專利名稱：微生物混合發(fā)酵制備木糖醇的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵，涉及葡萄糖直接發(fā)酵制備木糖醇的方法。
木糖醇是五碳多元醇，天然存在于草莓、萵苣等水果和蔬菜中。由于它的甜度高并有代謝不依賴胰島素、抗齲齒等特性，是糖尿病、牙病患者理想的蔗糖代用品。木糖醇的制備可以有三條途徑(1)直接從植物中提??；(2)化學(xué)法用木糖催化加氫；(3)利用微生物的方法。
由于木糖醇在植物中天然存在的含量太低，直接提取很不經(jīng)濟(jì)。目前工業(yè)上主要用木糖催化加氫的方法制備(Wisnik，J.etalInd.Eng.Chem.Prod.Res.Dev.，3232-236，1974)，但是這種方法工藝復(fù)雜，成本很高。利用微生物直接發(fā)酵葡萄糖制備木糖醇是經(jīng)濟(jì)上很理想的方法，但是迄今在自然界還沒有發(fā)現(xiàn)能直接發(fā)酵葡萄糖得到木糖醇的微生物。Hiroshi，0.等人曾用三種微生物分步發(fā)酵從葡萄糖制備了木糖醇(Appl.Microbiol.，181031-1035，1969)，證明了微生物發(fā)酵從葡萄糖制木糖醇的可能性，但是三菌分步發(fā)酵過程十分復(fù)雜，沒有實(shí)用價值。近年，Harkki，A.M.等人用重組DNA的方法構(gòu)建了工程菌，能直接發(fā)酵葡萄糖得到木糖醇，并申請了國際專利(WO 94/10325，1994)，但轉(zhuǎn)化率只有3-4％，距離應(yīng)用仍很遙遠(yuǎn)。
我們選育了一株酵母菌和一株細(xì)菌，分別培養(yǎng)后進(jìn)行混合發(fā)酵，可以直接從葡萄糖得到木糖醇。將酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces sp.)FX-6021在含高濃度葡萄糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，于24-32℃培養(yǎng)3-5天，酵母培養(yǎng)基的成分是葡萄糖10-70％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.1％，CaCO30.05％，pH4-8。然后與在含碳酸鈣培養(yǎng)基(碳酸鈣0.1-5％，葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl0.1％，pH5-9)中于24-37℃培養(yǎng)了6-36小時的細(xì)菌弱氧化醋桿菌(Acetobacter suboxydans)MF-21混合，繼續(xù)于24-34℃發(fā)酵16-120小時，檢測培養(yǎng)基中的葡萄糖全部轉(zhuǎn)化為木糖醇后，將發(fā)酵液離心除去菌體，上清液用活性炭脫色，減壓蒸干，用熱乙醇抽提后冷卻結(jié)晶，即得到木糖醇晶體。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)所不同的是1，本發(fā)明的制備方法以葡萄糖為主要原料，葡萄糖價格低廉，故用本發(fā)明制備木糖醇的成本比以木糖為原料的化學(xué)法要低。
2，本發(fā)明用二菌混合一步發(fā)酵，整個工藝比三菌分步發(fā)酵簡單，并可用普通的發(fā)酵設(shè)備。
3，本發(fā)明所選育的菌種，其利用葡萄糖產(chǎn)木糖醇的轉(zhuǎn)化率比已報道的重組工程菌高得多。
因此，本發(fā)明具有原料便宜、成本低廉、工藝簡單、設(shè)備通用、轉(zhuǎn)化率高等特點(diǎn)，適合于工業(yè)應(yīng)用。
以下是幾個實(shí)施例。
實(shí)施例1(1)將釀酒酵母菌FX6021接入裝有10ml酵母培養(yǎng)基A的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)96hr。酵母培養(yǎng)基A的成分是葡萄糖(淀粉酸水解制備)30％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.1％，CaCl20.05％，pH5.0。
(2)將弱氧化醋桿菌MF-21接入裝有10ml細(xì)菌培養(yǎng)基的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24hr。細(xì)菌培養(yǎng)基的成分是葡萄糖2％，酵母膏1％，蛋白胨0.5％，NaCl0.1％，CaCO32％，pH6.8。
(3)將(1)、(2)中的發(fā)酵液于無菌條件下混合后，繼續(xù)在搖床上以30℃、220rpm培養(yǎng)50hr。發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中木糖醇濃度為25g/L。
(4)將發(fā)酵液離心(Beckman GS-15R，8000rpm，10min，20℃)得上清液19ml，加入0.38g活性炭，調(diào)pH＝5.0，煮沸，冷卻到室溫后抽濾得無色清液。將清液于50℃減壓蒸干，用無水熱乙醇抽提固體物質(zhì)，冷卻后得木糖醇結(jié)晶，過濾，將晶體干燥，得木糖醇晶體0.46g。
實(shí)施例2(1)將酵母菌FX6021接入裝有10ml酵母培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(1))的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)96hr。
(2)將細(xì)菌MF-21接入裝有10ml細(xì)菌培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24hr。
(3)取(2)中發(fā)酵液3ml于無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有20ml細(xì)菌培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)8hr。
