專利名稱：重組救活可線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物技術(shù)基因工程領(lǐng)域中的昆蟲病毒載體，具體涉及重組救活可線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體。
重組昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)，主要有兩個(gè)一為以苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)為載體，秋粘蟲Sf細(xì)胞或昆蟲為宿主；一為以家蠶核多角體病毒(BmNPV)為載體，家蠶細(xì)胞或家蠶蟲體為宿主。表達(dá)系統(tǒng)包括啟動(dòng)子、轉(zhuǎn)移載體、NPV病毒載體和宿主細(xì)胞或蟲體。兩個(gè)表達(dá)系統(tǒng)都以各自病毒載體的多角體蛋白強(qiáng)啟動(dòng)子(Ph)為外源基因表達(dá)的調(diào)控元件。重組昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)操作的技術(shù)難度主要在于帶有外源基因重組病毒的篩選。早期用顯微鏡技術(shù)按病毒感染細(xì)胞成空斑的形態(tài)來篩選極為繁瑣，除需要熟練技術(shù)外，還費(fèi)時(shí)，周期很長。Kitts.P.A.等在AcNPV多角體蛋白基因(Ph)旁側(cè)引入兩個(gè)Bsu36I限制性酶切位點(diǎn)，其中一個(gè)在AcNPV復(fù)制必需基因ORF1629上，由此構(gòu)建成修飾型AcNPV病毒，即BacPAK6病毒[參見Kitts PA等，Biotech 1993；14810-817]。BacPAK6 DNA用Bsu36I切割線性化后，基因組不能復(fù)制，病毒失活，而只有通過與含必需基因ORF1629同源片段的轉(zhuǎn)移載體pBacPAK質(zhì)粒同源重組才能救活病毒。這一重組救活過程使存活的病毒90％以上為重組病毒，從而大大簡化了篩選操作。且BacPAK6中的β-半乳糖苷酶基因LacZ也可作報(bào)導(dǎo)基因，使篩選更方便。但，在具有重要應(yīng)用價(jià)值的重組家蠶BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中，至今尚無類似AcNPV的BacPAK6修飾型病毒載體，而且AcNPV不能感染家蠶細(xì)胞。構(gòu)建重組救活可線性化家蠶核多角體病毒基因工程載體很有必要性。
本發(fā)明的目的是提供重組救活可線性化家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體(由北京中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，1997年10月31日，保藏登記編號(hào)為CGMCC 0328)。它是將商品化的AcNPV BacPAK6修飾病毒基因組DNA與中國鎮(zhèn)江株野生型BmNPV ZJ8基因組DNA共導(dǎo)入家蠶細(xì)胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)通過兩種病毒基因組同源重組，將BacPAK6中含Bsu36I酶切位點(diǎn)、ORF1629及LacZ基因的片段替代BmNPV基因組相應(yīng)部分，構(gòu)建而成重組救活可線性化家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體。此病毒載體是以家蠶細(xì)胞和家蠶蟲體為宿主，可用于BmNPV重組基因工程表達(dá)系統(tǒng)，大大提高重組病毒篩選率，并簡化篩選操作。
本發(fā)明提供在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組獲得雜合核多角體病毒載體的構(gòu)建方法。將野生型BmNPV和修飾型AcNPV病毒BacPAK6這兩種宿主不同的病毒用脂質(zhì)體法導(dǎo)入家蠶細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組，將BacPAK6中所含的Bsu36I酶切位點(diǎn)、復(fù)制必需基因ORF1629及LacZ報(bào)導(dǎo)基因的片段替換BmNPV基因組DNA的相應(yīng)部分。從家蠶細(xì)胞增殖出的病毒中，用β半乳糖苷酶底物X-gal篩選出表達(dá)LacZ基因，而呈藍(lán)色空斑的重組病毒。此病毒即為可線性化修飾型雜合型家蠶核多角體病毒BmBacPAK。構(gòu)建過程見圖1。
