專利名稱：：包括蛋白質(zhì)的穩(wěn)定凍干配制劑；檢定藥包的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及一種以凍干產(chǎn)物的形式提供的和含有活性成分蛋白質(zhì)的藥理上可接受的配制劑。這一配制劑在25℃下是穩(wěn)定的，并能通過(guò)添加溶劑重新以液體形式構(gòu)成。它能對(duì)人或?qū)?dòng)物以胃腸外的方式給藥，或者用在檢定藥包。公所周知，該配制劑在凍干過(guò)程中對(duì)蛋白質(zhì)的降解有顯著的效果，以及對(duì)它們?cè)趦龈尚问较碌姆€(wěn)定性有高的影響。影響這些參數(shù)的各種配方變化因素主要是PII，所存在的鹽的量，賦形劑的類型和量，所選防凍劑的類型，以及冷凍、升華和脫水操作所選擇的溫度、壓力和時(shí)間。這些不同的變化因素影響了凍干產(chǎn)物的物理狀態(tài)，即玻璃狀無(wú)定形態(tài)，軟無(wú)定形態(tài)、結(jié)晶態(tài)或這些狀態(tài)的兼有。這些變化因素中的每一個(gè)的作用均已分別加以研究過(guò)，但它們的協(xié)同效應(yīng)仍然很難解釋(PikalMJ.，DellermanKM.，RoyML.RigginMN.，配方變化因素(Formulationvariables)對(duì)凍干人體生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性的影響，Pharm，Research，1991，8，No.4，427—436)。關(guān)于氨基酸和多元醇對(duì)將要凍干的溶液的性能或已凍干產(chǎn)物的性能的影響的文獻(xiàn)提要可以得出以下結(jié)論。與氨基酸、甘露糖醇、結(jié)晶相或無(wú)定形相的存在相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)和缺點(diǎn)列在如下與氨基酸的存在相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)。有人曾闡述過(guò)，凍干產(chǎn)物中甘氨酸的存在會(huì)在凍干操作的冷凍階段誘發(fā)存在于溶液中的分子的結(jié)晶(KoreyDJ，schwartzJB賦形劑在低壓凍干過(guò)程中對(duì)藥物化合物的結(jié)晶的影響，J，ParenteralSci.Tech.，1989，43，2，80—83)。這種活性成分的結(jié)晶(對(duì)于蛋白質(zhì)的情況它仍然是不太可能的)有可能提高其穩(wěn)定性。結(jié)晶形式的丙氨酸具有在升華和脫水過(guò)程中防止凍干產(chǎn)物塌陷的優(yōu)點(diǎn)和使得制備出具有較大的比表面積的凍干產(chǎn)物，從而能實(shí)現(xiàn)更快速的脫水(PikalMJ.，蛋白質(zhì)的凍干，Biopharm.26—30，1990年10月)。與氨基酸的存在相關(guān)的缺點(diǎn)在欲凍干的溶液中加入氨基酸對(duì)糖或?qū)Χ嘣家话銜?huì)具有降低糖的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度的作用(teBooy，MPWMderuiterRA.，deMeereALJ.，由于示差掃描量熱法評(píng)估凍干的含蔗糖配制劑的物理穩(wěn)定性，Pharm.Research.，1992，9，109—114)。目前，玻璃化溫度的降低是凍干產(chǎn)物不穩(wěn)定的代名詞(FranksF.，F(xiàn)reeze—drying；Fromempiricismtopredict—ability，Crvo—letters.1990，11，93—110)。與甘露糖醇的存在相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)蛋白質(zhì)周圍無(wú)定形甘露醇的存在能夠保證在凍干過(guò)程中鍵合到蛋白質(zhì)的非結(jié)晶水的存在，從而防止蛋白質(zhì)的變性。此外，多元醇的存在能夠通過(guò)疏水性的相互作用穩(wěn)定蛋白質(zhì)，不致于發(fā)生熱降解(BackJF.OakenfullD.