專利名稱：丙酮酸的制備方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及丙酮酸的生產(chǎn)方法，其中L-乳酸和氧是在由甘醇酸鹽氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和過氧化氫酶(EC1.11.1.6)組成的催化劑存在下，在水溶液中反應(yīng)的。
有關(guān)技術(shù)的描述丙酮酸已通過各種碳源(如葡萄糖、酵母提取物和胨)發(fā)酵制備，但這些方法產(chǎn)生的丙酮酸往往是低產(chǎn)率(基于所加的碳源)的，而且作為發(fā)酵產(chǎn)物混合物的一種成分，往往是相當?shù)蜐舛鹊摹娜绱藦?fù)雜的發(fā)酵液體培養(yǎng)基中分離提取丙酮酸一般是難以進行的，費用也很昂貴。
Cooper(美國專利4,900,6681990年2月13日)已描述了通過光學(xué)純D(-)-乳酸的微生物學(xué)氧化進行的丙酮酸制備。盡管這種工藝由于不利用D-乳酸作為碳源來產(chǎn)生該反應(yīng)所需的細胞群而比其它發(fā)酵路線有所改進，但細胞群的產(chǎn)生以及D-乳酸的發(fā)酵轉(zhuǎn)化都需要一種含有第二碳源(例如D(-)-甘露醇和玉米漿)的菌種生長培養(yǎng)基。此外，D-乳酸在自然界中不是隨遇的，其生產(chǎn)或購買要比L(+)-乳酸昂貴得多。
L-乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化，已利用L-乳酸鹽氧化酶(L-乳酸氧氧化還原酶，非脫羧，EC1.1.3.2)這種酶作為催化劑(B.A.Burdick and J.R.Schaeffer Biotech.Lett.，Vol.9，253-258(1987))加以證實。L-乳酸鹽氧化酶(來自足球菌屬(Pediococcus))催化氧將L-乳酸鹽氧化成丙酮酸鹽和過氧化氫 L-乳酸鹽氧化酶是與過氧化氫酶共固定的(氧化酶∶過氧化氫酶＝1∶281(IU/IU))，以限制副產(chǎn)物過氧化氫對丙酮酸鹽的氧化而產(chǎn)生乙酸鹽和二氧化碳。在pH7的0.1M磷酸鹽緩沖劑中，49mML-乳酸鹽溶液的氧化導(dǎo)致高達47％產(chǎn)率的丙酮酸(以2，4-二硝基苯腙衍生物形式分離)。
甘醇酸鹽氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC1.1.3.15)，即多葉綠色植物和哺乳動物細胞中常見的一種酶，能催化乙醇酸氧化成乙醛酸。這種酶同樣也能催化L-乳酸氧化成丙酮酸，并有過氧化氫隨附物質(zhì)產(chǎn)生。C.O.Clagett，N.E.Tolbert和R.H.Burris，J.Biol.Chem.，Vol.178，977-987(1949)，首次報告從各種綠色多葉植物提取的一種α-羥基酸氧化酶，它能催化乙醇酸氧化，而且對乳酸的L-異構(gòu)體也是專一的。80mM dl-乳酸鹽氧化的最佳pH是7.6；沒有鑒定或分離出反應(yīng)產(chǎn)物。N.E.Tolbert等人.J.Biol.Chem.，Vol.181，905-914(1949)，把從煙草葉提取的一種純化α-羥基酸氧化酶用于pH8的磷酸鹽緩沖劑中約113mM dl-乳酸的氧化；從反應(yīng)中以2，4-二硝基苯腙的形式分離出丙酮酸，未報告其數(shù)量，該反應(yīng)也產(chǎn)生顯著數(shù)量的二氧化碳。K.E.Richardson和N.E.Tolbert，J.Biol.Chem.，Vol.236，1280-1284(1961)，后來報告說這種α-羥基酸氧化酶更通常稱之為乙醇酸氧化酶(即甘醇酸鹽氧化酶)。
I.Zelitch和S.Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)，報告說，乙醇酸氧化酶能催化分子氧對L-乳酸的氧化而產(chǎn)生丙酮酸和過氧化氫，而且在不存在過氧化氫酶時，該過氧化物與丙酮酸鹽發(fā)生非酶促反應(yīng)而生成乙酸鹽、CO2和水。黃素單核苷酸(FMN)被確認為一種所需要的酶輔助因子，而且在該酶的水溶液中添加FMN大大提高了乙醇酸氧化酶的穩(wěn)定性。在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH8.0)中，在過量外加過氧化氫酶的存在下，3.3mM L-乳酸鹽溶液氧化產(chǎn)生3.2mM丙酮酸(比色法測定)；沒有分離產(chǎn)物。
乳酸鹽氧化成丙酮酸鹽，也已經(jīng)用一種從大鼠腎分離的L-α-羥基酸氧化酶加以證實(M.Blanchard等人，J.Biol.Chem.，Vol.163，137-144(1946))。在pH8.0的0.167M磷酸鹽緩沖劑中，在外加過量過氧化氫酶的存在下，33mM乳酸鹽溶液氧化產(chǎn)生79％產(chǎn)率的丙酮酸鹽(以2，4-二硝基苯腙衍生物的形式分離)。乳酸由可溶性酶催化氧化成丙酮酸的進一步參考文獻包括J.C.Robinson et al.，Biol.Chem.，Vol.237，2001-2010(1962)(豬腎皮層L-α-羥基酸氧化酶)；P.Urban et al.，Biochemistry，Vol.27，7365-7371(1988)(大鼠腎L-α-羥基酸氧化酶)；D.W.Fry和K.E.Richardson，Biochim.Biophs.Acta.Vol.568，135-144(1979))(人肝乙醇酸氧化酶)；M.J.Emes和K.H.Erismann，Int.J.Biochem.，Vol.16，1373-1378(1984)(浮萍(Lemna minor L.)甘醇酸鹽氧化酶)；H.S.Kim和J.D.Choi.，Korean Biochem.J.，Vol.20，350-356(1987)(菠菜甘醇酸鹽氧化酶)。
