專利名稱：新的啟動(dòng)子以及利用該啟動(dòng)子進(jìn)行基因表達(dá)的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及新的啟動(dòng)子以及利用該新的啟動(dòng)子表達(dá)基因的方法。具體地說，本發(fā)明涉及含有該新啟動(dòng)子的DNA，所述啟動(dòng)子能在動(dòng)物細(xì)胞中起作用，還涉及利用載體生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法，所述載體中插入了通過將有效基因連接到該啟動(dòng)子的下游獲得的DNA。本發(fā)明還涉及表達(dá)有效基因的方法，包括將有效基因連接到啟動(dòng)子下游，并將得到的DNA或攜帶該DNA的載體導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中。
當(dāng)采用基因工程技術(shù)將如大腸桿菌，枯草芽孢桿菌或酵母的微生物宿主用于生產(chǎn)動(dòng)物源的有效基因產(chǎn)物時(shí)，基因表達(dá)常常受阻。由于該基因產(chǎn)物蛋白質(zhì)的錯(cuò)誤構(gòu)型，轉(zhuǎn)譯后錯(cuò)誤修飾等原因使所需活性的獲得經(jīng)常受阻。為了解決這個(gè)問題，常將動(dòng)物細(xì)胞用作為宿主，在這種情況下啟動(dòng)子的選擇顯著地影響表達(dá)效率。通常用于動(dòng)物細(xì)胞的常規(guī)啟動(dòng)子包括SV40啟動(dòng)子，巨細(xì)胞病毒啟動(dòng)子和肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子。
當(dāng)利用動(dòng)物細(xì)胞作為宿主生產(chǎn)大量有效基因產(chǎn)物時(shí)，就轉(zhuǎn)錄活性而言通常用于動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子不是令人滿意的。因此，需要研制更有效力的啟動(dòng)子。
因此，本發(fā)明一個(gè)目的是提供作為動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子的DNA，它具有強(qiáng)啟動(dòng)子活性。本發(fā)明另一個(gè)目的在于提供利用該啟動(dòng)子表達(dá)有效基因的方法。
為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明人進(jìn)行了廣泛的研究試圖獲得具有高轉(zhuǎn)錄效率的啟動(dòng)子。結(jié)果，本發(fā)明人發(fā)現(xiàn)在人N-乙?；咸前忿D(zhuǎn)移酶III(人GnT-III)基因上游存在一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子。然后，他們測(cè)出了含有該啟動(dòng)子的DNA的堿基序列，將該DNA連接到Photinus螢光素酶基因的上游并表達(dá)該基因。結(jié)果是他們已經(jīng)證實(shí)該啟動(dòng)子的活性比動(dòng)物細(xì)胞常規(guī)啟動(dòng)子的活性高得多?；谶@些發(fā)現(xiàn)，完成了本發(fā)明。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及具有選自下列組中序列的離體DNA(a)含有SEQ ID NO1的序列或其片段的DNA序列；(b)含有SEQ ID NO2的序列或其片段的NDA序列；(c)含有SEQ ID NO3的序列或其片段的DNA序列；(d)含有SEQ ID NO4的序列或其片段的DNA序列(e)能夠與上述(a)-(d)任一序列進(jìn)行雜交的DNA序列，其中所說的離體DNA具有在動(dòng)物細(xì)胞中起作用的啟動(dòng)子活性。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有可操作連接的上述離體DNA和有效基因的重組DNA，涉及含有該重組DNA的載體，涉及導(dǎo)入了該重組DNA或載體的動(dòng)物細(xì)胞，以及含有所述動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物。
在另一實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及利用本發(fā)明的重組DNA生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法以及表達(dá)有效基因的方法。


圖1顯示了含有本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA(pPG204-1.1)與人GnT-III基因的cDNA之間的關(guān)系。
圖2是pHug5′-204插入物的限制性酶切圖譜。
本文中使用的術(shù)語“啟動(dòng)子”包括TATA盒或類似區(qū)域，它定位于復(fù)制起始點(diǎn)(+1)上游20-30個(gè)堿基對(duì)處并且它具有誘導(dǎo)RNA聚合酶在正確位置上啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄的功能，但不限于該區(qū)域附近的部分。除該區(qū)域以外，還提供了與除RNA聚合酶以外的蛋白質(zhì)相關(guān)聯(lián)的另一個(gè)必需區(qū)域以用于調(diào)節(jié)表達(dá)。本文中使用的術(shù)語“啟動(dòng)子區(qū)域”定義為含有上文中定義的啟動(dòng)子的區(qū)域。
本文中使用的術(shù)語“啟動(dòng)子活性”是指當(dāng)以該基因的可表達(dá)方式將有效基因連接到啟動(dòng)子的下游，并導(dǎo)入到宿主(動(dòng)物細(xì)胞)中，該宿主顯示具有在宿主內(nèi)或宿主外生產(chǎn)該有效基因產(chǎn)物的能力和功能。
