專利名稱：一種快速有序的基因表達差異顯示法的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及生物技術領域，更具體地，本發(fā)明涉及一種新的系統(tǒng)地比較基因表達差異，尋找不同組織或同一組織不同發(fā)育時期或不同環(huán)境中差異表達的基因和克隆差異基因的方法。
cDNA點陣是研究差異基因表達的一個有效的工具。然而，目前仍有成千上萬的基因是未知的，尤其是在諸如腦之類的復雜器官中基因。例如，大腦是非常復雜的，在不同環(huán)境和不同時期，它有特異性的基因表達譜。此外，由于cDNA點陣費用昂貴，因此cDNA點陣目前還不適于大腦等復雜系統(tǒng)的研究。
眾所周知的mRNA差異展示法是由Liang建立起來的用隨機引物擴增cDNA的一種傳統(tǒng)的DD-PCR(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71.)。該方法現(xiàn)已較少采用。
在DD-PCR基礎上發(fā)展出的有序差異顯示法(Ordered differential display，ODD)則不包括隨機cDNA引物(Matz，M.，Usman，N.，Shagin，D，Bogdanova，E.andLukyanov，S.1997 Nucleic Acids Research，25，2541-542)。ODD方法展示的是cDNA poly(A)端酶切片段。ODD法基于兩種技術原理抑制性PCR效應和接頭特異延伸引物選擇性擴增效應。ODD法測試所有可能的引物組合，從而可系統(tǒng)地研究基因表達譜。
ODD方法主要有六個步驟(1)雙鏈cDNA的合成。雙鏈cDNA可以從總RNA制備或由mRNA直接制得。
(2)雙鏈cDNA用識別四堿基對并形成平末端的限制性核酸內切酶進行消化，如RsaI和AluI等。雙鏈cDNA平均256個堿基就有一個此類酶的識別位點，雙鏈cDNA的酶切片段一般在100-500bp之間，大部分片段為250bp左右。這樣酶切片段經擴增后將適于用PAGE膠分析。
(3)雙鏈cDNA片段與接頭的連接。接頭是由一長鏈(40bp左右)和一短鏈(12bp左右)組成，短鏈與長鏈3′端互補成平端。人工合成的長鏈和短鏈(及cDNA合成所使用的T引物)的5′端不帶磷酸基團，所以接頭僅長鏈的3′端與酶切片段具磷酸基團的5′端進行連接。
(4)第一輪PCR特異擴增雙鏈cDNA。poly(A)端酶切連接片段。此輪PCR使用的引物對為與接頭長鏈5′端互補的接頭特異引物(Adaptor SpecificPrimer，簡稱為“ASP”，21bp左右)和下游錨定引物Tn-VN(V＝A、G或C；N＝A、G、C或T)。第一輪PCR中，基于抑制性PCR效應，雙鏈cDNA兩端連有接頭長鏈的酶切片段形成鍋柄結構，擴增受到抑制，所以體系中將只有雙鏈cDNA poly(A)端酶切連接片段能呈指數(shù)擴增。
(5)第二輪選擇性擴增PCR。此輪PCR使用的上游引物為與接頭長鏈3′端序列互補的接頭特異延伸引物(Adaptor Specific Primer Extention，簡稱為“ADE”，20bp左右)。此引物除與接頭3′端序列互補外，還延伸四堿基，其中內側兩堿基與連接處酶切位點互補，外側為兩個選擇性堿基NN(N＝A、G、C或T)。上游引物ADE-NN與下游Tn-VN錨定引物(Anchored Primer)配合使用可以有192種可能(16種ADE-NN和12種T-VN引物)。具體操作時，選擇其中一種或幾種組合，使用[γ-32P]末端標記所選定的ADE引物，選擇性擴增cDNApoly(A)端酶切連接片段，降低cDNA酶切片段的復雜程度，提高PAGE膠展示的分辨率。
(6)PAGE膠電泳分析。放射自顯影后，存儲基因表達圖譜。切割回收差異顯示的條帶，做進一步研究分析。
因此，ODD法展示的是3′EST(已表達序列標志)，因此不需要全長cDNA。然而，ODD法的缺點包括步驟仍較繁瑣，需要多次洗滌，假陽性率較高。
因此，本領域迫切需要一種快速、有效地顯示基因差異表達的方法。
本發(fā)明目的就是提供一種快速、有效地顯示基因差異表達的方法。
在本發(fā)明的一方面，提供了一種顯示基因表達水平有序差異的方法，它包括步驟(a)對mRNA，使用隨機引物和配基標記的oligo(dT)引物，合成雙鏈cDNA；
(b)用具有配體的涂層的反應容器吸附標有生物素的cDNA擴增產物，其中該配體與步驟(a)中配基特異性結合；(c)用限制性內切酶消化cDNA擴增產物，產生吸附于反應容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段；(d)洗脫除去未吸附的酶切片段；(e)將吸附于容器的3′端酶切片段與接頭連接，形成連接產物，所述接頭由長鏈和短鏈構成；(f)對連接產物進行第一輪PCR擴增，形成第一輪PCR擴增產物；(g)對第一輪PCR擴增產物進行第二輪PCR擴增，形成第二輪PCR擴增產物；(h)對第二輪PCR擴增產物進行凝膠電泳分離。
