專(zhuān)利名稱(chēng)：脂酶變異體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于具有改良特性的新型脂酶變異體，用于所述變體表達(dá)的編碼DNA構(gòu)建物、能夠由該DNA構(gòu)建物表達(dá)變異體的宿主細(xì)胞、及通過(guò)培養(yǎng)所述宿主細(xì)胞制備變異體的一種方法。
重組DNA技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展已對(duì)蛋白質(zhì)化學(xué)領(lǐng)域產(chǎn)生了深刻的影響，可以設(shè)想這些技術(shù)使得根據(jù)特定要求設(shè)計(jì)肽和蛋白如酶成為可能，從而保證化合物制品具有需要的特點(diǎn)。
由于這些技術(shù)的實(shí)用性，構(gòu)建具有需要氨基酸序列的酶已成為可能，而且對(duì)這一課題已做了大量的研究。
多種脂酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)已確定并在文獻(xiàn)中已描述(Boel等，Lipids23，701—706(1988)，de Caro等，Biochim.Biophys.Acta671，129—138(1981)，Winkler等，Nature343，771—774(1990)。而且對(duì)更有限數(shù)目的脂酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)也已闡明(Winkler等，Nature343，771—774(1990)，Brady等，Natrue343，767—770(1990)，J.D.Schrag等，Nature 351，1991，PP.761—764)。從這些研究中發(fā)現(xiàn)脂酶具有某種共同的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，但在另一方面，這些脂酶中也存在主要結(jié)構(gòu)的變異。
WO92/05249揭示了具有改良特性的脂酶變異體，其中通過(guò)其氨基酸序列的特異修飾改變了野生型脂酶的某些特征。例如，改變野生型脂酶一稱(chēng)為脂接觸區(qū)的靜電荷和疏水性，從而提高了脂類(lèi)底物進(jìn)入活性位點(diǎn)的能力，這一改變主要通過(guò)對(duì)天然脂酶分子中的氨基酸殘基的取代和缺失。
本發(fā)明現(xiàn)令人驚異地鑒定了更多構(gòu)建具有改良特性的新型脂酶變異體的氨基酸修飾。
因此，本發(fā)明一方面涉及親代脂酶的脂酶變異體，所述親代脂酶在脂酶分子中疏水優(yōu)勢(shì)的加長(zhǎng)結(jié)合袋中含有包括活性絲氨酸的類(lèi)胰蛋白酶催化三分體，該變異體的脂接觸區(qū)的非芳香氨基酸殘基被芳香氨基酸殘基所取代，所述脂接觸區(qū)包括位于含活性絲氨酸的脂酶結(jié)構(gòu)部分內(nèi)部的殘基，這些殘基在水解時(shí)或水解過(guò)程中參予與底物的相互作用。在下面的敘述中，這一類(lèi)型脂酶變異體被定義為脂酶變異體I。
本文中“類(lèi)胰蛋白酶”詞條用于表明親代脂酶在活性位點(diǎn)含有一與胰蛋白酶相應(yīng)的催化三分體，即絲氨酸、組氨酸和天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺或谷氨酰胺中的一種。當(dāng)一些脂酶為非活性形式時(shí)，其也可含有包括活性絲氨酸的表面環(huán)狀結(jié)構(gòu)(這種脂酶的一個(gè)例子由Brady等，在Nature343，1990，PP.767—770中做了描述)。當(dāng)脂酶被活化時(shí)，該環(huán)狀結(jié)構(gòu)被移去，以暴露出活性位點(diǎn)殘基，產(chǎn)生一提高了表面疏水性的表面，當(dāng)水解時(shí)或水解過(guò)程中，其可與脂類(lèi)底物相作用。針對(duì)本發(fā)明的目的，這一表面被稱(chēng)為“脂類(lèi)接觸區(qū)”以包括位于這一表面或構(gòu)成這一表面部分的氨基酸殘基(或者不含有該環(huán)狀結(jié)構(gòu)的脂酶的相對(duì)應(yīng)表面)。這些呈或不呈環(huán)形結(jié)構(gòu)的氨基酸殘基在水解時(shí)或在水解過(guò)程中可參與脂酶和底物的相互作用，通過(guò)接觸脂類(lèi)表面被活化時(shí)，脂酶從脂相中水解甘油三酯。在甘油三酯的水解過(guò)程中，形成不同量的脂肪酸和甘油單酯及甘油二酯。
Lanuginosa腐質(zhì)霉(Humicola lanuginosa)脂酶的脂類(lèi)接觸區(qū)在本發(fā)明的申請(qǐng)中被詳細(xì)討論，由氨基酸殘基21—25，36—38，56—62，81—98，110—116，144—147，172—174，199—213和248—269限定。這些殘基是在計(jì)算機(jī)模型模擬脂酶和脂類(lèi)底物相互作用的基礎(chǔ)上被鑒定出來(lái)的。
本文中的“芳香氨基酸殘基”意指酪氨酸、色氨酸和苯丙氨基，術(shù)語(yǔ)“非芳香氨基酸殘基”意指不同于酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸的氨基酸殘基。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及到特定的脂酶變異體，其中WO92/05249中公開(kāi)的Lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶中特定位點(diǎn)上的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基，或在其它來(lái)源脂酶的相似位點(diǎn)上已被其它氨基酸殘基取代，Lanuginosa腐植霉脂酶的cDNA和氨基酸序列如SEQ ID No.1和2所示。這些變異體在下文中將進(jìn)一步討論。
本發(fā)明也涉及到包括編碼上文所述的脂酶變異體的DNA序列的DNA構(gòu)建物，含有所述DNA構(gòu)建物的重組表達(dá)載體，用DNA構(gòu)建物或表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞，以及在有助于產(chǎn)生脂酶變異體的條件下培養(yǎng)上述細(xì)胞，然后從培養(yǎng)物中回收脂酶變異體生產(chǎn)本發(fā)明的脂酶變異體的方法。
本發(fā)明進(jìn)一步涉及含有本發(fā)明脂酶變異體的去污添加劑，該脂酶任選呈無(wú)粉塵顆粒、穩(wěn)定的液體或被保護(hù)酶的形式，還涉及到包括本發(fā)明脂酶變異體的去污劑組合物。
在描述本發(fā)明的脂酶變異體時(shí)，使用下列規(guī)則以易于指稱(chēng)
原氨基酸位置取代的氨基酸根據(jù)這一規(guī)則，例如位置96的天冬氨酸被取代為酪氨酸表示為Asp96Trp或D96W多突變則被加號(hào)分開(kāi)，例如Asp96Leu＋Leu206Val或D96L＋L206V其代表位置96和206的突變?yōu)樘於彼岷土涟彼岱謩e被亮氨酸和纈氨酸取代。脂酶變異體大多使用傳統(tǒng)單字母氨基酸碼來(lái)表示。
根據(jù)本發(fā)明，脂酶變異體I優(yōu)選其中被取代的非芳香氨基酸為谷氨酸或天冬氨酸殘基的變異體，并優(yōu)選該氨基酸位于如SEQ IDNO.2所示的成熟的Lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶的氨基酸序列的96位，或如下將詳細(xì)討論的其它來(lái)源的親代脂酶的相似位置。
從所述Lanuginose腐質(zhì)霉脂酶制得的本發(fā)明的特定脂酶變異體包括如下的一個(gè)或更多氨基酸殘基取代E56H，P，M，W，Y，F(xiàn)，I，G，C，V；D96H，E，P，M，W，Y，F(xiàn)，I，G，C，V；L259N，D，C，Q，E，H，I，M，F(xiàn)，P，W，Y；L206K，R，N，D，C，Q，E，H，I，M，F(xiàn)，P，W，Y當(dāng)本發(fā)明的脂酶變異體含有不只一個(gè)取代時(shí)，優(yōu)選兩個(gè)取代，能得到特別有意義的效果。例如，下列H.Lanuginosa脂酶的變異體已被發(fā)現(xiàn)很有意義D96Ｗ＋E210N；D254K＋L259I；D96L＋L206V；D96L＋L206S；D96W＋D102N；D96L＋L259I＋L206V；D56Q＋L259I＋L206V。