通常，以該基因的可表達(dá)方式將編碼容易定量檢測(cè)的蛋白質(zhì)(報(bào)道基因)的基因連接到該啟動(dòng)子的下游，將該基因?qū)胨拗鲀?nèi)，并檢測(cè)所表達(dá)的蛋白質(zhì)的量，可確定特定啟動(dòng)子的活性或是否存在該啟動(dòng)子或者該啟動(dòng)子的效力。當(dāng)以該基因的可表達(dá)方式將有效基因連接到啟動(dòng)子的下游并導(dǎo)入到宿主中，當(dāng)在宿主內(nèi)或宿主外證實(shí)該有效基因的表達(dá)產(chǎn)物時(shí)，則可認(rèn)為該啟動(dòng)子在其導(dǎo)入的宿主內(nèi)具有啟動(dòng)活性。
本文中使用的術(shù)語“動(dòng)物細(xì)胞”是指包括但不限于人細(xì)胞，只要本發(fā)明的啟動(dòng)子在該動(dòng)物細(xì)胞中顯示啟動(dòng)活性。這樣的動(dòng)物細(xì)胞包括非人哺乳動(dòng)物(例如小鼠，大鼠，兔，山羊，豬，牛，馬，狗，猴和黑猩猩)的細(xì)胞，鳥類(例如，雞，火雞，鵪鶉，鴨和野鴨)細(xì)胞，爬行動(dòng)物(例如，蛇、鱷魚和海龜)，兩棲動(dòng)物(例如，青蛙，火蛇和蠑螈)以及魚類(例如竹莢魚，鯖魚，海鱸魚，海鯉魚，科魚，鯡魚，金槍魚，鮭魚，真鱒魚，鯉魚，香魚，鱔魚，平魚，鯊魚，鷂魚以及鱘魚)的細(xì)胞。
本文中使用的術(shù)語“有效基因”是指包括編碼可在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因，來源于動(dòng)物細(xì)胞的基因的反義DNA或反義RNA，引誘物，例如，含有編碼動(dòng)物細(xì)胞源轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白基因的DNA序列或者編碼轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)和類似序列的DNA序列以及編碼切割動(dòng)物細(xì)胞源的mRNA核酶的DNA序列。
編碼可在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)的蛋白質(zhì)的基因包括，但不限于動(dòng)物源的基因。只要它們可以在動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)，來源于微生物例如細(xì)菌，酵母，放線菌，霉菌，子囊菌和擔(dān)子菌的基因，以及那些來自于非微生物生物體例如植物和昆蟲的基因也包括在上面介紹的有效基因范圍內(nèi)。
本文中使用的術(shù)語“誘導(dǎo)物”表示具有編碼動(dòng)物細(xì)胞源的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合蛋白基因的DNA序列或者具有轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)序列或者類似序列的DNA序列，當(dāng)導(dǎo)入到細(xì)胞中作為“誘餌”時(shí)，“誘導(dǎo)物”的DNA序列能夠抑制轉(zhuǎn)錄因子的作用。
本文中使用的術(shù)語“核酶”的定義為能夠裂解特定蛋白質(zhì)的mRNA從而抑制該蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)譯的酶。由編碼特定蛋白質(zhì)的基因序列可以設(shè)計(jì)核酶。例如，采用FEBS Letter，Vol.228，PP228-230(1988)中描述的方法可以制備錘頭型核酶。除錘頭型核酶以外，本文所述核酶的范圍內(nèi)包括發(fā)夾型，δ型或其他型核酶，只要它們能裂解特定蛋白質(zhì)的mRNA從而抑制該蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)譯。
通過將有效基因可操作地連接到具有本發(fā)明啟動(dòng)子活性的DNA片段的下游，則可以增強(qiáng)該有效基因的表達(dá)。通過借助于載體或不使用載體可將具有本發(fā)明啟動(dòng)子活性的DNA片段導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中，從使該有效基因在該動(dòng)物細(xì)胞中實(shí)現(xiàn)表達(dá)。作為一個(gè)載體，優(yōu)選使用質(zhì)粒載體或病毒載體。對(duì)于沒有使用載體的情況，采用Virology，52，456(1973)，Molecular and Cellular Biology，7，2745(1987)，Journal of theNational Cancer Institute，41，351(1968)，EMBO Journal，1，841(1982)以及Biotechniques，6，682(1988)描述的方法可直接導(dǎo)入該DNA片段。攜帶了本發(fā)明DNA片段的動(dòng)物細(xì)胞以及具有所述動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物也在本發(fā)明范圍內(nèi)。由本發(fā)明加強(qiáng)表達(dá)的有效基因包括編碼蛋白質(zhì)的DNA，反義DNA，反義RNA，編碼誘導(dǎo)物的多聚核苷酸，起著誘導(dǎo)物以及核酶作用的核苷酸序列。本發(fā)明還公開了生產(chǎn)所需蛋白質(zhì)的方法以及通過使用具有本發(fā)明啟動(dòng)子活性的DNA片段而表達(dá)有效基因的方法。
