專利名稱：截短的可溶性γ-干擾素受體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及截短的可溶性γ-干擾素受體，具體地說，涉及γ-干擾素受體的可溶性細(xì)胞外部分。
γ-干擾素(本文中有時(shí)稱作IFN-γ)是由激活的輔助T細(xì)胞產(chǎn)生的一種細(xì)胞素，它對(duì)許多類型的細(xì)胞，如B細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和T細(xì)胞，具有直接的效應(yīng)。它具有多重效應(yīng)(Trinchieri等，Immunology Today，6∶131-136，1985)，它的最顯著的活性之一是它誘導(dǎo)主要組織相容性復(fù)合體(MHC)Ⅰ類和Ⅱ類基因的表達(dá)(Kelley等，J.Immunol.，132∶240-245，1984;Collins等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，81∶4917-4921，1984;Cooper等，J.Immunol.，141∶1958-1962，1988;Amaldi等，J.Immunol.，142∶999-1004，1989)。MHCⅡ類基因的表達(dá)是抗原處理細(xì)胞(antigen-presenting cell)的標(biāo)志。Ⅱ類抗原的表達(dá)見于巨噬細(xì)胞和成熟的B細(xì)胞和T細(xì)胞，已知γ-干擾素可正調(diào)控這種表達(dá)。此外，已知γ-干擾素在那些并非是主要抗原處理細(xì)胞的細(xì)胞中，例如上皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、星形細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞及平滑肌細(xì)胞中，誘導(dǎo)Ⅱ類抗原編碼基因的表達(dá)。這些類型的細(xì)胞是否確實(shí)處理抗原尚未搞清，但已證明這些類型的細(xì)胞中Ⅱ類抗原的誘導(dǎo)與自身免疫疾病的發(fā)病相關(guān)(Massa等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84∶4219-4213，1987)。由于γ-干擾素是Ⅱ類抗原的主要刺激劑，它可能在疾病的表現(xiàn)中起重要作用。因此，γ-干擾素或其各種效應(yīng)的抑制劑，例如在受體界面水平上起作用的抑制劑，在自身免疫疾病的治療中將有巨大的潛在價(jià)值和用途。
曾有人嘗試給予小鼠γ-干擾素的單克隆抗體以抑制γ-干擾素在小鼠體內(nèi)的效應(yīng)(Grau等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，86∶5572-5574，1989)。然而，在給人做這種處理時(shí)，必須記住，單克隆抗體本身有可能會(huì)誘發(fā)中和免疫反應(yīng)，從而降低這種處理的效果。
現(xiàn)在已經(jīng)有了表達(dá)γ-干擾素受體的重組克隆(參見例外“人γ-干擾素受體的分子克隆和表達(dá)”，Aguet，G.等，Cell，55∶273-280，1988)，但這些克隆產(chǎn)生的是完整受體，包括胞質(zhì)(細(xì)胞內(nèi))區(qū)和跨膜區(qū)。胞質(zhì)區(qū)可能負(fù)責(zé)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)換，因此，如果尋找IFN-γ拮抗劑的目的是為了找到血流或其他體液(如關(guān)節(jié)液)中的IFN-γ并選擇性地與之結(jié)合，那么胞質(zhì)區(qū)就是多余的。此外，胞質(zhì)區(qū)在正常情況下隱藏在細(xì)胞內(nèi)，因此不能到達(dá)免疫系統(tǒng)，所以，全長IFN-γ受體肯定會(huì)由于其胞質(zhì)區(qū)而起到抗原的作用，從而被中和掉。如果發(fā)生中和，它在引入上述體液中時(shí)就會(huì)被除去而迅速喪失其效應(yīng)。因此需要有一種在競爭IFN-γ的同時(shí)沒有誘發(fā)與之相關(guān)的副作用的危險(xiǎn)的IFN-γ拮抗劑。
IFN-γ受體的編碼DNA和所預(yù)測的氨基酸順序已由Aguet等人(同上)公開，他們猜測，先導(dǎo)順序從氨基酸(殘基)1延伸至氨基酸14，跨膜順序從氨基酸246延伸至氨基酸266(這是其編號(hào))。因此，猜測所預(yù)測的IFN-γ受體的細(xì)胞外部分是從氨基酸15延伸至氨基酸245;其猜測結(jié)構(gòu)，包括由氨基酸殘基1-14組成的先導(dǎo)順序以及DNA編碼順序，示于附

圖1A和1B，其中先導(dǎo)順序的編號(hào)為-14至-1，預(yù)測的細(xì)胞外部分的編號(hào)為1-231。
在下面的討論中，所有編號(hào)均按附圖1的編號(hào)給出，但有可能與本文所提到的出版物中的編號(hào)不同。
尚不確定這個(gè)順序中有多少對(duì)能與IFN-γ特異結(jié)合的有效IFN-γ受體是必需的。但是，已知(Stueber等，文摘A3-15，J.Interferon Res.，9∶Suppl.2，1989年10月)氨基酸殘基1-198不構(gòu)成有效的受體，但據(jù)該文摘報(bào)道，氨基酸殘基12-231(包括早于12位起始的順序)構(gòu)成如大腸桿菌中所產(chǎn)生的有效受體，即在N端或C端有六個(gè)組氨酸殘基。這些組氨酸殘基肯定會(huì)改變受體的根本性質(zhì)，例如其免疫原性，因此在要把可溶性受體作為藥物使用時(shí)，這些殘基是非常不希望有的。我們自己的工作表明，氨基酸殘基6-221確實(shí)構(gòu)成有效的受體，但其他順序也可能是有效的。