雖然酶催化的氧對L-乳酸的氧化是眾所周知的，但對丙酮酸的高選擇性只在一個實驗中得到證實(I.Zelitch和S.Ochoa)，其中L-乳酸鹽的濃度是3.3mM；這種低濃度L-乳酸鹽限制了所生成過氧化氫的濃度，而且在過量過氧化氫酶的存在下，也限制了過氧化氫與丙酮酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生乙酸鹽和二氧化碳。從含水反應(yīng)混合物中回收如此低濃度的丙酮酸鹽(約3.2mM)對于一種經(jīng)濟制造工藝來說是不實際的。
發(fā)明概要本發(fā)明涉及在水溶液中，在甘醇酸鹽氧化酶(例如，(S)-2-羥基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和過氧化氫酶(例如，EC1.11.1.6)這兩種酶催化劑的存在下，用氧氧化L-乳酸(或其鹽)進行的丙酮酸(或其鹽，以下還要更充分地解釋)制備。因此，本發(fā)明提供一種改進的丙酮酸生產(chǎn)方法，包括如下步驟在一種水溶液中，在甘醇酸鹽氧化酶這種酶催化劑和過氧化氫酶這種酶催化劑的存在下，使L-乳酸和氧反應(yīng)一段足以使L-乳酸以高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化成丙酮酸的時間，其中L-乳酸的初始濃度是約0.1～約2.0M，然后回收丙酮酸。應(yīng)當知道的是，為了本發(fā)明之目的，丙酮酸和L-乳酸這些術(shù)語的使用，尤其當針對pH范圍為6～10的水溶液時，是更具體地指一種高度離解狀態(tài)，其中一種部分中和的酸溶液主要分別以丙酮酸根離子和L-乳酸根離子的形式存在。丙酮酸可作為一種化學(xué)中間體用于精細化學(xué)品、農(nóng)用化學(xué)品和醫(yī)藥的制備。因此，應(yīng)當進一步知道的是，為了本發(fā)明之目的，高產(chǎn)率和高回收率丙酮酸這種說法旨在包括一種等效方法.其中丙酮酸固有地以對應(yīng)高產(chǎn)率作為丙酮酸的其它可用衍生化合物的中間體產(chǎn)生。
按照本發(fā)明，丙酮酸是通過可高達0.5M濃度的L-乳酸的酶催化氧化制備并以96％產(chǎn)率(98％純度，鈉鹽)分離的。所采用L-乳酸的高初始濃度預(yù)期可能導(dǎo)致基質(zhì)對甘醇酸鹽氧化酶的抑制，這會限制反應(yīng)速度和/或產(chǎn)品最終濃度。類似地，0.5M丙酮酸濃度可能導(dǎo)致產(chǎn)品對酶的抑制，也會限制所得產(chǎn)品的濃度。
進一步按照本發(fā)明，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，用無任何pH控制的無緩沖反應(yīng)可以得到高達98-99％的丙酮酸鹽產(chǎn)率；以前L-乳酸鹽酶促氧化的所有實例都是用一種緩沖劑，通常用磷酸鹽緩沖劑進行的。緩沖劑不存在時得到的丙酮酸鹽的高產(chǎn)率等于或超過外加緩沖劑存在下得到的丙酮酸鹽產(chǎn)率。無外加緩沖劑的丙酮酸鹽制備簡化了反應(yīng)混合物中產(chǎn)品的分離；催化劑是用過濾或離心法脫除的，留下丙酮酸鹽水溶液，易于用脫水法回收(例如，用減壓下脫水、低壓升華干燥法，等)。
遺傳工程滲透整體細胞催化劑(即一種同時含有甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的微生物轉(zhuǎn)化體)用于使L-乳酸鹽氧化成丙酮酸鹽已經(jīng)得到證實。這些整體細胞催化劑的使用，已提供許多優(yōu)于可溶酶作為催化劑在本發(fā)明中使用的優(yōu)點。含有整體細胞催化劑的溶液可以隨氧或一種含氧氣體一起通入，從而提高反應(yīng)速度；而通入含有可溶酶的反應(yīng)混合物則導(dǎo)致甘醇酸鹽氧化酶的快速不可逆變性。在反應(yīng)結(jié)束時，整體細胞催化劑容易用過濾法或離心法回收重復(fù)利用，而可溶酶則不能離心分離，過濾會導(dǎo)致甘醇酸鹽氧化酶活性大量流失。整體細胞催化劑可重復(fù)利用酶活性的回收率在每次催化劑再循環(huán)之后都是極高的(大約95％或以上)，而一次反應(yīng)之后剩余可溶甘醇酸鹽氧化酶的實測活性典型地是40％～60％。使用附著或固定在惰性支撐體上的甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶，將顯示出許多與此相同的優(yōu)點，因而也被認為是符合本發(fā)明目的的等效物。
