專利名稱：水蛭素的重組體制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及水蛭素，其最初從藥用水蛭(Hirudo medibin alis)中分離，以及其衍生物的制備。
最常用的抗凝血肽可能屬于水蛭素類。水蛭素最初從藥用水蛭中分離，藥用水蛭(Hirudo medicinalis)為眾所周知的，代表性的凝血酶多肽抑制劑1，2，具體說，其通過離子間作用結(jié)合凝血酶而防止了纖維蛋白原斷裂成為纖維蛋白形成纖維蛋白塊。動物試驗(yàn)證實(shí)了水蛭素的預(yù)防靜脈血栓形成，血管分路閉塞及凝血酶誘導(dǎo)的彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)的作用。另外，水蛭素具有低毒性，很少或無抗原性并且在血液中清除的時間很短。
已知有三種水蛭素的天然變種，被稱作HVI的第一個變種的序列由Dodt等人測定(FEBS 165(1984)180-184根據(jù)三聯(lián)密碼(Eur.J.Biochem.138，9-37，1984)HVI的序列為
( 纈-纈-酪-蘇-天冬-半胱-蘇-谷-絲-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-絲-天冬酰胺-纈-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-賴-半胱-異亮-亮-甘-絲-天冬-甘-谷-賴-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-纈-蘇-甘-谷-甘-脯-谷氨酰胺-絲-組-天冬酰胺-天冬-甘-天冬-苯丙-谷-谷-異亮-脯-谷-谷-酪-亮-谷氨酰胺。
被稱作HV2的第二個變種由Dodt等人敘述，(Biol.Chem.Hoppe-Seyler 367(1986)803-811)HV2在下列方面與HVl不同異亮氨酸取代1位的纈氨酸，蘇氨酸取代2位纈氨酸、賴氨酸取代24位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代33位的天冬氨酸、賴氨酸取代35位的谷氨酸，甘氨酸取代36位的賴氨酸，天冬酰胺取代47位的賴氨酸，谷氨酸取代49位的谷氨酰胺，天冬酰胺取代53位的天冬氨酸。
被稱作HV3的第三個變種被Harvey等人在Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1986)1084-1088中敘述。HV3從1-32位與HV2相同。但在下列方面與HV1不同谷氨酰胺代替33位天冬氨酸，賴氨酸代替35位的谷氨酸，天冬氨酸代替36位的賴氨酸，谷氨酸胺代替53位的天冬氨酸，脯氨酸代替58位的谷氨酸，天冬氨酸代替62位的谷氨酸，丙氨酸代替63位的酪氨酸(SO3H)，天冬氨酸代替64位的亮氨酸，谷氨酸代替65位的谷氨酰胺。
現(xiàn)在發(fā)明了制備水蛭素及水蛭素樣多肽的新方法，該方法首先根據(jù)編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的核苷酸序列進(jìn)行化學(xué)合成，再用重組生物體表達(dá)水蛭素或水蛭素樣多肽，遺傳修飾了的生物體的培養(yǎng)可生成所需的具有全部生物活性的產(chǎn)物。
同時，本發(fā)明提供了含有編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列的表達(dá)載體。本發(fā)明還提供了與適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)換的宿主，還提供了編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的合成DNA。編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA片段可以是單股或雙股的。
水蛭素或水蛭素樣多肽可在其中表達(dá)的宿主中通過與本發(fā)明的適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體轉(zhuǎn)換進(jìn)行制備，表達(dá)載體通常的制備程序是(a)化學(xué)合成編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA;