通過(guò)如那些上述H.Lanuginosa脂酶的相似取代而從其它來(lái)源的脂酶獲得的脂酶變異體也被認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。
本文中，術(shù)語(yǔ)“相似取代”意指在與那些H.Lanuginosa脂酶中所確定的相似位置上進(jìn)行的其它脂酶的氨基酸取代。根據(jù)該脂酶與H.Lannginosa脂酶的三維結(jié)構(gòu)比較可以確定相似位置。H.Lanuginsosa脂酶的三維結(jié)構(gòu)結(jié)構(gòu)如WO92/05249的

圖1A和1B所示，被改造的親代脂酶的三維結(jié)構(gòu)可以是已知的，也可通過(guò)傳統(tǒng)方法得出，如應(yīng)用X－射線(xiàn)分析。被取代和插入的氨基酸殘基優(yōu)選屬于相同類(lèi)型的氨基酸(例如，疏水性，親水性等)，但不必與H.Lanuginosa脂酶的確切氨基酸相一致。
雖然親代脂酶可來(lái)自多種來(lái)源，如哺乳動(dòng)物脂酶，例如胰、胃、肝或脂蛋白脂酶，但一般優(yōu)選微生物脂酶。例如，親代脂酶可選自酵母，如假絲酵母脂酶；細(xì)菌，如假單孢菌脂酶或真菌，如腐質(zhì)霉和Rhizomucor脂酶。特別優(yōu)選從一組結(jié)構(gòu)同源脂酶中選擇親代脂酶。例如，親代脂酶可以是Rhizomucor miehei脂酶，特別是EP238 023中所述的脂酶，或如上所述的H.Lanuginosa脂酶。
應(yīng)注意到H.Lanuginosa脂酶和Rhizomucor miehei脂酶屬于同一組脂酶，這表明兩種酶的總體的三維結(jié)構(gòu)是非常相似的，并且通過(guò)X－射線(xiàn)晶體學(xué)顯示出高度同源性(H.Lanuginosa脂酶和Rh.miehei脂酶的計(jì)算機(jī)模型分別如WO92/05249的圖1A和B及2A和B所示，其中兩種脂酶的脂類(lèi)接解區(qū)之間的相似性是十分明顯的)。因此針對(duì)H.Lanuginosa脂酶的修飾類(lèi)型可能對(duì)Rh.miehei脂酶也有作用。
根據(jù)本發(fā)明，應(yīng)注意到上述任一氨基酸序列修飾可與本文所述的任何其它修飾或WO92/05249中提到的任一修飾相組合。
制備本發(fā)明脂酶變異體，可通過(guò)分離編碼親代脂酶的DNA序列，對(duì)所述序列適當(dāng)修飾，例如定點(diǎn)突變以使其編碼所述的變異體，并接著將修飾的DNA序列導(dǎo)入能表達(dá)所述變異體的適當(dāng)宿主生物中。本發(fā)明的DNA構(gòu)建物的DNA序列可以是按常規(guī)技術(shù)得到的cDNA、基因組DNA或合成的DNA序列或這些序列的任意組合。適用于克隆和誘變DNA序列的技術(shù)在WO92/05249中有詳細(xì)描述，該文獻(xiàn)的內(nèi)容也包括在本文中作為參考。在下面的實(shí)施例中這些技術(shù)被更加具體地說(shuō)明。
本發(fā)明的脂酶變異體的表達(dá)可如下進(jìn)行。如WO92/04249所述，或通過(guò)本領(lǐng)域中已知的任何其它方法產(chǎn)生的突變脂酶編碼序列，可利用表達(dá)載體表達(dá)為酶形式，所述載體典型地包括編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)和可任意選擇的抑制子基因或各種激活子基因的調(diào)控序列。為了使表達(dá)的蛋白具有分泌性，可在編碼脂酶的序列前加入編碼“信號(hào)序列”的核苷酸。為了在調(diào)控基因的指導(dǎo)下表達(dá)，將根據(jù)本發(fā)明待處理的靶基因以正確的讀碼框架有效地連接到調(diào)控序列?？杀灰氲劫|(zhì)粒載體及支持突變脂酶基因轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列包括但并不限于原核β－半乳糖苷酶啟動(dòng)子(Villa－Kamaroff，等，1978，proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.753727－3731)和tac啟動(dòng)子(Beboer等，1983，Proc.Natl.Acad，Sci.U.S.A.8021－25)。其它參考也可在“Useful Proteinsfrom recombinant bacteria”in Scientific Amer ican，1980，24274－94中找到。
根據(jù)一種具體實(shí)施例方案，芽孢桿菌屬細(xì)胞，例如地衣形芽孢桿菌，緩慢芽孢桿菌，枯草芽孢桿菌用含突變DNA的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化。如果表達(dá)是在分泌性微生物如枯草芽孢桿菌中進(jìn)行，信號(hào)序列可位于翻譯起始信號(hào)后和目的DNA序列之前。該信號(hào)序列用以轉(zhuǎn)運(yùn)表達(dá)產(chǎn)物到細(xì)胞壁，在細(xì)胞壁分泌時(shí)它被從產(chǎn)物中切下。如前所述的術(shù)語(yǔ)“調(diào)控序列”包括存在的信號(hào)序列。
在產(chǎn)生本發(fā)明的脂酶變異體的優(yōu)選方法中，絲狀真菌被用作宿主生物。對(duì)絲狀真菌宿主生物可方便地選擇以前已用作宿主以產(chǎn)生重組蛋白的曲霉屬菌株如黑色曲霉、構(gòu)巢曲霉、米曲霉。應(yīng)用米曲霉產(chǎn)生重組蛋白的深入描述見(jiàn)如EP238023中。
為了在曲霉屬中表達(dá)脂酶變異體，在編碼脂酶變異體的DNA序列之前存在一啟動(dòng)子，該啟動(dòng)子可以是在曲霉屬中具有強(qiáng)轉(zhuǎn)錄活性的任一DNA序列，可從編碼胞外或胞內(nèi)蛋白如淀粉酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂酶、纖維素酶或糖酵解酶的基因中得到。
合適啟動(dòng)子的例子為那些從編碼米曲霉高峰氏α－淀粉酶、Rhizomucor miehiei天冬氨酸蛋白酶、黑色曲霉中性α－淀粉酶、黑色曲霉酸穩(wěn)定α－淀粉酶、黑色曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucor miehei脂酶、米曲霉堿性蛋白酶或米曲霉磷酸丙糖異構(gòu)酶基因得到的啟動(dòng)子。
特別當(dāng)宿主生物為米曲霉時(shí)，應(yīng)用于本發(fā)明方法中的優(yōu)選啟動(dòng)子為米曲霉高峰氏淀粉酶啟動(dòng)子，因?yàn)樗诿浊怪斜憩F(xiàn)出高轉(zhuǎn)錄活性。高峰氏淀粉酶啟動(dòng)子序列見(jiàn)EP238023。
適當(dāng)?shù)慕K止和多聚腺苷化序列可與啟動(dòng)子同樣來(lái)源。
適用于轉(zhuǎn)化真菌宿主細(xì)胞的技術(shù)描述于EP238023。
為了確保脂酶變異體從宿主細(xì)胞中分泌，編碼脂酶變異體的DNA序列前可放置一信號(hào)序列，它可以是自然存在的信號(hào)序列或其功能性部分或保證蛋白從細(xì)胞中分泌的合成序列。特別是，信號(hào)序列可來(lái)自編碼曲霉屬菌株淀粉酶或葡糖淀粉酶的基因，編碼Rhizomucor miehei脂酶或蛋白酶的基因，或編碼腐質(zhì)霉屬纖維素酶、木聚糖酶或脂酶的基因。信號(hào)序列優(yōu)選來(lái)自編碼米曲霉高峰氏淀粉酶、黑色曲霉中性α－淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定α－淀粉酶或黑色曲霉葡糖淀粉酶的基因。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于曲霉屬細(xì)胞生長(zhǎng)的常規(guī)培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)化子通常是穩(wěn)定的，可沒(méi)有選擇壓力進(jìn)行培養(yǎng)，但是，如果發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)化子不穩(wěn)定，可向細(xì)胞中導(dǎo)入選擇標(biāo)記用于篩選。