本發(fā)明提供BmBacPAK病毒基因工程表達(dá)載體的結(jié)構(gòu)和酶切圖譜。BmBacPAK是一個(gè)雜合病毒，其基因組主體部分為BmNPV ZJ8野生型株的基因組，而含有的多角體蛋白基因(Ph)啟動(dòng)子、LacZ報(bào)導(dǎo)基因、部分ORF1629復(fù)制必需基因、Ph5’，3’旁側(cè)序列的基因片段及其所含的相應(yīng)的Bsu36I酶切位點(diǎn)均來自AcNPVBacPAK6。圖2表示了這個(gè)雜合病毒的結(jié)構(gòu)模式。用Bsu36I酶切修飾型家蠶病毒BmBacPAK DNA，與BacPAK6 DNA相比較(圖3)，結(jié)果顯示二者的Bsu36I酶切圖譜相同。已知BmNPV ZJ8基因組中無Bsu36I位點(diǎn)，說明修飾型家蠶病毒BmBacPAK含有來自BacPAK6基因組的AcNPV核多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制下的LacZ基因及兩測(cè)序列，并包括兩個(gè)人工引進(jìn)的Bsu36I酶切位點(diǎn)。Bsu36I酶切位點(diǎn)可用于線性化病毒DNA。另外，用限制性內(nèi)切酶EcoRI，HindIII，PstI酶切BmBacPAK和BacPAK6 DNA，發(fā)現(xiàn)修飾型家蠶病毒BmBacPAK的某些片段與野生型BmNPV ZJ8相同，而另一些酶切片段則與BacPAK6相同，說明BmBacPAK確由野生型BmNPV DNA與BacPAK6 DNA同源重組而產(chǎn)生(圖4)。
重組昆蟲病毒表達(dá)系統(tǒng)是一個(gè)真核表達(dá)系統(tǒng)。該系統(tǒng)用作外源基因表達(dá)時(shí)，具有表達(dá)效率高，表達(dá)后加工等優(yōu)點(diǎn)。BmNPV表達(dá)系統(tǒng)不僅可以以家蠶細(xì)胞為宿主，而且可利用個(gè)體較大的家蠶蟲體和家蠶蛹為宿主生產(chǎn)外源基因蛋白。外源基因在蟲體或蛹中的表達(dá)比細(xì)胞中表達(dá)量更高，且表達(dá)后加工更完善。本發(fā)明構(gòu)建的BmBacPAK重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒基因工程載體仍含有多角體蛋白基因強(qiáng)啟動(dòng)子，可作為外源基因表達(dá)的調(diào)控元件，有效表達(dá)外源基因。報(bào)道基因熒光素酶(Luc)基因，以及人促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因都利用BmBacPAK病毒為載體，在家蠶細(xì)胞、家蠶蟲體和家蠶蛹中獲得高效表達(dá)。
本發(fā)明BmBacPAK病毒基因工程載體可用于報(bào)導(dǎo)基因螢火蟲熒光素酶(Luc)基因的表達(dá)。由于BmBacPAK中Ph基因兩側(cè)順序被AcNPV BacPAK6相應(yīng)部分取代，其中含Bsu36I酶切位點(diǎn)的ORF1629必需基因可被Bsu36I切割破壞，故BmBacPAK基因組可被Bsu36I酶切線性化而失活，只有通過與含完整ORF1629基因的轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒DNA同源重組才能救活。由此設(shè)計(jì)的外源基因?qū)隑mBacPAK重組救活工作原理可以大大提高含外源基因重組病毒的篩選效率。用這一病毒載體構(gòu)建含外源基因的重組病毒的工作原理見圖5。以BmBacPAK病毒為載體，以昆蟲熒光素酶基因(Luc)作報(bào)導(dǎo)基因構(gòu)建的重組病毒感染家蠶細(xì)胞可以獲得較高的表達(dá)。將熒光素酶基因克隆在質(zhì)粒pBacPAK1(Clontech公司)的BamHI位點(diǎn)，構(gòu)建成轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-Luc(圖6)。轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-Luc DNA與線性化的BmBacPAK病毒DNA共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞。培養(yǎng)4-5天后作病毒空斑分析，重組率幾近100％。Luc在BmN細(xì)胞中的表達(dá)量參照熒光素酶標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算為45μg標(biāo)準(zhǔn)酶/106細(xì)胞(圖7)。單斑純化后的Luc基因表達(dá)水平與上述直接用共轉(zhuǎn)染液病毒表達(dá)的Luc水平基本相同，顯示了重組救活可線性化修飾型家蠶病毒BmBacPAK極高的應(yīng)用價(jià)值。
本發(fā)明BmBacPAK病毒基因工程載體可用于人促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因在家蠶蟲體和家蠶蛹中的高效表達(dá)。BmBacPAK重組救活雜合型可線性化修飾病毒是以家蠶細(xì)胞，家蠶幼蟲和家蠶蛹為宿主的基因工程表達(dá)載體。通過與含外源基因的轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)兩種DNA同源重組后構(gòu)成重組病毒。重組的BmBacPAK攜帶的外源基因在Ph啟動(dòng)子調(diào)控下，可以得到高效表達(dá)，生產(chǎn)有經(jīng)濟(jì)效益的重組蛋白或多肽。因此BmBacPAK病毒是一個(gè)有實(shí)用價(jià)值的基因工程載體。以BmBacPAk為病毒載體，將人工合成的人EPO基因(cDNA序列見圖8)構(gòu)建在載體pBacPAK8中的BamHI位點(diǎn)，獲得轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-EPO(圖9)。轉(zhuǎn)移載體與線性化修飾型家蠶病毒BmBacPAK共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞內(nèi)同源重組，獲得重組病毒。用EPO檢測(cè)藥盒(Boehringer Mannheim公司)多抗-EPO-單抗夾心ELISA測(cè)定表達(dá)量為13600U/ml。重組病毒注射五齡起眠家蠶和結(jié)繭4天的嫩蛹，感染4-5天后，測(cè)定EPO表達(dá)量為6.2×104U/ml蠶血淋巴，7.4×104U/ml蛹血淋巴(表1)。
表1，重組病毒BmBacPAK-EPO感染家蠶蟲體和家蠶蛹，人EPO基因的表達(dá)活性測(cè)定(單位U/ml)感染天數(shù)03 456.5幼蟲034000 6280046000/蛹 020500 470007400033400綜上，本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)如下提供不同宿主的兩個(gè)核多角體病毒BmNPV和AcNPV的基因組共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在細(xì)胞內(nèi)獲得以BmNPV為母體，含AcNPV部分序列的雜合病毒及其構(gòu)建方法；BmBacPAK修飾型病毒可以線性化，重組救活方式大大提高了含外源基因的重組BmNPV基因工程病毒載體篩選效率，簡化了操作；BmBacPAK以Ph基因強(qiáng)啟動(dòng)子為調(diào)控外源基因表達(dá)的元件，外源基因在家蠶細(xì)胞，家蠶蟲體和家蠶蛹中得到很高的表達(dá)，具有實(shí)用意義；相比以往用BmNPV或AcNPV表達(dá)系統(tǒng)必須各自選用自身的轉(zhuǎn)移載體，BmBacPAK病毒載體可利用任何BmNPV和AcNPV表達(dá)系統(tǒng)中的轉(zhuǎn)移載體來構(gòu)建重組病毒。
本發(fā)明通過以下附圖和實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明范圍。


圖1，重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒BmBacPAK的構(gòu)建過程。