下表比較了在相同反應(yīng)條件下使用下列催化劑進行0.50M L-乳酸鹽溶液氧化得到的結(jié)果1)可溶性甘醇酸鹽氧化酶(g.o.)和可溶性過氧化氫酶，2)多形漢遜酵母(Hansenula polymorpha)滲透細胞催化劑，和3)巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)滲透細胞催化劑(反應(yīng)條件見實例5、12和13)催化劑 甘醇酸鹽 過氧化 反應(yīng) 丙酮 乙酸乳酸氧化酶氫酶 時間 酸鹽鹽 鹽(IU/mL) (IU/mL) (h) (％) (％)(％)可溶酶6.010,000 595.34.50.9多形漢遜酵母 6.4 5,000 297.02.50.4巴斯德畢赤氏酵母 6.310,000 398.21.20.6當使用上述任意一種滲透細胞催化劑時，與使用可溶性甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶作為催化劑時相比較，丙酮酸鹽的產(chǎn)率較高，而副產(chǎn)物乙酸鹽的產(chǎn)量較低。當以與用于可溶酶實驗相同的甘醇酸鹽氧化酶濃度使用多形漢遜酵母(H.polymorpha)滲透細胞催化劑時，生成較少的乙酸鹽(由副產(chǎn)物過氧化氫與丙酮酸鹽反應(yīng)產(chǎn)生)，盡管反應(yīng)混合物中存在的內(nèi)生細胞過氧化氫酶的濃度是可溶酶反應(yīng)中該酶濃度的一半。這些結(jié)果，和伴隨實例中那些結(jié)果，證實當使用滲透細胞轉(zhuǎn)化體作為催化劑時丙酮酸鹽產(chǎn)率有意外的改善。
較好實施方案描述L-乳酸或其一種適用鹽的催化氧化，是在一種能催化L-乳酸與O2反應(yīng)生成丙酮酸的酶催化劑存在下，讓L-乳酸與一種分子氧源接觸而方便地進行的。一種這樣的催化劑是甘醇酸鹽氧化酶(EC1.1.3.15)這種酶，也稱之為乙醇酸氧化酶。甘醇酸鹽氧化酶可以從技術(shù)上眾所周知的許多源(見上文)分離。反應(yīng)中使用的甘醇酸鹽氧化酶應(yīng)以有效濃度存在，濃度通常為約0.01～約1000IU/ml，較好是約0.1～約10IU/ml。IU(國際單位)定義為每分鐘能催化1微摩爾底質(zhì)(酶作用物)轉(zhuǎn)化的酶的數(shù)量。這種酶的試驗步驟見I.Zelitch和S.Ochoa，J.Biol.Chem.，Vol.201，707-718(1953)。這種方法也用來檢測回收或再循環(huán)甘醇酸鹽氧化酶的活性。
甘醇酸鹽氧化酶作為催化劑用于L-乳酸氧化轉(zhuǎn)化成丙酮酸的最佳結(jié)果，是通過在反應(yīng)溶液中加進一種過氧化氫分解催化劑得到的。一種與甘醇酸鹽氧化酶組合時有效的此類過氧化物破壞催化劑是過氧化氫酶(EC1.11.1.6)這種酶。過氧化氫酶催化過氧化氫分解成水和氧，據(jù)信它能通過加速在甘醇酸鹽氧化酶催化的乳酸與O2的反應(yīng)中與丙酮酸一起產(chǎn)生的過氧化氫的分解，提高丙酮酸的產(chǎn)率。過氧化氫酶的濃度應(yīng)是50～50,000IU/ml，較好是2,000～15,000IU/ml。較好的是，把過氧化氫酶和甘醇酸鹽氧化酶濃度調(diào)整在上述范圍內(nèi)，從而使過氧化氫酶與甘醇酸鹽氧化酶的比值(每種酶均用IU量度)為至少約250∶1。
除使用可溶酶作為催化劑外，還制備了能表達甘醇酸鹽氧化酶活性以及內(nèi)生過氧化氫酶活性的微生物轉(zhuǎn)化體，并證實了它們作為微生物催化劑在本發(fā)明中的用途。本發(fā)明中利用的微生物細胞催化劑是多形漢遜酵母(H.polymorpha)(一種嗜甲基酵母)的一種轉(zhuǎn)化體。已通過在甲酸鹽脫氫酶(FMD)促進劑的控制下把甘醇酸鹽氧化酶的DNA插入一種表達媒介物中，制備了若干種具有足夠甘醇酸鹽氧化酶活性的多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體。多形漢遜酵母就是用這種媒介物轉(zhuǎn)化的，并篩選出一個能產(chǎn)生高水平甘醇酸鹽氧化酶的菌株，定名為GO1多形漢遜酵母(H.polymorpha GOl)(保藏在美國伊利諾州皮奧里亞美國農(nóng)業(yè)部ARS專利培養(yǎng)物保藏中心，北部地區(qū)研究室登記號Y-21065)。
多形漢遜酵母細胞催化劑的制備，典型地是先在500ml pH4.4的YPD(Difco公司)中生長一種多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體種菌。然后把這種培養(yǎng)物接種到一個盛有101由無氨基酸的酵母氮基(YNB，Difco公司)(14g)、硫酸銨(50g)和甲醇(100g)組成，pH5.0的培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中。該發(fā)酵罐在37℃、攪拌速度400轉(zhuǎn)/分、恒pH5.0、40％溶解氧(受控)和14磅/平方英寸表壓(psig)空氣的條件下運行42.5小時。發(fā)酵結(jié)束時添加1.0kg甘油，離心法收獲細胞，用液氮冷凍、貯存在-80℃。
本發(fā)明中利用的第二種微生物細胞催化劑是巴斯德畢赤氏酵母(Pichia pastoris)(一種嗜甲基酵母)的轉(zhuǎn)化體，它表達了來自菠菜的甘醇酸鹽氧化酶以及內(nèi)生過氧化氫酶。已按如下制備了若干種有足夠甘醇酸鹽氧化酶活性的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體諸如在甲醇誘導(dǎo)醇氧化酶I促進劑的控制下，把一種含有菠菜甘醇酸鹽氧化酶基因的DNA片段插入一種巴斯德畢赤氏酵母表達媒介物(pHIL-D4)中，產(chǎn)生質(zhì)粒pMP1。用質(zhì)粒pMP1使巴斯德畢赤氏酵母菌株GTS115(NRRLY-15851)轉(zhuǎn)化，并進行篩選，以使得線性化質(zhì)粒pMP1能整合到染色體醇氧化酶I位點上，用甘醇酸鹽氧化酶基因代替醇氧化酶基因。然后篩選一批這樣的轉(zhuǎn)化體，以得到最大數(shù)目的表達盒整合拷貝。分離出一種定名為GS115-MSP10巴斯德畢赤氏酵母菌株(P.pastorisstrain GS115-MSP10)的高拷貝數(shù)轉(zhuǎn)化體，作為NRRL Y-21001保藏。