，smithMB.，在糖類和多元醇存在下提高的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性，Biochemistry，1979，18，23，5191—96)。與甘露糖醇的存在相關(guān)的缺點(diǎn)已有人報(bào)道，甘露糖醇不能在37℃下保持酶的活性，而乳糖卻能夠(FordAW，DawsonPJ.，Theeffectofcarbohydrateadditivesinthefreeze—dryingofalkalinephosphatase，J.Pharm.pharmacol.，1993，45(2)，86—93)。與結(jié)晶相的存在相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)在冷凍溶液中結(jié)晶的溶解物(溶質(zhì))的存在是在脫水過(guò)程中穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方式(CarpenterJF.&CroweJH.，在脫水過(guò)程中由有機(jī)溶解物穩(wěn)定蛋白質(zhì)的方式，Cryobiology，1988，25，459—470)。與結(jié)晶相的存在相關(guān)的缺點(diǎn)有人曾闡述過(guò)，凍干蛋白質(zhì)活性的損失直接與防凍分子的結(jié)晶度有關(guān)(IzutsuKL，YoshiokaS.，teraot.，因結(jié)晶而降低的防凍劑穩(wěn)定蛋白質(zhì)的效果，Pharm，Research.1993，10，No.8，1232—1237)。在含蛋白質(zhì)的藥物產(chǎn)品的配制劑中，應(yīng)避免賦形劑結(jié)晶，其依據(jù)是(HermanskyM.，PesakM.，Lyophilizationofdrugs.VIAmorphousandCristallineformsCesk.Farm.，1993，42，(2)，95—98)。與無(wú)定形相的存在相關(guān)的優(yōu)點(diǎn)無(wú)定形狀態(tài)添加劑的存在將某些酶的活性與添加劑濃度成正比地穩(wěn)定下來(lái)，根據(jù)(IzutsuKL，YoshiokaC.，teraeT.，因結(jié)晶而降低的防凍劑穩(wěn)定蛋白質(zhì)的效果，Pharm.Research.1993，10，No.8，1232—1237)。賦形劑的防凍效果歸因于所得凍干產(chǎn)物中甘氨酸的無(wú)定形狀態(tài)(PikalMJ.，DellermannKM.，RoyML.RigginMN.，配方變化因素對(duì)凍干人體生長(zhǎng)激素的穩(wěn)定性的影響，Pharm.Research.，1991，8，No.4,427—436)。與無(wú)定形相的存在相關(guān)的缺點(diǎn)在固體無(wú)定形單獨(dú)存在下，在冷凍過(guò)程中凍干產(chǎn)物在比玻璃化轉(zhuǎn)變溫度高的溫度下塌陷。在軟無(wú)定形相中，與在結(jié)晶相中相比，化學(xué)降解反應(yīng)具有更快速的動(dòng)力學(xué)速度?？傊?，關(guān)于賦形劑對(duì)穩(wěn)定蛋白質(zhì)的效果的科學(xué)文獻(xiàn)總結(jié)能夠發(fā)現(xiàn)它們的性能的相反性息。沒(méi)有可以普通接受的關(guān)于凍干產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)和其穩(wěn)定性之間的關(guān)系的理論。同樣，多元醇和氨基酸(單獨(dú)的或結(jié)合的)的作用根據(jù)一組可概括的性能來(lái)說(shuō)沒(méi)有進(jìn)行描述，但是根據(jù)所研究的蛋白質(zhì)和所使用的賦形劑的量來(lái)說(shuō)已觀察到相反的結(jié)果。因此，現(xiàn)十分驚奇地發(fā)現(xiàn)，在甘露糖醇和丙氨酸之間存在對(duì)于穩(wěn)定凍干蛋白質(zhì)的協(xié)同效應(yīng)。曾經(jīng)已有說(shuō)明，這種協(xié)同效應(yīng)僅僅存在于這兩種賦形劑中每一種的較濃區(qū)域。