較佳地，在步驟(f)中PCR擴增所用的程序TouchUp程序。
在一優(yōu)選例中，在步驟(a)中，在合成了cDNA的第一鏈后，使用隨機引物和配基標記的oligo(dT)引物，合成雙鏈cDNA。
在一優(yōu)選例中，在步驟(c)中，所述的限制性內切酶是識別四堿基的核酸內切酶。較佳地，所述的限制性內切酶選自下組RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
在一優(yōu)選例中，步驟(h)中的凝膠電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳，從而獲得3′EST離散圖譜。
在一優(yōu)選例中，消化、連接和擴增在同一反應容器中進行。
在說明書附圖中，


圖1是本發(fā)明RODD法的流程圖。
圖2是胚胎(19-20天)腦和軀體的3′ESTs的差異圖譜。圖譜展示了九種引物組合(AE-GC，AE-GA，AE-AC)和(T-VG，T-VC，T-VG)。R代表胎腦；O代表胚胎軀體。
圖3顯示了雜交分析結果。其中，圖3A膜與胎腦探針雜交；圖3B膜與胚胎軀體探針雜交。C6-C10為正負對照C9(約0.5pmol)是3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為正對照，C6-C8(各約20pmol)分別為隨機引物、接頭特異引物和T引物，C10為質粒pBSK(+)(約1pmol)。A1-A10，B1-B10和C1-C5(約0.5pmol)為回收擴增的3′ESTs。
圖4顯示了EST(AW055732)分布狀況的RT-PCR法分析。泳道1-11各自代表胎腦、胚胎軀體、新生(小于一天)大鼠腦、新生(小于一天)大鼠軀體、以及成年大鼠的腦、心、腎、肌肉、肝、肺和胃。短片段為擴增的EST(AW055732)；長片段為3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)基因的一段，作為對照。
圖5是3′ESTs離散圖譜。1和2泳道各自為胚胎(17-18)腦和軀體；3和4泳道分別為胚胎(19-20)腦和軀體；5和6泳道分別為新生鼠(小于1天)腦和軀體；7和8泳道分別為成年大鼠的腦和肝。
圖6顯示了RT-PCR分析EST(AW055739)的分布情況。1-11分別代表胎腦、胚胎軀體、新生鼠(小于1天)腦、新生鼠的軀體、成年大鼠的腦、心、腎、肌肉、肝、肺和胃。圖中大片段為正對照(GAPDH)；小片段為EST(AW055739)。
圖7是為PAGE膠基因差異表達圖譜，數(shù)字1-9，13-19代表所獲得的在腦中差異表達的片段。其中6、7、8、9、13、14、15、16為Asp-GC和T12-CA引物對組合產物；5、18為Asp-GC和T12-VG引物對組合產物；3、4、17、19為Asp-GC和T12-VA引物對組合產物；1、2為Asp-GC和T12-VC引物對組合產物。M為分子量標記。
圖8是RT-PCR分析EST(AW055749)的分布情況。泳道1-11分別代表胎腦、胚胎軀體、新生鼠(小于1天)腦、新生鼠的軀體、成年大鼠的腦、心、腎、肌肉、肝、肺和胃。圖中大片段為正對照(GAPDH)；小片段為EST(AW055749)。
本發(fā)明人經過廣泛而深入的研究，發(fā)展了一種經濟有效的方法來研究大腦或其他復雜系統(tǒng)中的基因表達情況，該方法被稱為快速有序差異顯示法(RapidOrdered differential display，RODD)。RODD法的改進之處主要涉及以下步驟首先，用隨機引物和生物素標記的oligo(dT)引物來擴增雙鏈cDNA，這個反應只需要很少量的總RNA(50-100ng)就可起始。其次，具有鏈霉菌抗生物素蛋白涂層的PCR薄壁管被用于從擴增混合物中分離3′EST，這大大簡化了操作過程。因此，RODD法可特異而有效地展示3′EST。
定義如本文所用，“TouchUp程序”指在這樣PCR反應程序，其中PCR反應各循環(huán)中退火溫度逐漸上升。例如，一般從約40℃上升至約60℃。TouchUp程序是與已知的“TouchDown程序”相反，在“TouchDown程序”中，各循環(huán)中退火溫度逐漸下降(例如，一般從約60℃上升至約40℃)。在TouchUp程序中，一般每2個循環(huán)之間退火溫度增加約0.3-1℃，較佳地，增加約0.5-0.9℃，較佳地約0.6-0.8℃。