巴斯德畢赤氏酵母細胞的制備，典型地是在100ml含有1％甘油的YNR中生長一種種菌。在30℃生長48小時后，把這些細胞轉(zhuǎn)移到一個盛放101培養(yǎng)基的發(fā)酵罐中，該培養(yǎng)基由無氨基酸的酵母氮基(YNB)(134g)、甘油(100g)和生物素(20mg)組成。發(fā)酵操作條件是pH5.0(用NH4OH控制)，30℃，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分，曝氣5slpm，5磅/平方英寸表壓空氣，溶解氧保持在不低于50％飽和度。當甘油耗盡時，通過在除用甲醇(50g)代替甘油外相同的培養(yǎng)基中生長，誘導(dǎo)這些細胞以使之表達甘醇酸鹽氧化酶。誘導(dǎo)期間的甘醇酸鹽氧化酶活性用酶檢定法跟蹤。誘導(dǎo)24小時后，先用甘油(1kg)處理，再收獲這些細胞。收獲后，細胞用液氮冷凍，在-80℃保存。
多形漢遜酵母和巴斯德畢赤氏酵母細胞轉(zhuǎn)化體在作為乙醇酸氧化成乙醛酸的催化劑使用之前需要進行滲透。有各種各樣的已知滲透方法可用于制備有足夠甘醇酸鹽氧化酶活性的細胞(參閱Felix，H.，Anal.Biochemistry，Vol，120，211-234(1982))。典型地說，10％(重量)濕細胞在0.1％(體積)“TRITON”X-100/20mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中的懸浮液混合15分鐘，然后用液氮冷凍，解凍，用20mM磷酸鹽/0.1mM FMN緩沖劑(pH7.0)洗滌。第二種滲透方法按以下進行10％(重量)濕細胞在0.2％(重量/體積)氯化芐烷銨/20mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中的懸浮液混合60分鐘，然后用20mM磷酸鹽/0.1mM FMN緩沖劑(pH7.0)洗滌這些經(jīng)過滲透的細胞。一旦進行了滲透，立即選擇添加到反應(yīng)混合物中的整體細胞催化劑的數(shù)量，以便提供如以上對對應(yīng)可溶酶所述那樣的必要甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶活性濃度。甘醇酸鹽氧化酶與過氧化氫酶活性的回收率之所以大于其初始值的100％，是由于在反應(yīng)期間細胞的滲透作用增大。
微生物細胞轉(zhuǎn)化體的甘醇酸鹽氧化酶活性檢測是準確稱量約5～10mg濕細胞(用濾紙吸干以除去多余水分)放進一個3ml石英杯中，杯中含有一枚磁攪拌棒和2.0ml由0.12mM 2，6-二氯苯酚-靛酚(DCIP)和80mM TRIS(三(羥甲基)氨基甲烷)緩沖劑(pH8.3)組成的一種溶液。杯上蓋一張橡皮膜，通氮鼓泡5分鐘使溶液脫氧。然后用注射器向杯中添加40μl 1.0M乙醇酸/1.0M TRIS(pH8.3)，攪拌混合物，同時測定在605nm(ε＝22,000)的吸收隨時間的變化。過氧化氫酶活性檢測是準確稱量約2～5mg濕細胞(用濾紙吸干以除去多余水分)放進一個3ml石英杯中，杯中含有一枚磁攪拌棒和2.0ml蒸餾水，然后添加1.0ml 59mM過氧化氫在50mM磷酸鹽緩沖劑(pH7.0)中的溶液，并測定在240nm(ε＝39.4)的吸收隨時間的變化。在不同培養(yǎng)基中培養(yǎng)的多形漢遜酵母或巴斯德畢赤氏酵母濕細胞(滲透的)甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶活性范圍，對甘醇酸鹽氧化酶是20～120 DCIP IU/克濕細胞，而對內(nèi)生過氧化氫酶是30,000～200,000IU/克濕細胞。
反應(yīng)溶液中一種任選但往往有益的組分是黃素單核苷酸(FMN)，其使用濃度一般可高達約2.0mM，較好是約0.01～約0.2mM。據(jù)信，F(xiàn)MN能提高甘醇酸鹽氧化酶的生產(chǎn)力，即每單位酶能使乙醇酸轉(zhuǎn)化成乙醛酸的數(shù)量。要理解的是，所添加FMN的濃度不包括與酶一起存在的任何FMN，因為在酶的制備期間往往也向酶中添加FMN。FMN的結(jié)構(gòu)及其分析方法見K.Yagai，Methods of Biochemical Analysis，Vol.X，Interscience Publishers，New York，1962，p.319-355。
L-乳酸是商業(yè)上可得的，在本反應(yīng)中，它的初始濃度范圍是0.10M～2.0M，較好是在0.25M和1.0M之間。它可以作為酸或作為其一種兼容鹽用于反應(yīng)，這就是說，這種鹽應(yīng)是水溶性的，且其陽離子不干擾所希望的L-乳酸向丙酮酸的轉(zhuǎn)化。適用和兼容的成鹽陽離子組容易通過試驗來確定。這類鹽的代表是堿金屬鹽，堿土金屬鹽、銨鹽、取代的銨鹽、鏻鹽、和取代的鏻鹽。通過發(fā)酵產(chǎn)生的L-乳酸可以利用直接來自發(fā)酵罐的過濾溶液作為底質(zhì)，無需純化或與發(fā)酵液體培養(yǎng)基分離。