從宿主細(xì)胞分泌的成熟脂酶蛋白可通過(guò)常規(guī)的步驟從培養(yǎng)基中分離，這些步驟包括通過(guò)離心或過(guò)濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，使用鹽如硫酸銨沉淀蛋白質(zhì)組份，接著進(jìn)行層析，如離子交換層析，親和層析等。去污劑組合物根據(jù)本發(fā)明，該脂酶變異體可典型地作為去污劑組合物的一種組份。例如，它可以非粉塵顆粒、穩(wěn)定的液體或被保護(hù)酶的形式含于去污劑組合物中，非粉塵顆粒的制備如US4,106,991和4,661,452(都為NoVo Industri A/S所有)所示，并可通過(guò)本領(lǐng)域已知的方法進(jìn)行包衣或不包衣。蠟質(zhì)包衣材料的例子是具有平均摩爾分子量1000到20000的聚(氧化乙烯)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)具有16—50個(gè)氧化乙烯單位的乙氧基化壬基酚；醇含有12—20個(gè)碳原子、并具有15至80個(gè)氧化乙烯單位的乙氧基化脂肪醇；脂肪醇；脂肪酸；及單、二、三脂肪酸甘油酯。適于流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的例子見(jiàn)專(zhuān)利GB1483591。液體酶制品例如可根據(jù)已建立的方法加入多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸穩(wěn)定化。其它酶穩(wěn)定劑在本領(lǐng)域中是已知的。被保護(hù)酶的制備可根據(jù)EP238,216中所示方法進(jìn)行。
本發(fā)明的去污劑組合物可以是任何方便形式，如粉末、顆粒、糊狀或液體。液體去污劑可以是水型，典型地含有70％水和0—30％有機(jī)溶劑或非水型。
該去污劑組合物含有一種或多種表面活性劑，其中每一種可以是陰離子的、非離子的、陽(yáng)離子或兩性離子的表面活性劑。該去污劑通常含有0—50％的陰離子表面活性劑如線(xiàn)性烷基苯磺酸鹽(LAS)，α—烯屬磺酸鹽(AOS)，烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸酯鹽(AS))，脂肪醇乙氧基硫酸酯鹽(AEOS或AES)，仲烷基磺酸鹽(SAS)，α—磺基脂肪酸甲酯，烷基或烯基丁二酸或皂。它也可含有0—40％的非離子表面活性劑如醇乙氧基化物(AEO或AE)，羧化醇乙氧基化物，壬基酚乙氧基化物，烷基聚苷、烷基二甲基氧化胺，乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺，脂肪酸單乙醇酰胺或多羥基烷基脂肪酰胺(例如WO92/06154中所述)。
該去污劑組合物另外可含有一種或多種其它酶，如淀粉酶、脂酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、纖維素酶、過(guò)氧化物酶、或氧化酶。
該去污劑可含有1—65％的去污劑助洗劑或配位劑如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽，磷酸鹽，檸檬酸鹽、次氮基三乙酸(NTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)，二亞乙基三胺五乙酸(DTMPA)，烷基或烯基丁二酸，可溶性硅酸鹽或多層式硅酸鹽(如Hoechst的SKS—6)。該去污劑也可是無(wú)助洗劑的，即基本不含去污劑助洗劑。
該去污劑可含有一種或多種聚合物。例如羧甲基纖維素(CMC)，聚(乙烯基吡咯烷酮)(PVP)，聚乙二醇(PEG)，聚(乙烯醇)(PVA)，多聚羧酸鹽如多聚丙烯酸鹽，馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物。
該去污劑可含有漂白系該，該系統(tǒng)包括H2O2源如過(guò)硼酸鹽或過(guò)碳酸鹽，其可與形成過(guò)酸的漂白激活劑如四乙酰乙二胺(TAED)或壬酰氧苯磺酸鹽(NOBS)相結(jié)合。另外，該漂白系統(tǒng)可含有如酰胺、酰亞胺或砜型的過(guò)氧酸。
本發(fā)明的去污劑組合物的酶可應(yīng)用常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定化，如多元醇象丙二醇或甘油、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳酯，并且該組合物可按如WO92/19709和WO92/19708所述方法進(jìn)行配制。
該去污劑也可含有其它常規(guī)去污劑組份，如織物調(diào)理劑包括粘土、泡沫促進(jìn)劑、抑泡劑、抗腐蝕劑、懸污劑、防污再沉淀劑、染料、殺菌劑、熒光增白劑或香料。
PH值(以使用濃度的水溶性測(cè)定)通常為中性或堿性，如7—11。
本發(fā)明范圍內(nèi)的去污劑組合物的特定形式包括
1)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的去污劑組合物組成為線(xiàn)型烷基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算) 7—12％醇乙氧基硫酸酯鹽(例如C12-18醇，1—2EO)或烷基硫酸鹽(例如C16-18) 1—4％醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO) 5—9％碳酸鈉(Na2CO3)14—20％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2) 2—6％沸石(NaAlSiO4) 15—22％硫酸鈉(Na2SO4)0—6％檸檬酸鈉/檸檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％過(guò)硼酸鈉(NaBO3、H2O) 11—18％TAED2—6％羧甲基纖維素0—2％聚合物(例如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚0—3％物，PVP，PEG)酶 0—5％小組分(例如抑泡劑，香料，熒光增白劑，光漂白劑) 0—5％2)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的去污劑組合物組成為線(xiàn)性烷基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算) 6—11％醇乙氧基硫酸酯鹽(例如C12-8醇，1—2EO)或烷基硫酸鹽(例如C16-18) 1—3％醇乙氧基化物(例如C14-15醇，7EO) 5—9％碳酸鈉(Na2CO3) 15—21％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—4％沸石(NaAlSiO4) 24—34％硫酸鈉(Na2SO4) 4—10％檸檬酸鈉/檸檬酸(C6H5Na3O7/C6H8O7) 0—15％羧甲基纖維素 0—2％聚合物(例如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物，PVP，PEG) 1—6％酶0—5％小組份(例如抑泡劑、香料)0—5％3)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的去污劑組合物組成為線(xiàn)性烷基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算)5—9％醇乙氧基化物(例如C10-15醇，7EO) 7—14％皂如脂肪酸(例如G16-22)1—3％碳酸鈉(Na2CO3) 10—17％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2)3—9％沸石(NaAlSiO4)23—33％硫酸鈉(Na2SO4) 0—4％過(guò)硼酸鈉(NaBO3.H2O) 8—16％TAED 2—8％磷酸鹽(例如EDTMPA) 0—1％羧甲基纖維素 0—2％聚合物(例如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚體，PVP，PEG) 1—3％酶 0—5％小組份(例如抑泡劑，香料，熒光增白劑) 0—5％4)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的去污劑組合物，組成為線(xiàn)性烷基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算) 