快速有序差異顯示法(RODD)由有序差異顯示法ODD法改進而來，并與基因表達指紋法(Ivanova N.and Belyavsky A.1995 Nucleic Acids Res.23，2954-958)一樣，是一種展示3′ESTs的方法。因此，全長cDNA對RODD方法而言并非必需。
RODD的流程如
圖1所示。
首先，從mRNA合成cDNA。通常，在cDNA第一鏈合成后，用PCR法合成雙鏈cDNA，其中使用隨機引物和配體(在
圖1中以生物素為例)標記的oligo(dT)引物并不影響方法的有效性。因為這一步擴增，非常少的總RNA也能滿足實驗的需要。
其次，使用具有配體(在
圖1中，以鏈親和素(也稱為“鏈霉菌抗生物素蛋白”)為例)的涂層的PCR薄壁管，從擴增混合物中親和吸附生物素標記的雙鏈cDNA片段。
再次，用限制性內切酶消化cDNA擴增產物，產生吸附于反應容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段。例如用RsaI或其它限制性核酸內切酶消化。合適的限制性內切酶是識別四堿基的核酸內切酶。例如，代表性的限制性內切酶包括(但并不限于)RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
然后，經洗脫(或洗脫)去除非生物素標記的酶切片段。
隨后，仍吸附在管中生物素標記的3′ESTs再與接頭連接。其中，所用的接頭與本領域中用于ODD的接頭類似。接頭是由一長鏈(40bp左右，如30-50BP)和一短鏈(12bp左右，如10-16bp)組成，短鏈與長鏈3′端互補成平端。人工合成的長鏈和短鏈(及cDNA合成所使用的T引物)的5′端不帶磷酸基團，所以接頭僅長鏈的3′端與酶切片段具磷酸基團的5′端進行連接。該步驟與ODD法基本相同。
接著，對第一輪PCR擴增產物進行第二輪選擇性擴增PCR。該步驟與ODD法相同。具體地，此輪PCR使用的上游引物為與接頭長鏈3′端序列互補的接頭特異延伸引物(Adaptor Specific Primer Extention，簡稱為“ADE”，20bp左右，例如15-25bp)。此引物除與接頭3′端序列互補外，還延伸四堿基，其中內側兩堿基與連接處酶切位點互補，外側為兩個選擇性堿基NN(N＝A、G、C或T)。上游引物ADE-NN與下游錨定引物Tn-VN(Anchored Primer)配合使用可以有192種可能(16種ADE-NN和12種T-VN引物)。具體操作時，選擇其中一種或幾種組合，使用[γ-32P]末端標記所選定的ADE引物，選擇性擴增cDNA poly(A)端酶切連接片段，降低cDNA酶切片段的復雜程度，提高PAGE膠展示的分辨率。
經第二輪PCR的選擇性擴增后，3′ESTs片段經例如聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)后能清晰地得以展示。
為了進一步的克隆、測序和分析，差異顯示的3′ESTs片段從膠上回收并用適用于所有ESTs片段的通用引物進行PCR擴增。
可用本發(fā)明方法顯示表達差異的組織包括各種生物組織，包括動物和植物組織，例如脊椎動物、哺乳動物。例如，包括(但并不限于)動物各組織、人的正常組織、人的病理組織、人的不同生長期的組織。
可用于本發(fā)明的配基和配體并沒有特別限制，只要它們能夠形成特異性的結合。本領域已知的各種配基-配體組合都可用于本發(fā)明。例如，代表性的配基-配體組合包括(但并不限于)生物素和鏈親和素，地高辛和特異性抗地高辛抗體、半抗原和特異性抗半抗原的抗體。較佳地，所述的配基是生物素，所述的配體的鏈親和素。
本發(fā)明方法的優(yōu)點之一是，消化、連接和擴增三個步驟可在一個反應管中完成，大大簡化了操作步驟，同時也節(jié)省了時間和費用。
本發(fā)明方法的優(yōu)點之二是，TouchUp程序和洗脫過程都可降低消化后的雙鏈cDNA混合物的復雜性，從而提高RODD法的特異性。
本發(fā)明方法的優(yōu)點之三是，本發(fā)明的假陽性率小于現(xiàn)有技術ODD的假陽性率小于30％，而RODD的假陽性率小于16％。
綜上所述，證明了RODD是一種非常經濟、快速、有效和特異的方法，適于在各種研究系統(tǒng)和領域中應用，如發(fā)育、分化、凋亡和病變等生理機理的研究。