(b)將該DNA插入表達(dá)載體中。
通過本發(fā)明提供的轉(zhuǎn)換的宿主，并在一定的條件下使水蛭素或水蛭素樣多肽于其中表達(dá)，從而制備了水蛭素或水蛭素樣多肽，分離出水蛭素或水蛭素樣多肽，從而得到純化的水蛭素或水蛭素樣多肽。
本文所稱的“水蛭素或水蛭素樣多肽”指天然形式的水蛭素HV1，HV2和HV3及其衍生物，例如，通過氨基酸取代、缺失、插入、延伸、官能作用和化學(xué)修飾得到的。本發(fā)明還可用于具有抗凝活性的HV1，HV2或HV3的衍生物。
氨基酸序列HV1，HV2或HV3可被一或多個氨基酸取代，插入和/或缺失和/或在一端或另一端延伸進(jìn)行修飾，含有該被修飾序列的衍生物必須仍具有抗凝活性。HV1，HV2或HV3的氨基酸序列與其衍生物的氨基酸序列之間同源程度一般為75%或更多，同源程度也可以是85%或更多，95%或更多。
例如，HV1，HV2或HV3序列的一或多個氨基酸殘基可被被取代或缺失或插入一或多個氨基酸殘基，原序列的物化特性可被保留。如電荷密度，親脂/親水性，大小和構(gòu)型。根據(jù)單字母密碼，競爭取代基為A代替G或相反;
V被A，L或G取代;
K被R取代;
S被T取代或相反;
E代替D或相反;
Q被N取代或相反涉及到延伸時，多達(dá)50個氨基酸殘基的短序列可接于任一末端，該序列可含有多達(dá)30，例如多達(dá)20或多達(dá)10個氨基酸殘基。
水蛭素或水蛭素樣多肽可進(jìn)行一種或多種相譯后修飾，如糖基化，硫酸化、羧基-酰胺化，?；蚨嚯逆湹幕瘜W(xué)變化。例如63位的酪氨酸殘基可硫酸化。本發(fā)明得到的重組體水蛭素或水蛭素樣多肽不象天然的HV1，HV2和HV3，通常不在此位置硫酸化，本發(fā)明還可用于制備低分子量衍生物，該衍生物無HV1，HV2或HV3的N-末端或C-末端。
本發(fā)明特別適用于制備HV1和含有HV1的前46個殘基并接有HV2變種的第47-65殘基氨基酸序列的HV1的衍生物。
HV1纈-纈-酪-蘇-天冬-半胱-蘇-谷-絲-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-絲-天冬酰胺-纈-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天塑酰胺-賴-半胱-異亮-亮-甘-絲-天冬-甘-谷-賴-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-纈-蘇-甘-谷-甘-蘇-脯-賴-脯-谷氨酰胺-絲-組-天冬酰胺-天冬-甘-天冬-苯丙-谷-谷-異亮-脯-谷-谷-酪-異-谷氨酰胺雜交HV1/HV2(稱為HV12)纈-纈-酪-蘇-天冬-半胱-蘇-谷-絲-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-絲-天冬酰胺-纈-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-賴-半胱-異亮-亮-甘-絲-天冬-甘-谷-賴-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-纈-蘇-甘-蘇-脯-天冬酰胺-脯-谷-絲-組-天冬酰胺-天冬酰胺-甘-天冬-苯丙-谷-谷-異亮-脯-谷-谷-蘇-亮-谷氨酰胺。
劃線的序列為HV2的部分。上述的多肽HV12及其衍生物構(gòu)成了本發(fā)明的另一方面。
水蛭素和水蛭素樣多肽通過重組DNA技術(shù)制備。制備編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的合成DNA，DNA編碼序列通常不包括內(nèi)含子。合成基因被插入到能使重組產(chǎn)物生成的表達(dá)載體中。合成基因通常通過化學(xué)合成寡核苷酸制備，其與所需的基因一致，隨后將寡核苷酸組裝到基因中去。
基因由四種化學(xué)合成的寡核苷酸構(gòu)成，每種寡核苷酸代表雙股DNA基因中的二分之一股。寡核苷酸絡(luò)合并重結(jié)晶得到所需基因。如需要，基因序列可經(jīng)定位誘變進(jìn)行修飾引入一或多個密碼子的變化，具體講，基因形成時每端均有限定部位以便于隨之進(jìn)行處理。
編碼HV1的優(yōu)選DNA序列列于附圖的

圖1中。編碼HV12的優(yōu)選DNA序列列于圖3中，任一序列均可修飾以便編碼衍生物。
