專利名稱：結(jié)締組織生長(zhǎng)因子作為誘導(dǎo)劑的方法和應(yīng)用的制作方法
本說(shuō)明書(shū)中所公開(kāi)的資料，部分是在國(guó)立衛(wèi)生研究院所授予的基金號(hào)為GM37223的政府資助下完成的。政府對(duì)本說(shuō)明書(shū)所公開(kāi)的發(fā)明可能有某些權(quán)利。1.相關(guān)申請(qǐng)聲明該申請(qǐng)與1995年6月2日所提交的題目為“結(jié)締組織生長(zhǎng)因子”的系列號(hào)08/459,717的申請(qǐng)相關(guān)，并且是它的一個(gè)部分繼續(xù)申請(qǐng)，系列號(hào)08/459,717的申請(qǐng)是1995年2月10日所提交的具有相同題目的系列號(hào)08/386,680所描述申請(qǐng)的部分繼續(xù)申請(qǐng)，系列號(hào)08/386,680的申請(qǐng)是1993年12月4日所提交的現(xiàn)已授權(quán)為美國(guó)專利號(hào)5,408,040的系列號(hào)08/167,628所描述申請(qǐng)的分案申請(qǐng),專利號(hào)5,408,040是1991年8月30日所提交的目前已被放棄的系列號(hào)07/752,427的繼續(xù)申請(qǐng)。2.發(fā)明領(lǐng)域總體上該發(fā)明與生長(zhǎng)因子領(lǐng)域相關(guān)，尤其與結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)以及它的應(yīng)用方法有關(guān)。3.發(fā)明背景A.生長(zhǎng)因子在骨和軟骨形成中的作用骨和軟骨形成。在所有的來(lái)源于一個(gè)單一的受精卵的多細(xì)胞生物體中，組織和器官的形成需要起源于未分化干細(xì)胞的各種特化細(xì)胞的分化。隨著胚胎形成過(guò)程的進(jìn)展，更加高度特化的細(xì)胞類型和更復(fù)雜的結(jié)構(gòu)被形成。然而，目前得不到在包括人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中具體因子的鑒定或這些因子對(duì)骨和軟骨形成所發(fā)揮作用的機(jī)制方面的具體資料。
在哺乳動(dòng)物系中有兩種常見(jiàn)的骨形成類型膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化。顱骨的骨形成是膜內(nèi)骨化的例子。在顱骨那個(gè)部位，來(lái)自于神經(jīng)嵴的間充質(zhì)細(xì)胞與顱部上皮細(xì)胞的細(xì)胞外基質(zhì)相互作用并且形成骨。參見(jiàn)Hall，美國(guó)科學(xué)》(Amer.Sci)，1988，76174-181頁(yè)。間充質(zhì)細(xì)胞聚集成小的細(xì)胞島并且分化成成骨細(xì)胞和毛細(xì)管。成骨細(xì)胞分泌一種特種類型的細(xì)胞外基質(zhì)，(類骨質(zhì))它能夠結(jié)合鈣鹽。
軟骨內(nèi)骨化是形成中軸骨骼的長(zhǎng)骨(上肢和下肢)以及椎骨和肋骨的成骨過(guò)程。見(jiàn)Hall.上文。在這個(gè)過(guò)程中要經(jīng)過(guò)一個(gè)軟骨組織中間階段才能形成骨。在哺乳動(dòng)物中，長(zhǎng)骨形成于胚胎性肢芽中的某些間充質(zhì)細(xì)胞。這些細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞，并且分泌一種軟骨基質(zhì)。周圍的其它間充質(zhì)細(xì)胞形成軟骨膜(最終，骨膜)。在某些情況下，毗鄰于軟骨細(xì)胞正在增殖和形成區(qū)域的軟骨細(xì)胞分化成肥大軟骨細(xì)胞。
肥大軟骨細(xì)胞產(chǎn)生一種不同類型的基質(zhì)，并且改變組織的分化方向而形成長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部。長(zhǎng)骨生長(zhǎng)部的結(jié)構(gòu)排列成多個(gè)細(xì)胞柱，包括細(xì)胞肥大區(qū)、增殖區(qū)、骨化區(qū)和形成血管區(qū)。參見(jiàn)Hall，上文；Gilbert，“基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控”，《發(fā)育生物學(xué)》(DEVELOPMENTAL，BIOIOGY)，第5版。Sinaur Assoc.，387-390頁(yè)(1994)。這導(dǎo)致細(xì)胞從軟骨細(xì)胞發(fā)生轉(zhuǎn)化，逐漸演變成能形成含無(wú)機(jī)鹽骨的成骨細(xì)胞。
發(fā)生于哺乳動(dòng)物的從嬰兒成長(zhǎng)到成年這個(gè)過(guò)程的軟骨內(nèi)骨化是一個(gè)活躍的、不斷進(jìn)行的骨化過(guò)程。間充質(zhì)細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞，它們的增殖和由成骨細(xì)胞替代都依賴于生長(zhǎng)因子(包括TGF-β家族)，以及基質(zhì)的無(wú)機(jī)鹽化。Tuan，1984，《實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)雜志》J.Exp.Zool.(增刊)1卷1-13頁(yè)(1984)；Syfestad和Caplan，1984，《發(fā)育生物學(xué)》(Devel.Biol.)104卷348-386頁(yè)。
關(guān)于結(jié)締組織，可以看出在哺乳動(dòng)物中所有的骨骼成分都來(lái)源于能夠分化成包括肌肉、軟骨、骨和腱在內(nèi)的各種類型特化細(xì)胞的單一的干細(xì)胞。這些細(xì)胞似乎也能夠分化成脂肪組織。
涉及生長(zhǎng)因子和骨以及軟骨形成的相關(guān)領(lǐng)域。在該發(fā)明出現(xiàn)之前，人們通常知道生長(zhǎng)因子包括一類能刺激靶細(xì)胞增殖，分化和構(gòu)成發(fā)育組織的分泌性多肽。一般情況下，一種生長(zhǎng)因子的活性依賴于它結(jié)合特異的受體并激活細(xì)胞內(nèi)部發(fā)生信號(hào)傳導(dǎo)的能力。一些已詳細(xì)研究的生長(zhǎng)因子的實(shí)例包括血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)，胰島素樣生長(zhǎng)因子(IGF-1)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β家族(TGF-β)，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子α家族(TGF-α)，上皮生長(zhǎng)因子(EGF)，和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(FGF)。
TGF-β對(duì)軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)、分化和軟骨形成的效果。TGF-β在軟骨形成中發(fā)揮作用。正如以前所報(bào)道，TGF-β1和TGF-β2能增加大鼠胚胎性間充質(zhì)細(xì)胞中的軟骨形成(Seyedin，等，1987，《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)262卷，1946-1947頁(yè))，并且兩者的異構(gòu)體都能夠從培養(yǎng)的小鼠肌肉間充質(zhì)細(xì)胞中誘導(dǎo)成軟骨細(xì)胞的形成。Seyedin.等，1986，《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)261卷，5693-5695頁(yè)。TGF-β應(yīng)用于小鼠胚胎的類軟骨前(prechondroid)組織可增加間充質(zhì)細(xì)胞的分化，蛋白聚糖的產(chǎn)生以及成軟骨細(xì)胞的增殖。Centrella，等，1994，《內(nèi)分泌綜述》(Endocrine Reviews)15卷，27-38頁(yè)；Thorp和Jakowlew，1994，《骨》(Bone)15卷，59-64頁(yè)。
應(yīng)用原位雜交技術(shù)，在軟骨細(xì)胞停止分化并具有三種不同疾病的動(dòng)物的生長(zhǎng)板中可見(jiàn)TGF-β3的水平降低。用同樣方法檢測(cè)(Id.)，在牛關(guān)節(jié)軟骨的器官培養(yǎng)物中，當(dāng)使用TGF-β后，II型膠原和蛋白聚糖的合成增加。Morales和Roberts，1988，《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)263卷12828-12831頁(yè)。與之相反的是，TGF-β已被證實(shí)能夠降低所培養(yǎng)的類軟骨細(xì)胞中的II型和X型軟骨特異性膠原蛋白的表達(dá)、軟骨細(xì)胞蛋白聚糖的合成、以及堿性磷酸酶的活性。Mundy.“TGF-β對(duì)骨的效果”，《TGF-β的臨床應(yīng)用》(Clinical Applications ofTGF-β)，1991，Wiley Chichester，Ciba Foundation Symposium 157卷137-151頁(yè)。在兔生長(zhǎng)板中的軟骨細(xì)胞分化受到TGF-β的抑制，然而生長(zhǎng)板軟骨細(xì)胞的有絲分裂卻增加。Kato，等，1988，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)85卷9552-9556頁(yè)。
另外，加到骨誘導(dǎo)性模型中的高濃度TGF-β1或TGF-β2在使用較小的劑量時(shí)有利于軟骨形成，而不是有利于骨的形成。Mundy，上文。這些明顯相反的數(shù)據(jù)的積累已經(jīng)阻礙了有關(guān)確定TGF-β在軟骨形成中所發(fā)揮作用的研究。
骨形態(tài)發(fā)生蛋白和骨形成。一個(gè)被稱為骨形態(tài)發(fā)生蛋白的蛋白質(zhì)家族(BMP能夠在某些種類的哺乳動(dòng)物中誘發(fā)異位的骨形成。除了編碼金屬蛋白酶的BMP-1之外，所有的這些蛋白質(zhì)都具有與TGF-β相關(guān)的結(jié)構(gòu)。然而，如果有BMP與正常胚胎形成過(guò)程中的骨形成的調(diào)控有關(guān)，現(xiàn)在還不知道是哪一些有這種作用。
BMP′s作為在骨骼之外誘導(dǎo)異位骨形成的因子，最初是從脫無(wú)機(jī)鹽的骨中分離出來(lái)的。當(dāng)初三條多肽被鑒定為BMP-1，BMP-2A，和BMP-3。Celeste，等，1990，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc，Natl.Acad.Sci.USA)87卷9843-9847頁(yè)；Kubler和Urist，1990，《臨床矯形外科學(xué)和相關(guān)研究》(Clin.Orthopedics and Rel.Res.)258卷279-294頁(yè)。后兩個(gè)BMP是TGF-β超家族的成員。隨后，5個(gè)更密切相關(guān)的BMP蛋白組成員已經(jīng)被鑒定和克隆。BMP-5、BMP-6和BMP-7與vgr/60A最相似，然而B(niǎo)MP-2和BMP-4與Decapentaplegic最相似。Vga/60A和Decapentaplegic都是控制背部/腹部中軸模式(pattern)形成的果蠅屬基因。Hoffman，1992，《分子生殖和發(fā)育》(Mol.Reproand Dev.)32卷173-178頁(yè)。
在發(fā)育過(guò)程中的某些特定時(shí)期原位雜交已將BMP的基因表達(dá)限定于肢芽中的骨形成區(qū)，這提示BMP有生理意義。BMP能夠誘導(dǎo)胚胎后外膜的間充質(zhì)細(xì)胞由纖維發(fā)生模式轉(zhuǎn)變成軟骨骨胚前發(fā)生(chondrosteoprogenetic)模式。Kubler and Urist，上文。幾個(gè)系列的數(shù)據(jù)表明，BMPs可能與TGF-βs協(xié)同發(fā)揮作用來(lái)起始體內(nèi)的骨誘導(dǎo)鏈。在小鼠的皮下組織中，TGF-β1能夠增強(qiáng)大多數(shù)BMPs所誘發(fā)的異位骨的形成。BMP-6(也被稱為VGR-1)在肥大軟骨中有表達(dá)，與TGF-βs的表達(dá)時(shí)間和表達(dá)部位均相同，并且還與X型膠原的表達(dá)有關(guān)。見(jiàn)Celeste，等，上文。
TGF-β2加入到已經(jīng)被BMP-2或BMP-3處理過(guò)的骨移植物中可增加骨誘導(dǎo)的活性，并且當(dāng)與單獨(dú)一種因子處理進(jìn)行比較時(shí)可增加軟骨與骨的比例。Bentz，等，1991，《基質(zhì)》(Matrix)11卷269-275頁(yè)。然而，TGF-βs與這些蛋白之間的協(xié)同效果卻不是普遍存在的。已經(jīng)證實(shí)TGF-β1能直接降低胚胎大鼠顱蓋骨培養(yǎng)物中BMP-2的表達(dá)。Harris，等，1994，《骨和礦物質(zhì)研究雜志》(J.Bone and MineralRes.)9卷855-863頁(yè)。因?yàn)锽MP-2顯然在骨細(xì)胞分化中發(fā)揮重要作用，所以可以提示TGF-β1可能作為一個(gè)開(kāi)關(guān)發(fā)揮作用，來(lái)監(jiān)控成軟骨或成骨細(xì)胞前體的分化命運(yùn)。