下面結合具體實施例，進一步闡述本發(fā)明。應理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkColdSpring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1胚胎SD大鼠(19-20天)腦與身體的基因表達差異實驗材料的獲取成年SD大鼠(雌性，約250克)全腦、心、肝、肺和腎等組織器官的分離取頭，沿頭骨中縫剪開頭骨，快速取出大腦并置于液氮待用；.取鼠軀體，開腹腔，取心、肝、肺和腎等組織器官，液氮凍存。SD胎鼠的全腦和軀體的獲取將SD孕鼠乙醚麻醉，開腹腔，取出胎鼠(十余只)，置于Hanks/HEPES溶液里，在顯微解剖臺下，分離胎鼠中樞神經系統(tǒng)(腦&脊髓)和軀體，分別置于凍存管里液氮凍存。
總RNA的提取少量組織(≤50mg)總RNA的抽提詳見上海Watson公司″組織/細胞總RNA抽提試劑盒″說明書；大量組織(1g左右)總RNA的抽提采用異硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F(xiàn).and Smith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A Practical Approach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得總RNA置于-80℃冰箱保存。
雙鏈cDNA的合成RT具體流程參見TaKaRa RNA PCR試劑盒；然后用隨機引物(1pmol)和生物素標記的oligo(dT)引物(5pmol)合成雙鏈cDNA。PCR程序94℃預變性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25個循環(huán)，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
雙鏈cDNA的酶切及接頭連接生物素標記的雙鏈cDNA轉移至具有鏈霉菌抗生物素蛋白涂層的PCR管中，37℃溫育至少十分鐘，然后用洗脫緩沖液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，純化后用RsaI完全消化。
經洗脫去除非生物素標記的酶切產物，吸附在管中生物素標記的cDNA的3′末端的酶切產物與接頭(20pmol)于16℃6小時，4℃16小時條件連接。接頭是由長鏈和短鏈組成，長鏈的3′端與短鏈形成平端長鏈5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短鏈 3′-CGCCTCCCGCCA-5′連接產物的擴增擴增使用T錨定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接頭特異的外側引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃預變性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循環(huán))20sec，72℃ 45sec(+1sec/循環(huán))，28循環(huán)，72℃ 10min。
第二輪選擇性PCR使用特定的T錨定引物和γ32p標記的接頭特異的內側延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)進行擴增。PCR程序94℃預變性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28個循環(huán)，72℃ 10min。
差異表達的EST片段的PAGE膠分析、擴增、克隆摻有同位素的選擇性擴增產物用6％的變性PAGE電泳，X光片(Kodak)壓片、洗片，分析結果，于膠上找出并切下腦與身體有差異表達條帶，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室溫靜置10分鐘，然后沸水煮10分鐘，離心取上清液。有差異的條帶使用適用于所有ESTs片段的通用引物(接頭內側特異引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二輪的條件進行擴增，并克隆到pMD 18-T載體(TaKaRa)。
反向雜交雙鏈cDNA使用隨機引物DNA標記試劑盒(Gibco BRL，美國)進行標記。而雙鏈cDNA的合成使用10pmol的d(N)9隨機引物，50pmol的T引物，1ng的cDNA第一鏈和0.5 U Taq DNA聚合酶(Boehringer Mannheim，德國)，終體積為20ml.。CR程序94℃預變性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃30sec，10個循環(huán)，72℃ 5min。