8—12％醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO)10—25％碳酸鈉(Na2CO3) 14—22％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—5％沸石(NaAlSiO4) 25—35％硫酸鈉(Na2SO4) 0—10％羧甲基纖維素 0—2％聚合物(例如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚體，PVP，PEG) 1—3％酶 0—5％小組份(例如抑泡劑、香料) 0—5％5)水溶型液體去污劑組合物，包括線(xiàn)性烷基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算) 15—21％醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 12—18％皂如脂肪酸(例如油酸) 3—13％烯基丁二酸(C12-14) 0—13％氨基乙醇 8—18％檸檬酸 2—8％磷酸鹽 0—3％聚合物(例如PVP，PEG) 0—3％硼酸鹽(B4O7) 0—2％乙醇 0—3％丙二醇 8—14％酶 0—5％小組份(例如分散劑、抑泡劑、香料、熒光增白劑)0—5％6)水型液體去污劑組合物，包括線(xiàn)性熔基苯磺酸鹽(以酸計(jì)算) 15—21％醇乙氧基化物(例如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO)3—9％皂如脂肪酸(如油酸)沸石(NaAlSiO4) 14—22％檸檬酸鉀9—18％硼酸鹽(B4O7) 0—2％羧甲基纖維素0—2％聚合物(如PEG，PVP) 0—3％結(jié)合性聚合物如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物，摩爾比為25∶1；分子量0—3％3800甘油0—5％酶 0—5％小組份(如分散劑，抑泡劑，香料，熒光增白劑) 0—5％7)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的組合物，其組成為醇硫酸酯鹽 5—10％乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺3—9％皂如脂肪酸 0—3％碳酸鈉(Na2CO3) 5—10％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2) 1—4％沸石(NaAlSiO4) 20—40％硫酸鈉(Na2SO4)2—8％過(guò)硼酸鈉(NaBO3·H2O) 12—18％TAED 2—7％聚合物(如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚體，PEG) 1—5％酶 0—5％小組份(如熒光增白劑，抑泡劑，香料) 0—5％8)配制成顆粒的去污劑組合物，其組成為線(xiàn)性烷基苯基磺酸鹽 8—14％乙氧基化脂肪酸單乙酰胺 5—11％皂如脂肪酸 0—3％碳酸鈉(Na2CO3) 4—10％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2)1—4％沸石(NaAlSiO4)30—50％硫酸鈉(Na2SO4) 3—11％檸檬酸鈉(C6H5Na3O7) 5—12％聚合物(如PVP，馬來(lái)酸/丙烯酸共聚體，PEG) 1—5％酶 0—5％小組份(如抑泡劑，香料) 0—5％9)配制成顆粒的去污劑組合物，其組成為線(xiàn)性烷基苯基磺酸鹽 6—12％(以酸計(jì)算)非離子表面活性劑 1—4％皂如脂肪酸 2—6％碳酸鈉(Na2CO3) 14—22％沸石(NaAlSiO4) 18—32％硫酸鈉(Na2SO4) 5—20％檸檬酸鈉(C6H5Na3O7) 3—8％過(guò)硼酸鈉(NaBO3.H2O) 4—9％漂白活化劑(如NOBS或TAED) 1—5％羧甲基纖維素 0—2％聚合物(如聚羧酸鹽或PEG)1—5％酶 0—5％小組份(如熒光增白劑，香料) 0—5％10)水型液體去污劑組合物，其組成為線(xiàn)性烷基苯基磺酸鹽(以酸計(jì)算) 15—23％醇乙氧基硫酸酯(如C12-15醇，2—3EO) 8—15％醇乙氧基化物 3—9％(如C12-15醇7EO或C12-15醇，5EO)皂如脂肪酸(如月桂酸) 0—3％氨基乙醇 1—5％檸檬酸鈉 5—10％水溶助長(zhǎng)劑(如甲苯磺酸鈉) 2—6％硼酸鹽(B4O7) 0—2％羧甲基纖維素 0—1％乙醇 1—3％丙二醇 2—5％酶 0—5％小組份(如聚合物，分散劑，香料，熒光增白劑) 0—5％11)水性液體去污劑組合物，其組成為線(xiàn)性烷基苯基磺酸鹽 20—32％(以酸計(jì)算)醇乙氧基化物(如C12-15醇，7EO或C12-15醇，5EO) 6—12％氨基乙醇 2—6％檸檬酸 8—14％硼酸鹽(B4O7)1—3％聚合物(如馬來(lái)酸/丙烯酸共聚物，結(jié)合性聚合物如甲基丙烯酸月桂酯/丙烯酸共聚物和CMC) 0—3％甘油 3—8％酶 0—5％小組份(如水溶助長(zhǎng)劑，分散劑，香料，熒光增白劑) 0—5％12)配制成堆積密度至少為600g/l的顆粒的去污劑組合物，其組成為陰離子表面活性劑(線(xiàn)型烷基苯基磺酸鹽，烷基硫酸鹽，α—烯烴磺酸鹽，α—磺基脂肪酸甲酯，烷磺酸鹽，皂) 25—40％非離子表面活性劑(如脂肪醇乙氧基化物) 1—10％碳酸鈉(Na2CO3) 8—25％可溶性硅酸鹽(Na2O，2SiO2) 5—15％硫酸鈉(Na2SO4) 0—5％沸石(NaAlSiO4) 15—28％過(guò)硼酸鈉(NaBO3、4H2O) 0—20％漂白活化劑(TAED或NOBS)0—5％酶0—5％小組份(如香料，熒光增白劑) 0—3％13)1)—12)中所描述的去污劑配方，其中線(xiàn)性烷基苯基磺酸鹽組份或其一部分由烷基硫酸鹽(C12—C18)取代。
14)1)—13)中所描述的去污劑配方，其中含有穩(wěn)定的或包封的過(guò)酸或作為額外的組分或作為已述漂白系統(tǒng)的取代物。
15)3)，7)，9)和12)中所描述的去污劑組合物中的過(guò)硼酸鹽用過(guò)碳酸鹽取代。
16)配制成非水型液體去污劑的去污劑組合物包括液體非離子表面活性劑，如線(xiàn)性烷氧基化伯醇，助洗劑系統(tǒng)(如磷酸鹽)，酶和堿。該去污劑也可含有陰離子表面活性劑和/或漂白系統(tǒng)。
本發(fā)明的脂酶變異體以便于應(yīng)用于去污劑中的濃度摻入。目前預(yù)期在本發(fā)明的去污劑中，脂酯變異體以相應(yīng)每升洗液0.001—100mg的酶量加入。洗碟去污劑組合物脂酶變異體還可用作洗碟去污劑組合物的一種組份。該洗碟去污劑組合物包括表面活性劑，其可是陰離子的，非離子的、陽(yáng)離子的，兩性離子的或這些類(lèi)型的混合物。該去污劑可含有0—90％的非離子表面活性劑如低泡沫和無(wú)泡沫的乙氧基化丙氧基化直鏈醇。
該去污劑組合物可含有無(wú)機(jī)和/或有機(jī)類(lèi)型的去污劑助洗劑鹽類(lèi)。去污劑助洗劑可分為含磷和不含磷類(lèi)型。去污劑通常含有1—90％的去污劑助洗劑。
含磷無(wú)機(jī)堿性去污劑助洗劑的例子包括水溶性鹽類(lèi)，特別是堿金屬焦磷酸鹽，正磷酸鹽，多磷酸鹽和膦酸鹽。不含磷無(wú)機(jī)助洗劑的例子包括水溶性堿金屬碳酸鹽、硼酸鹽和硅酸鹽及各種類(lèi)型的不溶性結(jié)晶的或無(wú)定形的硅酸鋁，沸石是最熟知的代表。
適宜的有機(jī)助洗劑的例子包括堿金屬，銨和取代銨檸檬酸鹽、琥珀酸鹽、丙二酸鹽，脂肪酸磺酸鹽、羧甲氧琥珀酸鹽，多聚乙酸銨，羧基化物，多羧基化物，氨基多羧基化物，多聚乙酰羧基化物和多羥基磺酸鹽。
其它適宜的有機(jī)助洗劑包括已知具有助洗劑性能的較高分子量多聚物和共聚物，例如適當(dāng)?shù)木郾┧幔垴R來(lái)酸和聚丙烯酸/聚馬來(lái)酸共聚物及其鹽類(lèi)。
洗碟去污劑組合物可含有氯/溴型或氧型漂白劑。無(wú)機(jī)氯/溴型漂白劑的例子為次氯酸和次溴酸的鋰、鈉或鈣鹽及氯化磷酸三鈉。有機(jī)氯/溴型漂白劑的例子為雜環(huán)的N—溴和N—氯酰亞胺，例如三氯異氰脲酸，三溴異氰脲酸、二溴異氰脲酸和二氯異氰脲酸及其與水溶性陽(yáng)離子如鉀和鈉的鹽。乙內(nèi)酰脲化合物也適合。
氧漂白劑為優(yōu)選的，例如以無(wú)機(jī)過(guò)酸鹽的形式，優(yōu)選與漂白劑前體一起或作為過(guò)氧酸化合物。適當(dāng)?shù)倪^(guò)氧漂白劑化合物的典型例子為堿金屬過(guò)硼酸鹽，包括四水合物和單水合物，堿金屬過(guò)碳酸鹽，過(guò)硅酸鹽和過(guò)磷酸鹽。優(yōu)選的激活物為T(mén)AED和三乙酸甘油酯。