發(fā)現(xiàn)在發(fā)育組織中有表達(dá)的其它因子。Cyr61是一種在發(fā)育過(guò)程中的小鼠胚胎和胚外組織中發(fā)現(xiàn)有表達(dá)的生長(zhǎng)調(diào)控因子。O′Brien and Lau，1992，《細(xì)胞生長(zhǎng)分化》(Cell Growth and Differ.)3卷645-654頁(yè)。Cyr61與CTGF相關(guān)但又不相同，在本發(fā)明之前Cyr61的特異活性是未知的。
B.生長(zhǎng)因子在傷口愈合中的作用血小板衍生生長(zhǎng)因子和傷口愈合。PDGF是由A鏈和B鏈組成的二聚體分子。這些鏈形成同源二聚體中的異二聚體，并且到目前為止所有已分離的二聚體分子都有生物活性。關(guān)于該因子的活性，POGF一直被描述為在循環(huán)血小板的α粒中發(fā)現(xiàn)的帶正電荷、熱穩(wěn)定的蛋白。該分子進(jìn)一步被描述成一種有絲分裂原和趨向諸如成纖維細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞等結(jié)締組織細(xì)胞的趨化劑。
由于PDGF在傷口愈合過(guò)程中的生物活性和局部分泌，PDGF已被確定為參與傷口愈合及表現(xiàn)出結(jié)締組織過(guò)度增生的病理狀態(tài)的生長(zhǎng)因子，這些病理狀態(tài)包括動(dòng)脈粥樣硬化和纖維化疾病。
人們已經(jīng)推測(cè)除了PDGF之外的其它生長(zhǎng)因子在人類組織的正常發(fā)育、生長(zhǎng)和修復(fù)中也可能發(fā)揮一定作用。
TGF-β和傷口愈合。新生和再生組織的形成需要各種基因的協(xié)調(diào)作用，這些基因可產(chǎn)生參與細(xì)胞生長(zhǎng)和組織組成有機(jī)體的調(diào)節(jié)性和結(jié)構(gòu)性分子。至于骨誘導(dǎo)，似乎是TGF-β在這個(gè)過(guò)程中充當(dāng)中心調(diào)控分子。TGF-β是由存在于修復(fù)過(guò)程起始階段的血小板、巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞所分泌的。TGF-β可作為間充質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)刺激因子以及內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的生長(zhǎng)抑制因子。人們已經(jīng)提出TGF-β的生長(zhǎng)刺激作用似乎是由一種間接機(jī)制所介導(dǎo)的，這個(gè)機(jī)制包括其它諸如PDGF等生長(zhǎng)因子基因的誘導(dǎo)。
TGF-β超家族的幾名成員所具有的活性可能能用于治療細(xì)胞增殖失調(diào)，如癌癥。尤其是，TGF-β已被證實(shí)為許多類型細(xì)胞的強(qiáng)效生長(zhǎng)抑制因子。(Massague，1987，《細(xì)胞》(Cell)49卷437頁(yè))，MIS已被證實(shí)能抑制人子宮內(nèi)膜癌在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)(Donanoe，等，1981，《外科學(xué)年鑒》(Ann.Surg.)194卷472頁(yè))，并且這種抑制作用已被證實(shí)能抑制腫瘤在卵巢和睪丸中的生長(zhǎng)(Matzuk，等，1992，《自然》(Nature)，360卷313頁(yè))。
TGF-β家族的許多成員也是組織修復(fù)的重要調(diào)節(jié)者。TGF-β已被證實(shí)能夠顯著影響新生小鼠的膠原形成和明顯血管生成反應(yīng)的誘因(Roberts等，1986，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)83卷4167頁(yè))。骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMPs)可誘發(fā)新骨生成并對(duì)治療骨折和其它骨骼缺陷是有效的(Glowacki等，1981，《柳葉刀》(Lancet)，1卷959頁(yè)；Ferguson等，1988，《臨床矯形外科學(xué)相關(guān)研究》(Clin.Orthoped Relat.Res.)227卷265頁(yè)；Johnson等，1988，《臨床矯形外科學(xué)相關(guān)研究》(Clin Orthoped.Relat.Res.)230卷257頁(yè))。
C.結(jié)締組織生長(zhǎng)因子一種以前未知的與PDGF相關(guān)并被命名為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)的生長(zhǎng)因子已在一個(gè)相關(guān)專利中報(bào)道。參見(jiàn)美國(guó)專利號(hào)5,408,040。CTGF是一種富含半胱氨酸的促有絲分裂多肽，用TGF-β激活后可在成纖維細(xì)胞中選擇性誘導(dǎo)這種多肽。Igarashi等，1993，《分子生物學(xué)與細(xì)胞》(Mol.Biol.Cell)4卷637-645頁(yè)。
CTGF是多肽家族的成員，這些多肽包括血清誘導(dǎo)的基因產(chǎn)物Cef10(Simmons等，1989，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad Sci.USA)86卷1178-1182頁(yè))、Cyr61 (O′Brien等，1990，《分子細(xì)胞生物學(xué)》10卷3569-3577頁(yè))、fisp12/IGM1(Ryseck等，1993，《細(xì)胞生長(zhǎng)與分化》(Cell Growth & Differ.)2卷225-233頁(yè))、和雞轉(zhuǎn)化基因，nov(Joliot等，1992，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.CellBiol.)12卷10-21頁(yè)(1992)。CTGF與一種果蠅基因產(chǎn)物、扭轉(zhuǎn)原腸胚形成(twg)(twisted gastrulation)的序列同源(Mason等，1994，《基因與發(fā)育》(Genes & Develop.)8卷1489-1501頁(yè))，該產(chǎn)物決定胚胎背/腹模式形成過(guò)程中的細(xì)胞命運(yùn)。
如那個(gè)專利中所報(bào)道，CTGF是一種獨(dú)特基因的產(chǎn)物。又如美國(guó)專利號(hào)5,408,040所報(bào)道，CTGF具有促有絲分裂活性。在體內(nèi)這個(gè)促有絲分裂活性的最終結(jié)果是靶組織的生長(zhǎng)。CTGF也具有趨化活性，趨化活性是指由于與某些特定分子相互作用而引起的細(xì)胞化學(xué)性誘發(fā)移動(dòng)。
盡管這個(gè)分子在抗原性上與PDGF相關(guān)，但幾乎不清楚在CTGF和PDGF之間是否有多肽序列同源?？?PDGF抗體對(duì)PDGF同分異構(gòu)體的非還原形式和CTGF分子有高的親和力，而對(duì)這些多肽的缺乏生物學(xué)活性的還原形式有十分之一的親和力。
被鑒定為“結(jié)締組織生長(zhǎng)因子 - 2”或“CTGF-2”的又一種蛋白質(zhì)也已被報(bào)道。見(jiàn)PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US94/07736(國(guó)際出版號(hào)WO96/01896)。根據(jù)PCT申請(qǐng)，CTGF-2也可能被用來(lái)增強(qiáng)結(jié)締組織和支架組織的修復(fù)。盡管已鑒定為結(jié)締組織生長(zhǎng)因子，但CTGF-2與本發(fā)明的CTGF不是密切相關(guān)的。具體而言，CTGF家族包括三個(gè)不同的蛋白組CTGF/Fisp12，cyr61和nov。與屬于cyr61組的CTGF-2相比，申請(qǐng)專利的本發(fā)明中的蛋白質(zhì)屬于第一個(gè)蛋白組。PCT申請(qǐng)?zhí)朠CT/US 94/07736位于4(at4)。
在本發(fā)明之前，盡管已鑒定出了包括CTGF的各種PDGF相關(guān)的生長(zhǎng)因子，但還沒(méi)證實(shí)這樣的因子是基質(zhì)產(chǎn)生，包括骨和/或軟骨組織誘導(dǎo)產(chǎn)生的有效誘導(dǎo)劑。4.發(fā)明概述本發(fā)明的主題提供了用來(lái)治療需要基質(zhì)和/或結(jié)締組織生成，包括骨和/或軟骨生成的疾病、紊亂或失調(diào)的新的方法和組合物。本發(fā)明主題也針對(duì)于治療需要促進(jìn)傷口愈合的疾病，紊亂或失調(diào)。
更具體而言，本發(fā)明的組合物包括CTGF和/或其片斷和/或它的衍生物(此后統(tǒng)稱為CTGF)，它們單獨(dú)使用或與其它生長(zhǎng)因子聯(lián)用。用于本發(fā)明組合物的CTGF可以通過(guò)從自然資源分離、合成生產(chǎn)獲得，或者用基因重組生物工程技術(shù)進(jìn)行生產(chǎn)。
本發(fā)明的一方面是，本發(fā)明中的方法包括單獨(dú)使用有效量的CTGF或與其它一種或多種化合物聯(lián)用，來(lái)治療需要骨或軟骨組織誘發(fā)生成的疾病、紊亂或失調(diào)。在本方法的優(yōu)選實(shí)施方案中，這樣的附加化合物是一種生長(zhǎng)因子。
本發(fā)明的另一方面是，本發(fā)明的方法包括單獨(dú)使用有效量的CTGF或與一種或多種化合物聯(lián)用，再優(yōu)選一種或多種生長(zhǎng)因子，來(lái)治療需要促進(jìn)傷口愈合的疾病，紊亂或失調(diào)。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，包含CTGF的組合物直接用于需要骨或軟骨誘發(fā)生成的部位，以誘發(fā)這樣的骨或軟骨的形成。在另一實(shí)施方案中，配制組合物用于靶向用藥，或者，設(shè)計(jì)組合物用于新組合物在相應(yīng)部位的釋放(例如，需要軟骨形成的傷口處)。在每一種情況下，含CTGF的組合物被適當(dāng)配制，用于有需要的病人。5.定義在說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“CTGF”的意思應(yīng)該是(1)一種由

圖1C所述氨基酸序列編碼的蛋白質(zhì)，(2)一種具有CTGF活性的蛋白質(zhì)，由圖1C中的氨基酸序列所編碼，在該序列中一個(gè)或多個(gè)氨基酸被插入、缺失、突變、替代或發(fā)生其它改變(“衍生物”)，并且編碼該蛋白質(zhì)的核苷酸序列在嚴(yán)格條件下能與圖1C中的核苷酸序列雜交，或(3)CTGF的部分片斷或它的一種衍生物。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“誘導(dǎo)”在此所用的意思應(yīng)該是產(chǎn)生、形成、導(dǎo)致產(chǎn)生，或?qū)е滦纬伞?br> 在本說(shuō)明書(shū)中，“誘導(dǎo)劑”的意思應(yīng)該是一種包括蛋白質(zhì)或其它生物物質(zhì)的試劑，它能導(dǎo)致一種特定的最終結(jié)果的發(fā)生或形成(如結(jié)締組織的發(fā)生)。
在本說(shuō)明書(shū)中，術(shù)語(yǔ)“多聚核苷酸”指位于CTGF結(jié)構(gòu)基因的旁側(cè)編碼非翻譯序列的DNA，cDNA和/或RNA。例如，本發(fā)明中的一多聚核苷酸包括與CTGF結(jié)構(gòu)基因相關(guān)的5′調(diào)控核苷酸序列和3′非翻譯序列。在圖1C中圖解說(shuō)明本發(fā)明中包括5′和3′非翻譯區(qū)的一多聚核苷酸。在圖1B中圖解說(shuō)明包括啟動(dòng)子的5′調(diào)控區(qū)。本發(fā)明所關(guān)注的多聚核苷酸的更詳細(xì)描述可在美國(guó)專利號(hào)5,408,040中找到。
在本說(shuō)明書(shū)中，“嚴(yán)格條件”在此處應(yīng)用是指那些雜交條件(1)使用低離子強(qiáng)度和高溫度用于洗脫，例如，50℃，0.015M氯化鈉/0.0015M檸檬酸鈉/0.1％十二烷基硫酸鈉；(2)在雜交過(guò)程中使用諸如甲酰胺這樣的變性劑，如42℃，50％(體積/體積)含0.1％牛血清白蛋白/0.1％聚蔗糖/0.1％聚乙烯吡咯烷酮/50mM pH6.5的磷酸鈉緩沖液的甲酰胺，和750mM氯化鈉，75mM檸檬酸鈉；或(3)在42℃使用50％甲酰胺，5倍SSC(0.75M氯化鈉，0.075M焦磷酸鈉，5倍Denhardt′s液，超聲處理的鮭精DNA(50g/ml)，0.1％十二烷基硫酸鈉，和10％葡聚糖硫酸酯，同時(shí)在42℃用0.2倍SSC和0.1％十二烷基硫酸鈉沖洗。
在本說(shuō)明書(shū)中，“重組表達(dá)載體”指一種在本領(lǐng)域中已知的質(zhì)粒、病毒或其它載體，已通過(guò)CTGF基因序列的插入或整合進(jìn)行過(guò)操作。
在本說(shuō)明書(shū)中，“有療效的”是指CTGF誘發(fā)骨或軟骨形成或傷口愈合有效的劑量。6.附圖簡(jiǎn)述圖1A表示CTGF基因的結(jié)構(gòu)組成。外顯子以盒區(qū)表示，基因中的實(shí)心盒區(qū)為開(kāi)放閱讀框。