制備可編碼先導(dǎo)肽的DNA序列，該先導(dǎo)肽可引導(dǎo)從水蛭素或水蛭素樣多肽所表達(dá)的細(xì)胞中分泌水蛭素或水蛭素樣多肽。編碼先導(dǎo)肽的序列通常與編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列的5′端融合。
當(dāng)先導(dǎo)肽在細(xì)菌宿主中表達(dá)時，如大腸桿菌，優(yōu)選OmpA先導(dǎo)肽。當(dāng)先導(dǎo)肽在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)時，優(yōu)選水泡性口炎病毒G蛋白(VSV G蛋白)先導(dǎo)肽。適于編碼OmpA和VSV G蛋白先導(dǎo)序列的DNA序列分別列于圖5和圖8中。
還可制備編碼融合蛋白的DNA序列，該融合蛋白可斷裂釋放水蛭素或水蛭素樣多肽。還可使用編碼載體多肽序列的DNA序列。該載體多肽序列通過可斷裂的鍵與水蛭素或水蛭素樣多肽的N-末端融合，可斷裂的鍵可以是被溴化氰斷裂的鍵。
為表達(dá)水蛭素或水蛭素樣多肽，制備表達(dá)載體，其包括編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列。同時，當(dāng)提供適宜的宿主時，其可表達(dá)水蛭素或水蛭素樣多肽，并提供了適宜的轉(zhuǎn)錄和翻譯控制因子，包括DNA序列的啟動基因，轉(zhuǎn)錄終止定位，及翻譯起始和終止密碼子，在適當(dāng)?shù)目蚣苤刑峁〥NA序列以便于多肽在與載體相容的宿主中表達(dá)。
表達(dá)載體通常含有復(fù)制原形，如需要還含有可選擇的標(biāo)記基因如抗生素的抗性基因。啟動基因與編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列相連。表達(dá)載體可以是質(zhì)粒。在這種情況下，從ptrp和plcc/lac啟動子中選擇的啟動子優(yōu)選與DNA序列連接，而表達(dá)載體可以是病毒。該病毒可以是重組桿狀病毒，在該病毒中，多面體啟動子與編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列相連。
可表達(dá)水蛭素或水蛭素樣多肽的表達(dá)載體可經(jīng)任何方便的形式制備。編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA片段可以插入到表達(dá)載體如質(zhì)粒載體的適當(dāng)?shù)南薅ㄎ恢?。重組桿狀病毒可按下列方法制備(ⅰ)在多面體啟動子下側(cè)的限定位置將編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的基因進(jìn)行克隆繁殖使成桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體;
(ⅱ)將可被桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞與步驟(ⅰ)中的重組轉(zhuǎn)移載體和完整的野生型桿狀DNA進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。
進(jìn)行同級重組，得到含有水蛭素基因或編碼多面體啟動子下側(cè)水蛭素樣多肽的基因的重組桿狀病毒。桿狀病毒轉(zhuǎn)移載體可以具有多面體ATG起始密碼子下游區(qū)的單一克隆位點(diǎn)。隨后被所得重組桿狀病毒表達(dá)的產(chǎn)物可以是融合蛋白質(zhì)，其中多面體蛋白質(zhì)的N-末端與水蛭素或水蛭素樣多肽的N-末端融合。如上指出，在融合接合處提供了可斷裂鍵。
步驟(ⅱ)中所用的昆蟲細(xì)胞為代表性的Spodoptera frugiperda細(xì)胞、野生型桿狀病毒為代表性的Autographa californica核多角體病毒(AcNPV)。
在適宜的宿主中提供編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的表達(dá)載體。細(xì)胞用水蛭素或水蛭素樣多肽基因轉(zhuǎn)化，在該條件下得到轉(zhuǎn)化的宿主，水蛭素或水蛭素樣多肽在其中表達(dá)，將轉(zhuǎn)化的細(xì)胞培養(yǎng)以進(jìn)行表達(dá)。任何適用的宿主一載體均可使用。