本發(fā)明的洗碟去污劑組合物可使用常規(guī)的酶穩(wěn)定劑進(jìn)行穩(wěn)定化。如多元醇象丙二醇、糖或糖醇，乳酸、硼酸或硼酸衍生物，如硼酸芳酯。
該洗碟去污劑組合物也可含有其它酶，特別是淀粉酶、蛋白酶和/或纖維素酶。
本發(fā)明的洗碟去污劑組合物還可含有其它常規(guī)去污劑組份，如抗絮凝物、填料、抑泡劑、抗腐蝕劑、懸污劑、螯合劑、抗污物再沉淀劑、抗水合劑、染料、殺菌劑、熒光劑、增稠劑和香料。
總之，本發(fā)明的變異體可用于常規(guī)洗碟去污劑，例如描述于下列任何專(zhuān)利出版物中的任一去污劑中EP 551670，EP 533239，WO 9303129，EP 507404，US 5141664，GB 2247025，EP 414285，GB 2234980，EP 408278，GB 2228945，GB 2228944，EP 387063， EP 385521，EP 373851，EP 364260，EP 349314，EP 331370，EP 318279，EP 318204，GB 2204319，EP 266904，US 5213706，EP 530870，CA 2006687，EP 481547，EP 337760，WO 93/14183，US 5223179，WO 93/06202，WO 93/05132，WO 92/19707，WO 92/09680，WO 92/08777， WO 92/06161，WO 92/06157，WO 92/06156，WO 91/13959，EP 399752，US 4941988，US 4908148.軟化組合物另外，本發(fā)明的脂酶變異體可用于軟化組合物該脂酶變異體可用于織物軟化劑，如J，F(xiàn)albe編輯的Surtactant and Consumer Products 1987，PP295—296；TensideSurfactants Detergents，30(1993)，6，PP394—399；JADCS，Vol.61(1984)，2，PP367—376；EP517762；EP123400；WO92/19714；WO93/19147；US5,082,578；EP494769；EP544 493；EP543 562；US5,235,082；EP568 297；EP570 237中所述。
本發(fā)明的下列描述參考附圖，其中圖1為通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)構(gòu)建編碼脂酶變異體的質(zhì)粒的制備圖解；圖2為通過(guò)PCR的三步誘變圖解；在下面的實(shí)施中進(jìn)一步說(shuō)明本發(fā)明，但無(wú)意限制所要求的本發(fā)明的范圍。一般方法H.lanuginosa脂酶在米曲霉中的表達(dá)H.Lanuginosa脂酶的克隆描述于EP305,216。該專(zhuān)利申請(qǐng)也描述了在米曲霉中脂酶的表達(dá)和鑒定。所用表達(dá)質(zhì)粒被稱(chēng)為p960。
本申請(qǐng)中所用的表達(dá)質(zhì)粒與p960一致，只是在緊接脂酶編碼區(qū)3’附近有很小的修飾。該修飾按下面的方法進(jìn)行p960用Nrul和BamHI限制酶酶切。在這兩點(diǎn)之間克隆質(zhì)粒pBR322的BamHI/NheI片段，其中NheI片段用Klenow聚合酶補(bǔ)平。產(chǎn)生含有單一BamHI和NheI切點(diǎn)的質(zhì)粒pAO1(見(jiàn)WO92/05249圖5)，在這兩個(gè)單一切點(diǎn)之間克隆p960的BamHI/XbaI片段產(chǎn)生pAHL(見(jiàn)WO92/05249圖6)。脂酶基因的體外定點(diǎn)誘變向脂酶基因引入突變所用方法描述于Nelson and Long，Analytical Biochemistry)180，147—151(1989)它包括以化學(xué)合成的DNA鏈做為PCR反應(yīng)的引物，通過(guò)三步反應(yīng)產(chǎn)生含有所需突變的PCR片段。從PCR產(chǎn)生的片段上，帶有突變的DNA片段可通過(guò)限制酶酶切而得到，并重新插入到表達(dá)質(zhì)粒中。該方法詳細(xì)地描述于實(shí)施例3。在圖1和2中，進(jìn)一步描述了該方法。實(shí)施例1表達(dá)lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶變異體D96W質(zhì)粒的構(gòu)建質(zhì)粒pAHL的線(xiàn)性化環(huán)狀質(zhì)粒pAHL在下述50μl反應(yīng)混合物中以?xún)?nèi)切酶SphI線(xiàn)性化50mM氯化鈉，10mM Tris—Hcl，pH7.9，10mM MgCl，1mM二硫蘇糖醇、1μg質(zhì)粒和2單位的SphI。37℃消化兩個(gè)小時(shí)。反應(yīng)混合物以苯酚(以pH7.5的Tris—HCl平衡)抽提，加兩倍體積冰冷的96％乙醇沉淀。離心，沉淀干燥后，線(xiàn)狀DNA以50μl水溶解并在瓊脂糖凝膠上估計(jì)DNA濃度。三步PCR誘變?nèi)鐖D2所示，三步誘變要使用四個(gè)引物誘變引物(＝A)5′ -ATTTATTTCTTTCAACCAGAAGTTAAGATTCCC-3′PCR Helper1(＝B)5′ -GGTCATCCAGTCACTGAGACCCTCTACCTATTAAATCGGC-3′PCR Helper2(＝C)5’ —CCATGGCTTTCACGGTGTCT—3’PCR Handle(＝D)5’ —GGTCATCCAGTCACTGAGAC—3’所有三步反應(yīng)均在下述含有10mM Tris—HCl，pH8.3，50mM Kcl，1.5mM MgCl2，0.001％明膠，0.2mM dATP，0.2mMdCTP，0.2mMdGTP，0.2mMTTP，2.5單位Taq聚合酶的緩沖液中進(jìn)行。
第一步中，100pmol的引物A，100pmol的引物B和1fmol線(xiàn)狀質(zhì)粒加到一總體積為100μl的反應(yīng)混合物中，進(jìn)行15個(gè)反應(yīng)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃兩分鐘，37℃兩分鐘和72℃三分鐘。
PCR產(chǎn)物的濃度在瓊脂糖凝膠上估算。然后進(jìn)行第二步反應(yīng)。在總體積為100μl的上述緩沖液中加0.6pmol步驟1產(chǎn)物和1fmol的線(xiàn)狀質(zhì)粒，95℃5分鐘，37℃兩分鐘，72℃10分鐘進(jìn)行一個(gè)反應(yīng)循環(huán)。
在步驟2反應(yīng)混合物中加入100pmol引物C和100pmol引物D并進(jìn)行20個(gè)反應(yīng)循環(huán)，每個(gè)循環(huán)包括95℃兩分鐘，37℃兩分鐘和72℃三分鐘。此操作包括誘變程序中的步驟3。突變的限制性片段的分離步驟3產(chǎn)物用瓊脂糖凝膠分離，重新溶于20μl水中。然后在總體積為50μl含有下述成份的緩沖液100mM Nacl，50mMTris—Hcl，pH7.9，10mM Mgcl2，1mM DTT中以限制性?xún)?nèi)切酶BamHI和BstXI各10單位消化。在37℃溫育兩個(gè)小時(shí)，從瓊脂糖凝膠中分離到733bp的BamHI/BstXI片段。與表達(dá)載體pAHL的連接表達(dá)載體pAHL在上述條件下以BamHI和BstXI消化，并從瓊脂糖凝膠中分離大片段。將上述分離的突變片段連接到這個(gè)載體上，連接混合物用來(lái)轉(zhuǎn)化大腸桿菌。通過(guò)以限制性?xún)?nèi)切酶切轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒制備物來(lái)證實(shí)片段的存在和方向。應(yīng)用Sauger的雙脫氧鏈終止法進(jìn)行雙鏈質(zhì)粒的序列分析。質(zhì)粒被命名為pAHLD96W，除了改變的密碼子外它和pAHL是一致的。實(shí)施例2表達(dá)lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶其它變異體質(zhì)粒的構(gòu)建除了用限制性?xún)?nèi)切酶XhoI和BstXI來(lái)消化PCR產(chǎn)物和用于再克隆突變片段D254K/L259I和L259I的載體外，下述突變體是用和實(shí)施例1中描述的相同方法構(gòu)建的。用做修飾的質(zhì)粒名稱(chēng)和引物如下。
