專利名稱：有機(jī)酸的產(chǎn)生被阻抑了的新的大腸桿菌突變株的制作方法
背景技術(shù)：
1.發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及在有氧條件下生長在補(bǔ)加有葡萄糖的培養(yǎng)基中其發(fā)酵有機(jī)酸(特別是乙酸)的產(chǎn)生被阻抑了的新的大腸桿菌突變株。該菌株產(chǎn)生的有機(jī)酸的減少使它成為使用高密度有氧發(fā)酵方法生產(chǎn)重組蛋白質(zhì)的優(yōu)秀的宿主菌株。
2.現(xiàn)有技術(shù)的描述為了產(chǎn)生有用的重組蛋白質(zhì)，大腸桿菌被廣泛用作高細(xì)胞密度有氧發(fā)酵的宿主菌株。因?yàn)槠咸烟羌攘畠r(jià)又易于做為可利用的碳源和能源，為獲得宿主細(xì)胞的高密度生長以及重組基因的很好表達(dá)，大量的葡萄糖被加入到培養(yǎng)基中。高細(xì)胞密度有氧發(fā)酵過程中存在的主要問題是有發(fā)酵酸性副產(chǎn)物產(chǎn)生，其中乙酸是最主要的副產(chǎn)物。酸性副產(chǎn)物、尤其是乙酸的產(chǎn)生是限制高細(xì)胞密度生長的主要因素，因此亦是限制重組蛋白質(zhì)生產(chǎn)的主要因素(Han et al.，Biotechol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，39，663(1992)；Luli et al.，Appl.Erviron.Microbiol.(外界應(yīng)用微生物學(xué))，56，1004(1990)。
為了解決這些問題，已經(jīng)使用了下列技術(shù)或方法養(yǎng)料分批供應(yīng)培養(yǎng)技術(shù)(Fieschko等，Chem.Eng.Commun.(化學(xué)工程通訊)，45，2875(1986)；Ohta等，J.Ferment.Bioeng.(發(fā)酵生物工程雜志)，75，155(1993)；Yang，J.Biotechrol.(生物技術(shù)雜志)，23，271(1992))、從培養(yǎng)物中將產(chǎn)生的有機(jī)酸除去的方法(Landwall等，J.Gen.Microbiol.(微生物遺傳學(xué)雜志)，103，345(1977)；Meyer等，Proceedings of the 3rd European Congress on Biotechnology(第三屆歐洲生物技術(shù)大會(huì)記錄匯編)，(1984)；MacDonald，Appl.Environ.Microbiol.(外界應(yīng)用微生物學(xué))，56，640(1990))或者更換培養(yǎng)基組合物(Holmes，Curr.Topics Cell.Regul.(細(xì)胞調(diào)控的當(dāng)前課題)，28，69(1986)；Han等，Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，41，316(1993)；Reiling，J.Biotechnol.(生物技術(shù)雜志)，2，191(1985)；Mori等，J.Ferment.Technol.(發(fā)酵技術(shù)雜志)，50，519(1972)。然而，這些方法仍有局限性以致于生長速率緩慢和這些培養(yǎng)條件導(dǎo)致的培養(yǎng)物的代謝活性較低常常使重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量較低；控制錯(cuò)綜復(fù)雜的營養(yǎng)供應(yīng)非常麻煩而且容易出錯(cuò)(Chou等，Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，44，952(1994)；為控制pH而加入到培養(yǎng)基中的鹽經(jīng)常引起宿主生長的抑制和/或抑制產(chǎn)物產(chǎn)生(Jensen等，Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，36，1(1990))。
對于大腸桿菌在有氧條件下的葡萄糖代謝，超過其TCA循環(huán)能力的碳流被轉(zhuǎn)化成乙酸，所述的乙酸被分泌到細(xì)胞外(Majewski&Domach，Biotechmol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，35，732(1990))。分泌出的乙酸抑制宿主菌株的生長及所需重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生。乙酸是在磷酸轉(zhuǎn)乙酰酶(pta)和乙酸激酶(ack)的連續(xù)作用下從乙酰輔酶A產(chǎn)生的。發(fā)現(xiàn)乙酸形成酶的突變性失活(通過使pts和ack基因缺失)可使乙酸的產(chǎn)量減少，但仍有相當(dāng)大量的乙酸產(chǎn)生。該突變還引起乳酸和丙酮酸的積累(Diaz-Ricci等，Biotechnol.Bioeng.(生物技術(shù)生物工程)，38，1318(1991))，至使乳酸和丙酮酸的累積量比其親代菌株的還高。這些結(jié)果提示乙酸的產(chǎn)生還有另外的途徑，而且已知的乙酸生物合成途經(jīng)的失活使碳流流向其它的有機(jī)酸。