圖1B將CTGF啟動(dòng)子和fisp12啟動(dòng)子的核苷酸序列進(jìn)行比較。相同的核苷酸以星號(hào)來(lái)表示。TATA盒和其它的共有序列被表示出來(lái)并涂以陰影。轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)在位置數(shù)+1處。
圖1C表示所有的核苷酸和推導(dǎo)的CTGF結(jié)構(gòu)基因的氨基酸序列以及5′和3′端的非翻譯序列。
圖2表示在新生小鼠的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板中有關(guān)CTGF轉(zhuǎn)錄物表達(dá)的實(shí)驗(yàn)性原位雜交結(jié)果。原位雜交實(shí)驗(yàn)是用如下所述的反義CTGF RNA探針來(lái)進(jìn)行的。增殖區(qū)軟骨細(xì)胞的CTGF基因表達(dá)是強(qiáng)陽(yáng)性，這表明CTGF在軟骨生長(zhǎng)的部位進(jìn)行表達(dá)。
圖3表示在轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎形成過(guò)程中CTGF基因的表達(dá)，其中轉(zhuǎn)基因小鼠是由CTGF啟動(dòng)子和β-半乳糖苷酶的結(jié)構(gòu)基因所構(gòu)建的融合基因所構(gòu)成的。被導(dǎo)入胚胎系的該基因在CTGF表達(dá)的部位表達(dá)β-半乳糖苷酶，并可用免疫組化方法進(jìn)行檢測(cè)，免疫組化方法是將發(fā)育中的轉(zhuǎn)基因小鼠的表達(dá)部分加入能在β-半乳糖苷酶的活性部位沉積藍(lán)色的底物X-gal。圖A是這種轉(zhuǎn)基因小鼠第12天的小鼠胚胎。藍(lán)色染色區(qū)是注定形成Meckel′s軟骨的區(qū)域，該軟骨是要形成的第一塊軟骨。圖B是后肢和爪的照片，它證實(shí)了在跖的生長(zhǎng)區(qū)的長(zhǎng)骨末端和爪中的染色。
圖4提供了C3H10 T 1/2小鼠胚胎干細(xì)胞的培養(yǎng)物中骨和軟骨誘導(dǎo)生成的證據(jù)。C3H10 T 1/2細(xì)胞如方法中所述進(jìn)行培養(yǎng)。細(xì)胞不進(jìn)行處理(圖A)，用5-氮雜胞苷處理(圖B)，用50ng/ml的CTGF處理(圖C)或5-氮雜胞苷處理后再以CTGF處理(圖D)。
圖5說(shuō)明CTGF基因在移植于骨再生部位的愈傷柱中進(jìn)行表達(dá)的Northern印跡分析。
圖6提供了有關(guān)CTGF在人的對(duì)TGF-β有反應(yīng)的成骨細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的證據(jù)。
圖7A-7D說(shuō)明了軟骨形成試驗(yàn)的結(jié)果。
圖7A提供了對(duì)照培養(yǎng)的軟骨形成試驗(yàn)結(jié)果。
圖7B提供了加入5ng/ml TGF-β1的培養(yǎng)物的軟骨形成試驗(yàn)結(jié)果。
圖7C提供了加入5ng/ml TGF-β1和10ng霍亂毒素的培養(yǎng)物的軟骨形成試驗(yàn)結(jié)果。
圖7D提供了加入5ng/ml TGF-β1，10ng/ml霍亂毒素和5ng/mlCTGF的培養(yǎng)物的軟骨形成試驗(yàn)結(jié)果。
圖8A是反映CTGF與NRK細(xì)胞結(jié)合的Scatchard圖。
圖8B是反映CTGF與大鼠成軟骨細(xì)胞進(jìn)行結(jié)合的Scatchard圖。7.發(fā)明詳述7.1制備CTGF的方法編碼CTGF的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，編碼CTGF或它的功能性等價(jià)物的核苷酸序列可以用于制備指導(dǎo)該蛋白質(zhì)或它的功能性等價(jià)物在適當(dāng)宿主細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá)的重組DNA分子。另一選擇是，在嚴(yán)格條件下與CTGF序列的一些部分能夠雜交的核苷酸序列也可用于核酸雜交試驗(yàn)，Southern和Northern印跡分析等。然而在另一方法中，編碼CTGF的DNA分子可以通過(guò)雜交過(guò)程進(jìn)行分離，雜交過(guò)程包括表達(dá)文庫(kù)的抗體篩選，以檢測(cè)共有結(jié)構(gòu)特征。
由于遺傳密碼的固有簡(jiǎn)并性，其它的編碼基本相同的或功能上等價(jià)的氨基酸序列的DNA序列也可被分離出，并可用于本發(fā)明中進(jìn)行CTGF克隆和表達(dá)的實(shí)踐中。這些DNA序列包括那些能夠在嚴(yán)格條件下與人CTGF序列進(jìn)行雜交的序列。
根據(jù)本發(fā)明，可被使用的改變的DNA序列包括產(chǎn)生編碼相同的或一種功能上等價(jià)基因產(chǎn)物的序列的不同核苷酸殘基的缺失、插入或替代?；虍a(chǎn)物本身可能在CTGF序列中包含氨基酸殘基的缺失，插入或替代，這些改變?yōu)榫}默改變，因而產(chǎn)生功能上等價(jià)的蛋白質(zhì)。這樣的氨基酸替代可以根據(jù)所涉及殘基的極性、電荷、溶解性、疏水性、親水性和/或兩親性質(zhì)的相似性來(lái)進(jìn)行。例如，帶負(fù)電荷的氨基酸包括天門冬氨酸和谷氨酸；帶正電荷的氨基酸包括賴氨酸和精氨酸；具有無(wú)電荷的極性頭部基團(tuán)并且具有相似親水值的氨基酸包括下列氨基酸亮氨酸，異亮氨酸，纈氨酸；甘氨酸，丙氨酸；天冬酰胺，谷氨酰胺；絲氨酸，蘇氨酸；苯丙氨酸，酪氨酸。
本發(fā)明的DNA序列可以被設(shè)計(jì)改造以改變蛋白質(zhì)的序列來(lái)獲得包括但不限于改變基因產(chǎn)物加工和表達(dá)過(guò)程的這些變化的各種產(chǎn)物。例如，可用本領(lǐng)域眾所周知的技術(shù)如定點(diǎn)誘變引入突變，比如插入新的限制位點(diǎn)。例如，在酵母等某些表達(dá)系統(tǒng)中，宿主細(xì)胞可能將基因產(chǎn)物過(guò)分糖基化。當(dāng)使用這些表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，可以優(yōu)選改變CTGF的編碼序列以消除任何N-鍵糖基化位點(diǎn)。
CTGF序列可以與某一異源序列連接來(lái)編碼一種融合蛋白。比如，對(duì)多肽文庫(kù)篩選來(lái)說(shuō)，編碼一種表達(dá)能被可購(gòu)買到的商品抗體所識(shí)別的異源表位的嵌合CTGF蛋白是有用。融合蛋白也可被設(shè)計(jì)在CTGF序列和異源蛋白序列(如編碼與PDGF相關(guān)的生長(zhǎng)因子的序列)之間含有一個(gè)切割位點(diǎn)，以使CTGF能從異源部分切割下來(lái)。
CTGF的編碼序列也可以用本領(lǐng)域中眾所周知的化學(xué)方法全部或部分合成。見(jiàn)，如，Caruthers等，1980，《核酸研究討論會(huì)系列》(NucleicAcids Res.Symp.Ser.)7卷215-233頁(yè)；Crea和Horn，1980，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)9卷10期2331頁(yè)；Matteucci和Caruthers，1980，《四面體通訊》(Tetrahedron Letters)21卷719頁(yè)；和Chow及Kempe，1981，《核酸研究》(Nucleic Acids Res.)9卷12期2807-2817頁(yè)。另一種方法是，蛋白質(zhì)本身可用全部或部分合成CTGF氨基酸序列的化學(xué)方法來(lái)制備。例如，肽可用固相技術(shù)合成，從樹(shù)脂上分離下來(lái)，然后用制備高效液相層析進(jìn)行純化。見(jiàn)，如，Creighton，1983，《蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和分子原理》(Proteins Structures And Molecular Principles)，W.H.Freeman and CO.，N.Y.50-60頁(yè)。合成肽的組成可用氨基酸分析或測(cè)序進(jìn)行證實(shí)。見(jiàn)，如，Edman降解過(guò)程，見(jiàn)，Creighton，1983，《蛋白質(zhì)，結(jié)構(gòu)和分子原理》(Proteins，Structures and Molecular Principles)，W.H.Freeman and CO.，N.Y.34-49頁(yè)。
本發(fā)明包括的核酸序列的更詳細(xì)描述和鑒定這些序列的方法可在美國(guó)專利系列號(hào)5,408,040中找到，該專利號(hào)在此引入作為參考。
CTGF的表達(dá)。為了表達(dá)具有生物活性的CTGF，上文中編碼該蛋白質(zhì)或如上所述的功能性等價(jià)物的核苷酸序列被插入到一個(gè)適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，即含有被插入的編碼序列進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和翻譯所必須元件的一種載體。
更具體而言，為本領(lǐng)域的技術(shù)人員所熟知的方法可用于構(gòu)建含有CTGF序列和適當(dāng)轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控信號(hào)的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)，合成技術(shù)和體內(nèi)重組/遺傳重組。見(jiàn)，如，以下書(shū)中所述的技術(shù)，Maniatis等，1989，《分子克隆》(Molecular Cloning)實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，N.Y.和Ausubel等，1989，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，Greene PublishingAssociates and Wiley Interscience，N.Y.。
多種宿主表達(dá)載體系統(tǒng)可用來(lái)表達(dá)CTGF編碼序列。這些系統(tǒng)包括但不限于細(xì)菌等微生物，用含CTGF編碼序列的重組噬菌體DNA、質(zhì)粒DNA或粘粒DNA表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；酵母，包括巴斯德畢赤酵母和多形漢遜酵母，用含CTGF編碼序列的重組表達(dá)載體進(jìn)行轉(zhuǎn)化；用含CTGF編碼序列的重組病毒表達(dá)載體(如，桿狀病毒)所轉(zhuǎn)染的昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)；植物細(xì)胞系統(tǒng)，用重組病毒表達(dá)載體(如花椰菜花斑病病毒，CaMV；煙草花葉病毒，TMV)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，或用含CTGF編碼序列的重組質(zhì)粒表達(dá)載體(如，Ti質(zhì)粒)進(jìn)行轉(zhuǎn)化；或用重組病毒表達(dá)載體(如，腺病毒，痘病毒，人腫瘤細(xì)胞(如HT-1080))轉(zhuǎn)染的動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)，包括已工程改造的含多拷貝、在雙微染色體上穩(wěn)定擴(kuò)增(CHO/dhfr)或不穩(wěn)定擴(kuò)增CTGF DNA的細(xì)胞系(如，小鼠細(xì)胞系)。正如此處所用，可以理解術(shù)語(yǔ)“宿主表達(dá)載體系統(tǒng)”以及更廣泛地，“宿主細(xì)胞”包括宿主細(xì)胞或宿主表達(dá)載體系統(tǒng)的任何子代?？梢赃M(jìn)一步理解盡管可能不是所有子代都與親代細(xì)胞相同，因?yàn)樵趶?fù)制中可能發(fā)生突變，但這些子代包括在本發(fā)明的范圍之內(nèi)。
這些系統(tǒng)的表達(dá)元件在它們的強(qiáng)度和特異性方面有變化。根據(jù)所用的宿主/載體系統(tǒng)，任何可使用的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件，包括組成性和誘導(dǎo)性啟動(dòng)子，都可用于表達(dá)載體。例如，當(dāng)在細(xì)菌系統(tǒng)中克隆時(shí)，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子可被使用，誘導(dǎo)性啟動(dòng)子如噬菌體λ的pL，plac，ptrp，ptac(ptrp-lac雜合啟動(dòng)子)等；當(dāng)在昆蟲(chóng)細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，桿狀病毒多角體蛋白啟動(dòng)子等啟動(dòng)子可被使用；當(dāng)在植物細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，來(lái)自植物細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如，熱激啟動(dòng)子；RUBISCO小亞單位的啟動(dòng)子；葉綠素a/b結(jié)合蛋白的啟動(dòng)子)或來(lái)自植物病毒的啟動(dòng)子(如，CaMV的35S RNA啟動(dòng)子；TMV衣殼蛋白啟動(dòng)子)均可被使用；當(dāng)在哺乳細(xì)胞系統(tǒng)中克隆時(shí)，來(lái)自哺乳細(xì)胞基因組的啟動(dòng)子(如金屬硫蛋白啟動(dòng)子)或來(lái)自哺乳動(dòng)物病毒的啟動(dòng)子(如，腺病毒晚期啟動(dòng)子；痘病毒7.5K啟動(dòng)子)均可被使用；當(dāng)制備含多拷貝CTGF DNA的細(xì)胞系時(shí)，可使用SV40-、BPV-和EBV-為基礎(chǔ)的具有適當(dāng)選擇標(biāo)志的載體。