回收并擴增后的3′ESTs的樣品，加NaOH(終濃度為0.2 mM)變性，點樣在帶正電荷的尼龍膜上，一式兩份。然后，兩張膜分別與胚胎(19-20天)腦和軀體的cDNA探針雜交。
在該實施例中，選擇性擴增了九種接頭延伸引物和錨定T-VN引物的組合，所得到的胚胎(19-20天)腦和軀體的3′ESTs圖譜如圖2。
從圖2中，發(fā)現(xiàn)接頭延伸引物AE-GC和AE-AC產生的條帶要比引物AE-GA的條帶多而且強。這一現(xiàn)象與前人的結論一致，其結論是那些以A或T為末端的引物在擴增中效率較低(Mou，L.，Miller，H.，Li，J.，Wang，E.，Chalifour，L.，1994Biochem.and Biophys.Res.Comm.，199，564-69)。這或許是所有使用PCR為手段的策略的共同弱點。
二十五個3′ESTs片段從膠上回收擴增后，一式兩份地點在尼龍膜上，用反向雜交法驗證(Mou，L.，Miller，H.，Li，J.，Wang，E.，Chalifour，L.，1994 Biochem.andBiophys.Res.Comm.，199，564-69)。結果如圖3。其中圖3A是膜與胎腦探針雜交；圖3B是膜與胚胎軀體探針雜交。C6-C10為正負對照C9(約0.5pmol)是3磷酸甘油醛脫氫酶(GAPDH)作為正對照，C6-C8(各約20pmol)分別為隨機引物、接頭特異引物和T引物，C10為質粒pBSK(+)(約1pmol)。A1-A10，B1-B10和C1-C5(約0.5pmol)為回收擴增的3′ESTs。從圖3A和3B的對比可以清楚地看出有十幾個EST有表達差異。
對這些差異表達的EST測序。測序后，大鼠胎腦和軀體之間差異顯示的十六個3′ESTs片段的序列登錄并存放在GeneBank中(索引號為AW055727-AW055736和AW087141-AW087146)。
為進一步驗證RODD方法的有效性，本發(fā)明人使用RT-PCR的方法對一個EST片段(AW055732)做了更深入的研究，結果如圖4所示。EST(AW055732)在圖2中用箭頭標出，通過dbest庫的搜索，發(fā)現(xiàn)其與小鼠和人類的rp58基因高度同源。＞gb|AF140224.1|AF140224 Mus musculus轉錄受體RP58(rp58)mRNA，全長＝4993分值＝196 bits(99)，預計值＝7e-49相同性＝111/115(96％)Query1gtacgaaactaaacagtattgtaagttattccccctcaggaaataaaacatactatgatt 60|||| ||||||||||| ||| |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct4883 gtacaaaactaaacagcattataagttattccccctcaggaaataaaacatactatgatt 4824Query61 gtcaaagctagatgtcagtctaagatttacaacaaaggaagaatgtgaaactaag 115||||||||||||||||||||||||||||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct4823 gtcaaagctagatgtcagtctaagatttagaacaaaggaagaatgtgaaactaag 4769＞emb|AJ223321|H8AJ3321 Homo sapiens RP58基因全長＝5321分值＝174bits(88)，預計值＝3e-42相同性＝110/116(94％)，缺口＝1/116(0％)Query1gtacgaaactaaacagtattgtaagttattccccctcaggaaa-taaaacatactatgat 59|||| |||||||||| ||| ||||||||||||||||||||| ||||||||||||||||Sbjct4808 gtacaaaactaaacagcattataagttattccccctcaggaaaataaaacatactatgat 4749Query60 tgtcaaagctagatgtcagtctaagatttacaacaaaggaagaatgtgaaactaag 115||||||||||||||||||||||||| |||| |||||||||||||||||||||||||Sbjct4748 tgtcaaagctagatgtcagtctaagttttagaacaaaggaagaatgtgaaactaag 4693圖4所呈現(xiàn)的EST(AW055732)在各不同發(fā)育時期的腦和軀體中的表達情況，以及在成年大鼠不同組織中分布情況EST(AW055732)片段在不同發(fā)育時期的腦中均一高表達，而在成年大鼠中僅在心和肌肉中有微弱表達，這與文獻所報導的相符(Aoki，K.，Meng，G.，Suzuki，K.，Takashi，T.，Kameoka，Y.，Nakahara，K.，Ishida，R.and Kasai，M.，1998，J.Biol.Chem.273，26698-6704.)。