本發(fā)明的DNA具有動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子活性并且含有序列表中SEQ ID NO1的整個(gè)或部分DNA序列。換句話說，本發(fā)明的DNA片段是含有新啟動(dòng)子的DNA片段，只要它包含有所述啟動(dòng)子，它可以是SEQ ID NO1的DNA序列的任何片段或者可以是含有SEQ ID NO1的DNA序列的一部分的任何片段。所述DAN片段包括，但不限于SEQID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4的DNA片段以及含有SEQ ID NO2或SEQID NO3的DNA片段一部分的DNA片段，以及含有SEQ ID NO4的整個(gè)DNA序列或部分DNA序列的DNA片段。能夠與這些DNA片段雜交并且具有動(dòng)物細(xì)胞啟動(dòng)子活性的DNA片段也在本發(fā)明的DNA片段的范圍內(nèi)。
適用于動(dòng)物細(xì)胞中的本發(fā)明的啟動(dòng)子的發(fā)現(xiàn)過程如下由Ihara等人從胎兒肝cDNA文庫(kù)和基因組粘粒文庫(kù)中分離的人GnT-III基因[Journal of Biochemistry，Vol.113，pp.692-698(1993)]可用于本發(fā)明中。在編碼人GnT-III基因的cDNA克隆中，H15和H20(日本專利特許公開No.6-62865)各含有5′-非轉(zhuǎn)譯區(qū)，并且除預(yù)料中的起始密碼子上游的8個(gè)堿基對(duì)以外，兩個(gè)5’非-轉(zhuǎn)譯區(qū)的DNA序列互不相同。已獲得了基因組克隆形式的兩種粘粒Hug3和Hug5，其中Hug3含有GnT-III基因的編碼區(qū)以及其上游的約35kb區(qū)域。
記住這些以后，利用H15和H20的5’-非轉(zhuǎn)譯區(qū)作為探針對(duì)Hug3粘粒克隆進(jìn)行Southern雜交DNA堿基測(cè)序等，證明H15在起始密碼子的上游約29kb處有外顯子(H15外顯子-2)，在上游1kb處有外顯子(H15外顯子-1)，H20在起始密碼子上游約26kb處有外顯子(H20外顯子-1)。利用人腦mRNA作為模板利用特異于GnT-III基因的引物也可以對(duì)cDNA末端進(jìn)行5’-快速擴(kuò)增(RACE)，證明存在著在起始密碼子上游7個(gè)堿基對(duì)位置處沒有剪接的mRNA，其中剪接出現(xiàn)于H15和H20。從該mRNA獲得的cDNA命名為H204。
這些結(jié)果證明至少有三個(gè)人GnT-III基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。由于假設(shè)H15，H20和H204轉(zhuǎn)錄中涉及的啟動(dòng)子分別存在于H15外顯子-2的上游，H20外顯子-1的上游，以及基因組上預(yù)期的轉(zhuǎn)譯起始位點(diǎn)的上游。用Photinus螢光素酶基因作為報(bào)道基因可確定含有這些區(qū)域的DNA片段在COS1細(xì)胞中的啟動(dòng)子活性。如圖1所示(方盒為外顯子部分；打點(diǎn)線是內(nèi)含子部分)，在從H15外顯子-2的HindIII位點(diǎn)至H20外顯子-1的SacII位點(diǎn)的H20上游的約3kb片段(含有該片段的質(zhì)粒命名為pPG20B)中未檢測(cè)到啟動(dòng)子活性。但是，在從H15上游的EcoRI位點(diǎn)到H15外顯子-2的HindIII位點(diǎn)的約3kb片段(含有該片段的質(zhì)粒命名為pPG15)以及在從該編碼區(qū)上游的SphI位點(diǎn)至該編碼區(qū)內(nèi)的NaeI位點(diǎn)的約1.1kb片段(含有該片段的質(zhì)粒命名為pPG204-1.1)即編碼H204的片段中檢測(cè)到啟動(dòng)子活性，發(fā)現(xiàn)后者的效力是前者的約10倍并且是SV40啟動(dòng)子的約1.5倍。
而且，該1.1kg片段含有離NaeI位點(diǎn)約0.8kb的一個(gè)XhoI位點(diǎn)，以及離NaeI位點(diǎn)約0.5kb處的SspI位點(diǎn)，和離約0.2kb處的HincII位點(diǎn)；當(dāng)用這些限制性酶中任一種與BamHI(一種在該載體的多克隆位點(diǎn)處有切割位點(diǎn)的限制性酶)結(jié)合在一起用于消化pPG204-1.1時(shí)，可以切割出含有GnT-III起始密碼子的0.8kb片段(片段A)，0.5kb片段(片段B)和0.2kb片段(片段c)。就啟動(dòng)子活性而言，這些片段的效力為上述1.1kb片段的2-3倍，并且為SV40啟動(dòng)子的3-5倍。因此本發(fā)明人證實(shí)含有人GnT-III基因編碼區(qū)上游約0.2-1kb部分的DNA片段具有潛在的啟動(dòng)子活性?；谏鲜霭l(fā)現(xiàn)本發(fā)明人作了進(jìn)一步調(diào)查，并且研制了本發(fā)明。下文中將詳細(xì)描述獲得本發(fā)明DNA片段的方法。
1)具有動(dòng)物細(xì)胞的啟動(dòng)子活性的DNA片段的堿基序列用限制性酶SphI和NaeI(由Takara Shuzo生產(chǎn)的兩種酶)裂解含有人GnT-III基因的上游部分的基因組粘?？寺?，例如Ihara等人的粘粒克隆Hug3；分離出含有緊接GnT-III編碼區(qū)上游區(qū)域的1.1kb DNA片段。該DAN片段具有SEQ ID NO1的堿基序列。將該片段亞克降到一個(gè)質(zhì)粒載體例如，pUC19(由TakaraShuzo生產(chǎn))上以促進(jìn)其用于與有效基因的連接和其他目的使用。
通過例如雙脫氧法可確定亞克隆的1.1kb SphI-NaeI片段(pHug5′-204)的堿基序列[Proceeding of the NationalAcademy of Sciences of the USA，Vol.74，P.5463(1977)]。在單個(gè)反應(yīng)中要確定1.1kb NDA片段的堿基序列通常是困難的，為此，可以利用這樣的方法，包括用合適的限制性酶進(jìn)一步消化該片段并亞克隆，隨后進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)的方法，以及利用核酸外切酶III制備系列缺失的質(zhì)粒，隨后進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)的方法，以及利用以已知的堿基序列為基礎(chǔ)按順序合成引物，隨后進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)的方法。在本發(fā)明中，進(jìn)一步用限制性酶BstXI，XhoI，SspI，KpnI和HincIII消化該片段(pHug5′-204插入物的限制性酶切圖譜顯示于圖2中)，亞克隆，并進(jìn)行雙脫氧反應(yīng)，以確定pHug5′-204的堿基序列，如序列表中SEQ ID NO1所示。