最佳效果被定義比值R，而R表示存在于凍干產(chǎn)物中的甘露糖醇質(zhì)量/丙氨酸質(zhì)量之比，為0.1—1，尤其為0.2—0.8。此外，曾經(jīng)已說(shuō)明過(guò)，R為0.1—1該凍干產(chǎn)物由無(wú)定形相和結(jié)晶相組成，無(wú)定形相主要由甘露糖醇和蛋白質(zhì)組成，結(jié)晶相主要由丙氨酸組成。設(shè)想的假定是R為0.1—1形成的無(wú)定形相在冷凍過(guò)程中防止蛋白質(zhì)凍壞，結(jié)晶相加固凍干產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)并防止它塌陷。正是這種在共存的無(wú)定形相和結(jié)晶相之間的奇特協(xié)同效應(yīng)穩(wěn)定了凍干蛋白質(zhì)。因而本發(fā)明描述了產(chǎn)生這種效應(yīng)的優(yōu)選R比值。因此，本發(fā)明涉及一種凍干藥物劑型，它含有有效量的生物活性蛋白質(zhì)、已調(diào)節(jié)到為穩(wěn)定蛋白質(zhì)所需要的最佳PH的緩沖液、丙氨酸和甘露糖醇，后兩種賦形劑的質(zhì)量比值R(甘露糖醇質(zhì)量/丙氨酸質(zhì)量)為0.1—1。包含在該配制劑中的蛋白質(zhì)在凍干形式下保持穩(wěn)定。所得凍干產(chǎn)物的溶解是快速的和完全的，凍干產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)沒(méi)有被破壞或沒(méi)有塌陷，且其水含量適于維持蛋白質(zhì)的活性。本
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中熟練人員所周知的其它藥理上可接受的賦形劑可以引入這一配制劑，例如助溶劑，防腐劑、抗氧劑或螯合劑。因此，本發(fā)明的目的在于得到含蛋白質(zhì)的穩(wěn)定凍干產(chǎn)物，該蛋白質(zhì)在冷凍過(guò)程中通過(guò)主要由蛋白質(zhì)和甘露糖醇組成的無(wú)定形固相來(lái)防凍，這一無(wú)定形相在冷凍溶液升華和脫水之后共存于所得到的凍干產(chǎn)物中，而結(jié)晶相主要由丙氨酸組成。根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行配制用的生物活性蛋白質(zhì)可以是糖基化的或非糖基化的，天然的，合成的，半合成的或重組體多肽，它們?cè)谂R床或?qū)嶒?yàn)室實(shí)踐中使用。更具體地說(shuō)，該蛋白質(zhì)例如可以是激素，如生長(zhǎng)激素，優(yōu)選人體生長(zhǎng)激素(hGH)，促黃體(生成)激素(LH—RH)，促性腺激素。該蛋白質(zhì)也可以是酶，例如，血檢溶解酶比如尿激酶、Prourokinase、鏈激酶、葡萄球菌激酶、組織纖維蛋白溶酶原活化劑(tPA)或酶比如膦酸酯酶、硫酸酯酶、?；D(zhuǎn)移酶、單胺氧化酶、尿酸氧化酶。同樣，根據(jù)本發(fā)明配制的蛋白質(zhì)可以是細(xì)胞分裂素，例如白細(xì)胞間素(interleukin)—2(IL—2)，白細(xì)胞間素—4(IL—4)，白細(xì)胞間素—6(IL—6)或白細(xì)胞間素—13(IL—13)。根據(jù)本發(fā)明的另一類蛋白質(zhì)例如包括抗體、免疫球蛋白、抗毒素。多肽類如縮膽囊肽(CCK)、SubstanceP、神經(jīng)激肽A、神經(jīng)激肽B、神經(jīng)緊張素(neurotensin)、神經(jīng)多肽Y、血管擴(kuò)張素、bombesin可以根據(jù)本發(fā)明用來(lái)進(jìn)行配制。生物活性蛋白質(zhì)優(yōu)選是hGII(人體生長(zhǎng)激素)、尿酸氧化酶或白細(xì)胞間素—13。人體生長(zhǎng)激素是由在半胱氨酸53和165和半胱氨酸182和189之間具有2個(gè)二硫(化)橋鍵的191氨基酸的單一多肽鏈組成的蛋白質(zhì)。尿酸氧化酶是將尿酸氧化成尿囊素的酶，它是從Aspergillusflavus的生物量提取的(Laboureur等人，Bull.Soc.Chim.Biol.1968，50，811—825)提取的。