專利名稱：一種復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種酶解蠶蛹蛋白的生物化學(xué)方法。
在發(fā)明專利公報第3卷44期上公開了一種<由柞蠶蛹制備氨基酸復(fù)合液的方法>(專利號86106166)其采用木瓜蛋白酶在下述條件下酶解(a)酶量∶鮮蛹量＝1∶200～400(重量比)、(b)鮮蛹量∶水量＝1∶3.0～4.5(重量比)c)酶解溫度60～70℃d)酶解時間60～120分鐘e)酶解時反應(yīng)液PH值＝7～8。其不足之處是采用單一的木瓜蛋白酶酶解蛹蛋白，由于酶的作用切點有限，因此蛋白的利用率不是很高，如果無限期延長作用時間，勢必會拖長生產(chǎn)周期。
鑒于上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種生產(chǎn)工藝簡單、成本低的能提高蠶蛹蛋白利用率的復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法。
本發(fā)明的目的可以通過以下措施來實現(xiàn)一種復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法，其特征在于采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在下述條件下進(jìn)行酶解a、酶量鮮蛹量＝1∶500～600(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/g)1∶200～300(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/g)b、鮮蛹量∶水量＝1∶3.0～5.0(重量比)c、酶解溫度55～65℃d、酶解時間60～90分鐘e、酶解反應(yīng)液PH值6.0～8.0.
其酶解的最佳條件是
a、酶量∶鮮蛹量＝1∶540(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/g)＝1∶250(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/g)b、鮮蛹量∶水量＝1∶4.0(重量比)c、酶解溫度60℃d、酶解時間兩種酶同時加入60分鐘兩種酶先后加入80分鐘e、酶解反應(yīng)PH值7.5圖2是以木瓜蛋白酶和中性蛋白酶復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的制備工藝流程在該制備過程中，以中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解蠶蛹蛋白是主要反應(yīng)部分，因此必須注意控制酶解反應(yīng)的條件。
1.酶的用量酶量與鮮蛹量之比直接影響酶解的效果。在鮮蛹量一定時，隨著酶量的增加產(chǎn)物中氨基酸的含量也隨之增加，但不是正比關(guān)系，當(dāng)酶量達(dá)到一定數(shù)值后即使增加酶量產(chǎn)物中氨基酸的含量增加的幅度也很小，從經(jīng)濟(jì)角度考慮必須選擇適當(dāng)?shù)拿噶?，即酶量∶鮮蛹量＝1∶500～600(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/克)1∶200～300(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/克)較為適宜。其中又以酶量∶鮮蛹量＝1∶540(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/克)1∶250(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/克)為佳。
如表1所示，同是60克鮮蛹，在其它條件相同時不同酶量產(chǎn)物中氨基酸含量情況對比
表1酶量:蛹量(重量比) 1:270(木) 1:270(木) 1:540(木) 1:540(木)1:540(中)1:250(中)1:250(中)1:125(中)1:500(中)產(chǎn)物中氨基酸含量(克/升)10.0011.9712.2110.927.93注(木)為木瓜蛋白酶、(中)為中性蛋白酶由于酶的活力每批不一樣，即使同一批酶隨著貯存期的延長，酶的活力也隨之下降。因此使用前必須測定酶的活力，(方法附后)，根據(jù)測得的酶的活力按下式換算出實際所需酶的用量酶的實際用量＝ (酶的標(biāo)準(zhǔn)活力×酶的用量(按標(biāo)準(zhǔn)活力計))/(測得的酶的活力)2.反應(yīng)物濃度當(dāng)反應(yīng)物濃度較低即加入的水量較多時，不僅產(chǎn)物中氨基酸總量較低，而且降低了設(shè)備的利用率;而當(dāng)反應(yīng)物的濃度較高時雖然設(shè)備利用率較高，但由于體系粘稠酶不能充分作用于蠶蛹蛋白上，使得產(chǎn)物中氨基酸的總量也不高。表2中鮮蛹量均為60克，除反應(yīng)物的濃度不同外其它條件都相同時所得產(chǎn)物中氨基酸總量情況的對比表2水:鮮蛹(重量比)2.53.03.54.04.55.05.5產(chǎn)物中氨基酸含量(克/升)9.69 12.5 13.09 13.15 12.90 10.9 8.78從表中可以看出當(dāng)水量∶鮮蛹量＝3.0～5.0∶1效果較好，而當(dāng)水量∶鮮蛹量＝4.0∶1效果最佳。
3.酶解的時間蛋白酶水解蛹蛋白的反應(yīng)需要一定的時間。當(dāng)其它條件一定時隨著反應(yīng)時間增加產(chǎn)物中氨基酸的含量也隨之增加。從