如圖2所示，該1.1kb片段在離NaeI位點(diǎn)約0.8kb處有-XhoI位點(diǎn)，在離NaeI位點(diǎn)約0.5kb處有一個(gè)SspI位點(diǎn)并且在約0.2kb處有一個(gè)HincII位點(diǎn).當(dāng)用這些限制性內(nèi)切酶中任一種與BamHI，(在該載體的多克隆位點(diǎn)處有一個(gè)裂解位點(diǎn)的一種限制性酶)一起用于消化pHug5′-204時(shí)，可以切割出序列表中SEQ ID NO2的0.8kb片段(片段A)，SEQ ID NO3的0.5kb片段(片段B)以及SEQ ID NO4的0.2kb片段(片段c)，所有這些片段均含有GnT-III起始密碼子。(2)含有本發(fā)明啟動(dòng)子的DNA片段的制備制備含有本發(fā)明的啟動(dòng)子的DNA片段的最簡(jiǎn)便的方法是通過用限制性酶SphI和NaeI(由Takara Shuzo制備)，如果必要進(jìn)一步用類似于XhoI，SspI和HincII的限制性酶消化可以從上述粘粒或質(zhì)粒中切下該片段。其它有用的方法包括用其它限制性酶消化，超聲處理，用亞磷酰胺方法化學(xué)合成，利用聚合酶鏈反應(yīng)的方法。例如利用從SEQ ID NO1 DNA序列制備的合適的引物，通過聚合酶鏈反應(yīng)法可以容易地制備所需的DNA片段。
通過用本發(fā)明啟動(dòng)子的堿基序列進(jìn)行雜交，也可以從另一個(gè)細(xì)胞中衍生的基因獲得本發(fā)明的啟動(dòng)子。在這種情況下，可以使用例如下面的方法。首先，采用常規(guī)方法將從另一個(gè)細(xì)胞中的基因獲得的染色體DNA連接到質(zhì)粒，噬菌體載體或類似載體中，并導(dǎo)入到宿主中，制備一個(gè)文庫(kù)。然后將該文庫(kù)平板培養(yǎng)；將得到的菌落或者噬菌斑轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素濾膜或尼龍膜上，隨后進(jìn)行變性，將該DNA固定到膜上。然后將該膜在含有已經(jīng)用32P等標(biāo)記的探針(有效的探針包括序列表中SEQ ID NO1的DNA片段，和其部分，例如片段A(SEQ ID NO2)，片段B(SEQ ID NO3)和片段C(SEQ ID NO4))的溶液中保溫以便使該膜上的DNA和探針之間形成雜合體。
例如在含有6×SSC，1％十二烷基硫酸鈉(SDS)，100μg/ml鮭精DNA和5×Denhardt′s的溶液中于65℃將固定于膜上的DNA與探針雜交20小時(shí)。在雜交完成之后，洗掉非特異性吸附，隨后進(jìn)行放射自顯影等等，以便鑒定出與該探針形成雜合體的克隆。重復(fù)該程序直到單克隆形成雜合體。由此獲得的單克隆含有插入其中的所需的啟動(dòng)子。
通過例如下文中描述的方法確定所獲得的基因的堿基序列以證明該基因與所需的啟動(dòng)子同性。按照下文中介紹的方法可以對(duì)雜交獲得的克隆進(jìn)行堿基測(cè)序，當(dāng)重組體為大腸桿菌時(shí)將該重組體培養(yǎng)于試管中等等；提取質(zhì)粒并用限制性酶切割；荻取該插入物并亞克隆到M13噬菌體載體等等，隨后用雙脫氧法進(jìn)行堿基測(cè)序。當(dāng)重組體是噬菌體時(shí)，基本上可用相同的方法進(jìn)行堿基測(cè)序。從培養(yǎng)到堿基測(cè)序的基本操作，可按如下的描述進(jìn)行，例如Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，edited by T.Maniatis et al.，Chapter 1，PP.90-104，published by cold Spring Harbor Laboratory，1989。
根據(jù)測(cè)定的堿基序列與本發(fā)明的啟動(dòng)子堿基序列的同源性可估評(píng)所獲得的基因作為所需啟動(dòng)子的特性。當(dāng)假設(shè)獲得的基因不含有整個(gè)啟動(dòng)子時(shí)，則可通過根據(jù)該獲得的基因制備合成的DNA引物，采用PCR擴(kuò)增缺失的區(qū)域，或者利用獲得的基因片段作為探針篩選一個(gè)DNA文庫(kù)或者cDNA文庫(kù)，可以確定與本發(fā)明的啟動(dòng)子進(jìn)行雜交的整個(gè)啟動(dòng)子的堿基序列。
用于表達(dá)有效基因的本發(fā)明的方法特征在于以基因可表達(dá)的方式將該有效基因連接到本發(fā)明啟動(dòng)子的下游；將由此制備的DNA片段導(dǎo)入到動(dòng)物細(xì)胞中；培養(yǎng)獲得的細(xì)胞。為了將所需的有效基因以基因可表達(dá)的方式連接到按上述制備的DNA片段的下游，該片段含有本發(fā)明的啟動(dòng)子，可以使用DNA連接酶和同聚物的方法。當(dāng)將DNA連接酶用于連接兩個(gè)具有相同限制性酶位點(diǎn)的DNA片段時(shí)，則通過用合適的限制性酶將它們消化，在由Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd edition，edited by T.Maniatis et al.，Chapter 1，p.62，published by cold Spring Harbor Laboratory，1989描述的反應(yīng)緩沖液中將它們混合，加入DNA連接酶可實(shí)現(xiàn)連接。另外，當(dāng)兩個(gè)DNA片段不具有相同的限制性酶位點(diǎn)時(shí)，通過用T4DNA聚合酶(Takara Shuzo制備)使其成平齊末端并且用上文中描述的DNA連接酶處理可將它們連接在一起。當(dāng)使用同聚物的方法時(shí)，利用末端脫氧核糖核苷酰轉(zhuǎn)移酶和dGTP將多聚G鏈加到已經(jīng)用限制性酶線性化的載體的3’末端；按同樣的方法將多聚C鏈加到該插入DNA的3’末端；將這些多聚G和多聚C鏈一起退火并且采用例如氯化鈣方法導(dǎo)入到大腸桿菌中[Proceedings the National Academy of Sciences of the USA，Vol.75，P.3727(1978)]。
