATAT 1209
TAAGCATATG GTTGAGATGA ATTACTGTTC GGGTACCGGT ATTTCCAAAG TGCTGTCGAC 1269
TTTTGCAAGA GATGGCTATG AATGGGGCAC GCTCCATCAC CTCTCTGCGA GCCGGACTCA 1329
GCATTATATC CATCTCAAAA CCTAATATCA AATGGGATTG TGGTGCGCAG TACATGCGCA 1389
GTGCTGCACA TTTGAGGATC AATGGGTTTT TCCAGGCACT GCCTGGGTCA CTCACCCTAT 1449
TGCGGAGGGA CTAGTAGCTC TACCATTCTG AGCTGACTAA AATGTTTGAT TCTTTTGGTA 1509
CTTA
權(quán)利要求
1、用于在生物技術(shù)中制備核黃素的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，特別是微生物，其特征在于，該生物體具有這樣改變的甘氨酸物質(zhì)代謝，以致在無外加的甘氨酸下它的核黃素合成效率至少與野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895的核黃素合成效率相同，其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895是在標(biāo)準(zhǔn)條件下在加入6克/升的額外甘氨酸下培養(yǎng)的。
2、根據(jù)權(quán)利要求1的單細(xì)胞和多細(xì)胞生物體，其特征在于，在該生物體存在下，提高了甘氨酸的合成和/或甘氨酸的細(xì)胞內(nèi)分解和/或甘氨酸從細(xì)胞中的輸出至少部分被抑制。
3、根據(jù)權(quán)利要求1或2的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，其具有提高的蘇氨酸醛縮酶活性。
4、根據(jù)權(quán)利要求1至3之一的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，其中至少部分抑制由甘氨酸形成細(xì)胞內(nèi)絲氨酸。
5、根據(jù)權(quán)利要求4的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，其中至少部分抑制絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶活性。
6、根據(jù)權(quán)利要求4或5的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，它們對(duì)甘氨酸抗代謝物具有抗性。
7、根據(jù)權(quán)利要求6的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，它們是抗α-氨基甲基膦酸或α-氨基磺酸，β-羥基-正纈氨酸和/或其它蘇氨酸和/或賴氨酸類似物的。
8、根據(jù)權(quán)利要求1至7之一的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，它們是真菌，優(yōu)選來自阿舒氏囊霉菌屬的真菌。
9、根據(jù)權(quán)利要求1至8之一的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體，其特征在于，它們是棉桃阿舒氏囊霉菌屬的真菌。
10、具有附圖2b中給出的氨基酸序列和等位基因變異編碼的核苷酸序列的蘇氨酸醛縮酶基因。
11、根據(jù)權(quán)利要求10的蘇氨酸醛縮酶基因，它們具有附圖2b的核苷酸1至1149的核苷酸的核苷酸序列或基本上起相同作用的DNA序列。
12、根據(jù)權(quán)利要求10或11的蘇氨酸醛縮酶基因，它們具有前接的附圖2b的核苷酸-1231至1的核苷酸的核苷酸序列或基本上起相同作用的DNA序列的前接啟動(dòng)子。
13、根據(jù)權(quán)利要求10至12之一的蘇氨酸醛縮酶基因，它們具有對(duì)應(yīng)的可調(diào)節(jié)的基因序列。
14、包括權(quán)利要求10至13之一的蘇氨酸醛縮酶基因的基因結(jié)構(gòu)。
15、包括權(quán)利要求10至13的蘇氨酸醛縮酶基因或權(quán)利要求14的基因結(jié)構(gòu)的載體。
16、用于制備核黃素的轉(zhuǎn)化生物體，它們包括權(quán)利要求10至13之一的可復(fù)制型的蘇氨酸醛縮酶基因或權(quán)利要求14的基因結(jié)構(gòu)。
17、根據(jù)權(quán)利要求16的轉(zhuǎn)化生物體，它們包括權(quán)利要求15的載體。
18、制備核黃素的方法，其特征在于使用權(quán)利要求1至9的生物體。
19、制備產(chǎn)生核黃素的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體的方法，其特征在于，這樣改變?cè)撋矬w，即使該生物體具有這樣改變的甘氨酸物質(zhì)代謝，以致在無外加的甘氨酸下它的核黃素合成效率至少與野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895的核黃素合成效率相同，其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895是在標(biāo)準(zhǔn)條件下在加入6克/升的額外甘氨酸下培養(yǎng)的。
20、根據(jù)權(quán)利要求19的方法，其特征在于，借助于基因技術(shù)方法進(jìn)行生物體的改變。
21、根據(jù)權(quán)利要求19或20的方法，其特征在于，通過啟動(dòng)子的交換和/或基因拷貝數(shù)目的提高來實(shí)現(xiàn)生物體的改變。
22、根據(jù)權(quán)利要求19至21之一的方法，其特征在于，通過內(nèi)蘇氨酸醛縮酶基因的改變產(chǎn)生具有高活性的酶。
23、根據(jù)權(quán)利要求19至22的方法，其特征在于，通過內(nèi)絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶的改變來至少部分地抑制絲氨酸羥基甲基轉(zhuǎn)移酶的活性。
24、權(quán)利要求1至9以及16和17之一的生物體的用途，用于制備核黃素。
25、權(quán)利要求10至13之一的蘇氨酸醛縮酶基因和權(quán)利要求14的基因結(jié)構(gòu)的用途，用于制備權(quán)利要求1至9以及16和17之一的生物體。
26、權(quán)利要求15的載體的應(yīng)用，其用于制備權(quán)利要求1至9以及16和17的生物體。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在生物技術(shù)中制備核黃素的單細(xì)胞或多細(xì)胞生物體,特別是微生物。其特征在于,該生物體具有這樣改變的甘氨酸物質(zhì)代謝,以致在無外加的甘氨酸下它的核黃素合成效率至少與野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895的核黃素合成效率相同,其中野生型的棉桃阿舒氏囊霉菌屬ATCC10895是在標(biāo)準(zhǔn)條件下在加入6克/升的外甘氨酸下培養(yǎng)的。
文檔編號(hào)C12N9/88GK1225944SQ9812714
公開日1999年8月18日 申請(qǐng)日期1998年12月22日 優(yōu)先權(quán)日1997年12月22日
發(fā)明者N·蒙斯肖, K·－P·斯塔哈曼, H·薩哈姆, O·澤爾德 申請(qǐng)人:于利奇研究中心有限公司, Basf公司