因此，一直需要努力不懈的研究，以開發(fā)出使有機(jī)酸的總產(chǎn)量減少并因此使所需的重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量增加的新菌株。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的一個(gè)目的在于提供新的大腸桿菌菌株，該菌株的有機(jī)酸產(chǎn)生被阻抑了，而其生長或重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)生卻不受抑制。
該目的可用大腸桿菌新菌株JL1506(E.coliJL1506)來實(shí)現(xiàn)；E.coliJL1506在有氧條件下在葡萄糖培養(yǎng)基中生長的期間，其有機(jī)酸的產(chǎn)生被阻抑了。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，所述方法將所述菌株E.coli JL1506用作表達(dá)宿主系統(tǒng)。
對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員而言，本發(fā)明的上述的和其它的目的、特征及應(yīng)用可從下文的詳細(xì)描述中顯而易見地看出。
本發(fā)明的詳細(xì)解釋新菌株E.coli JL1506可通過下列步驟得到。
大腸桿菌菌株MG1655(Guyer等，Cold spring Harbor Sym.Quant.Biol.(冷泉港系統(tǒng)定量生物學(xué))，45，135(1981))由美國耶魯大學(xué)的大腸桿菌貯藏中心慷慨贈(zèng)予，采用標(biāo)準(zhǔn)的方法(Miller，Short course in bacterialgenetics(細(xì)菌遺傳學(xué)的短期課程)，Cold Spring Harbor Laboratory(冷泉港實(shí)驗(yàn)室)(1992))，用甲磺酸乙酯(EMS)對MG1655進(jìn)行誘變，并在厭氧條件下篩選產(chǎn)生有機(jī)酸的途徑有缺陷的突變體。然而，篩選出的所有突變體仍產(chǎn)生相當(dāng)大量的有機(jī)酸。人們一直認(rèn)為能在厭氧條件下生長的突變體就能產(chǎn)生有機(jī)酸。
因而，本案的發(fā)明人持續(xù)不斷地努力，以篩選出在厭氧條件下能生長的突變體。被篩選出的突變體中的一個(gè)被命名為JL1031；JL1031保持了其親代菌株的生長速度，而在有氧生長條件下從葡萄糖產(chǎn)生有機(jī)酸卻被有效地抑制了。采用P1噬菌體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)，將上述突變引起的表型轉(zhuǎn)入末被誘變的親代菌株MG1655中，并且證實(shí)所得的菌株JL1506具有與JL1031同樣的表型。
本發(fā)明突變菌株的這些有用的性質(zhì)使該菌株有可能被用作用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的表達(dá)宿主系統(tǒng)。用E.coli JL1506作為表達(dá)宿主系統(tǒng)產(chǎn)生的重組蛋白質(zhì)的種類不受特別的限制。不過，對于其表達(dá)受對分解代謝產(chǎn)物抑制敏感的啟動(dòng)子如Lac、tac等等控制的蛋白質(zhì)而言更是有用。然而，與其常規(guī)大腸桿菌宿主系統(tǒng)相比，本發(fā)明的宿主系統(tǒng)仍有助于用來產(chǎn)生其表達(dá)受對分解代謝產(chǎn)物抑制不敏感的啟動(dòng)子控制的其它蛋白質(zhì)。
可按照本領(lǐng)域普通技術(shù)人員熟知的方法，用編碼重組蛋白質(zhì)的外源基因轉(zhuǎn)化E.coli JL1506。轉(zhuǎn)化的方法和條件并不限制本發(fā)明，而且本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員依據(jù)重組蛋白質(zhì)的類型、編碼該蛋白質(zhì)基因的大小、選擇標(biāo)記等等可毫不費(fèi)力地將轉(zhuǎn)化方法和條件確定下來。