用于本發(fā)明的所需有效基因的例子包括但不限于白細(xì)胞介素1-12基因，干擾素α，β，γ基因，腫瘤壞死因子基因，集落刺激因子基因，促紅細(xì)胞生成素基因，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β基因，免疫球蛋白基因，組織纖維蛋白溶酶原刺激因子，尿激酶基因和Photinus螢光素酶基因。
將本發(fā)明的DNA片段和有效基因連接得到的DNA片段插入到動(dòng)物細(xì)胞的合適載體中，產(chǎn)生用于基因表達(dá)的質(zhì)粒。所說載體包括pTM[Nucleic Acids Research，Vol.10，p.6715(1982)]、cos 202[The EMBO Journal，Vol.6，p.355(1987)]，p91203(B)[Science，Vol.288，p.810(1985)]and BCMGSNeo[Journal ofExperimental Medicine，Vol.172，p.969(1990)]。
采用常規(guī)方法例如磷酸鈣方法([Molecular and CellularBiology，Vol.7，p.2745(1987)]，電穿孔方法[Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the USA，Vol.81，p.7161(1984)]，DEAE-葡聚糖方法[Methods in Nucleic AcidsResearch，p.283，edited by Karam，J.D.et al.，publishedby CRC Press，1991]和脂質(zhì)體方法[BioTechniques，Vol.6，p.682(1989)]將荻得的用于基因表達(dá)的質(zhì)粒導(dǎo)入到合適的宿主細(xì)胞中。所說的宿主細(xì)胞包括COS1細(xì)胞，HELA細(xì)胞，CHO-21細(xì)胞和BHK-21細(xì)胞。通過將獲得的轉(zhuǎn)化細(xì)胞在合適的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，可以有效地生產(chǎn)所需的有效基因產(chǎn)物。
通過利用本發(fā)明的DNA片段作為啟動(dòng)子，可以在動(dòng)物細(xì)胞中大量地表達(dá)所需的有效基因產(chǎn)物。
實(shí)施例下面的實(shí)施例用于描述本發(fā)明但不以任何方式限制本發(fā)明。
實(shí)施例1用限制性酶SphI和NaeI(都由Takara Shuzo生產(chǎn))消化粘?？寺ug3，該克隆插入了一個(gè)基因組區(qū)，該區(qū)含有Ihara et al.[Journal of Biochemistry，Vol.113，P.692(1993)]報(bào)道的GnT-III基因，并且進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從凝膠上切下1.1Kb片段，隨后用EASYTRAPTM(由Takara Shuzo制備)回收DNA。借助于T4DNA連接酶將該DNA片段連接到已經(jīng)用SphI和HincII消化的pUC19上，之后采用氯化鈣法將其導(dǎo)入到大腸桿菌XL1-Blue中。挑選得到的氨芐西林抗性菌落并培養(yǎng)；采用堿法從培養(yǎng)的細(xì)胞中制備質(zhì)粒。在pUC19的多克隆位點(diǎn)處，按照HindIII、SphI，HincII和BamHI位點(diǎn)的順序彼此緊密的排列。用BamHI和HindIII對(duì)該質(zhì)粒進(jìn)行雙重消化，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳；發(fā)現(xiàn)該質(zhì)粒含有一個(gè)1.1KbHindIII-BamHI片段(鑒定出該片段的堿基序列為SEQ ID NO1序列)并命名為pHug5′-204。用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL1-Blue，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子大腸桿菌XL1-Blue/pHug5′-204(該轉(zhuǎn)化子已保藏于National Institute of Bioscience and Human-Technology，Agency of Industrial Scienec and Technology，保藏號(hào)為FERM BP-5532)。
用BamHI和HindIII對(duì)pHug5′-204進(jìn)行消化；利用EASYTRAP從瓊脂糖凝膠上回收得到的1.1Kb片段，隨后用T4DNA聚合酶(由Takara Shuzo制備)在dATP，dGTP，dCTP和dTTP存在下使末端鈍化。單獨(dú)的，在緊靠Photinus螢光素酶基因上游的SmaI位點(diǎn)處消化加強(qiáng)載體(由Toyo Ink制備)，該載體是含有Photinus螢光素酶基因，SV40增強(qiáng)子，大腸桿菌復(fù)制起始位點(diǎn)和氨芐西林抗性基因的缺失啟動(dòng)子的質(zhì)粒。