因此，本發(fā)明提供一種可溶性γ-干擾素受體及其功能等價(jià)變異體，該受體由基本不含其他蛋白的天然人γ-干擾素受體的糖基化或未糖基化細(xì)胞外部分組成。功能等價(jià)變異體不僅包括天然存在的等位基因形式，而且包括由一個(gè)或更多個(gè)(例如至多3個(gè))氨基酸殘基的置換、缺失或加入而產(chǎn)生的仍基本保留了原有結(jié)合活性的變異體。這種可溶性IFN-γ受體最好具有附圖2中給出的化學(xué)式，其中Y為從以下順序的羧基末端(Pro)起始的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的亞順序Arg Ala Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro；Z為從以下順序的氨基末端(Ile)起始的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸殘基的亞順序Ile Thr Ile Phe Asn Ser Ser Ile Lys Gly；m、n和p彼此獨(dú)立地為0或1。
因此，這種可溶性受體是IFN-γ受體的細(xì)胞外部分，它在受體結(jié)合測試中競爭IFN-γ，因而是IFN-γ與其細(xì)胞受體結(jié)合作用的拮抗劑，即它與IFN-γ受體競爭IFN-γ。此外，它可用于在受體結(jié)合測試中測定IFN-γ，可以把后面實(shí)施例4D的方法改用固相進(jìn)行，以進(jìn)行IFN-γ拮抗劑的高容量篩選。
1位和2位的Ser和Arg殘基由一個(gè)潛在的核糖體結(jié)合位點(diǎn)AGCAGG(通常為AGGAGG，參見Shine和Dalgarno，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 71∶1342，1974)編碼(見圖1)，其下游7-9堿基對(duì)處有一個(gè)起始密碼子。為避免在大多數(shù)原核細(xì)胞(如細(xì)菌，例如大腸桿菌)中錯(cuò)誤起始的可能性，我們優(yōu)選在第6位的Gly殘基處起始，或者在更后的位置起始，最遠(yuǎn)為12位。以這種方式可以提供一種有效的可溶性IFN-γ受體，該受體包含氨基酸殘基12-221，特別是更長的順序，例如從氨基酸殘基1直到氨基酸殘基231。
有人曾利用聚合酶鏈反應(yīng)(Friedman等，Nucl.Acids Res.16∶8718，1988)，從λgtll胎盤cDNA文庫中直接分離編碼γ-干擾素受體的全長cDNA克隆(參見例如Aguet等，Cell.55∶273-280，1988.同上)，從其中分離出編碼IFN-γ受體可溶性部分的那部分cDNA，并把它摻入能夠表達(dá)它的質(zhì)粒中。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如上所限定，其中n為1，Y中的亞順序代表Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro.
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如上所限定，其中m、n和p均為1，由Y和Z所代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸殘基1-231的順序。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如上所限定，其中m和n為1，p為0，由Y代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸殘基1-221的順序。
在本發(fā)明的另一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如上所限定，其中m為0，n為1，p為0，由Y代表的順序從(6)Gly開始出現(xiàn)，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸殘基6-221的順序。
在本發(fā)明的又一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如上所限定，其中m為0，n和p均為1，由Y代表的順序從(6)Gly開始出現(xiàn)，由Z代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸殘基6-231的順序。
在本發(fā)明的又一個(gè)特別優(yōu)選的實(shí)施方案中，可溶性IFN-γ受體如前兩個(gè)自然段中所限定，不同的是m為1，因此該順序還包括一個(gè)起始的絲氨酸殘基。
圖1(分為A和B兩部分)給出了如Aguet等(Cell，55∶273-280，1988)所公開的全長可溶性IFN-γ受體及其編碼DNA的順序，不同的是其編號(hào)已象前面所指出的那樣做了變動(dòng)。
圖2給出了本發(fā)明的可溶性IFN-γ受體的優(yōu)選化學(xué)式。
圖3給出了質(zhì)粒pDSRS，其中插入了編碼可溶性IFN-γ受體的DNA順序。