在適當(dāng)?shù)臈l件下于合適的培養(yǎng)基中進(jìn)行轉(zhuǎn)化的E.coli JL1506的培養(yǎng)，所有的這些條件都可被本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員確定。
可用合適的誘變劑處理親代菌株MG1655并篩選具有所需性質(zhì)的突變體而得到根據(jù)本發(fā)明的新的突變菌株E.coli JL1506。至于誘變劑，化學(xué)誘變劑或UV光均可使用。還可用基因操縱來獲得本發(fā)明的突變菌株。
引起JL1506菌株的上述表型的突變被遺傳定位于大腸桿菌染色體的51-52min處。
產(chǎn)生在有氧條件下正常生長而在厭氧條件下不能生長這一表型的單一突變以前從未見有過報(bào)道，但這一突變卻被本發(fā)明的發(fā)明人首次找到了。
本發(fā)明的發(fā)明人將該突變的表型命名為“glf-1031”(葡萄糖發(fā)酵缺陷型)，并且表示突變體JL1031具有g(shù)lf-1031的表型。
為了避免在基因上發(fā)生除glf之外的任何可能的突變，本發(fā)明的發(fā)明人采用P1噬菌體將glf-1031表型轉(zhuǎn)導(dǎo)入MG1655中，得到了E.coliJL1506。
將通過實(shí)施例對本發(fā)明做更詳細(xì)的描述，其中實(shí)施例1至3描述了E.coli1031的分離和JL1506的構(gòu)建，而實(shí)施例4-6顯示在JL1506和MG1655菌株內(nèi)有由葡萄糖產(chǎn)生的分解代謝產(chǎn)物抑制。
而且，為了檢查用突變的E.coli JL1506作宿主系統(tǒng)表達(dá)經(jīng)遺傳操縱的重組基因的可能性，通過將帶有天然β-半乳糖苷酶基因(Lac Z)的質(zhì)粒pMKT2-1(Min等，Korean Biochem.J.(韓國生化期刊)，NucleicAcid Res.(核酸研究)，16，5075(1988))分別轉(zhuǎn)入JL1506和MG1655而得到菌株JL1506/pMKT2-1和MG1655/pMKT2-1(實(shí)施例7和8)。
在實(shí)施例9和10中，通過培養(yǎng)E.coli JL1506、MG1655或C600轉(zhuǎn)化體來估測用E.coli JL1506作宿主系統(tǒng)的蛋白質(zhì)表達(dá)，所述的轉(zhuǎn)化體帶有質(zhì)粒pHT1(Huh等，Korean Biochem.J.(韓國生化期刊)，23，459(1990))，而質(zhì)粒pHT1中含有在try啟動(dòng)子(Amann等，Gene(基因)，40，183(1985))控制下的人脂皮質(zhì)蛋白cDNA。
當(dāng)β-半乳糖苷酶或脂皮質(zhì)蛋白由所述的轉(zhuǎn)化體產(chǎn)生時(shí)，JL1506菌株內(nèi)的蛋白質(zhì)產(chǎn)量比野生型對照MG1655或C600內(nèi)的產(chǎn)量高大約2倍。
本發(fā)明進(jìn)行的各種試驗(yàn)如下1)按照Miller的方法(Miller，A short course in bacterial genetics(細(xì)菌遺傳學(xué)的短期課程)，Cold Spring Harbor(1992))進(jìn)行遺傳學(xué)試驗(yàn)如轉(zhuǎn)導(dǎo)、接合和基因定位。
2)用Min的方法(Min等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)，16，5075(1988))測量β-半乳糖苷酶的活性。因此，將帶有編碼β-半乳糖苷酶基因的菌株于37℃、200rpm培養(yǎng)在含40mg/ml氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中達(dá)12-16小時(shí)。在培養(yǎng)期間，加入1mM的IPTG(異丙基-1-硫代-β-D-吡喃半乳糖苷)來誘導(dǎo)LacZ的表達(dá)。以一定的間隔時(shí)間對培養(yǎng)基取樣，并向培養(yǎng)基中加入Z-緩沖液、氯仿和0.1％的SDS以使細(xì)菌破碎。將破碎的細(xì)胞置于28℃水浴中5分鐘，加入4mg/ml的ONPG以終止反應(yīng)。對反應(yīng)混合物離心之后，用分光光度計(jì)(Pharmacia LKB-Ultraspec III)測量上清液的吸光度(420nm)。
3)用碘法(Han等，.Biotechnol.，Bioeng.(生物技術(shù)與生物工程)，39，653(1992))測量β-內(nèi)酰胺酶的活性。因此，將培養(yǎng)肉湯(5ml)中的細(xì)胞懸浮在5ml的洗滌緩沖液(0.05M Na2HPO4、0.05M KH2PO4、0.014M NaCl、溶在0.1M磷酸鹽緩沖液(PBS)中的0.01M的H2SO4)中，并離心。將沉淀下來的細(xì)胞懸浮在0.1M的PBS(5ml)中，并用超聲勻漿器US-150T破碎細(xì)胞5分鐘。然后，將所得到的懸浮體系在4℃以15000rpm離心以得到細(xì)胞勻漿。