(4)取(3)中發(fā)酵液10ml與發(fā)酵液(1)于無菌條件下混合后，繼續(xù)在搖床上以30℃、220rpm培養(yǎng)60hr。發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中木糖醇濃度為31g/L。
(5)將發(fā)酵液離心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，調(diào)pH＝5.0，煮沸，冷卻到室溫后抽濾得無色清液。將清液于50℃減壓蒸干，用無水熱乙醇抽提固體物質(zhì)，冷卻后得木糖醇結(jié)晶，過濾，將晶體干燥，得木糖醇晶體0.57g。
實(shí)施例3(1)將酵母菌FX6021接入裝有20ml酵母培養(yǎng)基B的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)100hr。酵母培養(yǎng)基B的成分是葡萄糖(淀粉酶水解制備)30％，蛋白胨1％，酵母膏1％，牛肉膏0.5％，NaCl0.1％，CaCl20.05％，pH5.0。
(2)將細(xì)菌MF-21接入裝有20mI細(xì)菌培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)20hr。
(3)將(1)、(2)中的發(fā)酵液于無菌條件下混合后，繼續(xù)在搖床上以30℃、220rpm培養(yǎng)55hr。發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中木糖醇濃度為26g/L。
(4)將發(fā)酵液離心得上清液38.5ml，加入0.77g活性炭，調(diào)pH＝5.0，煮沸，冷卻到室溫后抽濾得無色清液。將清液于50℃減壓蒸干，用無水熱乙醇抽提固體物質(zhì)，冷卻后得木糖醇結(jié)晶，過濾，將晶體干燥，得木糖醇晶體0.96g。
實(shí)施例4(1)將酵母菌FX6021接入裝有10ml酵母培養(yǎng)基B(如實(shí)施例3(1))的250ml三角瓶中，于30℃、220rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)96hr。
(2)將細(xì)菌MF-21接入裝有10ml細(xì)菌培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)24hr。
(3)取(2)中發(fā)酵液2ml于無菌條件下轉(zhuǎn)入裝有20ml培養(yǎng)基(如實(shí)施例1(2))的250ml三角瓶中，于30℃、250rpm旋轉(zhuǎn)搖床培養(yǎng)10hr。
(4)取(3)中發(fā)酵液10ml與發(fā)酵液(1)于無菌條件下混合后，繼續(xù)在搖床上以30℃、220rpm培養(yǎng)46hr。發(fā)酵結(jié)束時發(fā)酵液中木糖醇濃度為25g/L。
(5)將發(fā)酵液離心得上清液19ml，加入0.38g活性炭，調(diào)pH＝5.0，煮沸，冷卻到室溫后抽濾得無色清液。將清液于50℃減壓蒸干，用無水熱乙醇抽提固體物質(zhì)，冷卻后得木糖醇結(jié)晶，過濾，將晶體干燥，得木糖醇晶體0.47g。
權(quán)利要求
1，一種制備木糖醇的方法，其特征是以葡萄糖為原料，經(jīng)一株酵母菌釀酒酵母(Saccharomyces sp.)和一株細(xì)菌弱氧化醋桿菌(Acetobacter suboxydans)混合發(fā)酵制備木糖醇。
2，如權(quán)利要求1所述的木糖醇制備方法，其主要過程為(1)酵母菌在含葡萄糖的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(2)細(xì)菌在含碳酸鈣的培養(yǎng)基中培養(yǎng)；(3)將兩種培養(yǎng)物混合后進(jìn)行發(fā)酵，得到木糖醇。
3，如權(quán)利要求1所述的木糖醇制備方法，其特征是所用的葡萄糖為淀粉酸水解制備得到的或酶法制備得到的。
4，如權(quán)利要求2(1)所述的酵母菌培養(yǎng)，其特征是所用的培養(yǎng)基中葡萄糖的含量可以在10％-70％范圍內(nèi)，以20％-50％的結(jié)果較佳。
5，如權(quán)利要求2(1)所述的酵母菌培養(yǎng)，其特征是所用的培養(yǎng)基pH為4-8，以pH5為最適。
6，如權(quán)利要求2(1)所述的酵母菌培養(yǎng)，其特征是培養(yǎng)溫度為24-32℃，以30℃為最適。
7，如權(quán)利要求2(1)所述的酵母菌培養(yǎng)，其特征是培養(yǎng)時間為3-5天，以4天為最適。
8，如權(quán)利要求2(2)所述的細(xì)菌培養(yǎng)，其特征是所用的培養(yǎng)基含碳酸鈣為0.1％-5％，以1-2.5％為最適。
9，如權(quán)利要求2(2)所述的細(xì)菌培養(yǎng)，其特征是所用的培養(yǎng)基pH為5-9，以pH7為最適。
10，如權(quán)利要求2(2)所述的細(xì)菌培養(yǎng)，其特征是培養(yǎng)溫度為24-37℃，以30℃為最適。
11，如權(quán)利要求2(2)所述的細(xì)菌培養(yǎng)，其特征是培養(yǎng)時間可以為6-36小時，以10-24小時較合適。
12，如權(quán)利要求2(3)所述的混合發(fā)酵，其特征是發(fā)酵溫度為24-37℃，以30℃為最適。
13，如權(quán)利要求2(3)所述的混合發(fā)酵，其特征是發(fā)酵時間可以為16-120小時，以40-80小時較合適。
全文摘要
一株酵母菌和一株細(xì)菌分別培養(yǎng)后混合發(fā)酵,直接從葡萄糖制備木糖醇。這種制備木糖醇的方法原料價廉、過程簡單,適合大規(guī)模推廣應(yīng)用。
文檔編號C12P7/02GK1184853SQ96120879
公開日1998年6月17日 申請日期1996年12月11日 優(yōu)先權(quán)日1996年12月11日
發(fā)明者江寧, 賀鵬, 孫萬儒, 盧大軍, 強(qiáng)亞靜, 楊柳 申請人:中國科學(xué)院微生物研究所