質(zhì)粒名稱(chēng) 引物A序列pAHLD96F 5′-ATTTATTTCTTTCAAGAAGAAGTTAAGATTCCC-3′pAHLD96V 5′-ATTTATTTCTTTCAAAACGAAGTTAAGATTCCC-3′pAHLL259I 5′-CCGAAGTACCAAATGTGAGCAGGGATATCC-3′pAHLD254K＋L259I5′-CCGAAGTACCAAATGTGAGCAGGGATCTTCGGAATGTTAGG-3′實(shí)施例3米曲霉的轉(zhuǎn)化(一般程序)用米曲霉的孢子接種100ml YPD(Sherman等，酵母遺傳學(xué)方法，冷泉港實(shí)驗(yàn)室，1981)，振蕩培養(yǎng)24小時(shí)。菌絲體以miracloth過(guò)濾收集并用200ml 0.6M MgSO4洗滌。菌絲體用15ml 1.2MMgSO4，10mM NaH2PO4，pH5.8懸浮。懸浮液置于冰上，加入1ml含120mg批號(hào)1687的NOVOZYm234緩沖液。5分鐘后加入1ml 12mg/ml的BSA，37℃輕輕振蕩溫育1.5—2.5小時(shí)直至顯微鏡下可看到溶液中大量的原生質(zhì)體。
懸浮液以miracloth過(guò)濾，濾過(guò)液轉(zhuǎn)移至一無(wú)菌試管，在上面加入5ml 0.6M山梨醇，100mM Tris—Hcl，pH7.0。1000g離心15分鐘。在MgSO4墊層的頂部收集原生質(zhì)體。原生質(zhì)體懸液中加入2倍體積的STC(1.2M山梨醇，10mM Tris—Hcl，Ph7.5，10mMCaCl2)，混合物1000g離心5分鐘。原生質(zhì)體沉淀重新懸于3mlSTC并再沉淀。重復(fù)此步驟。最后原生質(zhì)體重懸于0.2—1ml的STC中。100μl的原生質(zhì)體懸液同含5—25μgp3SR2的10μlSTC混合(p3SR2是一個(gè)攜帶構(gòu)巢曲霉amds基因的質(zhì)粒，詳見(jiàn)Hynes等，分子細(xì)胞生物學(xué)，第三卷第八期，1430—1439頁(yè)，1983年8月)?；旌衔锸覝胤胖?5分鐘。加入0.2ml60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris—HCl，pH7.5，仔細(xì)混合(兩次)，最后加入0.85ml同樣的溶液，仔細(xì)混合?；旌衔镉谑覝胤胖?5分鐘，2.500g離心15分鐘。沉淀重新懸于2ml 1.2M山梨醇中。再一次沉淀后將原生質(zhì)體涂布于含1.0M蔗糖，pH＝7.0，10mM乙酰胺做氮源和20mM CsCl抑制背景生長(zhǎng)的基本培養(yǎng)基上(Cove，生物化學(xué)與生物物理年鑒，113(1966)51—56)。37℃培養(yǎng)4至7天后，挑出孢子懸浮于無(wú)菌水中，涂成單菌落。重復(fù)此程序，第二次再分離得到的單菌落孢子做為確定的轉(zhuǎn)化子貯存。實(shí)施例4脂酶變異體D96W在米曲霉中的表達(dá)PAHLD96W通過(guò)和實(shí)施例3中描述的含有來(lái)自構(gòu)巢曲霉amds基因的p3SR2共轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)進(jìn)米曲霉IFO4177中。如述制備的原生質(zhì)體和等量的pAHLD96W及p3SR2混合物溫育，每一種質(zhì)粒約5μg。九個(gè)能利用乙酰胺做唯一氮源的轉(zhuǎn)化子重分離兩次。YPD上生長(zhǎng)3天后，利用實(shí)施例5中描述的脂酶活性測(cè)定方法(本發(fā)明脂酶變異體的純化)分析培養(yǎng)物上清液。選擇最好的轉(zhuǎn)化子做進(jìn)一步研究，在一個(gè)含200ml FG4培養(yǎng)基(3％豆粉，3％麥芽糖糊精，1％蛋白胨，以4M NaoH調(diào)pH至7.0)的1升搖瓶中30℃培養(yǎng)4天。在這些條件下每毫升轉(zhuǎn)化子培養(yǎng)物約含500個(gè)脂酶單位。
另一個(gè)脂酶變異體是按實(shí)施例3描述的一般程序基本如上所述構(gòu)建的。實(shí)施例5本發(fā)明的脂酶變異體的純化脂酶活性的分析以阿拉伯樹(shù)膠做乳化劑通過(guò)乳化三丁酸甘油酯(MERCK)制備脂酶的底物。脂酶活性是在pH7使用恒pH法分析。一個(gè)脂酶活性單位定義為每分鐘釋放1毫摩爾脂肪酸所需的脂酶量。
步驟1離心發(fā)酵上清液，棄沉淀。調(diào)節(jié)上清的pH至7，逐步加入等體積的96％冷乙醇，混合物于冰浴放置30分鐘，離心棄沉淀。步驟2
離子交換層析。過(guò)濾上清液。加樣于以50mM pH7的Tris—醋酸緩沖液平衡的DEAE—fast flow(phermacia TM)柱。以相同緩沖液洗柱直至280nm吸收值低于0.05OD。用5倍體積的同樣緩沖液的線(xiàn)性鹽梯度洗脫結(jié)合的酶活性組份，收集含酶活性的流份。
步驟3疏水層析。用固體醋酸銨調(diào)整含酶活性流份的摩爾濃度至0.8M，加樣于以0.8M醋酸銨預(yù)平衡的TSK膠Butyl—Toyopearl 650c柱(購(gòu)自日本Tosoh公司)。以0.8M醋酸銨洗去未結(jié)合的成份，以重蒸水洗脫結(jié)合的成份。
步驟4含脂酶活性的流份用水稀釋調(diào)整其電導(dǎo)率至2ms，pH至7，并加樣于以pH7的50mM Tris—醋酸緩沖液預(yù)平衡的高效Q瓊脂糖柱(Pharmacia)。以線(xiàn)性鹽梯度洗脫結(jié)合的酶。實(shí)施例6本發(fā)明的脂酶變異體的洗滌性能本發(fā)明的Lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶變異體的洗滌性能是在根據(jù)同野生型Lanuginosa腐質(zhì)酶脂酶比較OD280得出每升毫克蛋白計(jì)的酶量的基礎(chǔ)上評(píng)價(jià)。
洗滌測(cè)試是在一置于恒溫水浴中的150毫升燒杯中進(jìn)行的。燒杯以三角磁棒攪拌。實(shí)驗(yàn)條件如下方法三次循環(huán)，每次循環(huán)間過(guò)夜干燥。洗滌液每個(gè)燒杯100ml。布樣每個(gè)燒杯六個(gè)布樣(3.5×3.5cm)織物100％棉，試驗(yàn)織物型號(hào)#400污點(diǎn)用蘇丹紅染色(每克豬油0.75毫克染料)的豬油。加熱到
70℃的6μl豬油置于每個(gè)布樣的中心。涂上污點(diǎn)后，布樣于烘箱中75℃加熱30分鐘。第一次洗滌前樣品于室溫放置過(guò)夜。去污劑LAS(Nansa 1169/P，30％a.m.) 1.17g/LAEO(Dobanol 25—7) 0.15g/L三磷酸鈉1.25g/L硫酸鈉 1.00g/L碳酸鈉 0.45g/L硅酸鈉 0.15g/LpH10.2脂酶濃度每升0.075，0.188，0.375，0.75和2.5mg脂酶蛋白時(shí)間20分鐘溫度30度沖洗以流動(dòng)的自來(lái)水沖洗15分鐘干燥室溫過(guò)夜(約20℃，30—50％RH)估價(jià)第三次洗滌后，測(cè)定460nm的反射比。結(jié)果比較了野生型Lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶和脂酶變異體的劑量反應(yīng)曲線(xiàn)。劑量反應(yīng)曲線(xiàn)是以測(cè)得的數(shù)值代入下述方程計(jì)算的ΔR=ΔRmaxC0.5K+C0.5---(1)]]>其中△R是用反射比單位表示的效應(yīng)值C是酶濃度(mg/L)
△Rmax是一個(gè)表示最大效應(yīng)的常數(shù)K是一個(gè)常數(shù)；K2表示獲得最大效應(yīng)一半時(shí)的酶濃度基于野生型脂酶和每一個(gè)脂酶變異體的特征性常數(shù)△Rmax和K，計(jì)算了改進(jìn)因子(improvement factors)，其定義為f改進(jìn)＝CWT/C(II)表示獲得同0.25mg/L參照野生型蛋白(CWT)相同效應(yīng)所需的脂酶變異體蛋白的量。