圖2，BmBacPAK雜合病毒的結(jié)構(gòu)模式。
圖3，BmBacPAK DNA與BacPAK6 DNA的Bsu36I的酶切圖譜比較1，λ/HindIII，2，BmBacPAK/Bsu36I，3，BacPAK6/Bsu36I，4，BmBacPAK不酶切，5，BacPAK6不酶切。
圖4，BmBacPAK DNA與BacPAK6 DNA的其它酶切圖譜比較1，AcNPV/EcoRI，2，BmNPV/EcoRI，3，λ/HindIII，4，BacPAK6/EcoRI，5，BmBacPAK/EcoRI，6，BacPAK6/HindIII，7，BmBacPAK/HindIII，8，BacPAK6/PstI，9，BmBacPAK/PstI，10，λ/HindIII。
圖5，可線性化病毒重組救活工作原理。
圖6，重組病毒BmBacPAK-Luc的構(gòu)建。
圖7，重組病毒BmBacPAK-Luc感染家蠶細(xì)胞后，Luc基因的表達(dá)時(shí)相曲線。
圖8，人工合成的人促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因cDNA序列。
圖9，轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-EPO的構(gòu)建。
實(shí)施例1重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒BmBacPAK的構(gòu)建野生型BmNPV ZJ8 DNA 0.2μg與修飾型AcNPV病毒BacPAK6(Clontech公司)DNA 0.2μg加水至50μl，取Lipofectin(GIBCO BRL公司)溶液34μl加水至50μl，兩者混合后室溫放置20分鐘。將混合液滴加入經(jīng)無血清培基TC100(GIBICO BRL公司)洗過的家蠶細(xì)胞BmN(1.5×106)。27℃培養(yǎng)4天后，轉(zhuǎn)染上清作病毒空斑分析。取不同稀釋度的轉(zhuǎn)染液加入含105細(xì)胞的30mm培皿中，27℃保溫1小時(shí)，吸去轉(zhuǎn)染液，加含1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠，以及0.2mg/ml X-gal的培養(yǎng)基2ml，27℃培養(yǎng)4天。由于野生型BmNPV ZJ8不含β-半乳糖苷酶LacZ基因，并在感染細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)多角體，而BacPAK6病毒不能在家蠶細(xì)胞中復(fù)制，只有二者重組的雜合型重組修飾病毒才能在家蠶細(xì)胞中復(fù)制，且?guī)в蠰acZ基因。在培養(yǎng)基中添加終濃度為0.2mg/ml β-半乳糖苷酶底物X-gal，可篩選重組病毒。挑取呈藍(lán)色但不含多角體的空斑，即為野生型BmNPV ZJ8與BacPAK6同源重組的重組可線性化修飾型家蠶核多角體病毒BmBacPAK(圖1)。
實(shí)施例2家蠶修飾型病毒BmBacPAK DNA和AcNPV修飾型病毒BacPAK6 DNA的酶切圖譜分析a，病毒DNA的抽提經(jīng)病毒感染的昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)液24000rpm超離心1小時(shí)，收集沉淀，作10％和60％蔗糖非梯度24000rpm超離心1小時(shí)。收集在兩層蔗糖溶液界面處形成的病毒粒子。病毒懸浮后，加100μl 20％Sarkosyl溶液，60℃，30分鐘，裂解病毒。然后作50％CsCl(W/W)/EB(10mg/ml)密度梯度超離心，46000rpm，20℃，19小時(shí)，以純化病毒DNA。DNA經(jīng)透析后4℃保存。
b，酶切圖譜比較在總反應(yīng)體積20μl中，加入病毒DNA 2μg，10x酶切緩沖液2μl，合適的限制性內(nèi)切酶10單位，37℃1-2小時(shí)，作0.6％瓊脂糖凝膠電泳，凝膠在0.5mg/ml溴己啶(EB)中染色5-10分鐘，紫外燈下觀察并照相記錄，結(jié)果見圖3和圖4。
