專利名稱：腺病毒－胸苷激酶基因構型及其獲得方法和應用的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種基因構型，特別是一種腺病毒-胸苷激酶基因構型及其獲得方法和應用。
眾所周知，惡性腫瘤目前是危害人類健康及生命的首要疾病，每年我國死于惡性腫瘤的患者約130萬人以上。目前用于治療腫瘤的四大方法是手術、化療、放療和免疫綜合療法，它們雖可部分改善病人的預后，但尚未獲實質性進展，而基因治療正以巨大的生活力和嶄新的面貌出現，其發(fā)展代表了下世紀根治腫瘤的發(fā)展方向。
自1986年Moolten博士在偶然機會發(fā)現(Moolten等人，Cancer Res1986，465276)單純皰疹病毒的胸苷激酶(TK)基因轉染腫瘤細胞可使其對化療敏感性增加以來，人們對TK基因的抗癌作用進行了研究，認識到其治療腫瘤的基本原理在于胸苷激酶可將對哺乳動物細胞無毒的更昔洛韋代謝為細胞毒性產物，使轉染了單純瘡疹病毒胸苷激酶的腫瘤細胞在更昔洛韋的參與下自發(fā)死亡，也稱自殺效應。
顯然，如何獲得腺病毒-胸苷激酶基因以及使其在臨床應用上有高的轉染效率、高表達、較好的穩(wěn)定性是生物學家、醫(yī)學家共同關心的課題。
本發(fā)明目的是提供一種優(yōu)化的腺病毒-胸苷激酶基因構型，獲得該構型的方法以及利用上述基因構型得到的產品。
為達到上述目的本發(fā)明采用以下技術方案一種腺病毒-胸苷激酶基因構型，其特征在于全構件包括腺病毒載體、胸苷激酶片斷和RSV-LTP啟動子，全構件核苷酸長43Kb，胸苷激酶長2.8Kb，啟始片斷長18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
一種獲得上述基因構型的方法，其特征在于它包括(1)在序列為ATGGCTCGTCCCTGC啟始片斷誘導下，在體外與ADV載體胸苷激酶基因cDNA，經酶切、連結、共轉染使RSV-LTP啟動子和胸苷激酶片斷插入腺病毒載體中，(2)將(1)中的初級構件與輔助質粒PJM17再次結合，連結成型后使構件能在293細胞中培養(yǎng)擴增。
下面結合實施例對本發(fā)明作進一步說明。


圖1腺病毒-胸苷激酶基因構型2DNA連接及載體構建示意3TK基因核苷酸序列(之前應該含有多個A及尾帶共2.8Kb)1、ADV腺病毒載體的獲得ADV即致病輕微的人體腺病毒，本項目采用的ADV是經DNA重組技術去除基因組中Ela，E1b，E3編碼區(qū)，全長7.5Kb，成為一種復制缺陷病毒載體。采用ADV作為基因治療的載體具有以下明顯的生物學優(yōu)點(1)除淋巴細胞、骨髓基質細胞外具有廣泛的感染譜，其感染無須細胞處于分裂期；(2)ADV轉入細胞后以基因組外染色體的形式存在，無插入基因組導致突變，致癌的危險性；(3)病毒可在體外復制；(4)基因持續(xù)表達可達2-3個月等。
2、TK基因全長cDNA編碼片斷(請見附圖3)3、DNA連接及載體構建(1)在序列為ATGGCTTCGTACCCCTGC啟始片斷的誘導下，在體外與PBR322載體、上述TK基因cDNA，經酶切，所用酶為456×bal，Bg111/BamHI，BamHI連結、共轉染使RSV啟動子和胸苷激酶基因插入腺病毒PBR322載體中(見圖1、圖2)。
(2)由于上述構件尚缺乏在體外復制擴增能力，所以將初級構件與輔助質粒(PFM17)再次結合，連結成型后使構件能在293細胞(一種人胚腎細胞)培養(yǎng)擴增。選用293細胞(ATCC-CRL1573)作為病毒復制細胞系，此細胞系是V型ADV的轉化基因，是國際通用的繁殖分離病毒及進行ADV滴度測定的標準細胞系，此細胞系已從美國引進。