在細(xì)菌系統(tǒng)中，根據(jù)表達(dá)的CTGF的用途，許多表達(dá)載體因其優(yōu)點(diǎn)而被選擇。例如，在細(xì)菌中用于表達(dá)的適合載體包括T7為基礎(chǔ)的載體，如Rosenberg等所述，1987，《基因》(gene)56卷125頁(yè)。進(jìn)一步舉例，當(dāng)需要大量CTGF表達(dá)以進(jìn)行肽文庫(kù)篩選時(shí)，可能需要指導(dǎo)易于純化的高產(chǎn)量蛋白質(zhì)表達(dá)的載體。這些載體包括但不限于大腸桿菌表達(dá)載體pUR278(Ruther等，1983，EMBOJ.2卷1791頁(yè))，在這個(gè)載體上CTGF編碼序列與Lac Z編碼區(qū)符合讀框地連接在載體上，結(jié)果產(chǎn)生雜合AS-lac Z蛋白質(zhì)；pIN載體(Inouye & Inouye，1985，《核酸研究》(Nudeic Acids Res.)13卷3101-3109頁(yè)；Van Heeke &Schuster，1989，《生物與化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)264卷5503-5509頁(yè))等。pGEX載體也可用于表達(dá)外源多肽，如具有谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶(GST)的CTGF。總之，這些融合蛋白是可溶性的并且易于從裂解的細(xì)胞中純化出來(lái)，純化時(shí)吸附于谷胱甘肽-瓊脂糖珠，隨后在游離谷胱甘肽的存在下洗脫。pGEX載體被設(shè)計(jì)成含有凝血酶或因子X(jué)a蛋白酶的酶解位點(diǎn)，以使克隆的感興趣多肽可從GST部分切割下來(lái)。
更一般地，當(dāng)宿主是原核細(xì)胞時(shí)，能夠接受DNA的感受態(tài)細(xì)胞可用以下處理的細(xì)胞制備在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后收獲細(xì)胞，隨后用本領(lǐng)域中眾所周知的方法氯化鈣法，或另外的方法，用氯化鎂或氯化銣處理。
在宿主是真核細(xì)胞時(shí)，可采用多種DNA轉(zhuǎn)移的方法。它們包括用磷酸鈣沉淀的DNA轉(zhuǎn)染，包括微注射的常規(guī)機(jī)械方法，包裹在脂質(zhì)體中的質(zhì)粒插入，或采用病毒載體。真核細(xì)胞也可用編碼本發(fā)明多肽的DNA序列與另一編碼一種連擇性表型的外源DNA，比如單純皰疹胸苷激酶基因進(jìn)行共轉(zhuǎn)化。另一方法是采用真核細(xì)胞病毒載體，如猿猴病毒40(SV40)或牛乳頭瘤病毒，來(lái)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染或轉(zhuǎn)化真核生物細(xì)胞并表達(dá)蛋白質(zhì)。見(jiàn)，《真核生物病毒載體》(Eukaryotic Viral Vectors)，1992，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，Gluzman，Ed.)。真核宿主細(xì)胞包括酵母，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，昆蟲(chóng)細(xì)胞和植物細(xì)胞。
在酵母中，可采用許多含組成性或誘導(dǎo)性啟動(dòng)子的載體。綜述見(jiàn)，《現(xiàn)代分子生物學(xué)方法》(Current Protocols in Molecular Biology)，2卷，1988，Ausubel等，編，Greene Publish.Assoc.& Wiley Interscience，13章；Grant等，1987，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，Wu&Grossman編，Acad.Press，N.Y.，153卷516-544頁(yè)；Glover，1986，《DNA克隆》(DNA Cloning)，II卷，IRL Press，Wash，D.C.，3章；Bitter，1987，《在酵母中的異源基因表達(dá)》(HeterologousGene Expression in Yeast)，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymology)，Berger & Kimmel編，Acad.Press，N.Y.，152卷673- 684；和《酵母的分子生物學(xué)》(The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces)，1982，strathern等，編，Cold Spring Harbor Press，I和II卷。例如，已報(bào)道了許多在酵母中進(jìn)行外源基因表達(dá)的穿梭載體。Heinemann.等，1989，《自然》(Nature)340卷205頁(yè)；Rose等，1987，《基因》(Gene)60卷237頁(yè)。
在采用植物表達(dá)載體的情況下，CTGF編碼序列的表達(dá)可以由許多啟動(dòng)子中的任何一個(gè)來(lái)啟動(dòng)。如，可采用CaMV的35S RNA和19S RNA啟動(dòng)子(Brisson等，1984，《自然》(Nature)310卷511-514頁(yè))，或TMV的衣殼蛋白啟動(dòng)子(Takamatsu等，1987，EMBOJ.6卷307-311頁(yè))等病毒啟動(dòng)子。另一種方法，可采用植物啟動(dòng)子，如RUBISCO小亞單位的啟動(dòng)子(Coruzzi等，1984，EMBOJ.3卷1671-1680頁(yè)；Broglie等，1984，《科學(xué)》(Science)224卷838-843頁(yè))；或熱激啟動(dòng)子，如黃豆hsp17.5-E或hsp17.3-B(Gurley等，1986，《分子細(xì)胞生物學(xué)》(Mol.Cell.Biol.)6卷559-565頁(yè))。這些結(jié)構(gòu)可通過(guò)Ti質(zhì)粒，Ri質(zhì)粒，植物病毒載體，直接的DNA轉(zhuǎn)化，微注射，電穿孔等導(dǎo)入植物細(xì)胞。要看這些技術(shù)的綜述，見(jiàn)，如，Weissbach &Weissbach，1988，《植物分子生物學(xué)方法》(Methods for Plant MolecularBiology)Academic Press，N.Y.Section VIII，421-463頁(yè)；Grierson& Corey，1988，《植物分子生物學(xué)》(Plant Molecular Biology)，2版，Blackie，London，7-9章。
在昆蟲(chóng)系統(tǒng)中，另一種表達(dá)系統(tǒng)可用來(lái)表達(dá)CTGF。在其中一個(gè)系統(tǒng)中，用桿狀病毒作為表達(dá)外源基因的載體。然后病毒在昆蟲(chóng)細(xì)胞中生長(zhǎng)。CTGF的編碼序列可被克隆進(jìn)病毒的非必需區(qū)(如多角體蛋白基因)，并且置于桿狀病毒啟動(dòng)子的控制下。這些重組病毒然后被用于感染插入的基因能進(jìn)行表達(dá)的昆蟲(chóng)細(xì)胞。見(jiàn)，如，Smith等，1983，《病毒學(xué)雜志》(J.Virol.)46卷584頁(yè)；Smith，美國(guó)專利號(hào)4,215,051。
在哺乳動(dòng)物的宿主細(xì)胞中，可以使用許多以病毒為基礎(chǔ)的表達(dá)系統(tǒng)。在腺病毒被用作表達(dá)載體的情況下，CTGF編碼序列可被連接到腺病毒的轉(zhuǎn)錄/翻譯調(diào)控復(fù)合體上，如，晚期啟動(dòng)子和三聯(lián)前導(dǎo)序列。然后通過(guò)體外或體內(nèi)重組可以將該嵌合基因插入到腺病毒的基因組中。插入到病毒基因組的非必需區(qū)(如，E1或E3區(qū))將產(chǎn)生可以存活的并且在受感染的宿主中能表達(dá)CTGF的一種重組病毒。見(jiàn)，如，Logan & Shenk，1984，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))81卷3655-3659頁(yè)。另一種方法，也可以用痘病毒7.5K啟動(dòng)子。見(jiàn)，如，Mackett等，1982，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci(USA))79卷7415-7419頁(yè)；Mackett等，1984，《病毒學(xué)雜志》(J，Virol.)49卷857-864頁(yè)；Panicali等，1982，《國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.)79卷4927-4931頁(yè)。
在另一實(shí)施方案中，CTGF序列可以表達(dá)在已經(jīng)用磷酸鈣沉淀和新霉素抗性基因穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的人腫瘤細(xì)胞如HT-1080中。再一個(gè)實(shí)施方案中，在許多種哺乳動(dòng)物細(xì)胞中(包括COS，BHK293和CHO細(xì)胞)可使用pMSXND表達(dá)載體或類似表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)。Lee和Nathans，1988，《生物和化學(xué)雜志》(J.Biol.Chem.)263卷3521頁(yè)。
被插入的CTGF編碼序列要進(jìn)行有效翻譯也需要特定的起始信號(hào)。這些信號(hào)包括ATG起始密碼子和相鄰的序列。在完整的CTGF基因，包括它自己的起始密碼子和相鄰序列，被插入到適當(dāng)表達(dá)載體中的情況下，不需要另外的翻譯控制信號(hào)。然而，在只有一部分CTGF編碼序列被插入的情況下，必須提供外源的翻譯控制信號(hào)，包括ATG起始密碼子。進(jìn)一步講，起始密碼子必須與CTGF編碼序列的閱讀框相協(xié)調(diào)以確保完整插入序列的翻譯。這些外源翻譯調(diào)控信號(hào)和起始密碼子可有多種來(lái)源，可以是天然存在的和合成的。通過(guò)同時(shí)包含適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)錄增強(qiáng)子元件，轉(zhuǎn)錄終止子等，可以增強(qiáng)表達(dá)的效率。見(jiàn)如，Bitter等，1987，《酶學(xué)方法》(Methods in Enzymol.)153卷516-544頁(yè)。
另外，可以選擇能夠調(diào)節(jié)插入序列的表達(dá)或以所需要的特定方式對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行修飾或加工的一種宿主細(xì)胞株。對(duì)蛋白質(zhì)的功能來(lái)說(shuō)，這種蛋白質(zhì)產(chǎn)物的修飾(如，糖基化)和加工(如，裂解)可能是重要的。不同的宿主細(xì)胞對(duì)蛋白質(zhì)的翻譯后加工和修飾具有特征性的和特定的機(jī)制。可以選擇適當(dāng)?shù)募?xì)胞系或宿主系統(tǒng)以確保對(duì)所表達(dá)的外源蛋白質(zhì)進(jìn)行正確的修飾和加工。為了達(dá)到該目的，可以采用含有對(duì)初級(jí)轉(zhuǎn)錄物進(jìn)行正確加工，對(duì)基因產(chǎn)物進(jìn)行糖基化和磷酸化的細(xì)胞機(jī)制的真核宿主細(xì)胞。這樣的哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞包括但不限于CHO、VERO、BHK、Hela、COS、MDCK、293、WI38、HT-1080等。
為了達(dá)到重組蛋白質(zhì)的長(zhǎng)期、高產(chǎn)量表達(dá)，優(yōu)選穩(wěn)定表達(dá)。例如，穩(wěn)定表達(dá)CTGF的細(xì)胞系可以利用生物工程獲得?？梢杂糜蛇m當(dāng)表達(dá)調(diào)控元件(如，啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、序列、轉(zhuǎn)錄終止子、多聚腺苷酸位點(diǎn)，等)進(jìn)行調(diào)控的CTGF DNA和一種選擇標(biāo)志對(duì)宿主細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)化，而不是用含有病毒復(fù)制起點(diǎn)的表達(dá)載體。引入外源DNA之后，可以將工程改造的細(xì)胞在富集培養(yǎng)基中生長(zhǎng)1-2天，然后轉(zhuǎn)入一種選擇培養(yǎng)基中。在重組質(zhì)粒中的選擇標(biāo)志可以提供對(duì)選擇的抗性，并且允許質(zhì)粒穩(wěn)定整合到細(xì)胞染色體中，然后細(xì)胞生長(zhǎng)形成以后能被克隆和分裂到細(xì)胞系中的整合位點(diǎn)。