它曾用來(lái)冶療hyperuricemias達(dá)20年以上。給這種蛋白質(zhì)編密碼的CDNA最近已被克隆化并在E.coli中表征(LEGOUXR等人，J.ofBiol.chem.，1992，267，12，8565—8570)，AspergillusflavusandSaccharomycescerevisiae。該酶是具有分子量在32,000區(qū)域的等同亞單元的四聚體。由301氨基酸的單一多肽鏈組成的單體沒(méi)有二硫(化)橋鍵，并在N—終止端被乙酰化。白細(xì)胞間素—13是由帶2個(gè)二硫(化)橋鍵的112氨基酸的單一多肽鏈組成的細(xì)胞活素(Minty等人，Nature，1993，362，248—250)。無(wú)定形(甘露糖醇＋蛋白質(zhì))相與結(jié)晶丙氨酸相的共存的實(shí)現(xiàn)與用來(lái)調(diào)節(jié)溶液PH的緩沖劑的存在和濃度無(wú)關(guān)，但是，與上述定義的R比值有關(guān)。為了推出蛋白質(zhì)配制劑(公眾能得到，作為治療劑)，將它們配制成足夠穩(wěn)定的形式以便在配制時(shí)和使用時(shí)之間的這段時(shí)間保持它們的生物活性則是十分重要的。例如，hGH曾以各種方式如在下述專利或?qū)＠暾?qǐng)中所描述的那些方式進(jìn)行配制；US5，096，885，WO89/09614，WO92/17200，Au—30771/89，WO93/19773，WO93/19776。根據(jù)本發(fā)明的配制劑可在室溫下保藏，而目前在市場(chǎng)上購(gòu)買的含這些蛋白質(zhì)的配劑制劑必須在2℃—8℃范圍內(nèi)的溫度下保藏。在絕大多數(shù)情況下，藥物劑型是凍干、冷凍或在溶液中。它含有蛋白質(zhì)，緩沖劑，甘氨酸，精氨酸，甘露糖醇，鋅，表面活性劑，葡聚糖，EDTA，或其它賦形劑，但從來(lái)沒(méi)有質(zhì)量比R在0.1—1之間的丙氨酸/甘露糖醇結(jié)合物。凍干或冷凍形式是用來(lái)保持分子的生化完整性和生物活性。該凍干配制劑應(yīng)該在使用之前通過(guò)添加藥理上可接受的消毒溶劑如蒸餾水，氯化鈉水溶液(0.9％)或葡萄糖水溶液(5％)或者任何其它生理上可接受的溶劑，含或不含抗菌防腐劑如芐醇、苯酚或間甲苯酚，來(lái)重新構(gòu)成。在室溫下一直穩(wěn)定直到被重新構(gòu)成為止的配制劑在hGH為瓶裝形式或采用多次劑量筆形式的情況下對(duì)于流動(dòng)(ambulatory)治療來(lái)說(shuō)是特別理想的。如此制備的配制劑也可引入檢定藥包。因此，本發(fā)明是凍干產(chǎn)物的優(yōu)選組合物。這一凍干產(chǎn)物是從溶液開(kāi)始，通過(guò)凍干得到的。這一配制工藝包括混合、溶解、過(guò)濾和凍干步驟。待凍干溶液的組成如下蛋白質(zhì)，用來(lái)調(diào)節(jié)PH的藥理上可接受的緩沖劑，丙氨酸，甘露糖醇，注射用水，其中質(zhì)量比R(甘露糖醇的質(zhì)量/丙氨酸的質(zhì)量)在0.1—1之間。待凍干溶液按以下方式制備蛋白質(zhì)溶液在凝膠過(guò)濾柱上獲得，它含有將其PH保持在適合于穩(wěn)定蛋白質(zhì)的區(qū)域內(nèi)的緩沖劑。所需量的緩沖劑、丙氨酸、甘露糖醇和水被加入到這一溶液中，以便穩(wěn)定所有的賦形劑。該溶液經(jīng)無(wú)菌過(guò)濾，并被分配到容器(優(yōu)選小玻璃瓶或安瓿)中。溶液的凍干按如下進(jìn)行該溶液隨后進(jìn)行一冷凍循環(huán)，然后升華和脫水(它適應(yīng)于待凍干的體積和適應(yīng)于含有溶液的容器)。優(yōu)選地，在SMH15或SMJ100或SMH2000型的Usifroid冷凍機(jī)(法國(guó))中選擇接近—2℃/分鐘的冷凍速度。調(diào)控凍干產(chǎn)物的脫水的時(shí)間、溫度和壓力，作為待凍干溶液體積和凍干產(chǎn)物中所需殘留水量的函數(shù)。關(guān)于制備可注射配制劑的技術(shù)的全部信息對(duì)于本
技術(shù)領(lǐng)域：