圖4圖示了可溶性IFN-γ受體的大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒是如何構(gòu)建的。
圖5畫出了在大腸桿菌中產(chǎn)生的可溶性IFN-γ受體蛋白與結(jié)合在U937細(xì)胞上的IFN-γ的競爭作用。結(jié)合測試如實(shí)施例4D所述進(jìn)行。
這里引用的所有參考文獻(xiàn)的全部內(nèi)容均在此列為參考。
使用編碼并能夠在原核細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生IFN-γ受體cDNA細(xì)胞外區(qū)的表達(dá)載體，以得到產(chǎn)生IFN-γ受體可溶性(細(xì)胞外)部分的原核細(xì)胞克隆?？梢允褂玫脑思?xì)胞包括細(xì)菌，尤其是大腸桿菌?？梢杂迷S多大腸桿菌株來實(shí)施本發(fā)明。但優(yōu)選的大腸桿菌株是一種滲漏突變株，它能使可溶性IFN-γ受體從周質(zhì)間隙滲漏到培養(yǎng)基中，從培養(yǎng)基中很容易分離出可溶性IFN-γ受體，而沒有由于大多數(shù)其他大腸桿菌蛋白的存在而引起的復(fù)雜因素。這些細(xì)菌的生產(chǎn)方法及其在制備重組異源蛋白中的應(yīng)用，公開于1989年10月31日提交的共同未決申請(qǐng)07/429，588中，該申請(qǐng)?jiān)诖肆袨閰⒖肌?br> 在本發(fā)明的實(shí)施中可以使用若干不同的大腸桿菌啟動(dòng)子，如Trp、lac、lpp、λpL等。這些啟動(dòng)子指導(dǎo)異源蛋白在細(xì)胞質(zhì)中的表達(dá)。為能有效地分泌到周質(zhì)間隙中，可以使用一個(gè)信號(hào)肽順序，例如得自大腸桿菌OmpA、大腸桿菌堿性磷酸酯酶、大腸桿菌脂蛋白等的信號(hào)肽順序。供在大腸桿菌中進(jìn)行原核細(xì)胞表達(dá)的表達(dá)質(zhì)粒含有一個(gè)強(qiáng)啟動(dòng)子，特別是串聯(lián)的雙重啟動(dòng)子如lpp-lac，其后是一個(gè)編碼信號(hào)順序的DNA順序，該信號(hào)順序能將異源蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)到周質(zhì)間隙中。這最后一個(gè)DNA順序最好是得自大腸桿菌外膜蛋白OmpA的信號(hào)順序。該信號(hào)順序之后是IFN-γ受體cDNA的編碼順序。
用于制備這種質(zhì)粒的構(gòu)建方案(示于圖4)將另一個(gè)殘基即絲氨酸引入成熟編碼順序的起點(diǎn)處。在編碼預(yù)期可溶性IFN-γ受體的順序的末端引入了一個(gè)轉(zhuǎn)譯終止密碼子。含有這些成分的質(zhì)粒在用于轉(zhuǎn)化一個(gè)大腸桿菌突變株(例如可從ATCC以登記號(hào)53956得到的菌株)時(shí)，產(chǎn)生一種融合蛋白，此蛋白由OmpA信號(hào)順序后接可溶性IFN-γ受體順序組成。該融合蛋白在周質(zhì)中進(jìn)行進(jìn)一步加工，產(chǎn)生成熟的可溶性IFN-γ受體，它滲漏到培養(yǎng)基中。
可用的真核細(xì)胞系包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞系，如COS7、NS-1和CHO細(xì)胞，以及酵母細(xì)胞。此外也可以使用昆蟲表達(dá)系統(tǒng)，如家蠶或草地夜蛾。
為闡述本發(fā)明，用U937細(xì)胞作為γ-干擾素受體的方便來源，但本文所述的可溶性受體當(dāng)然將抑制IFN-γ與帶有這些受體的任何細(xì)胞的結(jié)合作用。這些細(xì)胞包括，例如B細(xì)胞、T細(xì)胞、嗜酸細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞、前髓細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、紅細(xì)胞、單核細(xì)胞、粒細(xì)胞等。
純化下面的實(shí)施例3描述了來自大腸桿菌的可溶性IFN-γ受體的純化過程，但其方法也可用來純化其他來源如真核細(xì)胞(特別是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞)的受體。
材料和方法1.試劑限制酶購自New England Biolabs公司(Beverly，MA)。水生棲熱菌DNA聚合酶和10X緩沖液購自Stratagene公司(LaJolla，CA)。雙鏈質(zhì)粒DNA的順序測定用United States Biochemical公司(Cleveland，OH)的Sequenase Version 2.0進(jìn)行。λgtll人胎盤cDNA文庫購自Clontech公司(Palo Alto，CA)。
2.合成寡核苷酸用Applied Biosystems 380A型DNA合成儀按標(biāo)準(zhǔn)方法合成下列合成寡核苷酸AB697:
5′- CAGACTGGTTACTACTTAAAGGT - 3′AB758:
5′- CAGCGACCGTCGGTAGCAGC - 3′AB759:
5′- CTTCAAAGTTGGTGCAACTT - 3′AB812:
5′- CTATCTGCAGCGACCGTCGGTAGCAGC - 3′AB813:
5′- GTATGTCGACTTCCAAAGTTGGTGCAACTT - 3′AB870JF:
5′- GCGCAAGCTTCTGGCACCGCGGATCTGGGGCCGTCCTCA - 3′AB871JF:
5′- GGCGGATCCTTAACCTTTTATACTGCTATTGAAAATGAA - 3′3.聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)如前人所述進(jìn)行(Friedmann等，Nucleic Acids Res.，16∶8718，1988)。
4.人IFN-γ可按實(shí)施例4A的方法純化，也可以買到，還可以買到其抗體。例如，Genzyme公司(Boston，MA)以代碼HG-IFN供應(yīng)重組人IFN-γ(純度為99%)，還以代碼IP-500供應(yīng)兔多克隆抗人IFN-γ供進(jìn)行Western吸印。
實(shí)施例1全長IFN-γ受體克隆的分離和短暫表達(dá)寡核苷酸AB758和AB759與IFN-γ受體cDNA順序的5′和3′非轉(zhuǎn)譯區(qū)相同，用這兩個(gè)寡核苷酸基本按前人所述(Friedmann等，Nucl.Acids Res.，16∶8718，1988)用胎盤cDNA文庫噬菌體溶解液進(jìn)行PCR。PCR用Techne可編程序的Dri-Block(GRI，Essex，UK)在下列條件下進(jìn)行于95℃變性2分鐘，引物退火在50℃下進(jìn)行2分鐘，鏈延長反應(yīng)在72℃下進(jìn)行2分鐘，所有這些操作都進(jìn)行30次循環(huán)，最后一次循環(huán)的延長反應(yīng)于72℃下進(jìn)行9分鐘。PCR產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳，用溴化乙錠染色顯現(xiàn)出一個(gè)約1.5kb的主帶，它相應(yīng)于全長的IFN-γ受體編碼區(qū)，用電洗脫法分離出這個(gè)主帶。用寡聚物AB758作5′引物，用AB697作相應(yīng)于IFN-γ受體細(xì)胞內(nèi)區(qū)順序的內(nèi)引物，進(jìn)行另一個(gè)PCR，產(chǎn)生一個(gè)約1.2kb的片段，以此來驗(yàn)證上述約1.5kb片段的真實(shí)性。
用寡聚物AB812和AB813進(jìn)行如上所述的PCR，從而在1.5kb全長IFN-γ受體片段上引入PstI(5′)和SalI(3′)的限制位點(diǎn)。分離出所得到的片段，用PstI和SalI消化，并連入已用PstI/SalI消化的供在COS7細(xì)胞中表達(dá)的pDSRS質(zhì)粒(ATCC登記號(hào)68232)(圖3)。用得到的連接混合物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌294(易從耶魯大學(xué)生物學(xué)系大腸桿菌遺傳學(xué)保藏中心(P.O.Box6666，New Haven，CT 06511-7444)得到)。
對(duì)用堿溶法(Birnboim和Doly，“一種用于篩選重組質(zhì)粒DNA的快速堿提取法”，Nucl.Acids.Res.，7∶1513，1978)從14個(gè)所得克隆中分離出的質(zhì)粒DNA進(jìn)行分析，并用限制分析和PCR法進(jìn)行檢驗(yàn)。有7個(gè)克隆含有1.5kb IFN-γ受體片段。用氯化銫/溴化乙錠梯度離心法(Maniatis等“分子克隆-實(shí)驗(yàn)室操作指南”，紐約州冷泉港實(shí)驗(yàn)室)從這7個(gè)克隆中的6個(gè)中純化出DNA，用基本上如文獻(xiàn)所述的DEAE-葡聚糖法(McCutchan和Pagano，“用二乙氨基乙基葡聚糖增強(qiáng)猿病毒40脫氧核糖核酸的感染性”，J.Natl.Cancer Inst.，41∶351-356，1968)將該DNA短暫轉(zhuǎn)染到COS7細(xì)胞中(5μg DNA/100mm培養(yǎng)皿)。在37℃下培養(yǎng)60-72小時(shí)后，用溫和胰酶水解法收集細(xì)胞，并再懸浮于含0.02%疊氮鈉的RPMI培養(yǎng)基中達(dá)1×107個(gè)細(xì)胞/ml，于4℃下保存。然后用下面實(shí)施例4所述的技術(shù)進(jìn)行125I標(biāo)記的IFN-γ的特異結(jié)合試驗(yàn)，以檢驗(yàn)上述細(xì)胞是否能表達(dá)IFN-γ受體。
有三個(gè)克隆呈現(xiàn)出125I標(biāo)記的γ-干擾素的特異性結(jié)合顯著增加(見后面的表1)。用雙脫氧鏈終止法(Sanger等，“用鏈終止性抑制劑進(jìn)行DNA順序測定”，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.，74∶5463-6567，1977)測定所有3個(gè)克隆的質(zhì)粒DNA的順序，細(xì)胞外區(qū)的順序與已發(fā)表的順序相同(Aguet等，同上)。