轉(zhuǎn)化的宿主可以是原核或真核宿主。也可使用細(xì)菌或酵母宿主。如大腸桿菌或啤酒菌，還可使用革蘭氏陽性菌。優(yōu)選的細(xì)菌宿主為大腸桿菌B類菌株，也可使用昆蟲細(xì)胞，在該情況下，桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)較適合。昆蟲細(xì)胞為代表性的Spodopterafrugiperda細(xì)胞。作為另一種選擇，哺乳類細(xì)胞系的細(xì)胞可被轉(zhuǎn)化。突變動物，如非人哺乳類可被提供，使水蛭素或水蛭素樣多肽在其中制備。表達(dá)的水蛭素或水蛭素樣多肽可被分離并純化。
本發(fā)明制備的水蛭素或水蛭素樣多肽，與藥用載體或賦形劑一起可用于藥劑處方中。該處方一般用于靜脈給藥(在此情況下，載體通常為無菌生理鹽水或純度合格的水)。本發(fā)明制備的水蛭素或水蛭素樣多肽為抗凝血酶，適于治療血栓栓塞，如凝血，典型患者為人類。本發(fā)明的一項(xiàng)內(nèi)容為，水蛭素或水蛭素樣多肽與纖維蛋白溶酶原激活劑如組織纖維蛋白溶酶原激活劑合并給藥。已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明中制備的水蛭素或水蛭素樣多肽與后者相容。
下列實(shí)施例用于說明本發(fā)明附圖中圖1表示編碼大部分水蛭素HV1鏈的四種寡核苷酸的核苷酸序列。劃線的序列表明BalⅠ位置，其用于進(jìn)一步制備。圖的下部表明四種寡聚物的組合。HindⅢ和PstⅠ位置可進(jìn)行隨后的處理。
圖2表示中間質(zhì)粒Ml3-HV1的制備圖解，其為BalⅠ-BamBⅠ DNA片段進(jìn)一步制備的起源。
圖3表示編碼大部分水蛭素HV12鏈的四種寡核苷酸的核苷酸序列，劃線的序列表示BalⅠ位置，其用于進(jìn)一步制備。圖的下部表示四種寡聚物的組合。HindⅢ和PstⅠ位置可進(jìn)行隨后的處理。
圖4表示中間質(zhì)粒MB-HV12的制備圖解。其為BalⅠ-BamHⅠ DNA片段進(jìn)行所有進(jìn)一步形成水蛭素的起源。
圖5用圖示新組合體M13S的形成，即OMP-HV1和OMP-HV12，其分別帶有連接于OmpA先導(dǎo)肽的全部HV1基因和全部HV12基因，先導(dǎo)多肽序列下劃二道線，而BalⅠ平頭末端和HindⅢ粘性末端下劃一道線。
圖6用圖示PFC-HV1和PFC-HV12的形成。其為在大腸桿菌中用于制備HV1和HV12的質(zhì)粒。
圖7表示在大桿桿菌中用于制備水蛭素的質(zhì)粒POMP-HV1的總結(jié)構(gòu)。使用傳統(tǒng)的基因操作技術(shù)制備該新質(zhì)粒，水蛭素基因是在雜交啟動子plpp/lac的轉(zhuǎn)錄控制下，在此例中，OmpA先導(dǎo)肽引導(dǎo)水蛭素分泌到大腸桿菌的泡質(zhì)中。
圖8表示用于從昆蟲細(xì)胞中分泌水蛭素的合成寡聚物的核苷酸序列和組合。下面劃線的序列表示VSV G蛋白先導(dǎo)肽。
圖9用圖示新組合體M13，即VSV-HV12的形成，在這里全部基因與VSV蛋白先導(dǎo)肽相連。
圖10用圖示PAc-HV12的形成，其用做桿狀病毒基因組的轉(zhuǎn)移載體。PAcYM1為起始質(zhì)粒，其廣泛地用做轉(zhuǎn)移到病毒的異種序列的受體。
圖11表示編碼水蛭素鏈前端的合成寡聚物的核苷酸序列和組合，下面劃線者為編碼附加蛋氨酸殘基的ATG密碼子。
圖12用圖示PAcFT1的形成，其用于細(xì)胞內(nèi)水蛭素表達(dá)。
圖13用圖示新的轉(zhuǎn)移質(zhì)粒，即PAcFT1-HV1和PAcFT1-HV12，其分別載有連接于多面體的前18個氨基酸的全部HV1和HV12序列。這些質(zhì)粒被用于將異種序列轉(zhuǎn)移到桿狀病毒基因組。
實(shí)施例1HV1和HV12基因的化學(xué)合成核苷酸編碼序列按大腸桿菌優(yōu)選的密碼子設(shè)計(jì)。所設(shè)的BalⅠ限定位置靠近合成基因的5′端，以便在不同的表達(dá)載體中插入編碼序列。確實(shí)，相同的合成基因可用于在細(xì)菌和昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。在昆蟲細(xì)胞的情況下，改進(jìn)方法生成分泌的或細(xì)胞質(zhì)產(chǎn)物。