的熟練人員來(lái)說(shuō)在Remington′sPharmaceuticalSciences，1985，17版中或在WilliamNA&amp;PolliGP，TheLyophilizationofPharmaceuticals一篇文獻(xiàn)綜述，J.ParenteralSci.Tech.，1984，38，(2)，48—59或者在FranksF.，F(xiàn)reeze—dryingfromempiricismtopredictability，cryo—Letters，1990，11，93—110中可以獲取。從而得到凍干產(chǎn)物，其中丙氨酸處在結(jié)晶形式而甘露糖醇處在無(wú)定形形式。該凍干產(chǎn)物可在25℃下保藏，而不會(huì)損害它所含的蛋白質(zhì)的生物活性。為了說(shuō)明本發(fā)明，選擇hGH或尿酸氧化酶作為蛋白質(zhì)的例子進(jìn)行評(píng)價(jià)。因此，含有作為生物活性蛋白質(zhì)的hGH或尿酸氧化酶和含有各種濃度下的磷酸鹽緩沖劑的幾種溶液，對(duì)于含hGH(在4IU/0.5nd)的溶液來(lái)說(shuō)PH＝7，而對(duì)于含尿酸氧化酶(在30EAU/ml，甘露糖醇單獨(dú)的，丙氨酸單獨(dú)的或丙氨酸/甘露糖醇混合物)的溶液來(lái)說(shuō)PH＝8，經(jīng)制備好，進(jìn)行凍干和分析。在下表1和2的例子中將詳細(xì)地描述這些組合物。分析方法以及穩(wěn)定時(shí)間和溫度也在下面有描述。表1下表1表明所研究的含尿酸氧化酶的配方的組成EAU指酶活性單位表2下表2表明所研究含hGH的配方的組成U指國(guó)際單位用來(lái)測(cè)定不同參數(shù)的分析方法如下。二聚體和較高分子量的相關(guān)物質(zhì)的含量二聚體和較高分子量的相關(guān)物質(zhì)的含量是使用SUPEROSE12柱(Pharmacia，Ref.17—0538—01)由排阻色譜法(SEC—HPLC)測(cè)定的。產(chǎn)物用PH＝7.0的磷酸銨緩沖液(1.38g磷酸二氫銨在1升水中，用流速為0.4毫升/分鐘的濃氫氧化銨調(diào)節(jié)PH＝7.0)洗脫。在220nm下進(jìn)行檢測(cè)(這一含量在分析結(jié)果中注明為低聚物＋聚合物的百分?jǐn)?shù))。還可以由在EuropeanPharmacopociamonograph(歐洲藥典專論)“Somatropinepourpreparationinjectable”(SomatropinforinjectablePreparation)ofJanuary1994中所描述的方法測(cè)定二聚體和較高分子量的物質(zhì)的含量。由反相色譜法進(jìn)行蛋白質(zhì)滴定分析以mg/每個(gè)小玻璃瓶表示，使用C18—300柱—25cm，直徑4.6mm(SYNCHROM，ref.CR103—25)由反相色譜法進(jìn)行測(cè)定。產(chǎn)物在35分鐘內(nèi)以梯度方式進(jìn)行洗脫，流動(dòng)相從75體積的水(0.1％三氟乙酸(TFA)(V/V)和25體積的丙烯腈(0.08％TFA(V/V)到30體積的水(0.1％TFA)和70體積丙烯腈(0.08％TFA)連續(xù)流過(guò)。流速是1毫升/分鐘，在200nm下進(jìn)行檢測(cè)。尿酸氧化酶的酶催活性的分析根據(jù)LegouxR，delpechBruno，dumontx，GuillemotJC.RamondP，ShireD，CaputD，F(xiàn)erraraP，LoisonG，J.Biol.chem，1992，267(12)，8565—8570，通過(guò)監(jiān)測(cè)尿酸在292nm處消失，在恒溫在30℃的比色杯中由光譜法測(cè)定尿酸氧化酶的酶催活性(表示為EAU)。重新構(gòu)成的溶液的濁度在PerkinElmer554光譜儀中，在500nm下由光譜法(Ph.Eur.2(I)V619)測(cè)定溶解在溶液中的含hGH的凍干產(chǎn)物的濁度。結(jié)果以吸收單位X1000給出。溶解在溶液中的含尿酸氧化酶的凍干產(chǎn)物的濁度是在RatioHach18900—00濁度計(jì)的協(xié)助下測(cè)定的。