綜上所述，證明了RODD是一種非常經濟、快速、有效和特異的方法，適于在各種研究系統(tǒng)和領域中應用，如發(fā)育、分化、凋亡和病變等生理機理的研究。結果還表明，本發(fā)明的假陽性率小于現(xiàn)有技術ODD的假陽性率小于30％，而RODD的假陽性率小于16％。
實施例2不同發(fā)育時期的大鼠的腦與身體的表達差異基因的研究實驗材料的獲取成年SD大鼠(雌性，約250克)全腦、心、肝、肺和腎等組織器官的分離取頭，沿頭骨中縫剪開頭骨，快速取出大腦并置于液氮待用；.取鼠軀體，開腹腔，取心、肝、肺和腎等組織器官，液氮凍存。新生SD大鼠的全腦和軀體的獲取將SD大鼠的新生鼠，置于Hanks/HEPES溶液里，在顯微解剖臺下，分離新生SD大鼠中樞神經系統(tǒng)(腦&脊髓)和軀體，分別置于凍存管里液氮凍存。SD胎鼠的全腦和軀體的獲取將SD孕鼠乙醚麻醉，開腹腔，取出胎鼠(十余只)，置于Hanks/HEPES溶液里，分離胎鼠中樞神經系統(tǒng)(腦&脊髓)和軀體，于液氮凍存。
總RNA的提取少量組織(≤50mg)總RNA的抽提詳見上海Watson公司″組織/細胞總RNA抽提試劑盒″說明書；大量組織(1g左右)總RNA的抽提采用異硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F(xiàn).and Smith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A Practical Approach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得總RNA置于-80℃冰箱保存。
雙鏈cDNA的合成RT具體流程參見TaKaRa RNA PCR試劑盒；然后用隨機引物(1pmol)和生物素標記的oligo(dT)引物(5pmol)合成雙鏈cDNA。PCR程序94℃預變性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25個循環(huán)，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
雙鏈cDNA的酶切及接頭連接生物素標記的雙鏈cDNA轉移至具有鏈霉菌抗生物素蛋白涂層的PCR管中，37℃溫育至少十分鐘，然后用洗脫緩沖液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，純化后用RsaI完全消化。
經洗脫去除非生物素標記的酶切產物，吸附在管中生物素標記的cDNA的3′末端的酶切產物與接頭(20pmol)于16℃ 6小時，4℃16小時條件連接。接頭是由長鏈和短鏈組成，長鏈的3′端與短鏈形成平端長鏈5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短鏈 3′-CGCCTCCCGCCA-5′連接產物的擴增擴增使用T錨定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接頭特異的外側引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃預變性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循環(huán))20sec，72℃ 45sec(+1sec/循環(huán))，28循環(huán)，72℃ 10min。
第二輪選擇性PCR使用特定的T錨定引物和γ32p標記的接頭特異的內側延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)進行擴增。PCR程序94℃預變性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28個循環(huán)，72℃ 10min。