所有質(zhì)粒DNA操作按Maniatis等人所述方法進(jìn)行。
按下述方法合成并裝配HV1基因。用自動DNA合成儀(實(shí)用生物系統(tǒng))制備四種合成互補(bǔ)寡核苷酸，其序列見圖1。酶磷酸化后，用DNA連接酶將四種寡聚物組合，將所得的雙股序列插入M13噬菌體載體mp18中，得到圖2中所示的重組質(zhì)粒M13-HV1。為使水蛭素基因插入M13載體，HindⅢ和PstⅠ位置也加于合成寡聚物中。正確的核苷酸序列已被在單股噬菌體DNA上進(jìn)行的桑格法證實(shí)。
重組質(zhì)粒M13-HV1用做實(shí)施例中全部表達(dá)載體HV1基因的起源。
按同樣的方法合成并裝配HV12基因，用于裝配基因的寡聚物列于圖3中。寡聚物3和4與圖1中的寡聚物3和4編碼不同的氨基酸，得到圖3中所示的重組質(zhì)粒M13-HV12。
實(shí)施例2大腸桿菌細(xì)胞中水蛭素的表達(dá)和分泌。
為獲得分泌至胞質(zhì)重組產(chǎn)物，必須合成前蛋白形式的HV1和HV2分子，特別是稱為“先導(dǎo)肽”的氨基酸序列，它必須存在于HV1或HV12的NH2端7.8，才能起到有效分泌的作用。該外加序列在體內(nèi)的分泌中被特定的大腸桿菌先導(dǎo)肽酶斷裂除去，得到正確的成熟序列9。
分泌系統(tǒng)的許多實(shí)例在文獻(xiàn)中敘述10，11，其中，根據(jù)以前發(fā)表的大腸桿菌(Omp A)外膜蛋白的分泌信號選擇體系，我們設(shè)計(jì)兩個附加的編碼OmpA先導(dǎo)肽的互補(bǔ)寡核苷酸，以負(fù)責(zé)充分翻譯信使RNA的OmpA Shine-Dalgarno順序?yàn)橄葘?dǎo)12，由圖5所見，其順序還包括編碼前10個氨基酸的HV1基因的開頭部分。BalⅠ位置使該合成片段與HV1編碼序列的其余部分相連。而HindⅢ位置的上端使其與M13載體相連。因此該合成HindⅢ-BalⅠ片段連接于M13-HV1的BalⅠ-BamHⅠ段，并插入M13mp18，得到被稱作Omp-HV1的新質(zhì)粒。這種新質(zhì)粒形成的圖示亦見于圖5中，從M13-HV12開始進(jìn)行同樣的處理得到OMP-HV12(圖5)。
從OMP-HV1水蛭素基因切除HindⅢ-BamHⅠ間的負(fù)責(zé)編碼OmpA Shine-Dalgarno和水蛭素編碼序列后面的先導(dǎo)肽片段?，F(xiàn)準(zhǔn)備將該限定的片段插入適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，從理論上，可使用幾種表達(dá)體系以便在細(xì)菌中得到高產(chǎn)量的異種蛋白，過去我們實(shí)驗(yàn)室成功地使用了這種基于啟動子Ptrp的體系。但在選擇這種啟動子時，所給的多肽的表達(dá)水平不能預(yù)知，用啟動子Ptrp進(jìn)行水蛭素的表達(dá)以前從未有報(bào)道。
圖6中的質(zhì)粒PFC33已在文獻(xiàn)中有介紹13。其帶有氨芐青霉素的抗性和引導(dǎo)脫脂蛋白原Al表達(dá)的細(xì)菌啟動子Ptrp。將帶有HindⅢ和BamHⅠ的PFC33消化后，將帶有抗生素抗性基因和啟動子的大段HindⅢ-BamHⅠ片段分離并將其與編碼水蛭素HV1或水蛭素衍生物HV12的OMP-HV1或OMP-HV12的HindⅢ-BamHⅠ片段連接。詳細(xì)的形成過程見圖6。我們分離出稱作PFc-HV1和PFc-HV12的新質(zhì)粒。其為在大腸桿菌中制備HV1和HV12的最終質(zhì)粒。
本發(fā)明的主要目的是使用B型大腸桿菌菌株表達(dá)和分泌水蛭素及其衍生物至胞質(zhì)。我們確實(shí)發(fā)現(xiàn)將質(zhì)粒PFC-HV1插入大腸桿菌B型菌株，可得到高產(chǎn)量的水蛭素。有趣的是，不同的大腸桿菌菌株并不同樣有效?？磥?，宿主的菌株類型是成功制備水蛭素的關(guān)鍵。
幾種B型大腸桿菌菌株可用于制備水蛭素或水蛭素樣多肽。優(yōu)選的菌株為ATCC 12407，ATCC 11303，NCTC 10537。下面是NCTC 10537菌株與質(zhì)粒PFC-HV1進(jìn)行轉(zhuǎn)化及轉(zhuǎn)化細(xì)胞培養(yǎng)的實(shí)例。