向試管(A)中加入20mM的芐基青霉素(0.25ml)、0.1M的PBS(1.25ml)和細(xì)胞勻漿(0.5ml)，使所得混合物在30℃反應(yīng)20分鐘。向?qū)φ赵嚬?B)中加入0.1M的PBS(2ml)。將碘(2.5ml)加入到各試管中，使試管靜置10分鐘，并測量它們在490nm的吸光度。
4)脂皮質(zhì)蛋白被SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳鑒定為37kD的一條帶(Davis，Ann.Rev.NY Acacl.Sci.，121，404(1964))。用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad GS-670)進(jìn)行定量分析。
4-1)由細(xì)胞產(chǎn)生的脂皮質(zhì)蛋白的定量將有氧培養(yǎng)12小時(shí)后的培養(yǎng)肉湯接種到20ml含1％葡萄糖的LB培養(yǎng)基中，使?jié)舛冗_(dá)2％以便在600nm處的吸光度為0.1，并培養(yǎng)10小時(shí)。將所述培養(yǎng)肉湯(1ml)與0.5ml的SDS溶液(4.0ml蒸餾水、1.0ml 0.5M的Tris-Cl、0.8ml甘油、10％的SDS、0.4ml β-巰基乙醇、0.1％的溴酚藍(lán)，pH6.8)混合，并在95℃對其加熱5分鐘。取20ml的反應(yīng)混合物，使之在10％SDS-聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)上電泳。
4-2)對混在可溶蛋白質(zhì)中的脂皮質(zhì)蛋白的定量按照與上文4-1)中的步驟相同的步驟進(jìn)行培養(yǎng)，并在6小時(shí)和10小時(shí)時(shí)取培養(yǎng)肉湯(3ml)、離心以收集細(xì)胞。將細(xì)胞懸浮在含有5mM EDTA的Tris緩沖液(1ml)中，并用超聲勻漿器破碎細(xì)胞。上清液被用作可溶蛋白質(zhì)部分。向20ml的上清液中加入等量的SDS，以與4-1)的方法相同的方法處理所得的混合物。用12％的SDS-PAGE定量脂皮質(zhì)蛋白。
本發(fā)明提供了新的突變的E.coli JL1506；該菌株在厭氧條件下不能利用葡萄糖，而在有氧條件下以高細(xì)胞濃度培養(yǎng)時(shí)其有機(jī)酸的產(chǎn)生被阻抑了。該突變體可被有效地用作產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的有用的宿主系統(tǒng)。通過封閉涉及產(chǎn)生有機(jī)酸的基因，它還可用來開發(fā)新的突變體。
本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案將以下述實(shí)施例對本發(fā)明進(jìn)行闡述。然而，這些實(shí)施例僅是用來描述本發(fā)明，不應(yīng)被看成是對本發(fā)明范圍的限制，本發(fā)明的范圍由所述的權(quán)利要求概括，除非另有說明，實(shí)施例中的份數(shù)或百分比指的是重量份或重量百分比。實(shí)施例1大腸桿菌野生型菌株MG 1655用EMS來處理。將誘變過的細(xì)胞鋪板在Luria-Bertani(LB胰酶解胨(trypton)10g、酵母膏5g、NaCl 5g、蒸餾水1升)瓊脂板上，并在37℃溫育以長出單個(gè)的菌落。將所述菌落復(fù)制轉(zhuǎn)板到兩套補(bǔ)加了葡萄糖(終濃度為1％)的M56基本培養(yǎng)基瓊脂平板上，所述的M56基本培養(yǎng)基含KH2PO4(10.6g)、Na2HPO4(17.4g)、10％的MgSO4·7H2O(4ml)、1％的(NH4)2SO4(2ml)、0.05％FeSO4·7H2O(2ml)、蒸餾水(1升)，pH7.0。使一套平板于37℃在有氧下溫育，而使另一套平板在無氧罐(BBL)中于37℃在厭氧條件下溫育。突變的菌株E.coli JL1031被鑒定為在有氧條件下生長正常但在厭氧條件下既使48小時(shí)后也不生長的菌落。實(shí)施例2為了將選擇標(biāo)記置于引起JL1031(Glf，是突變體的進(jìn)一步的特征)厭氧生長缺陷突變(暫時(shí)命名為glf-1031，要得到更詳細(xì)的說明請參見實(shí)施例4)的附近，將轉(zhuǎn)座子Tn10插入glf-1031附近。為此，用λNK561感染MG1655(Glf+)(Foster，Cell(細(xì)胞)，23，215(1981))，并以15μg/ml的量鋪板在LB/四環(huán)素上。所得的四環(huán)素抗性(Tc-r)菌落用來擴(kuò)增噬菌體P1病毒。