濁度結(jié)果以如下方法所定義的NephelometricTurbidityUnits(NTU)表示AmericanPublicHealthAssociation測(cè)定水和廢水的標(biāo)準(zhǔn)方法。根據(jù)歐洲藥典(II)V.6的方法，通過(guò)待分析樣品與對(duì)比懸浮液的比較，還可測(cè)定乳白色度。凍干產(chǎn)物的感官判據(jù)這些判據(jù)是用目測(cè)的并注意凍干產(chǎn)物的顏色，其結(jié)構(gòu)(塌陷或沒(méi)有塌陷)，以及注意現(xiàn)察在凍干產(chǎn)物的結(jié)皮和屑粒之間的可能的相轉(zhuǎn)移。對(duì)粉末的X—射線衍射分析對(duì)凍干產(chǎn)物的X—射線衍射分析是在SIEMENSD500TT衍射儀中進(jìn)行的，光源CuKal；發(fā)生器40KV，25mA，backmonochromator(逆光單色儀)；縫1/1/1/0.16/0.6；在派熱克期(硬質(zhì)玻璃)臺(tái)架上抽樣；掃描區(qū)域4°—40°/每分鐘，2倍布喇格θ角。示差熱分析通過(guò)示差熱分析對(duì)凍干產(chǎn)物的研究是在下述條件下進(jìn)行的裝置DSC7PerkinElmer；校準(zhǔn)物銦和鉛；樣品大小在50微升盤中5—10毫克之間；起始溫度10℃；加熱速度10℃/分鐘；終溫300℃。hGH的脫酰胺形式脫酰胺形式的百分?jǐn)?shù)是使用陰離子交換柱(PHARMACIAmono—QHR5/5，ref.17—0546—01)由陰離子交換色譜法(AEX—HPLC)測(cè)定的。使用以下方案，用溶液A(13.8g)磷酸二氫銨在1000毫升水中用濃氫氧化銨調(diào)PH＝7)和水(作為溶液B)進(jìn)行洗脫5％溶液A2分鐘，然后經(jīng)5分鐘過(guò)渡到15％溶液A，經(jīng)20分鐘過(guò)渡到50％溶液A，最后經(jīng)5分鐘過(guò)渡到100％溶液A并將該后一種溶液保持5分鐘。hGH的洗脫(tR大約15分鐘)和脫酰胺形式的洗脫被調(diào)控在220nm。流速為1毫升/分鐘。使用這些不同的方法得到的分析結(jié)果敘述如下。二聚體和較高分子量的相關(guān)物質(zhì)的含量溶解在0.5ml水中的含4國(guó)際單位(IU)hGH的凍干產(chǎn)物的低聚物＋高聚物的含量經(jīng)測(cè)定作為R比例的函數(shù)(圖1)。圖1表明溶液的低聚物＋高聚物的最低含量是當(dāng)R在0.1—1之間時(shí)獲得的，該數(shù)值0.1是從曲線上內(nèi)推的。借助于另外的例子，hGH在4IU和8IU的兩批樣被檢測(cè)在25℃下和在35℃下的穩(wěn)定性。在6個(gè)月的保藏期后它們的穩(wěn)定性良好。下表3和4表明，與EuropeanPharmacopoeiaStandards(歐洲藥典標(biāo)準(zhǔn))相比，脫酰胺形式的低聚物和高聚物的百分含量。在這些表中，R＝0.45。表3批料，4IU/瓶*在給定該分析方法精確度的時(shí)間內(nèi)滴定沒(méi)有顯著變化(±5％)表4批料，8IU/瓶<在給定該分析方法精確度的時(shí)間內(nèi)滴定沒(méi)有顯著變化(±5％)尿酸氧化酶的酶催活性的分析在35℃下1個(gè)月之后，測(cè)定溶解于1ml水中的含30EAU尿酸氧化酶的凍干產(chǎn)物的酶催活性，作為R比例的函數(shù)(cf.圖2)。圖2表明，當(dāng)R在0.4—1之間時(shí)，在35℃下在1個(gè)月之后，保持了尿酸氧化酶的初始酶催活性。借助于另外的例子，對(duì)于R＝0.45或R＝0.67的配方，在25℃下3個(gè)月后仍然保持良好的穩(wěn)定性(剩余活性接近時(shí)間0的活性的100％)。重新構(gòu)成的溶液的濁度測(cè)定溶解于0.5ml水中的含4IUhGH的凍干產(chǎn)物的濁度，作為R比例的函數(shù)(cf.圖3)。圖3表明，該溶液的最低濁度是當(dāng)R在0—1.5之間時(shí)得到的。測(cè)定溶解于1ml水中的含30EAU尿酸氧化酶的凍干產(chǎn)物的濁度，作為R比例的函數(shù)(cf.圖4)。圖4表明溶液最低濁度是當(dāng)R在0.2—1之間時(shí)獲得的。