因此計(jì)算改進(jìn)因子的程序如下1)0.25mg/L野生型蛋白的效應(yīng)△R(野生型)由方程(I)計(jì)算；2)同0.25mg/L野生型蛋白引起相同效應(yīng)的脂酶變異體的濃度以下述方程計(jì)算 改進(jìn)因子由方程(II)計(jì)算。結(jié)果如表1所示表 1變異體 改進(jìn)因子D96K4.0D96W2.7D96F1.7D254K＋L259I1.7D96W＋D102N 3.4L259I 1.2從表1可看出脂酶變異體D96K，D96W，D96W＋E210N及某種程度上D96F和D254K＋L259I都有比野生型脂酶好得多的洗滌性能。這種效應(yīng)提高的一個(gè)可能性解釋是變異體脂接觸區(qū)的電荷特性已被改變。
序列表(1)一般信息(i)申請(qǐng)人(A)姓名NOVO NORDISK A/S(B)街道NOVO Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK—2880(G)電話(huà)＋45 44448888(H)傳真＋45 4449 3256(I)電傳37304(ii)發(fā)明名稱(chēng)脂酶變異體(iii)序列數(shù)2(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)媒介類(lèi)型軟盤(pán)(B)計(jì)算機(jī)IBM PC兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC—IDOS/MS—DOS(2)SEQ ID NO1的信息(i)序列特征
(A)長(zhǎng)度918堿基對(duì)(B)類(lèi)別核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)湫途€(xiàn)狀。
(ii)分子類(lèi)別cDNA(vi)最初來(lái)源(A)生物體Lanuginosa腐質(zhì)霉(ix)特征(A)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞CDS(B)位置1..873(C)名稱(chēng)/關(guān)鍵詞mat—多肽(D)位置67..873(xi)序列描述SEQ IDNO1ATG AGG AGC TCC CTT GTG CTG TTC TTT GTC TCT GCG TGG ACG GCC TTG48Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10GCC AGT CCT ATT CGT CGA GAG GTC TCG CAG GAT CTG TTT AAC CAG TTC96Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 1 5 10AAT CTC TTT GCA CAG TAT TCT GCA GCC GCA TAC TGC GGA AAA AAC AAT144Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25GAT GCC CCA GCT GGT ACA AAC ATT ACG TGC ACG GGA AAT GCC TGC CCC192Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40GAG GTA GAG AAG GCG GAT GCA ACG TTT CTC TAC TCG TTT GAA GAC TCT240Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 50 55GGA GTG GGC GAT GTC ACC GGC TTC CTT GCT CTC GAC AAC ACG AAC AAA288Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70TTG ATC GTC CTC TCT TTC CGT GGC TCT CGT TCC ATA GAG AAC TGG ATC 336Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90GGG AAT CTT AAC TTC GAC TTG AAA GAA ATA AAT GAC ATT TGC TCC GGC 384Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly95 100 105TGC AGG GGA CAT GAC GGC TTC ACT TCG TCC TGG AGG TCT GTA GCC GAT 432Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp110 115 120ACG TTA AGG CAG AAG GTG GAG GAT GCT GTG AGG GAG CAT CCC GAC TAT 480Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr125 130 135CGC GTG GTG TTT ACC GGA CAT ACC TTG GGT GGT GCA TTG CCA ACT CTT 528Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val140 145 150GCC GGA GCA GAC CTG CGT GGA AAT GGG TAT GAT ATC GAC GTG TTT TCA 576Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170TAT GGC GCC CCC CGA GTC GGA AAC AGG GCT TTT GCA GAA TTC CTG ACC 624Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr175 180 185GTA CAG ACC GGC GGA ACA CTC TAC CGC ATT ACC CAC ACC AAT GAT ATT 672Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile190 195 200GTC CCT AGA CTC CCG CCG CGC GAA TTC GGT TAC AGC CAT TCT AGC CCA 720Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro205 210 215GAG TAC TGG ATC AAA TCT GGA ACC CTT GTC CCC GTC ACC CGA AAC GAT 768Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp220 225 230ATC GTG AAG ATA GAA GGC ATC GAT GCC ACC GGC GGC AAT AAC CAG CCT 816Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250AAC ATT CCG GAT ATC CCT GCG CAC CTA TGG TAC TTC GGG TTA ATT GGG 864Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265ACA TGT CTT TAGTGGCCGG CGCGGCTGGG TCCGACTCTA GCGAGCTCGA GATCT918Thr Cys Leu