(3)由于構件有可能出現缺碼或反序而形成無功能構件，所以需要對構件進行篩選，篩選過程在瓊脂膠上進行，隨后通過酶切，RT-PCR檢測DNA測序，篩選出符合設計要求的構型。
(4)篩選出的合格構件接種于293細胞中培養(yǎng)(37℃，CO2)，使其大量擴增，提取培養(yǎng)上清液，在80,000g超速離心分離出可用于治療腺病毒-胸苷激酶產品。
(5)對產品進行CsCl氯化銫純化，應用空斑試驗測出PFU效價，在80℃保存。
可利用腺病毒-胸苷激酶基因構件擴增后的上清液制取基因產品，根據本腺病毒-胸苷激酶基因構建系統(tǒng)在初步臨床前預實驗中表明，無論在體外腫瘤細胞系或動物模型內，該基因產品具有明確、高效抗人類腫瘤活性，安全性好，應用方便，其中對卵巢癌的臨床前期應用中，有效率超過70％，特別是用于多種宿主腫瘤局部直接注射，本產品對手術不能切除或切除不完全的局部病灶有獨到的治療效果。由于載體是一種缺陷的人體伴隨病毒，無宿主基因插入突變的危險性，因此為應用于臨床有很好的發(fā)展前景。特別是中國人實體瘤有效好效果。
機理將胸苷激酶通過腺病毒為載體轉入腫瘤細胞中使之表達，繼之加用更昔洛韋，在其參與下，胸苷激酶轉化單磷酸核苷為三磷酸核苷，并與腫瘤新生DNA鏈結合，干擾DNA的合成而殺死腫瘤細胞，而且胸苷激酶基因抗腫瘤細胞效應還能通過另一原理“旁觀者效應”，即使僅有10％的腫病細胞轉入胸苷激酶，加入更昔洛韋后，其余90％的腫瘤細胞由于細胞間的縫隙連接也將被殺死，使其抗腫瘤效應達到放大增效作用。
本發(fā)明優(yōu)點本發(fā)明通過優(yōu)化設計，選擇無毒腺病毒載體，選定相應功能基因片段長度等，使基因載體系統(tǒng)具有特異性，可轉染多種人體實體瘤，例如卵巢癌，宮頸癌，前列腺癌，胃腸道癌皮膚黑色素瘤及軟組織腫瘤，而且具有高抗癌作用，對卵巢癌的臨床前期應用中，有效率超過70％，本產品的表達率達95％以上。
權利要求
1.一種腺病毒-胸苷激酶基因構型，適用于人體腫瘤局部轉染，其特征在于全構件包括腺病毒載體，胸苷激酶片斷和RSV-LTP啟動子，全構件核苷酸長43Kb，胸苷激酶長2.8Kb，啟始片斷為18bp，其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。
2.一種獲得權利要求1所述基因構型的方法，其特征在于它包括(1)在序列為ATGGCTCGTCCCTGC啟始片斷的誘導下，在體外與ADV載體、TK基因cDNA，經酶切、連結、共轉染使RSV-LTP啟動子和胸苷激酶片斷插入腺病毒載體中，(2)將(1)中的初級構件與輔助質粒PJM17再次結合，連結成型后使構件能在293細胞中培養(yǎng)擴增。
3.根據權利要求2所述的獲得基因構型的方法，其特征在于所述構件經篩選過程，篩選系在瓊脂膠上進行，得到所需的正確基因構型。
4.一種利用腺病毒-胸苷激酶基因做成治療卵巢癌、宮頸癌、前列腺癌、胃腸道癌、皮膚黑色素瘤及軟組織腫瘤等實體癌的制劑。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種腺病毒－胸苷激酶基因構型及其獲得方法和應用。全構件包括腺病毒載體、胸苷激酶片斷和RSV－LTP啟動子,全構件核苷酸長43Kb,胸苷激酶長2.8Kb,啟始片斷為18bp,其序列ATGGCTTCGTACCCCTGC。該產品是通過對人體腫瘤特別是局部實體瘤進行轉染,在更昔洛韋的參與下,能針對特異性殺滅腫瘤細胞,可轉染各種人體實體瘤,特別對中國人有高抗癌作用。
文檔編號C12N15/54GK1254759SQ98124960
公開日2000年5月31日 申請日期1998年11月25日 優(yōu)先權日1998年11月25日
發(fā)明者馬丁, 盧運萍, 王世宣, 周劍鋒, 李震中 申請人:馬丁