凍干產(chǎn)物的感官判據(jù)測(cè)定含4IUhGh或30EAU尿酸氧化酶或者不含蛋白質(zhì)的每一種凍干產(chǎn)物的感官判據(jù)，以及磷酸鹽緩沖劑的各種含量，作為R比值的函數(shù)，并提供在表5中。表5表明，當(dāng)R在0.125—1.7之間時(shí)凍干產(chǎn)物表現(xiàn)出滿意的感官判據(jù)。這些特性作為時(shí)間的函數(shù)并不發(fā)生變化。表5作為比值R(甘露糖醇質(zhì)量/丙氨酸質(zhì)量)的函數(shù)的凍干產(chǎn)物和結(jié)晶了的賦形劑的感官判據(jù)。width="556">R感官判據(jù)結(jié)晶賦形劑(X—射線衍射)+∞106.46954.01421.7051.4021.251.09710.6670.456破裂(或塌陷)破裂(或塌陷)破裂(或塌陷)破裂(或塌陷)破裂(或塌陷)破裂(或塌陷)好好好好好好好甘露糖醇甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸甘露糖醇—丙氨酸丙氨酸丙氨酸丙氨酸</table><p>表5續(xù)<p>X—射線衍射對(duì)含丙氨酸/甘露糖醇混合物(R從0至＋∞變化)的所得凍干產(chǎn)物的粉末進(jìn)行X—射線衍射分析的結(jié)果在表5中給出。所得衍射圖表明，當(dāng)R在0—1之間時(shí)，只出現(xiàn)丙氨酸晶格的線；此外，衍射圖的基線的偏移表示存在由甘露糖醇組成的無(wú)定形相。R越大，因?yàn)楦事短谴嫉木壒剩瑹o(wú)定形相越多。當(dāng)R＞1時(shí)，甘露糖醇也結(jié)晶。當(dāng)R在0—1之間時(shí)，所得到的無(wú)定形相由甘露糖醇組成和結(jié)晶相由丙氨酸組成。示差熱分析測(cè)定含4IUhGH或30EAU尿酸氧化酶或不含蛋白質(zhì)的凍干產(chǎn)物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度，以磷酸鹽緩沖劑的各種含量，作為R比值的倒數(shù)的函數(shù)(cf.圖5)。圖5表明，當(dāng)1/R＞1，即R在0—1之間時(shí)，得到含丙氨酸和甘露糖醇的混合物的凍干產(chǎn)物的最高玻璃化轉(zhuǎn)變溫度。正是凍干產(chǎn)物的玻璃化轉(zhuǎn)變溫度表示出穩(wěn)定凍干產(chǎn)物的最高溫度。因此，當(dāng)R在0—1之間時(shí)，達(dá)到了穩(wěn)定凍干產(chǎn)物的最高溫度。脫酰胺形式對(duì)于4IU和8IU兩批樣所得到的結(jié)果僅顯示出極小的變化，與歐洲藥典的somatropinmonograph標(biāo)準(zhǔn)相比較而言，則是很容易接受。這些結(jié)果使人能夠聯(lián)想到，這一配方在25℃下充分穩(wěn)定?？傊?，已經(jīng)證明，對(duì)于凍干產(chǎn)物所評(píng)估的每一種性能在R值的某一間隔均表現(xiàn)出最佳值，它們可以按以下方式總結(jié)每一分析判據(jù)(％低聚物＋高聚物，hGH穩(wěn)定性，在35℃下1個(gè)月后尿酸氧化酶的酶催促活性，hGH溶液濁度，尿酸氧化酶溶液濁度，凍干產(chǎn)物的外觀，丙氨酸單獨(dú)的晶體，最高玻璃化轉(zhuǎn)變溫)定義了每種性能的特定最佳間隔。為了獲得可接受的配制劑，它義R的優(yōu)選間隔，即0.1＜R＜1。下面的實(shí)施例說(shuō)明本發(fā)明，但不能限制本發(fā)明。實(shí)施例1注射用的溶于0.5ml水中的含4IUhGH的凍干產(chǎn)物的組合物實(shí)施例2注射用的溶于1ml水中的含8IUhGH的凍干產(chǎn)物的組合物實(shí)施例3注射用的溶于1ml水中的含18IUhGH的凍干產(chǎn)物的組合物實(shí)施例4注射用的hGH的凍干產(chǎn)物(8IU/1ml)特性驗(yàn)證測(cè)試<tablesid="table14"num="014"><tablewidth="1048">脫酰胺形式二聚體和相關(guān)的物質(zhì)餾分形式(cutforms)相關(guān)的蛋白質(zhì)陰離子交換＜6.5％1.0％1.0％1.5％2.2％1.5％1.95％3.3％排阻色譜法＜6.0％1.0％0.75％1.5％1.7％0.8％1.2％2.2％電泳＜2.0％＜2.0％＜2.0％＜2.0％＜2.0％＜2.0％＜2.0％2.0％電泳一致一致一致一致一致一致一致一致</table></tables>實(shí)施例4續(xù)1(1)存在于對(duì)比物中的人工痕量或hGH低聚物的痕量除外，不存在另外的(吸收)帶(2)n.s.