用Mandel和Higa的氯化鈣法制備NCTC 10537菌株的感受態(tài)細(xì)胞。約200μl該類細(xì)胞制品(1×109細(xì)胞/毫升)與2μl質(zhì)粒DNA(近似濃度5μg/ml)進(jìn)行轉(zhuǎn)化。在含有100μg/ml氨芐青霉素的液體瓊脂的平皿上選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞。用木牙簽在含有相同抗生素的L-瓊脂上給兩個小菌落劃線(每個劃3道約1cm長的線)。在37℃培養(yǎng)12小時后，將菌線分段在10ml LB培養(yǎng)基(氨芐青霉素含量為150μg/ml)上培養(yǎng)。37℃過夜，以試驗(yàn)水蛭素的制備。第二天，培養(yǎng)物用含有相同濃度氨芐青霉素的M9培養(yǎng)基稀釋(1∶100)。并在37℃培養(yǎng)6小時。
將20ml該培養(yǎng)物于4℃，以12000×g的轉(zhuǎn)速離心10分鐘。將菌粒重新分散于2ml的33mM的鹽酸Tris緩沖液(PH8)中，加同體積的33mM EDTA溶液，和40%的蔗糖，將所得混合物于37℃溫度和振搖條件下培養(yǎng)10分鐘。離心后滲透的細(xì)胞再分散于2ml冷水中且冰浴冷卻10分鐘。離心分離所得的上清液，其為細(xì)菌細(xì)胞的胞質(zhì)部分。
利用顯色檢測測定斷裂合成底物的凝血酶活性的抑制率。我們測定到了胞漿中生成的水蛭素的抗凝血酶活性。這些樣品中，水蛭素活性程度約為50μg/ml。而對照的胞漿中無此活性。在PFC-HV12的情況下，水蛭素變種HV12的產(chǎn)量為80μg/ml。
用類似的方法，用啟動子PlPP/lac代替啟動子Ptrp生成新的水蛭素表達(dá)/分泌質(zhì)粒。這種被稱作POMP-HV1的質(zhì)粒列于圖7。將這種質(zhì)粒插入B型大腸桿菌菌株后，也得到高產(chǎn)量的活性水蛭素(40-80μg/ml)。我們使用Ghrayb等人所述的質(zhì)粒PIN-Ⅲ-ompA 3做為制備POMP-HV1的起始質(zhì)粒。培養(yǎng)條件及用異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)進(jìn)行表達(dá)誘導(dǎo)如前所述16。
實(shí)施例3從大腸桿菌所得重組HV1的抗凝活性利用活化的部分凝血致活酶時間(aPTT)試驗(yàn)和凝血酶時間(T.T.)試驗(yàn)檢測水蛭素變種HV1的抗凝活性。兩個試驗(yàn)均用自動血凝度計(jì)進(jìn)行(ACL 300 Research，Instrumen-tation Laboratory，Milan，Italy)。
往正常人的檸檬酸鹽血漿中，加入濃度遞增的重組制備的水蛭素HV1。樣品用自動血凝度計(jì)測定aPTT(活化的部分凝血致活酶時間)，和T.T.(凝血酶時間)，該測定通過往血漿中自動加入適當(dāng)?shù)脑噭┎⒂涗浹龎K形成速度而進(jìn)行。aPTT用腦磷脂和氯化鈣(自動APTT試劑，一般診斷用，USA)進(jìn)行測定，T.T.用濃度為5IU/ml的人凝血酶(Fibrindex，血清診斷用，Milan，Italy)進(jìn)行測定，試劑按廠家的說明制備，貯存和使用。
從aPTT和T.T.試驗(yàn)所得的凝血時間相對于重組蛋白的濃度繪圖。在每項(xiàng)試驗(yàn)中，計(jì)算出人血漿凝血時間兩倍的濃度。aPTT試驗(yàn)所得的數(shù)值為210ng/ml，T.T.試驗(yàn)的數(shù)值為90ng/ml。
實(shí)例4昆蟲細(xì)胞中HV12的表達(dá)和分泌為使HV12從重組昆蟲細(xì)胞中分泌HV12，必須將HV12編碼序列與可被這些細(xì)胞識別的先導(dǎo)肽連接。我們使用了水泡性口炎病毒(VSV)G蛋白
的先導(dǎo)肽。用這種序列在昆蟲細(xì)胞中制備水蛭素或其衍生物以前從未有報(bào)道。與前述方法類似。制備了接于HV12基因前段之后的編碼VSV G蛋白先導(dǎo)肽的合成DNA序列，該核苷酸序列列于圖8中。在此例中，我們還提供了方便的限定部位(Hind Ⅲ，BamHⅠ和BalⅠ)，以便將HV12的其余部分與表達(dá)載體連接。