實(shí)施例2供在大腸桿菌中表達(dá)可溶性IFN-γ受體編碼基因的pJFR105-6的構(gòu)建利用從一個(gè)cDNA文庫中分離出的編碼γ-干擾素受體的DNA片段制備引物，以將兩個(gè)用于克隆可溶性區(qū)的位點(diǎn)引入原核細(xì)胞表達(dá)質(zhì)粒。制備引物AB870JF以引入緊靠DNA氨基末端(它將是20位的Gly)的HindⅢ限制位點(diǎn);制備引物AB871JF以引入一個(gè)BamHI限制位點(diǎn)和一個(gè)終止密碼子。這兩個(gè)引物將用來只分離和確定分子的可溶性區(qū)。(這些引物分離和限定除去其自身的先導(dǎo)順序之外的IFN-γ受體可溶性區(qū)，即先導(dǎo)順序和跨膜區(qū)之間的多肽順序。)利用PCR技術(shù)，將DNA片段(編碼全長受體)和引物合并在如下的反應(yīng)混合物中100微微摩爾引物、25ng DNA、10mM dNTP、10μl TAQ聚合酶緩沖液、2單位TAQ聚合酶。使該體系進(jìn)行30次退火、變性和合成的循環(huán)，反應(yīng)液總體積為100μl。PCR之后，用1%瓊脂糖凝膠分離DNA，用溴化乙錠染色顯現(xiàn)出編碼γ-干擾素受體的800bp片段，并從瓊脂糖中分離出該片段。
質(zhì)粒p830-1(pINⅢ，OmpA先導(dǎo)順序)(D.Lundell等，“一種高堿性蛋白-人白細(xì)胞介素4在大腸桿菌中的胞質(zhì)表達(dá)和周質(zhì)表達(dá)”，J.Indust.Microbiol.，4，1989，可以請(qǐng)分子和細(xì)胞生物學(xué)公司DNAX研究所的R.Kastelein(901 California Avenue，Palo Alto，CA 94304-1104)提供)含有HindⅢ和BamHI限制位點(diǎn)，用這兩個(gè)位點(diǎn)將IFN-γ受體片段克隆在OmpA先導(dǎo)順序下游的碼內(nèi)，方法如下先用50單位HindⅢ限制核酸酶，然后用40單位BamHI限制核酸酶消化20μg質(zhì)粒DNA。消化后，限制片段的混合物在0.65%瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，分離出構(gòu)成質(zhì)粒骨架的7.5kb片段。也可以使用編碼合適分泌信號(hào)的任何其他適當(dāng)質(zhì)粒。
在含有ATP、T4 DNA連接酶(100單位)、二硫蘇糖醇的40μl混合物中，使構(gòu)成質(zhì)粒骨架的7.5kb片段(0.1μg)和1μg編碼γ-干擾素受體的800kb片段連接起來，連接反應(yīng)在16℃下進(jìn)行14小時(shí)。然后用一半產(chǎn)物來轉(zhuǎn)化用CaCl2制備的大腸桿菌(K12)294(易從耶魯大學(xué)生物學(xué)系的大腸桿菌遺傳學(xué)保藏中心(P.O.Box 6666，New Haven.CT 06511-7444)得到)。將由轉(zhuǎn)化得到的混合物鋪在氨芐青霉素平皿上，于30℃下培養(yǎng)16-24小時(shí)。然后挑出若干克隆進(jìn)行發(fā)酵，分離出DNA，并通過用前面提到的酶(HindⅢ，BamHI)消化進(jìn)行分析，選擇出克隆pJFR105-6。
pJFR105-6克隆含有插在OmpA下游并處于lpp/lac啟動(dòng)子控制下的片段。該質(zhì)粒衍生自pBR322，并攜有LAC-I基因，因而可用異丙基-硫代-β-半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)表達(dá)。
實(shí)施例3從大腸桿菌中純化可溶性人γ-干擾素受體從攜有質(zhì)粒pJFR105-6的大腸桿菌中純化人IFN-γ受體的細(xì)胞外區(qū)。在M9-酪蛋白氨基酸培養(yǎng)基〔1×M9基本鹽(Gibco BRL NO.M29800B)、3%(W/V)酪蛋白氨基酸、2g/l葡萄糖、0.1g/l硫胺素、0.2g/l硫酸鎂〕中，在30℃下將細(xì)胞培養(yǎng)至A660＝1.0。加入IPTG至0.5mM，于30℃下繼續(xù)發(fā)酵過夜(培養(yǎng)物最終的A660＝3.5)。從12升培養(yǎng)液中收集條件培養(yǎng)基，然后離心澄清。將澄清的上清液調(diào)至5%(W/V)三氯乙酸(TCA)，使蛋白在4℃下沉淀60分鐘。以10，000xg離心收集不溶部分，并再懸浮于200mM Tris(pH8)中達(dá)120ml使其重新溶解。于4℃下保溫60分鐘后，離心收集重新溶解部分的殘余物。將上清液調(diào)至4M脲、20mM Tris(pH8)，于4℃下保溫30分鐘，然后加到DEAE Sephadex Fast Flow柱(Pharmacia No.17-0709-01)上，該柱已用20mM Tris(pH8)、4M脲緩沖液平衡。然后將該柱用同一Tris/脲緩沖液中的0-0.3M氯化鈉線性梯度洗脫。人IFN-γ受體的可溶性細(xì)胞外區(qū)在約0.18M NaCl處洗脫出。將可溶性受體合并液對(duì)20mM Tris(pH8)透析，再加到已用20mM Tris平衡的5ml IFN-γ-Affigel 10柱上。(按制造廠家推薦的方法使人IFN-γ與Affigel 10(Biorad Catalog No.153-6046)共價(jià)偶合。這種親和樹脂含有4mg IFN-γ/ml載體樹脂?！秤?0ml含0.2M NaCl的200mM Tris(pH8)，洗柱，然后用10ml含0.5M NaCl的200mM Tris(pH8)洗柱。然后用200mM碳酸鈉緩沖液(pH10.3)、0.6M NaCl洗脫出可溶性受體。將各部分中和后合并，然后對(duì)20mM磷酸鈉(pH7.5)透析。
此方法由每次12升發(fā)酵得到0.7-1mg可溶性IFN-γ受體。但約有50%可溶性IFN-γ受體留在TCA不溶部分中。這一物料可進(jìn)行變性處理，然后重新折疊而產(chǎn)的更多的活性蛋白。