L-乳酸向丙酮酸轉(zhuǎn)化方便地且較好在水培養(yǎng)基中進行。反應(yīng)混合物的pH調(diào)節(jié)到6～10、較好7～9之間的一個值。在這個pH范圍內(nèi)，可以通過添加任何一種兼容的非干擾堿，包括，(但不限于)堿金屬氫氧化物、碳酸鹽、碳酸氫鹽和磷酸鹽，調(diào)節(jié)一個能獲得預(yù)期pH的準確數(shù)值。未緩沖反應(yīng)混合物的pH會隨著反應(yīng)進行而降低大約2pH單位，因此，往往有益的是讓反應(yīng)在最大酶活性pH范圍的高端約9.0～8.5開始，并讓它在反應(yīng)期間下降；典型地說，未緩沖反應(yīng)混合物的最終pH范圍是大約6.7～7.5。這個pH可以任選地通過單獨添加一種在pH7.5左右有一定緩沖能力的非干擾性無機或有機緩沖劑來保持，因為L-乳酸鹽氧化的最佳酶活性接近于這個值；當使用一種適用緩沖劑時采用7.5的初始pH。要理解，L-乳酸和丙酮酸在水中是高度離解的，而且在7～10之間的pH時大部分(如果不是基本上的話)以L-乳酸根和丙酮酸根離子的形式存在。
氧(O2)即L-乳酸轉(zhuǎn)化成丙酮酸的氧化劑，可以通過在氣-液界面上攪拌液體或通過一張能透過氧的膜，以氣體形式加到反應(yīng)中。當采用滲透的整體細胞催化劑時，可以通過向反應(yīng)混合物中通入(鼓泡)氧或一種含氧氣體來加氧。在大多數(shù)條件下，反應(yīng)速度至少部分地受到氧能溶解到該含水培養(yǎng)基中的速度控制。因此，盡管氧能以空氣形式加到反應(yīng)中，但也可以使用相當純粹形式的氧。盡管不知道氧壓的上限，但可以使用可高達50大氣壓的氧壓，而且較好是上限為15大氣壓。攪拌對于保持高氧溶解速度(因而高反應(yīng)速度)是重要的。任何方便的攪拌方式均可使用，例如機械攪拌。高剪切攪拌或產(chǎn)生泡沫的攪拌可能使溶解酶活性降低，因而當使用溶解酶催化劑時應(yīng)當避免。
反應(yīng)溫度是一個重要變量，其原因在于它影響反應(yīng)速度和酶的穩(wěn)定性。典型地說，可以使用可高達約40℃的反應(yīng)溫度而不顯著損失催化活性，但較好的反應(yīng)溫度范圍是約0℃～約15℃。在這個較好反應(yīng)溫度范圍內(nèi)操作，能在反應(yīng)結(jié)束時使回收的酶活性達到最大限度。溫度不應(yīng)低得使水溶液開始凝固。溫度可以用普通方法控制，例如，但不限于，使用夾套式反應(yīng)容器并讓有適當溫度的液體通過該夾套。反應(yīng)容器可以用任何一種對反應(yīng)組分惰性的材料建造。
當反應(yīng)完成時，可溶性酶催化劑可以用過濾法或離心法脫除，并任選地重復(fù)利用。此外，也可以通過加熱諸如到70℃5分鐘而使之變性和沉淀，和/或如果它們的存在不令人討厭，還可以允許它們?nèi)匀涣粼诜磻?yīng)混合物中。滲透的細胞催化劑可以用離心法或過濾法從反應(yīng)混合物中分離出來再循環(huán)。在可溶性酶或微生物細胞催化劑脫除之后，黃素單核苷酸(FMN)可以任選地通過讓該溶液與活性炭接觸而脫除。然后，所希望的丙酮酸(即丙酮酸和丙酮酸鹽)可以作為溶液本身回收，也可以通過脫水而使所得到的溶液濃縮和回收該丙酮酸這種濃縮可以諸如通過在減壓下脫水、凍干(冷凍干燥)或者技術(shù)上普遍知道的任何其它方法進行。
在用來進一步說明本發(fā)明的下列實例中，丙酮酸鹽和乙酸鹽的產(chǎn)率，以及L-乳酸鹽的回收率，是以反應(yīng)開始時存在的L-乳酸總量為基準計算的百分率，除非另有所指。反應(yīng)混合物的分析是用高壓液相色譜法(HPLC)進行的，有機酸分析用Bio-Rad HPX-87H柱進行。
實例1在一個3盎司Fischer-Porter玻璃氣溶膠反應(yīng)容器中放進一個磁攪拌棒和10ml pH8.9的水溶液，其中含有L-乳酸鋰(0.75M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)、N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖劑(0.788M)、菠菜甘醇酸鹽氧化酶(1.0IU/ml)和黑曲霉(Aspergillus niger)過氧化氫酶(1,400IU/ml)。將反應(yīng)容器密封并使反應(yīng)混合物冷卻到5℃，然后通過加壓至70磅/平方英寸表壓(psig)并在攪拌下向大氣壓放空5次，用氧沖洗該容器。然后使該容器增壓至70磅/平方英寸表壓的氧氣，混合物在5℃攪拌。按有規(guī)律的時間間隔用注射器通過采樣口(不損失容器內(nèi)的壓力)取出等分試樣(0.10ml)進行HPLC分析，以監(jiān)測反應(yīng)的進展。28.5小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為47.7％和43.6％，剩余11.5％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的40％和100％。
實例2在pH8.1和5℃，用10ml含有下列成分的水溶液重復(fù)實例1中所述步驟L-乳酸(96％L-異構(gòu)體，4％D-異構(gòu)體，0.750M)KH2PO4(0.750M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)，菠菜甘醇酸鹽氧化酶(1.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(14,000IU/ml)。48小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為79.6％和3.8％，剩余20.2％乳酸鹽。反應(yīng)18小時后甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的22％和100％。