將合成HindⅢ-BalⅠ片段與攜帶HV12基因的M13-HV12的純化的BalⅠ-BamHⅠ片段連接。并插入用HindⅢ和BamHⅠ切下的M13mp18中。生成新的被稱作VSV-HV12質(zhì)粒的過程在圖9中表示。從VSV-HV12中切除攜帶HV12基因的BamHⅠ-BamHⅠ DNA片段。被攜帶的HV12基因與插入載體PAcYml18的VSV先導(dǎo)肽融合，見圖10，所得質(zhì)粒被稱為PAC-HV12。
為在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，VSV-HV12編碼序列必須在多面體啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下轉(zhuǎn)移到桿狀病毒基因組。為此，我們將昆蟲細(xì)胞與野生型桿狀病毒DNA和轉(zhuǎn)移載體PAc-HV12進(jìn)行共轉(zhuǎn)染。作為昆蟲細(xì)胞，我們選擇Spodoptera frugiperda細(xì)胞做宿主細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)詳述如下將S.frugiperda細(xì)胞用感染性的AcNPV DNA和代表著被Summer等人19的方法進(jìn)行修飾了的重組轉(zhuǎn)移載體的質(zhì)粒DNA的混合物進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將1mg病毒DNA與25-100μg質(zhì)粒DNA混合，在有20mM HEPES緩沖液，PH7.5，1mM正磷酸氫二鈉，5mM氯化鉀，140mM氯化鈉和10mM葡萄糖(總體積為1ml)存在下，用(終濃度)0.125M氯化鈣溶液沉淀。
將DNA懸浮液在35mm的組織培養(yǎng)皿中的106個S.frugiperda單層細(xì)胞上進(jìn)行培養(yǎng)。在室溫下使其吸收其細(xì)胞1小時。隨后用1ml培養(yǎng)液取代。于28℃培養(yǎng)3天后，收集上清液。并用于在S.frugiperda單層細(xì)胞中形成噬菌斑。利用光顯微鏡檢查，根據(jù)無多面體現(xiàn)象可簽定出含有重組病毒的噬菌斑。該噬菌斑中將病毒復(fù)原，將噬菌斑進(jìn)一步純化后用于制備多面體陰性病毒原種。
上述過程使我們能夠在多面體啟動子和VSV G蛋白先導(dǎo)肽的控制下分離出基因組攜帶HV12基因的重組桿狀病毒。根據(jù)已建立的方法，我用這種病毒以10種感染的復(fù)合感染S.frugiperda細(xì)胞。按已發(fā)表的方法，在10%牛血清存在下，將被感染的細(xì)胞旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)或單層培養(yǎng)。在感染后不同的時間里，利用S-2238顯色檢測，測定上清液中抗凝血酶活性(ATU)。結(jié)果列于下表中
表水蛭素活性ATU/106細(xì)胞感染后時間0小時 24小時 48小時 72小時旋轉(zhuǎn)培養(yǎng) 0.8 0.9 1.4 1.8單層培養(yǎng) 0.8 0.8 2.0 5.1實(shí)例5昆蟲細(xì)胞質(zhì)中HV1和HV12的表達(dá)水蛭素及其衍生物也可在S.frugiperda細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中制備和聚集。該方法由于使用了不分泌的病毒蛋白多面體的表達(dá)信號，得到的異種蛋白的收率較好。
我們要得到大量重組HV1和HV12所用的方法基于融合多肽的表達(dá)，在這里多面體的前18個氨基酸以框架與HV1或HV12的65個氨基酸連接，多面體NH2末端序列的存在使能產(chǎn)生高水平的表達(dá)20。另外，在多面體部分與HV1或HV12序列之間我們插入一個蛋氨酸殘基，通過用CNBr(溴化氰)處理雜交蛋白可釋出HV1或HV12部分。
與前述方法類似，我們制備了合成DNA片段，其可使M13-HV1或M13-HV12的BalⅠ-BamHⅠ片段與適合的轉(zhuǎn)移載體相連。圖11中所示的新的合成片段也包括BamHⅠ和BalⅠ位點(diǎn)以便進(jìn)一步處理。