(2)SEQ ID NO2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度291個(gè)氨基酸(B)類(lèi)別氨基酸(D)拓?fù)湫途€(xiàn)狀(ii)分子類(lèi)別蛋白質(zhì)(xi)序列描述SEQ ID NO2Met Arg Ser Ser Leu Val Leu Phe Phe Val Ser Ala Trp Thr Ala Leu-20 -15 -10Ala Ser Pro Ile Arg Arg Glu Val Ser Gln Asp Leu Phe Asn Gln Phe-5 1 5 10Asn Leu Phe Ala Gln Tyr Ser Ala Ala Ala Tyr Cys Gly Lys Asn Asn15 20 25Asp Ala Pro Ala Gly Thr Asn Ile Thr Cys Thr Gly Asn Ala Cys Pro30 35 40Glu Val Glu Lys Ala Asp Ala Thr Phe Leu Tyr Ser Phe Glu Asp Ser45 5O 55Gly Val Gly Asp Val Thr Gly Phe Leu Ala Leu Asp Asn Thr Asn Lys60 65 70Leu Ile Val Leu Ser Phe Arg Gly Ser Arg Ser Ile Glu Asn Trp Ile75 80 85 90Gly Asn Leu Asn Phe Asp Leu Lys Glu Ile Asn Asp Ile Cys Ser Gly95 100 105Cys Arg Gly His Asp Gly Phe Thr Ser Ser Trp Arg Ser Val Ala Asp110 115 120Thr Leu Arg Gln Lys Val Glu Asp Ala Val Arg Glu His Pro Asp Tyr125 130 135Arg Val Val Phe Thr Gly His Ser Leu Gly Gly Ala Leu Ala Thr Val140 145 150Ala Gly Ala Asp Leu Arg Gly Asn Gly Tyr Asp Ile Asp Val Phe Ser155 160 165 170Tyr Gly Ala Pro Arg Val Gly Asn Arg Ala Phe Ala Glu Phe Leu Thr175 180 185Val Gln Thr Gly Gly Thr Leu Tyr Arg Ile Thr His Thr Asn Asp Ile190195 200Val Pro Arg Leu Pro Pro Arg Glu Phe Gly Tyr Ser His Ser Ser Pro205 210 215Glu Tyr Trp Ile Lys Ser Gly Thr Leu Val Pro Val Thr Arg Asn Asp220 225 230Ile Val Lys Ile Glu Gly Ile Asp Ala Thr Gly Gly Asn Asn Gln Pro235 240 245 250Asn Ile Pro Asp Ile Pro Ala His Leu Trp Tyr Phe Gly Leu Ile Gly255 260 265Thr Cys Leu
權(quán)利要求
1.脂酶分子疏水優(yōu)勢(shì)的、加長(zhǎng)結(jié)合袋中含有包括活性絲氨酸的類(lèi)胰蛋白酶催化三分體的親代脂酶的脂酶變異體，其中脂接觸區(qū)的非芳香族氨基酸殘基被芳香族氨基酸殘基所取代，此接觸區(qū)包括位于含活性絲氨酸殘基的脂酶結(jié)構(gòu)部分中的殘基，這些殘基在水解時(shí)或水解過(guò)程中參予與底物的相互作用。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的脂酶變異體，其中被取代的非芳族氨基酸殘基是谷氨酸或天冬氨酸殘基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的脂酶變異體，其中的芳香族氨基酸殘基選自包括色氨酸、苯丙氨酸和酪氨酸殘基的組中。
4.一親代脂酶的變異體，其中包括SEQIDNO.1所示氨基酸序列的Lanuginosa腐質(zhì)霉成熟脂酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代如下E56H，P，M，W，Y，F(xiàn)，I，G，C，V；D96H，E，P，M，W，Y，F(xiàn)，I，G，C，V；L259N，D，C，Q，E，H，I，M，F(xiàn)，P，W，Y；L206K，R，N，D，C，Q，E，H，I，M，F(xiàn)，P，W，Y，
5.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的脂酶變異體，其包含一個(gè)以上的取代，優(yōu)選兩個(gè)取代。
6.一親代脂酶的變異體，其中包含SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的Lanuginosa腐質(zhì)霉成熟脂酶的一個(gè)或多個(gè)氨基酸殘基被取代如下D96W＋E210N；D254K＋L259I；D96L＋L206V；D96L＋L206S；D96W＋D102N；D96L＋L259I＋L206V；E56Q＋L259I＋L206V。
7.根據(jù)任一前述權(quán)利要求的脂酶變異體，其中的親代脂酶是微生物脂酶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的脂酶變異體，其中親代脂酶是真菌脂酶。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的脂酶變異體，其中親代脂酶來(lái)自腐質(zhì)霉屬或Rhizomucor的菌種。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的脂酶變異體，其中親代脂酶是Rhizomucor miehei脂酶。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的脂酶變異體，其中親代脂酶是Lanuginosa腐質(zhì)霉脂酶。
12.根據(jù)權(quán)利要求8的脂酶變異體，其中親代脂酶是酵母脂酶。
13.根據(jù)要求12的脂酶變異體，其中親代脂酶來(lái)自假絲酵母屬的菌種。
14.根據(jù)權(quán)利要求7的脂酶變異體，其中親代脂酶為細(xì)菌脂酶。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的脂酶變異體，其中親代脂酶來(lái)自假單孢菌屬的菌種。
16.含有編碼權(quán)利要求1—15中任一脂酶變異體的DNA序列的DNA構(gòu)建物。
17.帶有權(quán)利要求16的DNA構(gòu)建物的重組表達(dá)載體。
18.用權(quán)利要求16的DNA構(gòu)建物或權(quán)利要求17的載體轉(zhuǎn)化的細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的細(xì)胞，它是真菌細(xì)胞，例如屬于曲霉屬如黑色曲霉，米曲霉或構(gòu)巢曲霉；酵母細(xì)胞，例如屬于酵母屬的菌種，如釀酒酵母或來(lái)自漢遜酵母屬的甲醇酵母，如多形漢遜酵母，或畢赤氏酵母(Phichia)，如P.pastoris；或細(xì)菌細(xì)胞，例屬于芽孢桿菌的菌種，如枯草芽孢桿菌，或遲緩芽孢桿菌。
20.產(chǎn)生權(quán)利要求1—15之任一項(xiàng)的脂酶變異體的方法，其中權(quán)利要示18或19的細(xì)胞在有助于脂酶變異體產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)，隨后從培養(yǎng)物中分離脂酶變異體。
21.含有權(quán)利要求1—15任何一項(xiàng)的脂酶變異體的去污劑添加劑，脂酶變異體任選呈非粉塵顆粒、穩(wěn)定液態(tài)或被護(hù)酶的形式。
22.根據(jù)權(quán)利要求21的去污劑添加劑，其中每克添加劑含0.02至200mg的酶蛋白。
23.根據(jù)權(quán)利要求21或22的去污劑添加劑，它另外含有另一種酶如蛋白酶、淀粉酶、氧化酶、過(guò)氧化酶、纖維素或/和一種不同于所述脂酶變異體的脂酶。
24.含有權(quán)利要求1至15任何一項(xiàng)的脂酶變異體的去污劑組合物。
25.根據(jù)權(quán)利要求24的去污劑組合物，它另外含有另一種酶如蛋白酶、淀粉酶、過(guò)氧化酶、纖維素酶，和/或一種不同于所述脂酶變異體的脂酶。
26.含有權(quán)利要求1至15任何一項(xiàng)的脂酶變異體的洗碟去污劑組合物。
27.含有權(quán)利要求1至15任何一項(xiàng)的脂酶變異體的軟化組合物。
全文摘要
在脂酶分子疏水優(yōu)勢(shì)的、加長(zhǎng)結(jié)合袋中含有包括一活性絲氨酸的類(lèi)胰蛋白酶催化三分體的脂酶發(fā)生突變，使脂接觸區(qū)的非芳香族氨基酸殘基被芳香族氨基酸殘基所取代，此接觸區(qū)包括位于含活性絲氨酸殘基的脂酶結(jié)構(gòu)部分內(nèi)部的殘基，這些殘基在水解時(shí)或水解過(guò)程中參予與底物的相互作用。
文檔編號(hào)C12R1/125GK1124039SQ9419217
公開(kāi)日1996年6月5日 申請(qǐng)日期1994年4月22日 優(yōu)先權(quán)日1993年4月23日
發(fā)明者A·思文森, S·A·帕卡, E·高森, L·G·克勞森 申請(qǐng)人:諾沃挪第克公司