＝未研究5注射用的hGH的凍干產(chǎn)物(4IU/0.5ml)<特性測(cè)試實(shí)施例5續(xù)1<t>重新構(gòu)成的溶液<>(1)存在于對(duì)比物中的人工痕量或hGH低聚物的痕量除外，不存在另外的(吸收)帶(2)n.s.＝未研究實(shí)施例618IU的hGH在5℃下穩(wěn)定1年后的分析結(jié)果對(duì)于全部結(jié)果，R＝0.45實(shí)施例718IU的hGH在25℃下穩(wěn)定3個(gè)月的分析結(jié)果對(duì)于全部結(jié)果R＝0.45實(shí)施例8尿酸氧化酶的凍干產(chǎn)物的組合物(30EAU/瓶)<實(shí)施例8續(xù)1在給定該分析方法的精確度時(shí)間內(nèi)滴定沒(méi)有顯著變化(±10％)在35℃下1個(gè)月和在5℃、25℃和35℃下3個(gè)月時(shí)，尿酸氧化酶實(shí)施例9凍干產(chǎn)物的穩(wěn)定性的結(jié)果實(shí)施例9續(xù)1實(shí)施例9續(xù)2(*)在給定該分析方法的精確度的時(shí)間內(nèi)滴定沒(méi)有顯著變化(±10％)權(quán)利要求1.一種穩(wěn)定的、凍干的和藥理上可接受的配制劑，它包括蛋白質(zhì)、緩沖劑、丙氨酸和甘露糖醇，其中比值R二甘露糖醇質(zhì)量/丙氨酸質(zhì)量是在0.1—1之間。2.根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑，其中該蛋白質(zhì)是激素、酶或細(xì)胞分裂素。3.根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑，用來(lái)重新構(gòu)成一種可注射的溶液。4.根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑，用來(lái)重新構(gòu)成一種溶液，該溶液可以經(jīng)皮下、靜脈、肌肉內(nèi)的方式注射入人體或動(dòng)物體。5.根據(jù)權(quán)利要求2的配制劑，其中激素是hGH。6.根據(jù)權(quán)利要求2的配制劑，其中酶是尿酸氧化酶。7.根據(jù)權(quán)利要求2的配制劑，其中細(xì)胞分裂素是白細(xì)胞間素(Interlenkin)—13。8.根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑，其中丙氨酸處在結(jié)晶的形式和甘露糖醇處在無(wú)定形的形式。9.根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑，其特征在于凍干產(chǎn)物由無(wú)定形相和結(jié)晶相組成，無(wú)定形相主要由甘露糖醇和蛋白質(zhì)組成，結(jié)晶相主要由丙氨酸組成。10.根據(jù)權(quán)利要求2的配制劑，其中緩沖劑是磷酸鹽緩沖劑。11.檢定藥包，其特征在于它包括根據(jù)權(quán)利要求1的配制劑。全文摘要本發(fā)明的主題是一種穩(wěn)定的凍干的和藥理上可接受的配制劑，它包括蛋白質(zhì)、緩沖劑、丙氨酸和甘露糖醇，其中甘露糖醇的質(zhì)量和丙氨酸的質(zhì)量之比在0.1-1之間。該蛋白質(zhì)尤其是具有生物活性的蛋白質(zhì)，如激素，特別是hGH、酶或細(xì)胞分裂素。本發(fā)明的主題還是一種包括前面定義的配制劑的檢定藥包(assaykit)。文檔編號(hào)C12Q1/26GK1116522SQ9510479公開(kāi)日1996年2月14日申請(qǐng)日期1995年5月4日優(yōu)先權(quán)日1994年5月4日發(fā)明者A·貝約爾,T·布魯爾,P·杜平,P·福爾申請(qǐng)人:薩諾費(fèi)公司