實(shí)施例3以修飾型家蠶病毒BmBacPAK為載體，在家蠶細(xì)胞中表達(dá)熒光素酶(Luc)基因a，轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-Luc的構(gòu)建將含昆蟲熒光素酶基因的質(zhì)粒pUC-Luc用BamHI酶切完全。走1％低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳，在EB存在下，在紫外燈下切割出1.8kb含熒光素酶基因片段。65℃保溫凝膠10分鐘，苯酚抽提，乙醇沉淀DNA。載體pBacPAK1(Clontech公司)質(zhì)粒DNA用BamHI酶切完全。在10μl總反應(yīng)體積中，加入pBacPAK DNA和Luc基因片段DNA共約0.5μg，5x連接酶緩沖液2μl，T4DNA連接酶1-2單位，14℃保溫過夜。連接樣品轉(zhuǎn)化大腸桿菌，堿法抽提質(zhì)粒DNA。用EcoRV酶切鑒定，篩選出含Luc基因的轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-Luc.(圖6)。用T7 DNA測(cè)序試劑盒(Amershan公司)，雙脫氧法進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果表明Luc基因起始碼ATG與啟動(dòng)子之間間隔48bp，且連接處序列正確。
b，重組病毒BmBacPAK-Luc的分離上述重組救活修飾型家蠶病毒BmBacPAKDNA用Bsu36I酶切線性化，與轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-Luc DNA共轉(zhuǎn)染家蠶BmN細(xì)胞。27℃培養(yǎng)4-5天后，共轉(zhuǎn)染上清用作病毒空斑分析。在0.2mg/ml X-gal存在下，病毒空斑均呈多角體陰性，LacZ基因陰性，無藍(lán)色空斑出現(xiàn)。以感染指數(shù)MOI＝20接種細(xì)胞后作空斑分析，亦無藍(lán)色空斑出現(xiàn)。說明重組救活后，獲得重組病毒比例幾近100％。
c，Luc基因在家蠶細(xì)胞中的表達(dá)時(shí)相和表達(dá)水平共轉(zhuǎn)染病毒以MOI＝1感染105家蠶細(xì)胞(BmN)。分別在感染后48、60、72、84、96小時(shí)收集細(xì)胞，懸浮于25mM苷氨酰苷氨酸(Glycylglycine)pH7.8，150mM NaCl溶液中，加TritonX-100至終濃度1％，裂解細(xì)胞。12000rpm離心5分鐘。上清置于熒光光度計(jì)配套比色杯，加入熒光素酶檢測(cè)液(3.3mM ATP，6.6mM MgCl2，100mM D-熒光素Lucuferin)立即進(jìn)行熒光光度檢測(cè)。結(jié)果顯示感染后72小時(shí)，Luc基因在家蠶細(xì)胞中表達(dá)最高。參照標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出表達(dá)量達(dá)45μg/106細(xì)胞(圖7)。
實(shí)施例4以修飾型重組救活可線性化家蠶病毒BmBacPAK為載體，在家蠶蟲體及家蠶蛹中表達(dá)人促紅細(xì)胞生成素(EPO)基因
a，轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-EPO的構(gòu)建和重組病毒的獲得由中科院上海生物工程基地化學(xué)合成的人EPO基因cDNA(圖8)用XbaI和BamHI雙酶切，經(jīng)大片段DNA聚合酶(Klenow)補(bǔ)平后，用T4DNA連接酶連接在質(zhì)粒pBacPAK8(Clontech公司)DNA的BamHI補(bǔ)平位點(diǎn)上。使EPO基因在多角體蛋白基因啟動(dòng)子控制之下，獲得轉(zhuǎn)移載體pBacPAK-EPO(圖9)。轉(zhuǎn)移載體DNA2μg與病毒DNA1μg混合后，加水至50μl。另取Lipofectin溶液15μl，加水至50μl。兩者混合后，室溫放置15分鐘，然后滴加入含單層家蠶細(xì)胞(BmN)的平皿中，27℃培養(yǎng)6小時(shí)，換3ml含10％胎牛血清的培養(yǎng)基TC100(GIBICO BRL公司)，繼續(xù)培養(yǎng)5天。收集上清病毒用于感染。