并且利用T4-DNA連接酶將其連接到前面得到的1.1Kb片段上，之后采用氯化鈣的方法將得到的產(chǎn)物導(dǎo)入到大腸桿菌XL1-Blue中。
為了測(cè)定該1.1kb片段的方向，從具氨芐西林抗性的細(xì)菌中制備質(zhì)粒，用XhoI消化并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳。從該限制性酶切圖譜可判斷，正如預(yù)料中的如果該1.1kb片段以與Photinus螢光素酶基因的插入相同的方向插入則可發(fā)現(xiàn)0.8kb的片段，以及如果該1.1kb片段以相反方向插入則可發(fā)現(xiàn)一個(gè)0.3kb的片段。根據(jù)這些結(jié)果，選擇一個(gè)具有0.8kb XhoI片段的質(zhì)粒用于生產(chǎn)pPG204-1.1。
向裝有含有100μg/ml氨芐西林的LB培養(yǎng)基[1％細(xì)菌培養(yǎng)用胰蛋白胨，0.5％細(xì)菌培養(yǎng)用酵母提取物(兩者由DIFCO生產(chǎn))，0.5％NaCl]的2升圓錐瓶中，接種攜帶pPT204-1.1的大腸桿菌，隨后在37℃振蕩培養(yǎng)過夜，培養(yǎng)之后采用由Molecular andCellularBiology，Vol.7，p.2745(1987)描述的氯化銫平衡的密度梯度離心方法制備該質(zhì)粒。采用Molecuar Cellular Biology，Vol，7，p.2745(1987)中描述的磷酸鈣方法以每10cm的平皿中20μg的濃度將pPG204-1.1轉(zhuǎn)染COS1細(xì)胞(ATCC CRL 1650)。
利用Pica GeneTM試劑盒(由Toyo Ink生產(chǎn))按照該試劑盒的使用手冊(cè)的說明確定cos1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的螢光素酶活性。轉(zhuǎn)染之后48小時(shí)，將細(xì)胞懸浮于該試劑盒中含有的0.7ml細(xì)胞裂解溶液中；將20μl的上清液和100μl的發(fā)光物質(zhì)一起混合，混和之后立即用液體閃爍計(jì)數(shù)器確定發(fā)光強(qiáng)度。對(duì)于陽性對(duì)照而言，用該試劑盒中含有的對(duì)照載體(SV40啟動(dòng)子)轉(zhuǎn)染該細(xì)胞；對(duì)于陰性對(duì)照而言，用增強(qiáng)子載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
結(jié)果，就啟動(dòng)活性而言發(fā)現(xiàn)摻入了本發(fā)明DNA片段的pPG204-1.1比SV40啟動(dòng)子更有效力。
相對(duì)發(fā)光強(qiáng)度(％)增強(qiáng)子載體 0.4SV40啟動(dòng)子 100pPG204-1.1 156實(shí)施例2用XhoI消化pHug5′-204，隨后在dATP，dGTP，dCTP和dTTP存在下利用T4-DNA聚合酶使其成平齊末端，之后，進(jìn)一步用BamHI消化，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，隨后利用EASYTRAP回收0.8kb片段(片段A)。單獨(dú)地，用SspI和BamHI消化pHug5′204，隨后按制備片段A的相同方法回收0.5kb片段(片段B)。再用HincII和BamHI消化pHug5-204，隨后按制備片段A的相同方法回收0.2kb片段(片段C)。
片段A是817bp長(zhǎng)的DNA片段，它覆蓋了SEQ ID NO1的第300位C到第1,116位C的DNA片段區(qū)域；片段B是522bp長(zhǎng)的DNA片段，它覆蓋了SEQ ID NO1的第595位A到第1,116位C的DNA片段區(qū)域，片段C是200bp長(zhǎng)的DNA片段，包覆蓋了SEQ ID NO1的第917位G到第1,116位C的DNA片段的區(qū)域。將片段A，B或C連接到前面已用SmaI和BamHI消化的增強(qiáng)子載體上，并導(dǎo)入到大腸桿菌XL1-Blue中。從由此獲得的氨芐西林抗性菌株中提取質(zhì)粒DNA，并用ScaI和HindIII切割；證實(shí)插入了所需的片段。具體地說，正如預(yù)料中的，如果插入了片段A可發(fā)現(xiàn)一個(gè)2.0kb片段，如果插入了片段B可發(fā)現(xiàn)一個(gè)1.7kb片段，如果插入了片段C可發(fā)現(xiàn)一個(gè)1.4kb片段。于是獲得了攜帶片段A的pPG204-0.8攜帶片段B的pPG204-0.5，攜帶片段C的pPG204-0.2。
采用實(shí)施例1中描述的氯化銫平衡密度梯度離心法分別從攜帶pPG204-0.8，pPG204-0.5和pPG204-0.2的大腸桿菌菌株中制備質(zhì)粒，隨后轉(zhuǎn)染COS-1細(xì)胞。按與實(shí)施例1相同方法確定COS-1轉(zhuǎn)染細(xì)胞的提取物的螢光素酶活性，所不同的是利用發(fā)光測(cè)量計(jì)(LB9501，由Belthold生產(chǎn))確定發(fā)光強(qiáng)度。
結(jié)果，就啟動(dòng)子活性而言發(fā)現(xiàn)較小的片段比1.1kb SphI-NaeI片段的效力大2-3倍。
對(duì)上面描述的實(shí)施方案進(jìn)行本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員顯而易見的其他修飾都在下列權(quán)利要求的范圍內(nèi)。
相對(duì)的發(fā)光強(qiáng)度(％)pPG204-1.1100pPG204-0.8316pPG204-0.5333pPG204-0.2219