差異表達的EST片段的PAGE膠分析、擴增、克隆摻有同位素的選擇性擴增產物用6％的變性PAGE電泳，X光片(Kodak)壓片、洗片，分析結果，于膠上找出并切下腦與身體有差異表達條帶，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室溫靜置10分鐘，然后沸水煮10分鐘，離心取上清液。有差異的條帶使用適用于所有ESTs片段的通用引物(接頭內側特異引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二輪的條件進行擴增，并克隆到pMD 18-T載體(TaKaRa)。
在該實施例中，研究了不同發(fā)育時期的大鼠的腦與身體的表達差異基因情況胚胎(17-18)腦和軀體、胚胎(19-20)腦和軀體、新生鼠(小于1天)腦和軀體、成年大鼠的腦和肝。3′ESTs離散圖譜如圖5所示。從圖中可以清楚地看出顯示出許多差異表達的基因。
為進一步驗證RODD方法的有效性，使用RT-PCR的方法對一個EST片段(AW055739)做了更深入的研究(圖6)。通過dbest庫的搜索，我們發(fā)現(xiàn)EST(AW055739)與小鼠和人類的一種鋅指蛋白高度同源。圖6所呈現(xiàn)的EST(AW055739)在各不同發(fā)育時期的腦和軀體中的表達情況，以及在成年大鼠不同組織中分布情況，與PAGE膠所呈現(xiàn)的一致。EST(AW055739)片段在不同發(fā)育時期的腦中均一高表達，而在成年大鼠其它組織中低表達。
該實施例進一步證明了RODD是一種非常經濟、快速、有效和特異的方法，適于在各種研究系統(tǒng)和領域中應用，如發(fā)育、分化、凋亡和病變等生理機理的研究。
實施例3成年大鼠腦與肝臟的基因表達差異實驗材料的獲取成年SD大鼠(雌性，約250克)全腦、心、肝、肺和腎等組織器官的分離取頭，沿頭骨中縫剪開頭骨，快速取出大腦并置于液氮待用；.取鼠軀體，開腹腔，取心、肝、肺和腎等組織器官，液氮凍存。
總RNA的提取總RNA的抽提采用異硫氰酸胍法(Byrnes，L.，Enenkel，B.，Gannon，F(xiàn).andSmith，T.(1995)In Hames B.D.and Higgins S.J.(ed.)，Gene Probe 1A PracticalApproach.Oxford University Press，NY，pp.38-39)，抽提所得總RNA置于-80℃冰箱保存。
雙鏈cDNA的合成RT具體流程參見TaKaRa RNA PCR試劑盒；然后用隨機引物(1pmol)和生物素標記的oligo(dT)引物(5pmol)合成雙鏈cDNA。PCR程序94℃預變性2min，94℃ 30sec，40℃ 2min，72℃ 30sec，25個循環(huán)，72℃ 5min(Liang，P.and Pardee，A.1992 Science 257，967-71)。
雙鏈cDNA的酶切及接頭連接生物素標記的雙鏈cDNA轉移至具有鏈霉菌抗生物素蛋白涂層的PCR管中，37℃溫育至少十分鐘，然后用洗脫緩沖液用[200 mM LiCl，10 mM Tris-HClPH 7.5(4℃)，和1 mM EDTA PH 8.0]洗三次，純化后用RsaI完全消化。
經洗脫去除非生物素標記的酶切產物，吸附在管中生物素標記的cDNA的3′末端的酶切產物與接頭(20pmol)于16℃6小時，4℃ 16小時條件連接。接頭是由長鏈和短鏈組成，長鏈的3′端與短鏈形成平端長鏈5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAAAGGGCGTGGTGCGGAGGGCGGT-3′短鏈 3′-CGCCTCCCGCCA-5′連接產物的擴增擴增使用T錨定引物(5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTVN-3′，V＝A，C，G；N＝A，T，C，G)和接頭特異的外側引物(5′-TGTAGCGTGAAGACGACAGAA-3′)，PCR程序94℃預變性1min，然后94℃ 10sec，42℃(+0.7℃/循環(huán))20sec，72℃ 45sec(+1sec/循環(huán))，28循環(huán)，72℃ 10min。
第二輪選擇性PCR使用特定的T錨定引物和γ32p標記的接頭特異的內側延伸引物(AE-NN5′-CGTGGTGCGGAGGGCGGTACNN-3′)進行擴增。PCR程序94℃預變性3min，94℃ 20sec，65℃ 20sec，72℃ 1min，28個循環(huán)，72℃ 10min。
差異表達的EST片段的PAGE膠分析、擴增、克隆摻有同位素的選擇性擴增產物用6％的變性PAGE電泳，X光片(Kodak)壓片、洗片，分析結果，于膠上找出并切下腦與身體有差異表達條帶，置于100μ1TE(PH 8.0)中，室溫靜置10分鐘，然后沸水煮10分鐘，離心取上清液。有差異的條帶使用適用于所有ESTs片段的通用引物(接頭內側特異引物5′-AAAGGGCGTGGTGCGGAGGGC-3′和T引物5′-GCGAGTCGACCGTTTTTTTTTTTTN-3′，N＝A，T，C，G)，按第二輪的條件進行擴增，并克隆到pMD 18-T載體(TaKaRa)。