實(shí)施例4可溶性γ-干擾素受體的測試A.人γ-干擾素的純化在經(jīng)過改良的GC培養(yǎng)基(20g/l甘油、30g/l酪蛋白氨基酸(Difco)、20g/l酵母提取物(Difco)、5g/l KH2PO4、1g/l MgSO4·7H2O)中，于37℃下培養(yǎng)攜有質(zhì)粒pGIF4-137(一種以pBR322為基礎(chǔ)的表達(dá)載體，它帶有細(xì)菌脂蛋白(lpp)啟動(dòng)子并編碼人γ-干擾素基因(成熟蛋白質(zhì)的氨基酸4-137))的大腸桿菌。在A660＝7-10時(shí)收集細(xì)胞并用超聲破碎法使其溶解。然后離心分離無細(xì)胞的不溶部分，再懸浮于20mM Tris(pH8)、6M鹽酸胍和5mM二硫蘇糖醇中，并在56℃下加熱30分鐘使其重新溶解。
然后把這個(gè)重新溶解的部分加到已在室溫下用20mM Tris(pH8)、6mM鹽酸胍平衡的3×90cm Sepracyl 200-SF柱(Pharmacia AB)上。分級(jí)分離后，合并含γ-干擾素(例如用Western印跡分析法檢測)的部分，用10mM NH4OAc(pH7)稀釋120倍，于4℃下混合過夜。在該樣品中加入SP-Sephadex樹脂(Sigma化學(xué)公司)(10ml，為樹脂在20mM Tris，pH8中的1∶1漿液)，并于4℃下混合60分鐘。濾出樹脂，用10mM NH4OAc(pH7)洗滌，用1mM NaCl洗脫出純化的γ-干擾素。由SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳法表明這個(gè)γ-干擾素部分的純度大于95%。
B.人γ-干擾素的標(biāo)記用Bolton Hunter試劑(New England Nuclear)按供貨商所述方法制備125I標(biāo)記的人γ-干擾素(反應(yīng)液中含70μg/ml γ-干擾素和20mM磷酸鈉，pH8)。最終的反應(yīng)混合物用透析法脫鹽，并加到已用PBS和0.2%明膠平衡的1×24cm Sephadex G75柱上，將多聚γ-干擾素與二聚體蛋白分開。已標(biāo)記至50居里/mM的γ-干擾素合并液于4℃下貯存?zhèn)溆谩?br> C.用大腸桿菌制備樣品于37℃下，在營養(yǎng)培養(yǎng)基中將已用質(zhì)粒pJFR105-6轉(zhuǎn)化的大腸桿菌732I(ATCC登記號(hào)53956)培養(yǎng)至A660＝1。然后用0.1mM IPTG誘導(dǎo)該培養(yǎng)物，于37℃下繼續(xù)培養(yǎng)3小時(shí)。取誘導(dǎo)后培養(yǎng)物的上清液，利用下述結(jié)合測試法檢驗(yàn)可溶性IFN-γ受體的表達(dá)。
D.結(jié)合測試從5%二甲亞砜、95%胎牛血清冰凍貯液取U-937細(xì)胞(ATCC目錄號(hào)為CRL1593)接種到已預(yù)熱的RPMI 1640培養(yǎng)基(Hazelton Biologics公司)中，然后于37℃下培養(yǎng)并傳代至細(xì)胞密度不超過1×106個(gè)細(xì)胞/ml。即將使用前，離心收集細(xì)胞，在含0.02%疊氮鈉的RPMI 1640培養(yǎng)基中重新懸浮至1.25×107個(gè)細(xì)胞/ml，于冰上貯存。所有后續(xù)步驟均在4℃下進(jìn)行。
如下進(jìn)行受體結(jié)合測試每次測試用1.25×106個(gè)U937細(xì)胞。(每次測試得到圖5中的的一個(gè)點(diǎn)。)以相當(dāng)于10，000cpm的量加入125I-IFN-γ。加入用質(zhì)粒T892-5B(表達(dá)可溶性受體的基因)轉(zhuǎn)染的細(xì)胞培養(yǎng)上清液，加入的體積從0-100ml逐漸增加。測試液中有三個(gè)成分U-937細(xì)胞、125I標(biāo)記的IFN-γ及含有可溶性IFN-γ受體的樣品。將含有這三個(gè)成分之中兩個(gè)成分的混合液于4℃下保溫30分鐘。然后加入第三個(gè)成分，于4℃下繼續(xù)保溫120分鐘。將細(xì)胞置于油〔150μl鄰苯二甲酸二辛酯(Aldrich化學(xué)公司)和鄰苯二甲酸二丁酯(伊斯曼柯達(dá)公司)的1∶1混合物〕中離心。然后將離心管快速冷凍，從每個(gè)離心管的底部切下細(xì)胞沉淀，用γ-計(jì)數(shù)器測定沉淀上結(jié)合的放射性。
舉例來說，進(jìn)行上述步驟的一種方式如下用50μl RPMI培養(yǎng)基對(duì)可能含有可溶性受體的條件培養(yǎng)基作各種稀釋，然后將不同稀釋倍數(shù)的培養(yǎng)基加到96孔微量滴定板的各小孔中。在每個(gè)小孔中加入標(biāo)記的γ-干擾素(約50，000cpm，體積為50μl)，然后加入100μl U-937細(xì)胞懸浮液(1.25×107個(gè)細(xì)胞/ml)。于4℃下培養(yǎng)2小時(shí)后，將每個(gè)反應(yīng)混合物吸入裝有150μl鄰苯二甲酸二辛酯∶鄰苯二甲酸二丁酯(1∶1)的0.4ml小試管(Bio-Rad)中。將測試管置擺動(dòng)筒型轉(zhuǎn)子中離心，在液氮中冷凍，切下管底(其中所含的冰凍細(xì)胞沉淀和反應(yīng)液被油層隔開)，用γ計(jì)數(shù)器分析其放射性。鑒定出培養(yǎng)基中能夠抑制γ-干擾素與U-937細(xì)胞結(jié)合的各部分中含有可溶性IFN-γ受體。
結(jié)果示于表1。