許多選擇系統(tǒng)可被采用，包括但不限于單純皰疹病毒胸苷激酶(Wigler，等，1977，《細(xì)胞》(Cell)11卷223頁(yè))，次黃嘌呤-鳥(niǎo)嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Szybalska & Szybalski，1962，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))48卷2026頁(yè))，以及腺嘌呤磷酸核糖基轉(zhuǎn)移酶(Lowy，等，1980，《細(xì)胞》(Cell)22卷817頁(yè))?；蚩煞謩e使用于tk-、hgprt-或aprt-細(xì)胞。
再者，抗代謝物抗性可被用作以下幾種選擇的基礎(chǔ)，能提供氨甲喋呤抗性的dhfr基因(Wigler，等1980，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))77卷3567頁(yè)；O′Hare，等，1981，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))78卷1527頁(yè))；能提供霉酚酸抗性的gpt基因(Mulligan & Berg，1981，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))78卷2072頁(yè))；能提供氨基糖苷G-418抗性的neo基因(Colberre-Garapin，等，1981，《分子生物學(xué)雜志》(J.Mol.Biol)150卷1頁(yè))；和能提供潮霉素抗性的hygro基因(Santerre，等，1984，《基因》(Gene)30卷147頁(yè))。近來(lái)，另外的可選擇基因已被描述，即能使細(xì)胞利用吲哚代替色氨酸的trpB，能使細(xì)胞利用組氨醇代替組氨酸的hisD(Hartman &Mulligan，1988，《美國(guó)國(guó)家科學(xué)院學(xué)報(bào)》(Proc.Natl.Acad.Sci.(USA))85-卷8047頁(yè))，和能提供對(duì)鳥(niǎo)氨酸脫羧酶抑制劑2-(二氟甲基)-DL-鳥(niǎo)氨酸(DFMO)抗性的ODC(鳥(niǎo)氨酸脫羧酶)(McConlogue，1987，見(jiàn)；《現(xiàn)代分子生物學(xué)通訊》(Current Communications in MolecularBiology)，冷泉港實(shí)驗(yàn)室)。
本發(fā)明中的在宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的多肽可通過(guò)任何一種常規(guī)方法進(jìn)行分離和純化，諸如，例如制備層析法分離和免疫法分離，比如那些涉及使用單克隆抗體或多克隆抗體的方法。
7.2表達(dá)CTGF的轉(zhuǎn)染體或轉(zhuǎn)化體的鑒定至少可以通過(guò)四種普通方法對(duì)含有編碼序列并表達(dá)出生物活性基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞進(jìn)行鑒定(a)DNA-DNA或DNA-RNA雜交；(b)存在或缺乏“標(biāo)記”基因的功能；(c)根據(jù)宿主細(xì)胞中CTGF轉(zhuǎn)錄物mRNA表達(dá)的測(cè)定來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)錄的水平；和(d)根據(jù)一種試驗(yàn)或它的生物活性的測(cè)定來(lái)檢測(cè)基因產(chǎn)物。
在第一種方法中，已插入表達(dá)載體的CTGF編碼序列的存在可用DNA-DNA或DNA-RNA雜交進(jìn)行檢測(cè)，雜交采用含有分別與CTGF編碼序列，或部分序列或它的衍生序列同源的核苷酸序列的探針。
在第二種方法中，根據(jù)某些“標(biāo)記”基因功能(如，抗抗生素，抗氨甲喋呤，轉(zhuǎn)化表型，桿狀病毒中包涵體的形成，等。)的存在或缺乏對(duì)重組表達(dá)載體/宿主系統(tǒng)進(jìn)行鑒定和選擇。例如，在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，CTGF編碼序列插入到載體的抗新霉素標(biāo)記基因序列中，然后含CTGF編碼序列的重組體由于缺乏標(biāo)記基因功能而被鑒定出。另一種方法，標(biāo)記基因和CTGF序列可一前一后放在控制CTGF編碼序列進(jìn)行表達(dá)的相同或不同啟動(dòng)子的控制下。應(yīng)答于誘導(dǎo)或選擇的標(biāo)記基因的表達(dá)表明有CTGF編碼序列的表達(dá)。
在第三種方法中，CTGF編碼區(qū)的轉(zhuǎn)錄活性可通過(guò)雜交試驗(yàn)進(jìn)行評(píng)估。例如，RNA可以提取出來(lái)，然后用與CTGF編碼序列或它的特定部分同源的探針進(jìn)行Northern印跡分析。另一種方法，宿主細(xì)胞的所有核酸可以提取出來(lái)，然后與這樣的探針進(jìn)行雜交。
第四種方法包括CTGF基因產(chǎn)物生物活性或免疫活性的檢測(cè)。許多試驗(yàn)可用于檢測(cè)CTGF活性，這些試驗(yàn)包括但不限于在美國(guó)專利號(hào)5,408,040中所描述的那些。
7.3治療適應(yīng)癥本發(fā)明的方法，化合物和制劑每一個(gè)都是針對(duì)于治療骨、軟骨或其它諸如皮膚和肌肉等器官中結(jié)締組織增生不足有關(guān)的紊亂、疾病或失調(diào)，針對(duì)于治療需要骨或軟骨形成的紊亂、疾病或失調(diào)。
這些疾病、紊亂或失調(diào)包括各種創(chuàng)傷損傷后軟骨或骨缺損的修復(fù)或包括關(guān)節(jié)炎、骨質(zhì)疏松和其它的骨骼疾病、瘢痕增生、燒傷、和血管增生的疾病。因?yàn)榧膊∈怯捎趽p傷部位的成纖維細(xì)胞、干細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、成骨細(xì)胞或成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)反應(yīng)不良引起的，所以加入能刺激這些細(xì)胞生長(zhǎng)的生物活性劑是有益的。
CTGF的另一重要應(yīng)用可以是用在再移植之前的用以擴(kuò)增從一個(gè)個(gè)體中分離出來(lái)的干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞的培養(yǎng)系統(tǒng)中。以相似的過(guò)程，CTGF加入到被用作移植物的干細(xì)胞或軟骨細(xì)胞中以利于刺激這些細(xì)胞在移植部位的擴(kuò)增和分化。CTGF也可以加入到含有軟骨或骨的移植物中以幫助刺激生長(zhǎng)。
另一治療適應(yīng)癥是針對(duì)于給有需要的病人使用CTGF來(lái)促進(jìn)傷口愈合。在皮膚傷口的正常愈合過(guò)程中需要血小板衍生生長(zhǎng)因子(PDGF)和其它的生長(zhǎng)因子，如CTGF。在皮膚傷口修復(fù)愈合或需要促進(jìn)正常愈合機(jī)制的情況下，如，燒傷，本發(fā)明的CTGF多肽治療是有價(jià)值的。使用CTGF蛋白來(lái)促進(jìn)傷口愈合的一個(gè)重要好處在于該分子高比例的半胱氨酸殘基。與PDGF和其它的與傷口愈合有關(guān)的生長(zhǎng)因子相比，CTGF，或它的功能片斷更穩(wěn)定，對(duì)蛋白酶的降解作用敏感性低。
優(yōu)選本發(fā)明的試劑是TGF-β與CTGF聯(lián)合使用，然而，TGF-β家族的其它成員通過(guò)誘導(dǎo)CTGF在促進(jìn)傷口愈合方面可能也是有效的。本發(fā)明的組合物有助于愈合傷口，部分是通過(guò)促進(jìn)結(jié)締組織生長(zhǎng)而實(shí)現(xiàn)的。將純化的CTGF和TGF-β聯(lián)合用于藥學(xué)上可接受的載體物質(zhì)，如，惰性膠或液體，進(jìn)行組合物的制備。
本發(fā)明所關(guān)注的與傷口愈合有關(guān)的治療適應(yīng)癥包括預(yù)期傷口(如外科手術(shù)所致的傷口)，以及非預(yù)期傷口(如創(chuàng)傷引起的傷口)。
7.4.藥用制劑和給藥途徑本發(fā)明的分子單獨(dú)或以由一種或多種分子與適當(dāng)?shù)妮d體或賦形劑混合所組成的藥用組合物形式施用于有需要的病人來(lái)治療或緩解各種各樣的疾病。另一種可選擇方法，因?yàn)镃TGF是由都在骨或軟骨形成和受傷部位存在的內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞所產(chǎn)生的，所以能刺激CTGF分泌的試劑可加入到用于促進(jìn)骨或軟骨誘導(dǎo)或傷口愈合的組合物中。優(yōu)選本發(fā)明的試劑是轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β。本發(fā)明的組合物有助于愈合傷口，部分是通過(guò)促進(jìn)結(jié)締組織的增生來(lái)實(shí)現(xiàn)的。在另一實(shí)施方案中，CTGF可以與被認(rèn)為能夠促進(jìn)結(jié)締組織形成的蛋白質(zhì)或化合物聯(lián)合使用。
無(wú)論組合物只包括CTGF還是包括CTGF和其它的試劑作為活性成分，這樣的組合物是通過(guò)將純化的CTGF和TGF-β結(jié)合于一種藥學(xué)上可接受的載體物質(zhì)，如，惰性膠或液體，來(lái)進(jìn)行制備的。
有療效的劑量進(jìn)一步指化合物足以引起癥狀緩解的那個(gè)劑量。本申請(qǐng)用以化合物制備和施用的技術(shù)可見(jiàn)于“雷明頓制藥科學(xué)”，MackPublishing Co.，Easton，PA，最新版。
7.4.1.給藥途徑適當(dāng)?shù)慕o藥途徑可以包括，比如，口服、直腸、經(jīng)粘膜或腸道用藥；非腸道用藥，包括肌肉內(nèi)，皮下，髓內(nèi)注射，以及鞘內(nèi)、直接心室內(nèi)、靜脈內(nèi)、腹膜腔內(nèi)、鼻內(nèi)或眼內(nèi)注射。
另一種用藥方法，病人可局部使用化合物而不是全身用藥，比如，直接將化合物注射入需要CTGF的部位，常以一種儲(chǔ)存或持續(xù)釋放的制劑形式。
再進(jìn)一步，病人可以采用靶向藥物運(yùn)送系統(tǒng)用藥，如，以用諸如靶向軟骨的一種特異抗體所包被的脂質(zhì)體形式。這樣的脂質(zhì)體將靶向患病組織并被患病組織選擇性地吸收。
7.4.2.組合物/制劑本發(fā)明的藥用組合物可以已知的方法進(jìn)行制備，如，通過(guò)常規(guī)混合、溶解、顆?；?、制備糖錠劑、研碎、乳化、用膠囊包被、夾裹(entrapping)或凍干過(guò)程。
這樣，根據(jù)本發(fā)明制備的進(jìn)行應(yīng)用的藥用組合物可以通過(guò)常規(guī)方法進(jìn)行配制，采用一種或多種含有賦形劑和佐劑的生理學(xué)可接受的載體，這些賦形劑和佐劑有利于活性分子加工成能在藥學(xué)上應(yīng)用的制劑。合適的制劑依賴于所選用的給藥途徑。
用于注射時(shí)，本發(fā)明的藥劑可制備成水溶液，優(yōu)選采用生理相容的緩沖液如Hank′s溶液，Ringer′s溶液，或生理鹽緩沖液。用于經(jīng)粘膜應(yīng)用時(shí)，在制劑中使用適合于將被滲透的屏障的滲透劑。這樣的滲透劑在該領(lǐng)域中是普遍知曉的。
對(duì)于口服用藥，化合物易于通過(guò)組合活性化合物和本領(lǐng)域中熟知的藥學(xué)上可接受的載體進(jìn)行配制。這些載體能使本發(fā)明的化合物制備成欲治療的病人可以口服的片劑，丸劑，糖錠劑，膠囊，液體，膠，糖漿，膏劑，懸液等。用于口服的藥用制劑可采用固體賦形劑，如果必要，加入適當(dāng)佐劑之后，任選是否研磨所形成的混合物，以及加工這些顆粒的混合物，以獲得片劑或糖錠劑核心。合適的賦形劑尤其是填充劑，如糖，包括乳糖，蔗糖，甘露醇，或山梨醇；纖維素制品如，例如，玉米淀粉，小麥淀粉，大米淀粉，馬鈴薯淀粉，明膠，黃蓍樹(shù)膠，甲基纖維素，羥丙基甲基-纖維素，羧甲基纖維素鈉，和/或聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如果必要，也可加入裂解劑，如交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮，瓊脂，或藻酸或它的鹽，如藻酸鈉。
糖錠劑核心可包被適當(dāng)?shù)耐庖?。為了達(dá)到此目的，可使用濃縮糖溶液，糖溶液可任選含有阿拉伯樹(shù)膠，滑石粉，聚乙烯吡咯烷酮，聚羰乙烯凝膠，聚乙二醇，和/或二氧化鈦，漆溶液，和適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑或溶劑混合物。染料或色素可加入片劑或糖錠劑的包衣中，用以鑒別或標(biāo)明活性化合物劑量的不同組合。
能口服應(yīng)用的藥用制劑包括由明膠組成的推入配合的膠囊，以及由明膠和一種諸如甘油或山梨醇等成形劑組成的密閉軟膠囊。推入配合的膠囊可包含與乳糖等填充劑，淀粉等粘合劑，和/或諸如滑石粉或硬脂酸鎂等潤(rùn)滑劑相混合的活性成分，并任選地與穩(wěn)定劑混合。在軟膠囊中，活性化合物可溶解或懸浮在適當(dāng)液體中，例如脂肪油，液體石蠟，或液態(tài)聚乙二醇。另外，也可加入穩(wěn)定劑。所有用于口服的制劑應(yīng)該制成適合這種用藥的劑量。