PAGE膠基因差異表達圖譜如圖7所示。在該實施例中，本發(fā)明人研究了Asp-GC和T12-CA、Asp-GC和T12-VG、Asp-GC和T12-VA、Asp-GC和T12-VC引物對組合。
EST片段(AW055749)的RT-PCR方法分析結果如圖8所示。dbest庫的搜索后，未發(fā)現(xiàn)EST(AW055749)的同源序列，說明EST(AW055749)是一個全新的EST片段。圖8所呈現(xiàn)的EST(AW055749)在各不同發(fā)育時期的腦和軀體中的表達情況，以及在成年大鼠不同組織中分布情況EST(AW055749)片段在胚胎腦和成年大鼠的腦中高表達，在新生鼠(小于1天)腦和成年大鼠其它組織中低表達，而在不同時期的軀體未見表達。
該實施例進一步證明了RODD是一種非常經濟、快速、有效和特異的方法，適于在各種研究系統(tǒng)和領域中應用，如發(fā)育、分化、凋亡和病變等生理機理的研究。
在本發(fā)明提及的所有文獻都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻被單獨引用作為參考那樣。此外應理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內容之后，本領域技術人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權利要求書所限定的范圍。
權利要求
1.一種顯示基因表達水平有序差異的方法，其特征在于，它包括步驟(a)對mRNA，使用隨機引物和配基標記的oligo(dT)引物，合成雙鏈cDNA；(b)用具有配體的涂層的反應容器吸附標有生物素的cDNA擴增產物，其中該配體與步驟(a)中配基特異性結合；(c)用限制性內切酶消化cDNA擴增產物，產生吸附于反應容器的3′端酶切片段和未吸附的酶切片段；(d)洗脫除去未吸附的酶切片段；(e)將吸附于容器的3′端酶切片段與接頭連接，形成連接產物，所述接頭由長鏈和短鏈構成；(f)對連接產物進行第一輪PCR擴增，形成第一輪PCR擴增產物；(g)對第一輪PCR擴增產物進行第二輪PCR擴增，形成第二輪PCR擴增產物；(h)對第二輪PCR擴增產物進行凝膠電泳分離。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(f)中PCR擴增所用的程序TouchUp程序。
3.如權利要求1所述所述的方法，其特征在于，在步驟(a)中，在合成了cDNA的第一鏈后，使用隨機引物和配基標記的oligo(dT)引物，合成雙鏈cDNA。
4.如權利要求1所述的方法，其特征在于，在步驟(c)中，所述的限制性內切酶是識別四堿基的核酸內切酶。
5.如權利要求4所述的方法，其特征在于，所述的限制性內切酶選自下組RsaI、AluI、AccII、HaeIII、HapI。
6.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的mRNA來自下列組織動物各組織、人的正常組織、人的病理組織、人的不同生長期的組織。
7.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述的配基和配體選自下組生物素和鏈親和素，地高辛和特異性抗地高辛抗體、半抗原和特異性抗半抗原的抗體。
8.如權利要求7所述的方法，其特征在于，所述的配基是生物素，所述的配體的鏈親和素。
9.如權利要求1所述的方法，其特征在于，步驟(h)中的凝膠電泳為聚丙烯酰胺凝膠電泳。
10.如權利要求1所述的方法，其特征在于，消化、連接和擴增在同一反應容器中進行。
全文摘要
本發(fā)明更快了一種經濟、高效、快速的基因表達水平有序差異顯示法。它主要用于系統(tǒng)地比較基因表達整體狀況的差異,尋找差異基因。首先,雙鏈cDNA的合成使用隨機引物和配基標記的oligo(dT)引物;其次,具有配體涂層的薄壁管用于吸附標有配基的cDNA3′端酶切片段。吸附的雙鏈cDNA酶切、洗脫后與接頭連接。再經第一輪PCR擴增和第二輪選擇性PCR擴增,從而獲得清晰的3′ESTs離散圖譜。
文檔編號C12Q1/68GK1354259SQ0012749
公開日2002年6月19日 申請日期2000年11月22日 優(yōu)先權日2000年11月22日
發(fā)明者李榮秀, 康建勝, 王志平 申請人:中國科學院上海生物工程研究中心