表1篩選克隆的全長γ-干擾素受體在COS7細(xì)胞中的表達(dá)實(shí)驗(yàn)號(hào) 質(zhì)粒號(hào) 本底結(jié)合 本底結(jié)合 特異結(jié)合(1) (2) (3)1 T884-5 1832.8 129.8 1703.01′ T884-5 1560.5 77.8 1482.72 T886-5 1985.0 150.4 1834.62′ T886-5 2404.6 197.6 2207.03 T886-6 2525.9 230.9 2295.03′ T886-6 2092.8 69.8 2023.04 無插段 110.7 136.8 04′ 無插段 159.4 160.0 05 無DNA 125.4 184.4 05′ 無DNA 158.1 178.3 0無氯奎(1)在未標(biāo)記IFN-γ的濃度為0.1μg/ml時(shí)結(jié)合的125I-IFN-γcpm。
(2)在未標(biāo)記IFN-γ的濃度為10μg/ml時(shí)結(jié)合的125I-IFN-γcpm。
(3)特異結(jié)合＝(1)-(2)。
圖5給出了實(shí)驗(yàn)結(jié)果，其中將U937細(xì)胞上的完整γ-干擾素受體與γ-干擾素的結(jié)合作用與本發(fā)明的可溶性γ-干擾素受體與γ-干擾素的結(jié)合作用作了比較。在這個(gè)受體結(jié)合測試中，由大腸桿菌產(chǎn)生的可溶性γ-干擾素受體，以依賴劑量的方式競爭性地抑制125I標(biāo)記的γ-干擾素與其在U937細(xì)胞上的受體的結(jié)合作用。
這些數(shù)據(jù)表明，可溶性受體是γ-干擾素與其細(xì)胞受體結(jié)合作用的競爭性抑制劑。在利用這種競爭性抑制作用進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)方法(如篩選測試)中，可以用能產(chǎn)生信號(hào)的標(biāo)記物標(biāo)記IFN-γ或其可溶性受體，這種標(biāo)記物可以是放射標(biāo)記或化學(xué)標(biāo)記，尤其是熒光標(biāo)記。此外，借助這種競爭性抑制作用，本發(fā)明的可溶性γ-干擾素受體也可能可用于治療自身免疫疾病，如風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、多發(fā)性硬化、斯耶格倫綜合癥和盤狀紅斑狼瘡。
本發(fā)明的可溶性IFN-γ受體可以以藥物組合物形式施用。這類組合物含有治療有效量的本發(fā)明可溶性受體及一種藥物載體或賦形劑。藥物載體可以是適于將本發(fā)明的可溶性IFN-γ受體釋放給患者的任何可配伍的無毒物質(zhì)。例如，載體中可包含無菌水、乙醇、脂肪、蠟及惰性固體，還可以加入藥用助劑(如緩沖劑、分散劑)。一般來說，用于腸胃外給予這類藥物的組合物是公知的，例如參見Remington′s Pharmaceutical Sciences第14版(Mack出版公司，Easton，PA1980)。另外，也可利用可埋植藥物釋放系統(tǒng)把本發(fā)明組合物引入患者體內(nèi)，參見例如Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.，24∶199-236，1984。
本發(fā)明的可溶性IFN-γ受體一般是腸胃外給藥，優(yōu)選靜脈給藥。雖然預(yù)計(jì)可溶性IFN-γ受體不具有免疫原性，但最好緩慢給藥，或者用常規(guī)的靜脈給藥，或者通過皮下埋植給藥。
腸胃外給藥時(shí)，可溶性IFN-γ受體一般是用藥用腸胃外載體配制成適于注射的單位劑型(例如溶液、懸浮液或乳液)。這種載體本質(zhì)上是無毒和無治療作用的。這些載體的例子有生理鹽水、林格溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。也可以使用非水性載體如固定油和油酸乙酯。優(yōu)選的載體是5%葡萄糖/生理鹽水。載體中可含有少量添加劑，例如那些能提高等滲性和化學(xué)穩(wěn)定性的物質(zhì)，如緩沖劑和防腐劑?？扇苄訧FN-γ受體最好以基本不含團(tuán)聚體、降解產(chǎn)物和污染蛋白的純化形式進(jìn)行配制，使其濃度為約5-500μg/ml，優(yōu)選20-250μg/ml。
可溶性IFN-γ受體給藥方案的選擇取決于多種因素，包括可溶性IFN-γ受體的血清代謝率、與自身免疫疾病相關(guān)的IFN-γ的血清水平、可溶性IFN-γ受體的任何可能的免疫原性、靶IFN-γ的易接近性、IFN-γ與其細(xì)胞受體相對(duì)于IFN-γ與可溶性IFN-γ受體的親和性、等等。
確定本發(fā)明化合物對(duì)特定情況的適當(dāng)劑量屬本領(lǐng)域的技能。通常是以低于最適劑量的劑量開始治療。以后漸漸提高劑量，直到達(dá)到各種情況下的最佳效果。為方便起見，需要時(shí)可把總?cè)談┝吭谝惶靸?nèi)分次服用。
根據(jù)主治醫(yī)生考慮患者年齡、身體狀況和體重以及所治療癥狀的嚴(yán)重程度等因素后所做出的判斷，調(diào)整可溶性IFN-γ受體的服用劑量和次數(shù)。
按照該服用方案，最好盡可能加大給予患者的可溶性IFN-γ受體的劑量，使其與可接受水平的副作用相協(xié)調(diào)。因此所給予的劑量部分地取決于所治療疾病的嚴(yán)重程度。該劑量優(yōu)選在每天約0.1-500μg/kg的范圍，更優(yōu)選的是每天約1-50μg/kg。
推薦的典型劑量方案是，腸胃外服用劑量1μg/天至5mg/天，優(yōu)選20μg/天至1mg/天，以2-4個(gè)分次劑量服用，以使自身免疫癥狀得到緩解。