對(duì)于頰部用藥，組合物可采用以常規(guī)方法制備的片劑或錠劑形式。
對(duì)于吸入用藥，以來(lái)自加壓的器皿或噴霧器的氣霧劑噴霧的形式可以方便地傳遞根據(jù)本發(fā)明的適合應(yīng)用的化合物，噴霧時(shí)同時(shí)使用一種合適的推進(jìn)劑，如，二氯二氟甲烷，三氯氟甲烷，二氯四氟乙烷，二氧化碳或其它合適的氣體。在加壓氣霧劑的情況下，劑量單位可通過(guò)一個(gè)傳遞已計(jì)量氣霧的閥門來(lái)進(jìn)行測(cè)定。可以制備含有化合物的粉末和諸如乳糖或淀粉等適當(dāng)粉末主劑，用在吸霧器或吹入器中的明膠膠囊或其它膠囊和子彈狀制劑。
這些分子可以被配制成適合通過(guò)注射進(jìn)行非腸道用藥，如，藥團(tuán)注射或連續(xù)輸注。含有添加防腐劑的注射用制劑可以單位劑量形式表示，如，以安瓿或多劑量容器的形式。組合物可采用諸如油或水作為載體的懸液、溶液或乳劑等形式，并且可含有配制(formulatory)劑，如懸浮，穩(wěn)定和/或分散劑。
非腸道用藥的藥用制劑包括活性化合物以水溶形式的水溶液。另外，活性化合物的懸浮液可制備成適當(dāng)?shù)挠托宰⑸鋺乙?。適當(dāng)?shù)挠H脂溶劑或載體包括芝麻油等脂肪油，或合成脂肪酸酯，如油酸乙酯或甘油三酯，或脂質(zhì)體。水性注射懸液可含有能增加懸液粘性的物質(zhì)，如羧甲基纖維素鈉，山梨醇或葡聚糖。懸液也可任選地含有適當(dāng)?shù)姆€(wěn)定劑或能增加化合物溶解度的試劑以允許制備高濃縮的溶液。
另一種選擇方法，活性成分在應(yīng)用前可以粉末形式與適當(dāng)?shù)妮d體，如，無(wú)熱原的無(wú)菌水，進(jìn)行混合。
化合物也可配制成直腸用組合物，如栓劑或潴留灌腸劑，例如，含諸如可可緩沖液或其它甘油酯等常規(guī)栓劑主劑的制劑。
除了上述制劑外，化合物也可制成一種儲(chǔ)存制劑。這樣的長(zhǎng)效制劑可通過(guò)植入(如皮下或肌肉內(nèi))或肌肉內(nèi)注射進(jìn)行使用。例如，化合物可以這樣制備，與適當(dāng)?shù)亩嗑垠w或疏水性物質(zhì)(如一種可接受的油中的乳劑)或離子交換樹(shù)脂，或輕度可溶的衍生物，如一種輕度可溶性的鹽，共同來(lái)制備。
適用于本發(fā)明中疏水分子的藥用載體是一種共溶系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括芐醇、一種非極性表面活性劑，一種可與水混合的有機(jī)多聚體，和一種水相。共溶系統(tǒng)可以是VPD共溶系統(tǒng)。VPD是一種溶液，由3％w/v的芐醇、8％w/v的非極性表面活性劑聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80和65％w/v的聚乙二醇300用無(wú)水乙醇配制而成。VPD共溶系統(tǒng)(VPD5W)由5％的水溶右旋糖1∶1稀釋VPD得到。這個(gè)共溶系統(tǒng)很好地溶解疏水性化合物，并且它本身對(duì)全身用藥是低毒性的。當(dāng)然，在不破壞它的溶解性和毒性特點(diǎn)的情況下，共溶系統(tǒng)的各部分比例可以發(fā)生很大變化。更進(jìn)一步，共溶的各成分可以發(fā)生變化例如，可用其它低毒的非極性表面活性劑代替聚氧乙烯山梨醇脂肪酸酯80；聚乙二醇的分子量可以改變；其它的生物相容性多聚體可代替聚乙二醇，如聚乙烯吡咯烷酮；以及其它的糖或多糖代替右旋糖。
另一種選擇方法，對(duì)于疏水分子也可采用其它的運(yùn)載系統(tǒng)。脂質(zhì)體和乳劑都是眾所周知的疏水性藥物的運(yùn)載體或載體的例子。諸如二甲基亞砜等某些有機(jī)溶劑盡管有更大的毒性，但也可被采用。另外，可用持久釋放系統(tǒng)運(yùn)載化合物，如含有治療劑的固體疏水多聚體的半滲透性基質(zhì)。已發(fā)展了各種各樣的持久釋放材料并為本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知。持久釋放膠囊根據(jù)它們的化學(xué)性質(zhì)，可數(shù)周到100多天釋放化合物。根據(jù)治療劑的化學(xué)性質(zhì)和生物穩(wěn)定性，也可采用另外的保持蛋白質(zhì)穩(wěn)定的策略。
藥用組合物也可包括適當(dāng)?shù)墓滔嗷蚰z載體或賦形劑。這樣的載體或賦形劑的例子包括但不限于碳酸鈣，磷酸鈣，各種糖，淀粉，纖維素衍生物，明膠，和諸如聚乙二醇等多聚體。
7.4.3有效劑量適合用于本發(fā)明的藥用組合物包括那些含有效量活性成分以達(dá)到它預(yù)期目的組合物。更具體地講，有療效量意思是有效阻止或緩解受治療者所具有的癥狀的劑量。有效量的確定完全處于本領(lǐng)域的技術(shù)人員的能力范圍之內(nèi)，尤其是根據(jù)此處所提供的詳細(xì)內(nèi)容。
對(duì)于用于本發(fā)明的方法中的任一化合物，它的有療效量可從細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中初步評(píng)估。例如，在動(dòng)物模型中可用公式表示出一個(gè)劑量以獲得包括在細(xì)胞培養(yǎng)中所測(cè)定的IC50(即，所檢測(cè)化合物獲得最大CTGF活性一半的濃度)的循環(huán)濃度范圍。這些資料可用來(lái)更加準(zhǔn)確地確定人的有效劑量。
有療效量指能引起病人的癥狀緩解或生存期延長(zhǎng)的分子的劑量。這些分子的毒性和治療效果可通過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)或?qū)嶒?yàn)動(dòng)物中標(biāo)準(zhǔn)的藥學(xué)方法進(jìn)行測(cè)定。如，用于測(cè)定LD50(50％的受試對(duì)象死亡的劑量)和ED50(在50％的受試對(duì)象中治療有效的劑量)的方法。毒性作用和療效之間的劑量比是治療指數(shù)，并且它可表達(dá)成LD50和ED50之間的比。優(yōu)選能表現(xiàn)出高治療指數(shù)的分子。從這些細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)和動(dòng)物研究中所獲得的數(shù)據(jù)可用于制定應(yīng)用于人的劑量范圍。優(yōu)選這些分子的劑量在包括ED50的幾乎沒(méi)有或沒(méi)有毒性的循環(huán)濃度范圍之內(nèi)。劑量可根據(jù)所采用的劑量形式和用藥途徑在這個(gè)范圍之內(nèi)變化。每個(gè)醫(yī)生可根據(jù)病人的情況選擇確切的制劑，用藥途徑和劑量。見(jiàn)，如，F(xiàn)ingl等，1975，《治療的藥學(xué)基礎(chǔ)》(The Pharmacological Basis of Therapeutics)，第一章第一頁(yè)。
根據(jù)每個(gè)病人調(diào)整劑量和用藥間隔以使得活性部分的血漿濃度足以保持CTGF的誘導(dǎo)效應(yīng)，或最低的有效濃度(MEC)。MEC對(duì)每種化合物會(huì)有所變化，但可通過(guò)體外數(shù)據(jù)進(jìn)行估計(jì)；例如，用此處所述試驗(yàn)測(cè)定的以獲得50-90％的CTGF活性以誘導(dǎo)骨生長(zhǎng)的必需濃度。要達(dá)到MEC所必需的劑量將依賴于每個(gè)個(gè)體的特性和用藥途徑。然而，可利用HPLC或生物試驗(yàn)來(lái)測(cè)定血漿濃度。
用藥間隔也可利用MEC值進(jìn)行測(cè)定。化合物應(yīng)采用能維持MEC以上血漿濃度達(dá)10-90％的時(shí)間的給藥法進(jìn)行用藥，優(yōu)選30～90％的時(shí)間，最優(yōu)選50-90％的時(shí)間。
在局部用藥或選擇性吸收的情況下，藥物的局部有效濃度可能不與血漿濃度相關(guān)。
當(dāng)然，使用的組合物的量依賴于受治療者，受治療者的體重，疾病的嚴(yán)重程度，用藥方式和開(kāi)處方醫(yī)生的判斷。
7.4.4包裝如果需要，組合物可使用包含一個(gè)或多個(gè)單位的含活性成分的劑量形式的包裝或配藥裝置。例如，包裝可包括金屬或塑料箔，如泡狀包裝。包裝或配藥裝置可伴有用藥說(shuō)明。含有配制于適當(dāng)藥用載體中的本發(fā)明化合物的藥用組合物也可以進(jìn)行制備，置于適當(dāng)容器中，并且用標(biāo)簽表明治療的適應(yīng)癥。標(biāo)簽上表明的適應(yīng)癥包括治療需要軟骨或骨誘導(dǎo)和傷口愈合，或類似情況的紊亂或疾病。
7.5.誘導(dǎo)軟骨中CTGF產(chǎn)生的化合物的鑒定CTGF基因的啟動(dòng)子元件，具體來(lái)說(shuō)是TGF-β反應(yīng)/調(diào)節(jié)元件(TβRE)(5′-GTGTCAACCCTC-3′；核苷酸-157和-145)的鑒定為鑒定影響CTGF表達(dá)的化合物或組合物的篩選方法提供了一種手段。更具體地，用于鑒定那些增強(qiáng)CTGF的活性，因而能用于增強(qiáng)骨、組織和軟骨誘導(dǎo)的組合物的方法包括(1)孵育諸如但不限于含有組合物的寡核苷酸和CTGF的TGF-β反應(yīng)元件等成分，其中所說(shuō)的孵育是在足以允許各成分相互作用的條件下進(jìn)行的；和(2)測(cè)定組合物對(duì)CTGF表達(dá)的效果。優(yōu)選此處所述的用于篩選試驗(yàn)的啟動(dòng)子區(qū)包括核苷酸-823到+74，盡管包括TGF-β反應(yīng)元件的范圍更小的區(qū)域也可用于此處公開(kāi)的方法中(如-162到-128，或-154到-145)。在其它試驗(yàn)中，包括TβRE的這個(gè)區(qū)域中的核苷酸與熒光素酶等受體基因偶聯(lián)，并轉(zhuǎn)染進(jìn)哺乳動(dòng)物細(xì)胞中以獲得攜帶構(gòu)建基因并且與TGF-β孵育時(shí)表現(xiàn)出活性的細(xì)胞系。修飾激活功能的這些待選藥物，寡聚核苷酸，和化合物易于在細(xì)胞試驗(yàn)中進(jìn)行檢測(cè)。8.實(shí)例結(jié)締組織生長(zhǎng)因子基因不僅在成纖維細(xì)胞中表達(dá)，而且在間充質(zhì)來(lái)源的結(jié)締組織細(xì)胞(如，成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞，星形膠質(zhì)細(xì)胞等)中可被TGF-β選擇性誘導(dǎo)表達(dá)?；虮磉_(dá)于脊椎動(dòng)物的構(gòu)成骨架成分的結(jié)締組織細(xì)胞中，這表明CTGF在脊椎動(dòng)物的軟骨、骨、韌帶和肌肉的形成中發(fā)揮作用。以下實(shí)例的結(jié)果證實(shí)了CTGF能調(diào)節(jié)包括人在內(nèi)的脊椎動(dòng)物中形成軟骨和骨的細(xì)胞的誘導(dǎo)、分化和生長(zhǎng)。具體地說(shuō)，這些結(jié)果證實(shí)了(1)CTGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物存在于成年大鼠和新生小鼠的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板中；(2)CTGF基因在胚胎小鼠的軟骨誘導(dǎo)和生長(zhǎng)部位有表達(dá)；(3)CTGF受體存在于大鼠的軟骨細(xì)胞上；(4)CTGF基因在成年兔損傷后骨再生的部位有表達(dá)；(5)CTGF蛋白能誘導(dǎo)多能小鼠胚胎干細(xì)胞分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞；(6)培養(yǎng)的人成骨細(xì)胞分泌CTGF。
8.1.生物學(xué)實(shí)驗(yàn)方法促有絲分裂和無(wú)貼壁依賴性生長(zhǎng)試驗(yàn)。促有絲分裂試驗(yàn)在單層培養(yǎng)細(xì)胞中進(jìn)行，采用48孔培養(yǎng)板和NRK成纖維細(xì)胞作為靶細(xì)胞，如Grotendorst等以前所述，1991，《細(xì)胞生理學(xué)雜志》(J.CellPhysiolo.)149卷235-243頁(yè)。無(wú)貼壁依賴性生長(zhǎng)試驗(yàn)基本上按照Guadagno和Assoian所述方法進(jìn)行，1991，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.CellBiol.)115卷1572-1575頁(yè)。
方法細(xì)胞外基質(zhì)蛋白的mRNA誘導(dǎo)試驗(yàn)。NRK大鼠成纖維細(xì)胞在含5％胎牛血清的Dulbecco′s modified eagle培養(yǎng)基中培養(yǎng)至匯合，然后在含1％牛血清白蛋白的DMEM中血清饑餓24小時(shí)。生長(zhǎng)因子加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，然后總細(xì)胞RNA在24小時(shí)后提取出來(lái)，并進(jìn)行northern印跡分析，如Igarashi等人所述，1993，《分子生物學(xué)與細(xì)胞》(Mol.Biol.Cell)4卷637-645頁(yè)。