實例3在pH8.3和5℃，用10ml含有下列成分的水溶液重復(fù)實例1中所述步驟L-乳酸(96％L-異構(gòu)體，4％D-異構(gòu)體，0.500M)KH2PO4(0.50M)、FMN(0.01mM)、異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)，菠菜甘醇酸鹽氧化酶(2.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(14,000IU/ml)。18小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為90.5％和4.2％，剩余6.4％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的57％和100％。
實例4在pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))和15℃，用10ml含有下列成分的水溶液重復(fù)實例1中所述步驟L-乳酸鈉(0.500M)，異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)，菠菜甘酵酸鹽氧化酶(2.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(20,000IU/ml)；不添加緩沖劑。7小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為91.6％和0.6％，剩余7.1％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氫化氫酶的剩余活性分別為其初始值的21％和100％。
實例5在pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))和15℃，用10ml含有下列成分的水溶液重復(fù)實例1中所述步驟L-乳酸鈉(0.500M)，異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)，菠菜甘醇酸鹽氧化酶(6.0IU/ml)，和可溶性黑曲霉過氧化氫酶(10,000IU/ml)；不添加緩沖劑。5小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為95.3％和0.9％，剩余4.5％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余活性分別為其初始值的68％和100％ 。
實例6在一個3盎司Fischer-Porter氣溶膠反應(yīng)容器中放置一枚磁攪拌棒和10ml合有乳酸鈉(0.500M)、KH2PO4(0.50M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)、pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))的水溶液，將溶液冷卻到5℃。然后向該容器中添加0.75g已經(jīng)通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZA BARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(65.2IU甘醇酸鹽氧化酶和101,000IU過氧化氫酶)，然后將反應(yīng)容器密封，反應(yīng)混合物冷卻到5℃，該容器通過增壓至70磅/平方英寸表壓并在攪拌下向大氣壓放空5次，用氧沖洗該容器；然后使該容器增壓至70磅/平方英寸表壓的氧氣，混合物在5℃攪拌。按有規(guī)律的時間間隔用注射器通過采樣口(不損失容器內(nèi)的壓力)取出等分樣品(0.10ml)進行HPLC分析，以監(jiān)測反應(yīng)的進展。5小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為97.6％和2.5％，剩余0.3％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的104％和105％。
實例7用N-二(羥乙基)甘氨酸緩沖劑(0.5M)代替KH2PO4(0.50M)，重復(fù)實例6中的反應(yīng)。5小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為93.1％和6.3％，剩余0.4％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的107％和122％。
實例8用10ml含有L-乳酸鈉(0.500M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例6中所述步驟，向該水溶液中添加0.75g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(65.2IU甘醇酸鹽氧化酶和101,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。5小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為99.0％和0.7％，剩余0.4％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的119％和113％。