用P1溶菌產(chǎn)物感染菌株JL1031，并在LB/四環(huán)素板上鋪板選擇Tc-r轉(zhuǎn)導(dǎo)子。將轉(zhuǎn)導(dǎo)子復(fù)制轉(zhuǎn)板到葡萄糖基本培養(yǎng)基上，得到了在厭氧條件下能在該培養(yǎng)上生長的菌落(Glf+)。從Glf轉(zhuǎn)導(dǎo)子制備的P1溶菌產(chǎn)物被用來將JL1031(Glf+)轉(zhuǎn)導(dǎo)成Tc-r。在所測試的61個(gè)Tc-r轉(zhuǎn)導(dǎo)子中，16個(gè)不能在厭氧條件下在葡萄糖基本培養(yǎng)基上生長。這些結(jié)果表明轉(zhuǎn)座子Tn10(zzz-1051∷Tn10)被置于glf-1031附近，而且這些當(dāng)中有26.2％(16/61)的可共轉(zhuǎn)導(dǎo)。所得的45個(gè)Glf-zzz-1031∷Tn10轉(zhuǎn)導(dǎo)子中的一個(gè)被選擇出來，并被命名為JL1501(glf-1031，zzz-1051∷Tn10)。實(shí)施例3用JL1501做供體，將glf-1031突變重新轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)MG1655中，隨機(jī)選取一個(gè)所得的Glf-zzz-1051∷Tn10轉(zhuǎn)導(dǎo)子，將之命名為JL1506(glf-1031，zzz-1051∷Tn10)，并用該轉(zhuǎn)導(dǎo)子進(jìn)行下文所述的進(jìn)一步的特征分析。按照布達(dá)佩斯條約，大腸桿菌菌株JL1506于1995年10月19日被保藏于座落在GERI，KIST，PO Box 115，Yusong，Taejon的韓國典型培養(yǎng)物保藏中心(Korean Collection for Type Cultures)中，其保藏編號為KCTC0204BP。
高頻重組接合和P1轉(zhuǎn)導(dǎo)分析揭示zzz-1051∷Tn10可與位于大腸桿菌染色體51.75min處的nupC-3146∷Tn10共轉(zhuǎn)導(dǎo)。在厭氧條件下，在葡萄糖基本培養(yǎng)上測定回復(fù)突變頻率，glf-1031的回復(fù)突變頻率為8×10-3。實(shí)施例4測試菌株JL1506及其親代菌株MG1655在有氧條件下和厭氧條件下，在補(bǔ)加了各種碳源(補(bǔ)加的終濃度為1％)的M56培養(yǎng)基中生長的能力。在本試驗(yàn)中，這些菌株被片狀接種到LB平板上，并于37℃在有氧條件下過夜培養(yǎng)。過夜生長的培養(yǎng)物被復(fù)制轉(zhuǎn)板到兩個(gè)含適當(dāng)糖的基本培養(yǎng)基平板上。將一份復(fù)制平板在有氧條件下溫育，而將第二份平板在缺氧罐(BBL)中溫育。18小時(shí)后記錄有氧培養(yǎng)物的生長狀況或48小時(shí)后記錄厭氧培養(yǎng)物的生長狀況。這些菌株在有氧和缺氧生長條件下利用各種碳源的能力被總結(jié)于表1中。
表1生 長 狀 況菌株 有氧條件下 厭氧條件下碳源葡萄 果 甘 甘油 葡萄 果甘甘油糖 糖 油 /NO3糖 糖油/NO3JL1506 ++ ++ -+ - +MG1655 ++ ++ ++ - +突變菌株JL1506在厭氧條件下不能在葡萄糖上生長，而其親代菌株MG1655卻能在同樣的條件下正常生長。然而，該突變體在厭氧條件下在甘油/NO3-(20mM)的基本培養(yǎng)基中生長正常。這些結(jié)果提示JL1506突變體的厭氧呼吸途徑?jīng)]有缺陷，但其葡萄糖發(fā)酵途徑卻是有缺陷的。因此，將JL1506中的該突變座位臨時(shí)定名為glf(葡萄糖發(fā)酵缺陷)。實(shí)施例5將突變菌株JL1506和其對照菌株MG1655在有氧生長于葡萄糖培養(yǎng)基期間產(chǎn)生有機(jī)酸的能力做一比較。將在有氧條件下過夜生長的各菌株的LB培養(yǎng)物接種于250ml的燒瓶中，所述的燒瓶中裝有50ml的M56/葡萄糖(終濃度為0.5％)培養(yǎng)基，接種量控制在其在600nm處的起始O.D.值為0.01。將培養(yǎng)物于37℃、200rpm在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)。每隔3小時(shí)采集培養(yǎng)物等份。測定600nm處的吸光度及有機(jī)酸濃度，用HPLC測定酸的產(chǎn)量。為進(jìn)行有機(jī)酸分析，將1ml的培養(yǎng)物樣品在室溫下離心。將上清液與等體積的5mM的H2SO4混合后再次離心。使所得的上清液通過濾膜(Gelman，0.2nm)過濾，并于-20℃貯藏直至分析之前。為進(jìn)行有機(jī)酸的定量，采用Aminex HPX-87H柱(300×7.8mm；Bio-Rad)對10ml的濾液進(jìn)行HPLC(Spectra Physics Co.)分析。0.01M的H2SO4用作洗脫劑，洗脫流速為0.4ml/分鐘。使用210nm的UV探測器。