對(duì)本發(fā)明的上述方案所做的敘述目的在于說明和描述，而不是要詳盡無遺或把本發(fā)明限制于所公開的具體形式，顯然可根據(jù)以上敘述做出各種修改和變動(dòng)。選擇和敘述這些實(shí)施方案是為了解釋本發(fā)明的原理及其實(shí)際應(yīng)用，以使本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠適當(dāng)?shù)夭捎煤蛯?shí)施這些實(shí)施方案以及適于所設(shè)想的特定用途的本發(fā)明修改形式。發(fā)明范圍打算用所附的權(quán)利要求書來限定。
權(quán)利要求
1.一種制備可溶性γ-干擾素(IFN-γ)受體及其功能等價(jià)變異體的方法，該受體由基本不含其他蛋白的天然人IFN-γ跨膜細(xì)胞受體的糖基化或未糖基化細(xì)胞外部分組成；其特征在于該方法包括以下步驟構(gòu)建一個(gè)含有編碼所述可溶性受體的核苷酸順序的載體，其中該核苷酸順序能夠由含有該載體的宿主表達(dá)；將載體引入宿主；使含載體的宿主保持在適于使所述核苷酸順序表達(dá)出可溶性受體的條件下。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其中可溶性受體具有下式
其中Y為從下列順序的羧基末端起始的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的亞順序Arg Ala Glu Met Gly Thr Ala Asp Leu Gly Pro；Z為從下列順序的氨基末端起始的一個(gè)或更多個(gè)氨基酸的亞順序Ile Thr Ile Phe Asn Ser Ser Ile Lys Gly；m、n和p彼此獨(dú)立地為0或1。
3.如權(quán)利要求2所述的方法，其中m和n均為，1，Y中的亞順序?yàn)镚ly Thr Ala Asp Leu Gly Pro.
4.如權(quán)利要求2所述的方法，其中m、n和p均為1，Y和Z所代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸1-231的順序;或m為1，n為1，p為0，Y所代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸1-221的順序;或m為0，n為1，p為0，Y所代表的順序以(6)Gly開始，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸6-221的順序;或m為0，n和p均為1，Y所代表的順序以(6)Gly開始，Z所代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸6-231的順序。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其中m為1，所述順序包括一個(gè)起始絲氨酸殘基。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其中m為1，n為1，p為0，Y所代表的順序以(6)Gly開始，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸Ser+6-221的順序。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其中m為1，n和p均為1，Y所代表的順序以(6)Gly開始，Z所代表的順序完整存在，即，可溶性IFN-γ受體具有氨基酸Ser+6-231的順序。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其中權(quán)利要求1的可溶性受體以未糖基化形式產(chǎn)生。
9.制備一種藥物組合物的方法，該組合物包含有效量的權(quán)利要求1所限定的可溶性受體和一種藥用載體或賦形劑，該方法包括將權(quán)利要求1限定的可溶性受體與一種藥用載體或賦形劑混合。
10.制備一種藥物組合物的方法，該組合物包含有效量的權(quán)利要求2所限定的可溶性受體和一種藥用載體或賦形劑，該方法包括將權(quán)利要求2限定的可溶性受體與一種藥用載體或賦形劑混合。
11.一種抑制IFN-γ與帶IFN-γ受體細(xì)胞的結(jié)合作用的方法，該方法包括如下步驟在含有帶IFN-γ受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中，加入有效量的權(quán)利要求1所限定的可溶性IFN-γ受體;使所述可溶性受體與細(xì)胞受體競爭。
12.一種抑制IFN-γ與帶IFN-γ受體細(xì)胞的結(jié)合作用的方法，該方法包括如下步驟在含有帶IFN-γ受體細(xì)胞的培養(yǎng)基中，加入有效量的權(quán)利要求2所限定的可溶性IFN-γ受體;使所述可溶性受體與細(xì)胞受體競爭。
全文摘要
提供了截短的可溶性γ-干擾素受體，尤其是人γ-干擾素受體的可溶性細(xì)胞外區(qū)，以及編碼這些受體的DNA順序和產(chǎn)生這些受體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞系，還提供了用這些受體抑制γ-干擾素與其細(xì)胞受體結(jié)合作用的方法。
文檔編號(hào)C12R1/19GK1056125SQ91102639
公開日1991年11月13日 申請(qǐng)日期1991年4月24日 優(yōu)先權(quán)日1990年4月24日
發(fā)明者P·J·扎沃尼, S·K·納魯拉, M·E·彼得羅, D·J·倫德爾, J·D·福塞塔 申請(qǐng)人:先靈公司