序列表(1)一般資料(iii)序列數(shù)4(2)SEQID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度1116堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)推測(cè)非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO1GCATGCGCCA CTACACTCAG CTACTTTGTA TTTTTAGTAG AGACAGGGTT TCACCATGTT 60GGCCAGGCTG GTCTCGAACT CCTGACCTTG TGATCTGCCC ACCTCGGCCT CCCAAAGTGC120TGGGATTATA GGCGTGAGCC ACTGCACTGG CCGACCTCAA ATTTTTATGC CTGGAGATTA180GTAAAGGGCA TGGAATAATG AAGGGGAACT TTTATTTTAT TTTGTTTTTG AGATAGGGTC240TCAGTCTGTT GTCCAGGCTG GGGCGCAGTG GTGCAATCAT GGCTCACTGC AGCCTCAACC300TCGAGGTCTC AAGTGATCCT CCCACCTCAC CTCAGCCTCC TAAGTAGCTG GGACCACAAG360CACATGGCAC CACACCTGGC ACCACACCTG GCTAATTTTT AAATTTTCTG TAGAGATGGG420GTCTCACTAT GTTGTCCAGC TGGTCTCAAA CTCCTGGGCT CAAGTGATCC TCCTGCCTCA480GCCTCTGAAG GTGTTGGGAT TACAGGCGTG AGCACCACGC CTGGCCTAAT TTTATTCATT540AAATATGTTA GAATTAAGTG TTTTCCCTTG AGACCTGTGA GTTTTTCAGT GAAAAATATT600CAAAAGGTTT GTCAGTATGT CCATAAAAAA GAAGATAGGA GGGGAGGGAC AGGACCCAGG660AGGGCAGCCT ACAGCCTGCT CTCCCCGTTC TGTCCTGGGG CGGAGTCTGT ACTGCGAGTT720GAGCTTTTCC CAAGTCGTCA TGTTACTCCT GGAGCCAAGC CTAGCAGTGC AGCCTCACAG780TCAGGTTGGG GTGGTCCAGC GGAGAAGCAG GCTGCAGAGG GGGCAGGGTG GTGGCCTGGG840GATCTCAGGG AAGGGCTATG GGAGCACGGC GGTGTCCTCA GTGCTGGGGC TTTCAGGGGC900CTTGGTACCG CGAGTTGACT CTTGGGGGCA GGAGGTCACT CCATGCAGGG GCAGCAGGTG960CTGGCCACCA CATTGTCCAG CAAGGTGGCA GCAGAGGCCT CCTAGGTCCC CTTCCTAGGA 1020AAGGAGCCTG GGCTGCCCTG ATGAGTCTCC TGTCTCTCTC TCTCCCGCAG GATGAAGATG 1080AGACGCTACA AGCTCTTTCT CATGTTCTGT ATGGCC 1116(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度817堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)推測(cè)非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO2CTCGAGGTCT CAAGTGATCC TCCCACCTCA CCTCAGCCTC CTAAGTAGCT GGGACCACAA 60GCACATGGCA CCACACCTGG CACCACACCT GGCTAATTTT TAAATTTTCT GTAGAGATGG120GGTCTCACTA TGTTGTCCAG CTGGTCTCAA ACTCCTGGGC TCAAGTGATC CTCCTGCCTC180AGCCTCTGAA GGTGTTGGGA TTACAGGCGT GAGCACCACG CCTGGCCTAA TTTTATTCAT240TAAATATGTT AGAATTAAGT GTTTTCCCTT GAGACCTGTG AGTTTTTCAG TGAAAAATAT300TCAAAAGGTT TGTCAGTATG TCCATAAAAA AGAAGATAGG AGGGGAGGGA CAGGACCCAG360GAGGGCAGCC TACAGCCTGC TCTCCCCGTT CTGTCCTGGG GCGGAGTCTG TACTGCGAGT420TGAGCTTTTC CCAAGTCGTC ATGTTACTCC TGGAGCCAAG CCTAGCAGTG CAGCCTCACA480GTCAGGTTGG GGTGGTCCAG CGGAGAAGCA GGCTGCAGAG GGGGCAGGGT GGTGGCCTGG540GGATCTCAGG GAAGGGCTAT GGGAGCACGG CGGTGTCCTC AGTGCTGGGG CTTTCAGGGG600CCTTGGTACC GCGAGTTGAC TCTTGGGGGC AGGAGGTCAC TCCATGCAGG GGCAGCAGGT660GCTGGCCACC ACATTGTCCA GCAAGGCGGC AGCAGAGGCC TCCTAGGTCC CCTTCCTAGG720AAAGGAGCCT GGGCTGCCCT GATGAGTCTC CTGTCTCTCT CTCTCCCGCA GGATGAAGAT780GAGACGCTAC AAGCTCTTTC TCATGTTCTG TATGGCC 817(3)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度522堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈
(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)推測(cè)非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO3AATATTCAAA AGGTTTGTCA GTATGTCCAT AAAAAAGAAG ATAGGAGGGG AGGGACAGGA 60CCCAGGAGGG CAGCCTACAG CCTGCTCTCC CCGTTCTGTC CTGGGGCGGA GTCTGTACTG120CGAGTTGAGC TTTTCCCAAG TCGTCATGTT ACTCCTGGAG CCAAGCCTAG CAGTGCAGCC180TCACAGTCAG GTTGGGGTGG TCCAGCGGAG AAGCAGGCTG CAGAGGGGGC AGGGTGGTGG240CCTGGGGATC TCAGGGAAGG GCTATGGGAG CACGGCGGTG TCCTCAGTGC TGGGGCTTTC300AGGGGCCTTG GTACCGCGAG TTGACTCTTG GGGGCAGGAG GTCACTCCAT GCAGGGGCAG360CAGGTGCTGG CCACCACATT GTCCAGCAAG GTGGCAGCAG AGGCCTCCTA GGTCCCCTTC420CTAGGAAAGG AGCCTGGGCT GCCCTGATGA GTCTCCTGTC TCTCTCTCTC CCGCAGGATG480AAGATGAGAC GCTACAAGCT CTTTCTCATG TTCTGTATGG CC522
(4)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度200堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型雙鏈(D)幾何結(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型基因組DNA(iii)推測(cè)非(iv)反義非(xi)序列描述SEQ ID NO4GACTCTTGGG GGCAGGAGGT CACTCCATGC AGGGGCAGCA GGTGCTGGCC ACCACATTGT 60CCAGCAAGGT GGCAGCAGAG GCCTCCTAGG TCCCCTTCCT AGGAAAGGAG CCTGGGCTGC 120CCTGATGAGT CTCCTGTCTC TCTCTCTCCC GCAGGATGAA GATGAGACGC TACAAGCTCT 180TTCTCATGTT CTGTATGGCC 200
權(quán)利要求
1.一種具有選自于下列組的序列的離體DNAa)包括SEQID NO1的序列或其片段的DNA序列；b)包括SEQID NO2的序列或其片段的DNA序列；c)包括SEQID NO3的序列或其片段的DNA序列；d)包括SEQID NO4的序列或其片段的DNA序列；和e)能與上述(a)-(d)中任一項(xiàng)進(jìn)行雜交的DNA序列，其中所述的離體DNA在動(dòng)物細(xì)胞中具有啟動(dòng)子活性。
2.重組DNA，它含有權(quán)利要求1的離體DNA以及與之進(jìn)行可操作連接的有效基因。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述重組DNA，其中所述有效基因選自于下列組編碼蛋白質(zhì)的DNA，反義DNA，反義RNA，編碼誘導(dǎo)物和核酶的多聚核苷酸。
4.含有權(quán)利要求2或3的重組DNA的載體。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的載體，其中載體是質(zhì)粒載體或病毒載體。
6.動(dòng)物細(xì)胞，其中向該細(xì)胞中導(dǎo)入了權(quán)利要求2或3的重組DNA。
7.具有權(quán)利要求6的動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物。
8.用權(quán)利要求4或5的載體轉(zhuǎn)化的動(dòng)物細(xì)胞。
9.具有權(quán)利要求8的動(dòng)物細(xì)胞的動(dòng)物。
10.利用動(dòng)物細(xì)胞制備蛋白質(zhì)的方法，包括下列步驟(a)按照編碼所需蛋白質(zhì)的DNA可以被表達(dá)的方式將編碼所需蛋白質(zhì)的DNA連接到權(quán)利要求1的離體DNA的下游以便獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入到載體中；(c)用該載體轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞；(d)培養(yǎng)該動(dòng)物細(xì)胞；以及(d)從培養(yǎng)物中回收所需的蛋白質(zhì)。
11.表達(dá)有效基因的方法，該方法包括下列步驟(a)以該有效基因可表達(dá)方式將該有效基因連接到權(quán)利要求1的離體DNA的下游以便獲得重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段導(dǎo)入動(dòng)物細(xì)胞中；以及(c)培養(yǎng)該動(dòng)物細(xì)胞。
12.表達(dá)有效基因的方法，該方法包括下列步驟(a)以該有效基因可表達(dá)的方式將該有效基因連接到權(quán)利要求1的離體DNA的下游以獲得一個(gè)重組DNA片段；(b)將該重組DNA片段插入載體中；(c)用該載體轉(zhuǎn)化動(dòng)物細(xì)胞；以及(d)培養(yǎng)該動(dòng)物細(xì)胞。
全文摘要
在動(dòng)物細(xì)胞中具有啟動(dòng)子活性的離體DNA；利用該離體DNA表達(dá)有效基因的方法；以及利用該離體DNA在動(dòng)物細(xì)胞中生產(chǎn)蛋白質(zhì)的方法。本發(fā)明提供了在動(dòng)物細(xì)胞中大量地生產(chǎn)預(yù)期的基因產(chǎn)物的方法。
文檔編號(hào)C12N9/02GK1145951SQ9611098
公開日1997年3月26日 申請(qǐng)日期1996年6月29日 優(yōu)先權(quán)日1995年6月30日
發(fā)明者小山信人, 三善英知, 井原義人, 西河淳, 谷口直之 申請(qǐng)人:寶酒造株式會(huì)社