結(jié)果，與由各培養(yǎng)物產(chǎn)生的各種有機(jī)酸的最大濃度相比，JL1506產(chǎn)生了0.3mM的乙酸、0.8mM的甲酸和0.3mM的乳酸；而MG1655卻產(chǎn)生了20.6mM的乙酸、14.9mM的甲酸和0.4mM的乳酸。因此，對于本發(fā)明的突變的JL1506而言，其有機(jī)酸產(chǎn)量被明顯地抑制了。特別是它產(chǎn)生的乙酸的量僅為其野生型對照的1％。實(shí)施例6通過監(jiān)測JL1506和MG1655在加了各種濃度葡萄糖的LB培養(yǎng)基中的生長狀況，比較了葡萄糖對JL1506和MG1655生長的作用效果。在有氧條件下將過夜生長的各菌株的LB培養(yǎng)物接種在125ml的燒瓶中，所述燒瓶中裝有10ml補(bǔ)加了0.2％、0.5％或1％終濃度葡萄糖的LB。將培養(yǎng)物于37℃、200rpm在轉(zhuǎn)旋振蕩器中培養(yǎng)。每隔1小時(shí)測量培養(yǎng)肉湯于600nm的吸光度，以確定菌株的生長。結(jié)果被示于表2。
表2O.D.600菌株JL1506MG1655時(shí)間/葡萄糖濃度(％) 0.2％0.5％1.0％1.0％0 0.03 0.05 0.02 0.154 3.05 2.5 2.96 2.518 6.15 7.1 6.87 4.0410 6.22 6.81 7.13 4.0312 6.2 6.5 7.18 3.84可從表2中看出，隨著葡萄糖濃度的增加菌株JL1506表現(xiàn)出生長增加，而菌株MG1655從培養(yǎng)的第8小時(shí)開始表現(xiàn)出生長下降，這是因?yàn)樵摼戤a(chǎn)生的有機(jī)酸積累了的緣故。
而且，JL1506最大生長的吸光度達(dá)到了7.18，該值大約是親代菌株的最大吸光度(4.04)的2倍。實(shí)施例7為了測試菌株JL1506作為重組蛋白質(zhì)表達(dá)宿主的可行性，對編碼蛋白質(zhì)的質(zhì)粒在JL1506和MG1655中的繁殖力進(jìn)行了測試。將編碼β-半乳糖苷酶(1acZ)和β-內(nèi)酰胺酶基因(bla)的質(zhì)粒pMKT2-1(Min等，Nucleic Acid Res.(核酸研究)，16，5075(1988))引入JL1506和MG1655中。將所得的轉(zhuǎn)化體JL1506/pMKT2-1或MG1655/pMKT2-1于37℃、200rpm培養(yǎng)在裝有10ml LB/葡萄糖(0.5％)的250ml的燒瓶中。測600nm處的吸光度來確定細(xì)胞的生長，并測定β-半乳糖苷酶和β-內(nèi)酰胺酶的酶活性以及質(zhì)粒的穩(wěn)定性。
結(jié)果證實(shí)從本發(fā)明的JL1506衍生的JL1506/pMKT2-1十分穩(wěn)定地將質(zhì)粒保留下來；經(jīng)過18代的繼代培養(yǎng)之后，仍有100％的質(zhì)粒被保存下來。
生長的狀況及酶活性被示于表3。
表3單位體積的酶活力(活力單位數(shù)/ml)菌株 JL1506/p MG1655/pMKT2-1 MKT2-1時(shí)間O.D. β-半乳β-內(nèi)酰 O.D. β-半乳β-內(nèi)酰糖苷酶*胺酶糖苷酶*胺酶0 0.380.34 0.04 0.31.4 0.034 8.34155.425.18 4.62 25.225.078 7.23148.7110.97 4.55 28.496.210 8.32151.7111.97 4.62 18.717.1812 7.95242.8613.13 4.69 21.1 7.89*×103活力單位JL1506/pMKT2-1培養(yǎng)物的最終O.D.值(12小時(shí)時(shí))為7.95，而MG1655/pMKT2-1的O.D.值卻是4.69。從OD值判斷，JL1506/pMKT2-1產(chǎn)生的細(xì)胞量比野生型對照MG1655/pMKT2-1大約多70％。至于β-半乳糖苷酶的產(chǎn)量，本發(fā)明突變體產(chǎn)生的總(體積)活力比其野生型對照要高11.5倍。因此，該突變體產(chǎn)生的比活力(活力單位數(shù)/O.D.)比其對照大約高6.8倍。至于由同一質(zhì)粒pMKT2-1編碼的β-內(nèi)酰胺酶，突變體產(chǎn)生的總活力比其對照高66％。然而，在突變體和野生型對照之間的比活力沒有觀察到(統(tǒng)計(jì)學(xué)上的)差異。