實例9用10ml含有L-乳酸鈉(0.500M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例6中所述步驟，向該水溶液中添加0.35g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(22.6IU甘醇酸鹽氧化酶和50,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。8小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為97.4％和2.3％，剩余0.4％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別是其初始值的123％和150％。
實例10用10ml含有L-乳酸鈉(0.500M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例6中所述步驟，向該水溶液中添加0.18g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(11.3IU甘醇酸鹽氧化酶和25,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。10小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為92.9％和5.0％，剩余3.3％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別是其初始值的121％和228％。
實例11用10ml含有L-乳酸鈉(1.00M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例6中所述步驟，向該水溶液中添加0.71g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(45.9IU甘醇酸鹽氧化酶和100,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。8小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為89.1％和8.4％，剩余1.3％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的124％和145％。
實例12用10ml含有L-乳酸鈉(0.50M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.1000M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例6中所述步驟，向該水溶液中添加0.66g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體GS115-MSP10(62.7IU甘醇酸鹽氧化酶和100,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。反應(yīng)溫度是15℃，氧壓是70磅/平方英寸表壓。3小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別是98.2％和1.2％，剩余0.6％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的124％和130％。
實例13用10ml含有L-乳酸鈉(0.50M)和異丁酸(HPLC內(nèi)插標準，0.100M)的pH9.0(用50％NaOH調(diào)節(jié))水溶液重復(fù)實例12中所述步驟，向該水溶液中添加1.04g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZABARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的多形漢遜酵母轉(zhuǎn)化體G01(64.7IU甘醇酸鹽氧化酶和50,000IU過氧化氫酶)；不添加緩沖劑。反應(yīng)溫度是15℃，氧壓是70磅/平方英寸表壓。2小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為97.0％和2.5％，剩余0.4％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的99％和155％。
實例14在5℃和120磅/平方英寸表壓的氧，重復(fù)實例13中所述反應(yīng)。4小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為93.1％和3.7％，剩余2.2％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的66％和180％。
實例15在30℃和70磅/平方英寸表壓的氧，重復(fù)實例13中所述的反應(yīng)。3小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為89.9％和6.5％，剩余0.6％乳酸鹽。甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶的剩余滲透細胞活性分別為其初始值的45％和140％。