為了確保等量的總RNA加入到凝膠的每一泳道中，通過(guò)A260/A280比對(duì)RNA進(jìn)行定量，然后用溴化乙錠染色后通過(guò)比較在每一泳道中的核糖體28S和18S RNA來(lái)確保等量轉(zhuǎn)移。用肌動(dòng)蛋白cDNA探針再進(jìn)行雜交作為另外的對(duì)照。采用隨機(jī)引物標(biāo)記試劑盒(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)用32P-dCTP標(biāo)記用作探針的雙鏈cDNA片斷。CTGF探針來(lái)自包括CTGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物開(kāi)放閱讀框的1.1kb的人cDNA片斷。TGF-β1探針是2.0kb的人TGF-β1 cDNA的1.0kb的NarI片斷(G.I.Bell，H.H.醫(yī)學(xué)研究所，芝加哥大學(xué))。αI-型1人膠原蛋白探針來(lái)自3′端的1.5kb的開(kāi)放閱讀框片斷(ATCC號(hào)61323)。α5融合素探針來(lái)自含開(kāi)放閱讀框的一部分人cDNA的cDNA插入片斷，這是由邁阿密大學(xué)的R.Associan獲得的。人的纖維結(jié)合素探針是0.9kb的EcoR1/Hind III片斷，來(lái)自F.Woessner(也是邁阿密大學(xué))所提供的含開(kāi)放閱讀框3′區(qū)的2.2kb的cDNA克隆片斷。用作對(duì)照RNA探針的人肌動(dòng)蛋白探針購(gòu)自O(shè)ncor，Co.(Gaithersberg，MD)。
8.2 CTGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在新生小鼠中的定位根據(jù)Fava，等，1990，《血液》(Blood)76卷1946-1955頁(yè)，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定CTGF轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物是否存在于新生小鼠的長(zhǎng)骨生長(zhǎng)板中。
方法原位雜交。組織標(biāo)本迅速放入4.0％多聚甲醛中持續(xù)1.5小時(shí)，然后迅速冰凍并包埋。切片切成5μm并置于TESPA包被的載玻片上(Oncor，Gathersburg，MD)。采用標(biāo)準(zhǔn)的方法對(duì)CTGF mRNA進(jìn)行原位雜交。簡(jiǎn)而言之，帶標(biāo)本的玻片通過(guò)梯度酒精進(jìn)行脫水，用溶于50mM Tris-HCl pH7.4，5mM EDTA的20μg/ml蛋白酶K進(jìn)行處理，然后在連續(xù)梯度酒精中脫水之前，在4.0％多聚甲醛中重新固定并浸泡于0.1M三乙醇胺和1ml醋酸酐中。利用riboprobe試劑盒(Promega，Madison，WI)分別使用T7和SP6啟動(dòng)子構(gòu)建正義和反義CTGF RNA探針。探針的特異活性是1×108cpm/μg RNA。在54℃玻片于一蓋玻片下過(guò)夜雜交，雜交環(huán)境為50％去離子的甲酰胺。10％葡聚糖硫酸酯，50mM DTT，0.3M NaCl，0.01M Tris pH7.5，5mM EDTA，10mMNa2HPO4，0.02％聚蔗糖，0.02％聚乙烯吡咯烷酮，0.02％牛血清白蛋白，0.2mg/ml酵母tRNA和riboprobe(5×104cpm/μl)。玻片于250ml5×SSC，10mM β-巰基乙醇中50℃洗30分鐘，于2×SSC，100mMβ-巰基乙醇，50％甲酰胺中65℃洗20分鐘，并在TEN緩沖液(1MTris，0.5 M EDTA，5M NaCl)中洗10分鐘，連續(xù)3次。第二次TEN沖洗包括10μgRNase A。最后兩次沖洗是于2×SSC中在65℃進(jìn)行，每次15分鐘。用含0.3M醋酸銨的梯度酒精再次脫水之后，載玻片浸于顯影乳劑(Ilford K-5，Polyscience)中，并在4℃孵育8天。然后載玻片顯影并且切片，于Mayer′s蘇木素和伊紅中進(jìn)行復(fù)染。
結(jié)果。這些研究結(jié)果表明CTGF基因表達(dá)于生長(zhǎng)板的增殖區(qū)。該區(qū)包含有那些活躍地增殖以增加骨長(zhǎng)度的軟骨細(xì)胞。CTGF在該部位表達(dá)與它作為軟骨細(xì)胞的生長(zhǎng)因子來(lái)發(fā)揮作用的功能相一致。
8.3.CTGF基因在胚胎小鼠的軟骨誘導(dǎo)和生長(zhǎng)部位的表達(dá)。
為了證實(shí)CTGFs在軟骨誘導(dǎo)和生長(zhǎng)中的作用，CTGF基因在小鼠胚胎中軟骨和骨將要形成但還尚未形成部位的表達(dá)情況已進(jìn)行了研究。為了達(dá)到該研究的目的，建立了含有一段轉(zhuǎn)入基因的轉(zhuǎn)基因小鼠系，該轉(zhuǎn)入的基因包括調(diào)控細(xì)菌半乳糖苷酶基因表達(dá)的人CTGF啟動(dòng)子元件。表達(dá)這個(gè)基因的細(xì)胞容易用能在酶活性部位形成一種藍(lán)色沉淀的X-gal染色來(lái)進(jìn)行鑒定。用這個(gè)方法我們對(duì)轉(zhuǎn)基因小鼠的胚胎進(jìn)行染色以定位CTGF基因的表達(dá)。如圖4中A圖所示，沒(méi)有軟骨或骨形成，這表明CTGF是在骨骼形成之前表達(dá)，并可能作為軟骨和骨的誘導(dǎo)劑發(fā)揮作用。結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了轉(zhuǎn)入基因的表達(dá)與CTGF探針原位雜交所檢測(cè)的表達(dá)情況一致。
這些研究也證實(shí)了基因表達(dá)于長(zhǎng)骨的生長(zhǎng)板，軟骨前區(qū)和Meckel′s軟骨，后者是在哺乳動(dòng)物發(fā)育過(guò)程中所形成的第一塊軟骨。這些區(qū)域被稱為軟骨形成前間充質(zhì)，并可通過(guò)細(xì)胞聚縮加以鑒別。CTGF基因表達(dá)于這些部位但不表達(dá)于附近組織中。更一步，在這些部位CTGF表達(dá)于細(xì)胞聚縮的前一天，細(xì)胞聚縮發(fā)生在真正的軟骨形成的前一天。這些結(jié)果證明CTGF存在于軟骨或具有真正軟骨細(xì)胞表型的細(xì)胞形成之前，并且與CTGF誘導(dǎo)未分化干細(xì)胞中軟骨表型的作用相一致。
重要的是，這些研究證明了CTGF表達(dá)于胚胎中通過(guò)膜內(nèi)，或軟骨內(nèi)途徑形成骨的部位，這表明CTGF能作為軟骨形成的一種信號(hào)發(fā)揮作用，這些軟骨形成或來(lái)自形成四肢骨的未分化間充質(zhì)干細(xì)胞，或來(lái)自那些在Meckel′s軟骨和顱骨長(zhǎng)骨中形成軟骨的神經(jīng)嵴細(xì)胞8.4.CTGF受體在大鼠軟骨細(xì)胞上的定位細(xì)胞為了能與諸如CTGF等多肽因子發(fā)生反應(yīng)，它們必須在細(xì)胞表面表達(dá)針對(duì)特異多肽因子的同族受體。
平衡試驗(yàn)。在匯合的單層NRK-49F大鼠成纖維細(xì)胞和原代大鼠關(guān)節(jié)成軟骨細(xì)胞上進(jìn)行平衡結(jié)合試驗(yàn)，以測(cè)定在這些細(xì)胞上CTGF受體的數(shù)目和親和力。在低溫下同各種濃度的碘化重組人CTGF(rhCTGF)結(jié)合4小時(shí)。通過(guò)包含200倍摩爾過(guò)量的未標(biāo)記配體測(cè)定非特異性結(jié)合。代表性的Scatchard圖見(jiàn)圖8A(與利用NRK細(xì)胞所進(jìn)行的平衡結(jié)合試驗(yàn)有關(guān))和圖8B(與利用大鼠成軟骨細(xì)胞所進(jìn)行的平衡結(jié)合試驗(yàn)有關(guān))。
競(jìng)爭(zhēng)試驗(yàn)。幾種類型的細(xì)胞被檢測(cè)CTGF受體的表達(dá)，這些細(xì)胞包括正常大鼠腎成纖維細(xì)胞，小鼠成纖維細(xì)胞，水貂肺上皮細(xì)胞和大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞。通過(guò)125I碘化對(duì)CTGF進(jìn)行標(biāo)記，并且將放射標(biāo)記的CTGF用于競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合試驗(yàn)中以測(cè)定各種類型細(xì)胞上的CTGF受體。如下面的表1所示，只有NRK成纖維細(xì)胞和大鼠關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞表達(dá)CTGF的高親和力受體。小鼠成纖維細(xì)胞幾乎不表達(dá)高親和力受體，在水貂肺上皮細(xì)胞表面未檢測(cè)到結(jié)合現(xiàn)象。
表1rhCTGF對(duì)各種細(xì)胞的結(jié)合特征高親和力 低親和力細(xì)胞類型KD(pM) 位點(diǎn)/細(xì)胞 KD(nM)位點(diǎn)/細(xì)胞NRK 13-232200-3500 11-2.2126,000-195,000軟骨細(xì)胞21 3500-4800 1.0 150,000NIH3T3 5-10 480 1.8 102.000MLEC 未測(cè)定 未測(cè)定這些數(shù)據(jù)表明軟骨細(xì)胞表達(dá)CTGF和CTGF的受體，因此能夠與作為一種生長(zhǎng)刺激因子的CTGF發(fā)生應(yīng)答反應(yīng)。
8.5.CTGF在誘導(dǎo)多能小鼠胚胎干細(xì)胞系分化成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中的活性。
對(duì)CTGF在培養(yǎng)的未分化干細(xì)胞中誘導(dǎo)軟骨細(xì)胞和骨細(xì)胞表型的能力進(jìn)行了評(píng)估。具體地說(shuō)，采用C3H10T1/2細(xì)胞系來(lái)評(píng)估這個(gè)生物學(xué)活性。對(duì)這些類型的研究來(lái)說(shuō)，這些細(xì)胞是一種標(biāo)準(zhǔn)的并且非常成熟的細(xì)胞系。在培養(yǎng)中可保持C3H10T1/2處于一種未分化狀態(tài)，然后誘導(dǎo)它們分化成骨骼肌細(xì)胞，軟骨細(xì)胞，成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞。用CTGF處理的細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞集落和軟骨結(jié)節(jié)。用5-氮雜胞苷過(guò)夜處理后隨后用CTGF過(guò)夜處理的細(xì)胞分化成成骨細(xì)胞和類骨質(zhì)小體。這些培養(yǎng)的細(xì)胞分化成肌肉和脂肪細(xì)胞可由CTGF的存在而阻斷。
更具體地，細(xì)胞用5-氮雜胞苷過(guò)夜處理，隨后孵育10-14天，以使細(xì)胞分化發(fā)生。然后比較5-氮雜胞苷和CTGF單獨(dú)使用和聯(lián)合使用時(shí)對(duì)這些細(xì)胞的效果。未用兩者之中任一試劑處理的對(duì)照培養(yǎng)保持細(xì)胞處于單層生長(zhǎng)的未分化狀態(tài)。如圖4所示，用5-氮雜胞苷單獨(dú)處理的細(xì)胞主要是分化成骨骼肌細(xì)胞(肌小管)和脂肪細(xì)胞。在培養(yǎng)的細(xì)胞中未見(jiàn)軟骨細(xì)胞。CTGF處理細(xì)胞(50ng/ml)10天會(huì)導(dǎo)致軟骨結(jié)節(jié)的生成。這些結(jié)節(jié)在其它的任何條件下都未發(fā)現(xiàn)。用FGF，PDGF、EGF或TGF-β處理培養(yǎng)的細(xì)胞均未誘導(dǎo)這些結(jié)節(jié)的生成，這表明唯有CTGF能夠在未分化的間充質(zhì)干細(xì)胞中誘導(dǎo)軟骨生成。
用5-氮雜胞苷(過(guò)夜)處理，隨后CTGF(50ng/ml)處理10天會(huì)對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞有明顯的效果。首先，未見(jiàn)有骨骼肌小管存在，這證實(shí)了CTGF能阻止細(xì)胞分化成骨骼肌細(xì)胞。其次，當(dāng)存在一些軟骨結(jié)節(jié)時(shí)，大多數(shù)結(jié)節(jié)似乎是類骨質(zhì)(骨)。這樣CTGF能誘導(dǎo)未分化的間充質(zhì)細(xì)胞形成軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞。這些結(jié)果表明該因子能在需要的部位用于刺激軟骨和骨的分化。
8.6成年家兔損傷后骨再生部位的CTGF基因表達(dá)。
建立一個(gè)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛠?lái)檢測(cè)損傷修復(fù)過(guò)程中各種調(diào)節(jié)和基質(zhì)蛋白基因的表達(dá)。在該模型中，將帶網(wǎng)眼的尼龍柱植入已用乙醚麻醉的雄性新西蘭大白兔(10kg)骨盆的髂骨中。用骨鉆在骨盆的髂骨中鉆一個(gè)1.1cm直徑的孔，然后將該圓柱塞入孔中。利用附近肌肉系統(tǒng)和韌帶的部分組織將尼龍柱固定。在20只動(dòng)物中每只移植入兩個(gè)尼龍柱。
在植入尼龍柱后第9、14、21、24、28、31、35，42和56天分別將動(dòng)物處死。取出尼龍柱，并且仔細(xì)、完全徹底地分離尼龍柱外面上的組織。切開(kāi)尼龍柱并收集柱內(nèi)所含的組織。