這些結(jié)果表明，本發(fā)明的JL1506是非常有用的宿主系統(tǒng)，可用它作宿主產(chǎn)生由質(zhì)粒編碼基因編碼的重組蛋白質(zhì)。實(shí)施例8為了測定本發(fā)明的JL1506在葡萄糖培養(yǎng)基中生長的期間代謝產(chǎn)物對質(zhì)粒編碼基因(β-半乳糖苷酶)表達(dá)的抑制程度，測定了在有或沒有cAMP補(bǔ)加的LB/葡萄糖培養(yǎng)基中其β-半乳糖苷酶活力和細(xì)胞生長狀況。將菌株MG1655在同樣的條件下培養(yǎng)，作為對照。將這些菌株接種在裝有20ml LB/葡萄糖(0.1％)的250ml的燒瓶中，所述的20ml LB/葡萄糖(0.1％)中加有或沒有加cAMP(終濃度為5mM)。使培養(yǎng)物于37℃、200rpm在旋轉(zhuǎn)振蕩器中溫育。測定生長狀況及β-半乳糖苷酶的活性。測定的結(jié)果被示于表4。
表4菌株 JL1506/pMKT2-1 MG1655/pMKT2-1-cAMP+cAMP-cAMP +cAMP時(shí)間 O.D β-半乳O.D β-半乳O.D β-半乳O.D β-半乳(小時(shí))糖苷酶 糖苷酶 糖苷酶 糖苷酶0 0 0.120.02 0.1 0.10.090.050.084 1.8 30.51.42 26.22.512.72.0235.528 3.9 55.13.02 52.13.111.82.9335.0010 4.8 43.73.67 57.63.35.453.1424.7612 5.7 45.84.46 66.23.54.043.2519.41野生型菌株MG1655顯示在沒有cAMP存在時(shí)，β-半乳糖苷酶表達(dá)受到強(qiáng)烈的抑制；隨著細(xì)胞的逐漸老化，抑制效果也顯現(xiàn)出來。加入cAMP緩解了由葡萄糖產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的抑制作用。然而，本發(fā)明的突變菌株JL1506沒有表現(xiàn)出代謝產(chǎn)物的抑制作用，并且在有cAMP存在時(shí)其酶活力比MG1655的酶活力高得多。這些結(jié)果證實(shí)本發(fā)明的突變菌株JL1506在培養(yǎng)基中，葡萄糖代謝產(chǎn)物對質(zhì)粒編碼基因的表達(dá)幾乎沒有抑制。實(shí)施例9測量并比較了在JL1506和兩個(gè)對照菌株(MG1655和C600)的燒瓶分批培養(yǎng)物中的雜合重組蛋白質(zhì)的產(chǎn)量。通過轉(zhuǎn)化，將含有人脂皮質(zhì)蛋白cDNA的質(zhì)粒pHT1(Huh等，Korean Biochem.J.(韓國生化期刊)，23，459(1990))轉(zhuǎn)入本發(fā)明的JL1506、其野生型親代菌株MG1655和C600菌株中。據(jù)上文的文獻(xiàn)報(bào)道C600過表達(dá)脂皮質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)。將各轉(zhuǎn)化體(JL1506/pHT1、MG1655/pHT1和C600/pHT1)接種在裝有20mlLB/葡萄糖(終濃度為0.1％)培養(yǎng)基的250ml的燒瓶中，并于37℃、200rpm使之在旋轉(zhuǎn)振蕩器中培養(yǎng)。經(jīng)適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)時(shí)間后，采集培養(yǎng)基并于600nm測吸光度以確定生長狀況。對培養(yǎng)樣品還進(jìn)行產(chǎn)生的總脂皮質(zhì)蛋白占總細(xì)胞蛋白質(zhì)量的分析。為進(jìn)行脂皮質(zhì)蛋白分析，將1ml的培養(yǎng)液與0.5ml的SDS樣品緩沖液(0.5M Tris-HCl(pH6.8)，1.0ml；10％(w/v)甘油，0.8ml；10％(w/v)SDS；β-巰基乙醇，0.4ml；溴酚藍(lán)，0.1％(w/v)；蒸餾水，4.0ml)混合，并在95℃加熱5分鐘。取20ml的樣品進(jìn)行10％的SDS-PAGE分析。電泳后，用考馬斯亮藍(lán)對凝膠染色，并用圖像光密度計(jì)(Bio-Rad Model GS-670)進(jìn)行掃描。由據(jù)報(bào)道的其分子量(37kd)而鑒定出脂皮質(zhì)蛋白帶，而且其相對的帶體積(密度×帶的面積)被比較于表5。
表5JL1506/pHT1MG1655/pHT1 C600/pHT1時(shí)間 吸光度 脂皮質(zhì) 吸光度 脂皮質(zhì) 吸光度 脂皮質(zhì)(小時(shí)) 蛋白蛋白蛋白00.090.110.0944.816.133.650.945.703.4486.534.076.4110 6.989.934.061.006.50 4.6412 7.384.036.64在所有被測試的在該有氧LB/葡萄糖中分批培養(yǎng)的菌株中，本發(fā)明突變的JL1506的細(xì)胞產(chǎn)量最高。在所有受試菌株中它產(chǎn)出的脂皮質(zhì)蛋白的量也最高。JL1506/pHT1的10小時(shí)時(shí)的樣品產(chǎn)出的脂皮質(zhì)蛋白的量比MG1655/pHT1(10小時(shí))產(chǎn)出的量高9.93倍。