實例16一臺配備Dispersimax Impeller的300ml EZE-Seal攪拌式高壓釜反應(yīng)器(Autoclave Engineers)注入100ml含有L-乳酸鈉(5.50g，0.50M)的溶液。然后向該反應(yīng)器中添加6.70g已通過用0.1％氯化芐烷銨(“LONZA BARQUAT”MB-50)處理而滲透的巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體菌株GS115-MSP10(670IU甘醇酸鹽氧化酶和1,177,000IU過氧化氫酶).混合物用50％NaOH調(diào)節(jié)至pN9.0，冷卻至5℃。該反應(yīng)器通氧，然后該混合物在40磅/平方英寸表壓氧氣下在5℃以750轉(zhuǎn)/分攪拌，利用渦輪葉輪的作用使氧氣通過混合物鼓泡。反應(yīng)的監(jiān)測按如下進行按有規(guī)律的時間間隔取出0.40ml反應(yīng)混合物等分樣品，用一種Millipore Ultrafree-MC10,000NMWL過濾單元過濾該等分樣品，對濾液進行HPLC分析，用添加到樣品中的0.10M異丁酸作為內(nèi)插標準。3.0小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別為99.2％和1.4％，剩余0.6％乳酸鹽。回收的滲透細胞甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶活性分別為其初始值的107％和106％。
反應(yīng)混合物離心分離，以除去滲透細胞催化劑，得到的上清液通過一種0.2mm尼龍過濾器過濾，用1.0N HCl把所得到濾液的pH調(diào)節(jié)到4.6，然后將溶液冷凍，用凍干法脫水，產(chǎn)生5.20g丙酮酸鈉(分離產(chǎn)率96％，用HPLC分析測定的98％丙酮酸鈉)。
實例17一種含有109.9g/l乳酸銨(97.8％L-乳酸鹽，2.2％D-乳酸鹽)、0.8g/l乙酸鹽和2.8g/l麥芽糖的發(fā)酵液體培養(yǎng)基進行離心分離以除去顆粒物質(zhì)，然后通過一個0.45mm過濾器過濾。所得到溶液中乳酸銨的濃度是1.10M(118.6g/l，用HPLC分析法測定)。在一個配備Dispersimax Impeller的300ml EZE-Seal攪拌式高壓釜反應(yīng)器(Autoclave Engineers)中放入45ml 1.10M過濾的發(fā)酵液體培養(yǎng)基，然后加55ml蒸餾水，以產(chǎn)生100ml含有0.50M乳酸銨的水溶液。然后向該反應(yīng)器中添加6.70g已通過用0.1％氧化芐烷銨(“LONZA BARQUAT”O(jiān)J-50)處理而滲透的再循環(huán)巴斯德畢赤氏酵母轉(zhuǎn)化體菌株GS115-MSP10(666IU甘醇酸鹽氧化酶和1,107,000IU過氧化氫酶)，混合物用50％NaOH調(diào)節(jié)至pH7.5，冷卻到5℃。反應(yīng)器中通入氧氣，然后混合物在40磅/平方英寸表壓氧氣下在5℃以750轉(zhuǎn)/分攪拌，借助于渦輪葉輪的作用使氧氣通過混合物鼓泡。反應(yīng)的監(jiān)測按如下進行，按有規(guī)律的時間間隔取出0.40ml反應(yīng)混合物等分樣品，用一種Millipore Ultrafree-MC10,000NMWL過濾單元過濾該等分樣品，對濾液進行HPLC分析，用0.10M異丁酸作為內(nèi)插標準。3.0小時后，丙酮酸鹽和乙酸鹽的HPLC產(chǎn)率分別是94.1％(根據(jù)L-乳酸鹽計算為96.2％)和2.8％，剩余2.5％乳酸鹽?；厥盏臐B透細胞甘醇酸鹽氧化酶和過氧化氫酶活性分別為其初始值的101％和56％。
以上對本發(fā)明做了某種具體程度的描述和說明，應(yīng)當知道的是，下列權(quán)利要求不要因此而受限制，而是有一個與各該權(quán)利要求的每個要素及其對等物的說法一致的范圍。
權(quán)利要求
1.一種生產(chǎn)丙酮酸的方法，包括如下步驟在一種水溶液中，在甘醇酸鹽氧化酶這種酶催化劑和過氧化氫酶這種酶催化劑的存在下，讓L-乳酸和氧反應(yīng)一段足以使L-乳酸以高產(chǎn)率轉(zhuǎn)化成丙酮酸的時間，其中L-乳酸的初始濃度是約0.1～約2.0M，然后回收該丙酮酸。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述酶催化劑存在于一種微生物轉(zhuǎn)化體中。
3.權(quán)利要求1的方法，其中不添加額外的緩沖劑，反應(yīng)期間也不進行pH控制。
4.權(quán)利要求1的方法，其中反應(yīng)是在約6～約10的pH進行的，且其中存在0.01～1,000IU/ml甘醇酸鹽氧化酶活性和50～50,000IU/ml過氧化氰酶活性。
5.權(quán)利要求3的方法，其中存在0.1～10IU/ml甘醇酸鹽氧化酶活性和2,000～15,000TU/ml過氧化氫酶活性，且過氧化氫酶活性與甘醇酸鹽氧化酶活性的IU/ml比是至少250∶1。
全文摘要
一種生產(chǎn)丙酮酸的方法，包括在水溶液中，在甘醇酸鹽氧化酶((S)-2-羥基酸氧化酶，EC1.1.3.15)和過氧化氫酶(EC1.11.1.6)這些催化劑的存在下，L-乳酸和氧的酶促反應(yīng)。能以商業(yè)上可接受的濃度(典型地可高達0.5M)得到高純度(98％鈉鹽)、高產(chǎn)率(例如96％)的丙酮酸鹽，產(chǎn)品對酶基本上無抑制作用。
文檔編號C12N1/16GK1125961SQ94192574
公開日1996年7月3日 申請日期1994年6月15日 優(yōu)先權(quán)日1993年6月25日
發(fā)明者D·L·安頓, R·迪科西莫, V·G·韋特霍爾特 申請人:納幕爾杜邦公司