b，EPO基因在家蠶蟲體和家蠶蛹中的表達(dá)家蠶用人工飼料飼養(yǎng)。5齡起眠蠶或結(jié)繭第4天蛹經(jīng)表皮消毒，每頭蠶穿刺接種1×105pfu重組病毒。發(fā)病后收集血淋巴。液氮和37℃反復(fù)凍融三次，離心去除細(xì)胞碎片和脂質(zhì)，上清用于EPO檢測(cè)。按Boehringer Mannheim公司產(chǎn)品說明書描述的方法，根據(jù)多抗-EPO-單抗夾心ELISA測(cè)定EPO單位，結(jié)果見表1。
權(quán)利要求
1.一種保藏登記號(hào)為CGMCC 0328的重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體，其特征在于它是一個(gè)含苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒(AcNPV)基因組部分片段的雜合型家蠶病毒，是一個(gè)雙鏈DNA病毒，長度為130kb，其基因組主體部分為野生型家蠶核多角體病毒基因組，還含有來自于AcNPV的BacPAK6修飾型病毒載體的多角體蛋白基因(Ph)啟動(dòng)子；LacZ報(bào)導(dǎo)基因；部分ORF1629復(fù)制必需基因；Ph5’，3’旁側(cè)序列基因片段及人工引入的兩個(gè)Bsu36I酶切位點(diǎn)。
2.如權(quán)利要求1所述家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體的構(gòu)建方法，其特征在于它是通過野生型家蠶核多角體病毒與修飾型苜宿銀紋夜蛾核多角體病毒(BacPAK6)經(jīng)全基因組共轉(zhuǎn)染家蠶細(xì)胞，在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組而獲得。
3.如權(quán)利要求1所述家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體，其特征在于所述野生型家蠶核多角體病毒是中國鎮(zhèn)江株(BmNPV ZJ8)病毒。
4.如權(quán)利要求1所述家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體的應(yīng)用，其特征在于它含有多角體蛋白基因啟動(dòng)子，可應(yīng)用于外源基因在BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中的高效表達(dá)。
5.如權(quán)利要求4所述的家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體的應(yīng)用，其特征在于它可用于報(bào)道基因螢火蟲熒光素酶基因在BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。
6.如權(quán)利要求4所述家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體的應(yīng)用，其特征在于它可用于人促紅細(xì)胞生成素基因在BmNPV表達(dá)系統(tǒng)中的表達(dá)。
7.如權(quán)利要求1所述家蠶核多角體病毒BmBacPAK基因工程載體，其特征在于它是以家蠶細(xì)胞，家蠶蟲體和家蠶蛹為宿主的基因工程表達(dá)載體。
全文摘要
通過野生型家蠶核多角體病毒中國鎮(zhèn)江株BmNPV ZJ8基因組與修飾型苜蓿銀紋夜蛾核多角體病毒AcNPV BacPAK6基因組在家蠶細(xì)胞內(nèi)同源重組,構(gòu)建成重組救活可線性化修飾型家蠶核多角體病毒基因工程載體BmBacPAK。BmBacPAK含有LacZ基因和兩個(gè)Bsu36I酶切位點(diǎn)用于線性化。BmBacPAK用作外源基因表達(dá)重組救活病毒篩出率幾近100%。BmBacPAK用作載體表達(dá)人EPO基因,感染家蠶蟲體和家蠶蛹時(shí),EPO表達(dá)量達(dá)7.4×10
文檔編號(hào)C12N15/86GK1242428SQ9811096
公開日2000年1月26日 申請(qǐng)日期1998年7月17日 優(yōu)先權(quán)日1998年7月17日
發(fā)明者吳祥甫, 楊冠珍, 胡建新 申請(qǐng)人:中國科學(xué)院上海生物化學(xué)研究所