由本發(fā)明突變體產(chǎn)生的脂皮質(zhì)蛋白的量大約是C600/pHT1產(chǎn)生的量的2倍。實(shí)施例10測定并比較了由等量的JL1506和其它兩個(gè)對照菌株的可溶性細(xì)胞部分產(chǎn)生的可溶性的脂皮質(zhì)蛋白的量。所用的培養(yǎng)條件和菌株與實(shí)施例9所述的相同。在培養(yǎng)6小時(shí)和10小時(shí)時(shí)采集培養(yǎng)液3ml，在室溫下離心以收獲細(xì)胞。將所得的細(xì)胞沉淀物重新懸浮于含有EDTA(終濃度為5mM)的Tris-HCl緩沖液(1ml)中。用超聲勻漿器破碎細(xì)胞并于4℃離心取上清液來制備可溶性的細(xì)胞蛋白質(zhì)部分。用Bradford方法(Bradford，Anal.Biochem.(分析生物化學(xué))，72，248(1976))測定可溶性細(xì)胞蛋白質(zhì)部分的蛋白質(zhì)濃度。所得的上清液與等體積的SDS樣品緩沖液混合，并將等量的可溶性蛋白質(zhì)進(jìn)行10％的SDS-PAGE電泳，如實(shí)施例9所述，測定脂皮質(zhì)蛋白蛋白質(zhì)的相對產(chǎn)率。測定的結(jié)果被示于表6。
表6在可溶部分中脂皮質(zhì)蛋白的相對產(chǎn)量*脂皮質(zhì)JL1506/pHT1MG1655/pHT1C600/pHT1溶后6小時(shí) 4.32 0.89 1.64溶后10小時(shí) 4.64 1.00 0.89*在可溶部分中脂皮質(zhì)蛋白的相對產(chǎn)量。為比較的目的，將MG1655/pHT1在10小時(shí)時(shí)的脂皮質(zhì)蛋白帶的體積(密度×帶的面積)視為1.0。
基于在單位量的可溶性細(xì)胞蛋白質(zhì)中所含的可溶性脂皮質(zhì)蛋白的量(比產(chǎn)率)，在所有受試菌株中，菌株JL1506/pHT1也表現(xiàn)出最高的可溶性脂皮質(zhì)蛋白產(chǎn)率。它所產(chǎn)的脂皮質(zhì)蛋白比MG1655/pHT1所產(chǎn)的量多4.64倍。C600/pHT1在6小時(shí)時(shí)產(chǎn)出的可溶性脂皮質(zhì)蛋白比在10小時(shí)時(shí)多。JL1506/pHT1比C600/pHT16小時(shí)的培養(yǎng)物產(chǎn)生的產(chǎn)率高2.83倍(4.64/1.64)。這些結(jié)果證明本發(fā)明的菌株JL1506可作為脂皮質(zhì)蛋白生產(chǎn)的極佳宿主菌株。
權(quán)利要求
1.大腸桿菌(E.Coli)突變菌株，該菌株不能在有葡萄糖存在的厭氧條件下生長，所述的突變株在有氧培養(yǎng)條件下能利用葡萄糖作碳源但其有機(jī)酸的產(chǎn)生被阻抑了。
2.權(quán)利要求1的大腸桿菌突變菌株，該菌株是按照布達(dá)佩斯條約保藏的E.ColiJL1506，保藏號為KCTC0204BP。
3.用大腸桿菌菌株作表達(dá)宿主系統(tǒng)產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的方法，所述的方法包括下列步驟(a)將編碼所需重組蛋白質(zhì)的外源基因引入按照權(quán)利要求1的大腸桿菌突變菌株，以得到攜帶了所述外源基因的轉(zhuǎn)化大腸桿菌突變體；(b)在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基中培養(yǎng)步驟(a)所得的大腸桿菌突變株轉(zhuǎn)化體，來生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)；以及(c)從培養(yǎng)物中回收目的蛋白質(zhì)。
4.權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的大腸桿菌突變體為按照布達(dá)斯條約保藏的其保藏編號為KCTC0204BP的E.Coli JL1506。
5.權(quán)利要求3的方法，其特征在于所述的蛋白質(zhì)為脂皮質(zhì)蛋白。
全文摘要
本文公開了一種新的大腸桿菌突變株，該菌株不能在厭氧培養(yǎng)條件下生長，卻能在有氧培養(yǎng)條件下利用葡萄糖作碳源，其有機(jī)酸的產(chǎn)生在有氧培養(yǎng)條件下被阻抑了。該突變菌株可被用作表達(dá)縮主系統(tǒng)，來產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)。
文檔編號C12N1/20GK1166857SQ96191319
公開日1997年12月3日 申請日期1996年10月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年10月30日
發(fā)明者李鐘浩, 崔翰, 鄭一來, 羅燾善, 樸英敏 申請人:株式會(huì)社綠十字, 李鐘浩