得到了不同的轉(zhuǎn)移載體，PAcFT1，其攜帶著編碼多面體前18個氨基酸的核苷酸序列(圖12)。簡言之，即PAcYM1 EcoRV-BamHⅠ片段被含有核苷酸-92到核苷酸+55的多面體基因序列的合成寡核苷酸取代。該序列后有一個BamHⅠ位點(diǎn)，根據(jù)圖13中設(shè)計(jì)的路線可在該位點(diǎn)插入全面HV1或HV12編碼序列。通過此制備過程，我們得到了被稱作PAcFT1-HV1和PAcFT1-HV12的兩個新質(zhì)粒，其可用于將雜交基因轉(zhuǎn)移到桿狀病毒基因組。
按實(shí)例4得到重組桿狀病毒。按標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行S.frugip-erda細(xì)胞的感染，被感染昆蟲細(xì)胞的培養(yǎng)導(dǎo)致融合蛋白的細(xì)胞質(zhì)聚積，該雜交蛋白為重組HV1或HV12的起源，按幾種文獻(xiàn)方法可用CNBr(溴化氰)斷裂雜交21，22。利用Olson等人的方法，使我們能得到正確多肽序列的HV1和HV12。這兩個分子展示了其抗凝血酶活性。
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1.制備具有下列序列的HV12水蛭素樣多肽的重組DNA方法。纈-纈-蘇-天冬-半胱-蘇-谷-絲-甘-谷氨酰胺-天冬酰胺-亮-半胱-亮-半胱-谷-甘-絲-天冬酰胺-纈-半胱-甘-谷氨酰胺-甘-天冬酰胺-賴-半胱-異亮-亮-甘-絲-天冬-甘-谷-賴-天冬酰胺-谷氨酰胺-半胱-纈-蘇-甘-谷-甘-蘇-脯-天冬酰胺-脯-谷-絲-組-天冬酰胺-天冬酰胺-甘-天冬-苯丙-谷-谷-異亮-脯-谷-谷-酪-亮-谷氨酰胺，該方法包括提供一個用相容的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主，所用的表達(dá)載體含有編碼該HV12水蛭素樣多肽的DNA序列。
2.權(quán)利要求1的方法，其中DNA序列還可編碼一個先導(dǎo)肽，該先導(dǎo)肽能夠引導(dǎo)水蛭素樣多肽從水蛭素樣多肽所表達(dá)的細(xì)胞中分泌出。
3.權(quán)利要求2的方法，其中先導(dǎo)肽為OmpA或VSV G蛋白先導(dǎo)肽。
4.權(quán)利要求1的方法，其中DNA序列編碼的融合蛋白可斷裂釋放所述的水蛭素樣多肽。
5.權(quán)利要求1的方法，表達(dá)載體為質(zhì)粒。
6.權(quán)利要求5的方法，其中從Ptrp和Plpp/lac啟動子中選出的啟動子與前述的DNA序列相連。
7.權(quán)利要求1的方法，其中表達(dá)載體為病毒。
8.權(quán)利要求7的方法，其中病毒為重組桿狀病毒。其中多面體啟動子與前述的DNA序列相連。
9.權(quán)利要求1的方法，其中宿主為細(xì)菌。
10.權(quán)利要求9的方法，其中細(xì)菌為大腸桿菌B型菌株。
11.權(quán)利要求1的方法，其中宿主為從酵母，哺乳細(xì)胞系，昆蟲細(xì)胞系和動物中選出的真核宿主。
12.權(quán)利要求11的方法，其中宿主為spodoptera frugiperda細(xì)胞系。
13.重組DNA制備水蛭素或水蛭素樣多肽的方法，該方法包括提供用重組桿狀病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的spodoptera frugi-perda細(xì)胞系，該桿狀病毒表達(dá)載體包括與編碼水蛭素或水蛭素樣多肽的DNA序列相連的多面體啟動子。
14.權(quán)利要求13的方法，其中DNA序列還可編碼一先導(dǎo)肽，該先導(dǎo)肽可引導(dǎo)水蛭素或水蛭素樣多肽從spodoptera frugiperda細(xì)胞中分泌出來。
15.權(quán)利要求14的方法，其中先導(dǎo)肽為VSV G蛋白先導(dǎo)肽。
16.權(quán)利要求13到15的任一方法，其中水蛭素多肽為水蛭素HVl。
全文摘要
利用重組DNA的方法制備具有抗凝血酶活性的水蛭素或水蛭素樣多肽。水蛭素或水蛭素樣多肽優(yōu)選在大腸桿菌或昆蟲細(xì)胞中表達(dá)。
文檔編號C12P21/02GK1057294SQ9110302
公開日1991年12月25日 申請日期1991年5月8日 優(yōu)先權(quán)日1990年5月10日
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