用異硫氰酸胍抽提(Chomcaynski和Sachi，1987，《分析生物化學(xué)》(Anal Biochem.)162卷156-159頁(yè))和氯化銫離心(Chirgwin等，1979，《生物化學(xué)》(Biochemistry)18卷5294-5299頁(yè))，從6～18個(gè)尼龍柱(從1-3只動(dòng)物中匯集的)中所獲得的組織中提取出總RNA。在不同天收集的組織中所回收的RNA量在100～300μg之間?？俁NA在瓊脂糖/福爾馬林凝膠上電泳，然后轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜。根據(jù)每個(gè)樣本中所存在的核糖體RNA的染色來(lái)判斷，將等量的RNA轉(zhuǎn)移到硝化纖維素膜上。CTGF探針是代表CTGF cDNA開(kāi)放閱讀框的900個(gè)堿基對(duì)的片斷。通過(guò)隨機(jī)引物DNA標(biāo)記試劑盒(Boehringer MannheimBiochemicals Indianapolis，IN)，用[32p]dCTP標(biāo)記探針，1×106cpm/ml的這些探針用來(lái)進(jìn)行雜交試驗(yàn)。利用X-線膠片和加強(qiáng)顯影在-70℃放射自顯影24-72小時(shí)。
在修復(fù)部位血凝后是炎癥，然后是結(jié)締組織增生，組織通過(guò)一定的修復(fù)鏈進(jìn)行增生。在植入尼龍柱的骨中，如果所形成的致密結(jié)締組織與軟組織植入物中所形成的那些不是完全相同的話，至少也是類似的。
如圖5所示，從14到42天CTGF的基因表達(dá)是明顯的。這是在尼龍腔內(nèi)最初出現(xiàn)骨的組織學(xué)外形前的4天，并且與腔內(nèi)骨形成的時(shí)間過(guò)程相一致。然而，也如圖5所示，大約植入后17-18天，在結(jié)締組織區(qū)的形態(tài)上發(fā)生一些改變。然后到移植后20-21天，這些區(qū)域開(kāi)始形成骨，這表明這是研究骨再生的一個(gè)功能性模型。
腔內(nèi)CTGF mRNA的表達(dá)稍微提前，然后與腔內(nèi)骨形成區(qū)的形成和生長(zhǎng)一致，這表明CTGF表達(dá)于哺乳動(dòng)物的骨再生部位。
8.7通過(guò)使用CTGF促進(jìn)人成骨細(xì)胞的形成細(xì)胞培養(yǎng)。自人骨的移植物中培養(yǎng)人成骨細(xì)胞。在37℃含10％CO2和90％空氣的環(huán)境中；細(xì)胞培養(yǎng)于含10％胎牛血清(FCS)的Dulbecco′s modified Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM)中。
Western印跡分析。條件培養(yǎng)基中的CTGF產(chǎn)物在12％的丙烯酰胺凝膠上通過(guò)SDS-PAGE進(jìn)行分析，隨后用電轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移至硝化纖維素膜。在與2g/ml的稀釋于TBS-牛奶中的雞抗人CTGF IgY過(guò)夜孵育之前，雜交膜于含2％脫脂粉狀牛奶(TBS-牛奶)的Tris-緩沖鹽水(100mM氯化鈉，50mM Tris-鹽酸pH7.4)中孵育1小時(shí)。雜交膜在TBS-牛奶中沖洗5次，每次5分鐘，然后與堿性磷酸酶交聯(lián)的親和純化的兔抗雞IgY(1∶1,000稀釋，Organon Teknika-Cappel，WestChester，Pa.)于TBS-牛奶中共同孵育90分鐘。雜交膜用TBS-牛奶沖洗3次，隨后在TBS中沖洗2次，然后用商品堿性磷酸酶底物試劑盒(Sigma.St.Louis.MO)檢測(cè)抗原。
結(jié)果。在切除骨腫瘤或關(guān)節(jié)置換的手術(shù)中，外科手術(shù)切除骨之后，自捐獻(xiàn)者中獲得人成骨細(xì)胞。自骨中培養(yǎng)成骨細(xì)胞并用標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行鑒定。細(xì)胞在含10％胎牛血清的完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)至匯合，然后將培養(yǎng)基改成無(wú)血清培養(yǎng)基，過(guò)夜培養(yǎng)使細(xì)胞停止生長(zhǎng)。一些培養(yǎng)細(xì)胞用TGF-β處理并與非處理的培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行比較。用TGF-β處理過(guò)的成骨細(xì)胞受刺激分泌CTGF，用一種特異的抗-CTGF抗體檢測(cè)CTGF。如圖5所示，收集培養(yǎng)基并通過(guò)一種CTGF特異性抗體對(duì)CTGF的免疫純化來(lái)分析CTGF的產(chǎn)生和分泌，以及用同一種抗體通過(guò)Western印跡對(duì)CTGF進(jìn)行檢測(cè)和定量。如同用成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞和軟骨細(xì)胞所觀察到的，TGF-β誘導(dǎo)人成骨細(xì)胞產(chǎn)生CTGF。未經(jīng)處理的對(duì)照細(xì)胞不能合成可檢測(cè)量的CTGF。
正如該實(shí)驗(yàn)所證實(shí)的，就CTGF產(chǎn)生來(lái)說(shuō)，成骨細(xì)胞與TGF-β發(fā)生的反應(yīng)類似于其它的結(jié)締組織細(xì)胞。
8.8.轉(zhuǎn)基因家兔模型所有進(jìn)行的小鼠實(shí)驗(yàn)研究都符合在“實(shí)驗(yàn)動(dòng)物保護(hù)和應(yīng)用的指導(dǎo)”中所概括的原則和方法。利用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)在邁阿密大學(xué)轉(zhuǎn)基因小鼠核心設(shè)施處進(jìn)行轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型的建立。簡(jiǎn)而言之，要注射的基因(轉(zhuǎn)入基因)通過(guò)限制性酶消化使之線性化，然后用低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠電泳分離DNA片斷，并用GENECLEAN進(jìn)行純化。
將線性DNA注射入-100-300最近受精的小鼠卵細(xì)胞的一個(gè)原核中來(lái)制備轉(zhuǎn)基因小鼠。Hogan等，1986，操作小鼠胚胎，Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY。這些注射后存活的卵細(xì)胞被轉(zhuǎn)移至假孕小鼠(已與切除輸精管的雄性小鼠交配)的輸卵管中。出生后一到三周從幼鼠中進(jìn)行鼠尾活檢，并且通過(guò)Southern印跡分析基因組DNA來(lái)檢測(cè)轉(zhuǎn)入的基因是否存在。存在轉(zhuǎn)入基因的陽(yáng)性小鼠與對(duì)照小鼠交配以建立轉(zhuǎn)基因小鼠系。這些實(shí)驗(yàn)的結(jié)果是，建立了兩個(gè)獨(dú)立的在CTGF啟動(dòng)子控制下表達(dá)β-半乳糖苷酶的轉(zhuǎn)基因小鼠系。這兩個(gè)小鼠系表現(xiàn)出相似的表達(dá)模式。
8.9.軟骨形成試驗(yàn)如在Seydin等，1983，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.Cell Biology)97卷1950-53頁(yè)中所述的軟骨形成試驗(yàn)中，對(duì)CTGF以及TGF-β進(jìn)行檢測(cè)。簡(jiǎn)單地說(shuō)，從19-20日齡的Sprague-Dawley胚胎的肢體上分離肌肉組織并切成碎片，自這些碎片肌肉組織長(zhǎng)出的細(xì)胞中獲取胚胎肌肉的原代培養(yǎng)細(xì)胞。為了進(jìn)行軟骨形成試驗(yàn)，細(xì)胞用胰酶消化并植入瓊脂糖中，然后加入不含因子(圖7A)，只含TGF-β(圖7B)，含TGF-β和霍亂毒素(圖7C)或含TGF-β，霍亂毒素和CTGF(圖7D)的培養(yǎng)基。對(duì)每一個(gè)試驗(yàn)，每2～3天更換培養(yǎng)基1次，然后在培養(yǎng)21天后用甲苯胺藍(lán)染色，如在Horwitz和Dorfman，1970，《細(xì)胞生物學(xué)雜志》(J.Cell Biol.)45卷434-438頁(yè)中所述。
如圖7A-7D所示，在CTGF加入培養(yǎng)基的培養(yǎng)部位可見(jiàn)明顯的軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)，這表明CTGF刺激軟骨細(xì)胞生長(zhǎng)以及結(jié)締組織基質(zhì)的產(chǎn)生。
本發(fā)明的范圍不受意在說(shuō)明本發(fā)明一個(gè)方面的具體實(shí)施方案的限制，并且在功能上等價(jià)的方法也在發(fā)明的范圍之內(nèi)。事實(shí)上，根據(jù)前面的描述和相應(yīng)的附圖，除了此處所述的那些實(shí)例外，本發(fā)明的各種改良對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員將是顯而易見(jiàn)的。所附權(quán)利要求意在包括這樣的改良。
在本發(fā)明的說(shuō)明書(shū)中所引用的所有參考資料在此全文引入作為參考。生物保藏本發(fā)明中CTGF的序列在1990年7月26日被保藏于基因庫(kù)，LosAlamos National Laboratory，Los Alamos，New Mexico，87545，美國(guó)，并給予登記號(hào)M36965。該CTGF序列的保藏僅為舉例說(shuō)明，不應(yīng)要求申請(qǐng)者承認(rèn)這種保藏是要求保護(hù)的主題得到保護(hù)所必需的。
對(duì)所有指定國(guó)來(lái)說(shuō)，這樣做是可能的，并且根據(jù)指定國(guó)的法律也是合法的，獨(dú)立的專家要取得保藏的微生物樣品，必須是在本發(fā)明授權(quán)之后，這符合相關(guān)的專利法規(guī)，如EPC細(xì)則28(4)，聯(lián)合王國(guó)專利細(xì)則1982年細(xì)則17(3)，澳大利亞法典(Regulation)3，25(3)以及任一其它指定國(guó)的大體類似的準(zhǔn)用規(guī)定。
權(quán)利要求
1.一種含有CTGF的藥用組合物。
2.一種誘導(dǎo)骨形成的方法，它包括給有需要的患者使用一種含有CTGF和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
3.權(quán)利要求2的方法，其中的組合物進(jìn)一步包含第二種生長(zhǎng)因子。
4.權(quán)利要求3的方法，其中第二種生長(zhǎng)因子是TGF-β。
5.權(quán)利要求2的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括至少一種膠原蛋白。
6.權(quán)利要求2的方法，其中病人正患有影響骨形成的一種疾病。
7.權(quán)利要求6的方法，其中疾病選自骨質(zhì)疏松，骨關(guān)節(jié)炎和骨軟骨炎。
8.一種誘導(dǎo)組織形成的方法，它包括給有需要的病人使用一種含CTGF和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
9.權(quán)利要求8的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括第二種生長(zhǎng)因子。
10.權(quán)利要求8的方法，其中第二種生長(zhǎng)因子是TGF-β。
11.權(quán)利要求8的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括至少一種膠原蛋白。
12.一種誘導(dǎo)軟骨形成的方法，它包括給有需要的病人使用一種含CTGF和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
13.權(quán)利要求12的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括第二種生長(zhǎng)因子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中第二種生長(zhǎng)因子是TGF-β。
15.權(quán)利要求12的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括至少一種膠原蛋白。
16.一種誘導(dǎo)傷口愈合的方法，它包括給有需要的病人使用一種含CTGF和一種藥學(xué)上可接受的載體的組合物。
17.權(quán)利要求16的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括第二種生長(zhǎng)因子。
18.權(quán)利要求16的方法，其中第二種生長(zhǎng)因子是TGF-β。
19.權(quán)利要求16的方法，其中的組合物進(jìn)一步包括至少一種膠原蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及與單獨(dú)使用結(jié)締組織生長(zhǎng)因子或聯(lián)合應(yīng)用其它生長(zhǎng)因子、組合物或化合物來(lái)誘導(dǎo)包括骨、軟骨和皮膚在內(nèi)的結(jié)締組織形成有關(guān)的方法和組合物。
文檔編號(hào)C12N5/077GK1195295SQ96195711
公開(kāi)日1998年10月7日 申請(qǐng)日期1996年5月31日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月2日
發(fā)明者加里R·格羅登多斯特 申請(qǐng)人:加時(shí)R·格羅登多斯特