圖1中可以看出酶解時間與產(chǎn)物中氨基酸含量不成正比關(guān)系。當(dāng)反應(yīng)時間在60～90分鐘時，產(chǎn)物中氨基酸含量較高，當(dāng)超過90分鐘時，雖增加反應(yīng)時間但產(chǎn)物中氨基酸含量增加的幅度也不大。從縮短反應(yīng)周期、提高生產(chǎn)效率的角度考慮，取60～90分鐘較為適宜。因為本發(fā)明采用了兩種蛋白酶，因而投入的方式也可以是兩種，一種方式是兩種蛋白酶同時加入，另一種方式是兩種蛋白酶分先后加入，各反應(yīng)40分鐘。結(jié)果表明兩種方式進(jìn)行的結(jié)果使產(chǎn)物中氨基酸總量差別不大。從簡化工藝的生產(chǎn)實際考慮，采用兩種酶同時加入的方式反應(yīng)60分鐘為最佳。
4.酶解的溫度木瓜蛋白酶的最適作用溫度為65℃，而中性蛋白酶的最適作用溫度為55℃。由于進(jìn)行復(fù)合酶解兩種酶同時加入反應(yīng)，需尋找一個最佳溫度接近這兩種酶的最適作用溫度。在表3中，同是60克鮮蛹在其它條件相同時，在不同溫度下產(chǎn)物中氨基酸含量情況對比表3酶解溫度℃5055606570產(chǎn)物中氨基酸含量(克/升)7.2211.5312.2010.578.29從上述試驗結(jié)果表明反應(yīng)溫度在55～65℃較為適宜，而60℃最接近兩種酶的最適溫度。
5.酶解的PH值中性蛋白酶與木瓜蛋白酶需在合適的PH值下進(jìn)行酶解。當(dāng)其它反應(yīng)條件相同時反應(yīng)液呈酸性或堿性都會影響酶的活性，使產(chǎn)物中氨基酸的含量降低。表5是60克鮮蛹在其它條件相同時不同PH值的條件下產(chǎn)物中氨基酸含量情況的對比表5PH值5.566.57.07.58.08.5氨基酸含量(克/升)7.769.7810.0211.8512.2010.91 5.14上述結(jié)果表明PH值在6.0～8.0時產(chǎn)物中氨基酸的含量比較理想，而PH值為7.5時效果最佳。但在實際生產(chǎn)中由于蛋白質(zhì)逐漸被水解，反應(yīng)體系的PH值逐漸被降低，因此需采用碳酸鈉(30%)水溶液對反應(yīng)液的PH值隨時進(jìn)行調(diào)整。
實施例1取60公斤鮮蛹沖洗干凈，加少量水經(jīng)絞肉機(jī)絞碎，然后再加水到240公斤(鮮蛹∶水＝1∶4)，于膠體磨上磨成勻漿(顆粒直徑5～20微米)由飲料泵打入反應(yīng)釜。向反應(yīng)釜的夾套通入蒸汽，同時開動攪拌器，使?jié){液升溫到60℃，并用30%(重量)的碳酸鈉將漿液的PH值調(diào)到7.5。此時加入中性酶220克(活力20萬單位/克)、木瓜酶110克(活力60萬單位/克)。在此條件下維持反應(yīng)60分鐘(間歇攪拌)，然后冷卻至室溫。用離心機(jī)(2000轉(zhuǎn)/分)過濾兩遍(滌綸濾布)。再加入去腥劑乙基麥芽酚100克、酒精4公斤混合均勻后高壓過濾。這時再加山梨酸鉀防腐劑600克。濾液通過高溫瞬時滅菌器，即得到氨基酸復(fù)合液成品200公斤，氨基酸含量為12.3克/升。
實施例2重復(fù)例1的操作條件，只是在加酶酶解時先加入中性酶220克(活力20萬單位/克)反應(yīng)40分鐘后，再加入木瓜酶110克(活力60萬單位/克)反應(yīng)40分鐘，其可得到氨基酸復(fù)合液成品205公斤，氨基酸含量為12.0克/升。
實施例3重復(fù)例1的操作條件，其中加水200公斤(鮮蛹量∶水＝1∶3.3)中性酶200克(活力20萬單位/克)、木瓜酶120克(活力60萬單位/克)，在65℃的溫度維持反應(yīng)90分鐘，可得到氨基酸復(fù)合液成品165公斤，氨基酸含量為10.88克/升。
實施例4重復(fù)例1的操作條件，其中加水300公斤(鮮蛹量∶水＝1∶5.0)中性酶300克(活力20萬單位/克)、木瓜酶100克(活力60萬單位/克)，在55℃的溫度維持反應(yīng)60分鐘，可得到氨基酸復(fù)合液成品310公斤，氨基酸含量為10.9克/升。
實施例5重復(fù)例1的操作條件，其中測得木瓜酶活力為50萬單位/克，中性蛋白酶活力為14萬單位/克，則加入酶的量分別為木瓜酶110×60/50＝132克中性酶220×20/14＝315克得到氨基酸復(fù)合液成品200公斤，氨基酸含量為12.1克/升。
本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有如下優(yōu)點1.提高了氨基酸的轉(zhuǎn)化率。
本發(fā)明是采用兩種作用條件相近似的酶對蠶蛹蛋白共同作用，由于酶的種類不同，因此酶的作用位點也不同，這樣就使蛋白肽鏈上的酶切點增多，即蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化成氨基酸的數(shù)量增多。表6是同為60克鮮蛹，除酶的種類與數(shù)量不同外其余條件均相同時產(chǎn)物中氨基酸含量情況的對比表61:540(木)酶量:蛹量(重量比) 1:540(木) 1:270(木) 1:250(中) 1:250(中)1.55(中)產(chǎn)物中氨基酸含量(克/升)5.829.0812.210.08.27從上表可以看出兩種酶復(fù)合酶解較之單一酶解產(chǎn)率能提高25%左右。
2.降低了生產(chǎn)成本。
中性蛋白酶的價格比木瓜蛋白酶的價格便宜，可使成本降低25%以上，益于工業(yè)化生產(chǎn)。
附件11398中性蛋白酶活力測定方法一、試劑1.福林試劑于2000毫升的磨口回流裝置內(nèi)，加入鎢酸鈉(Na2WO4·2H2O)100g，鉬酸鈉(Na2M0O4·2H2O)25g，蒸餾水700ml，85%磷酸50ml，濃鹽酸100ml，小火沸騰回流10小時，去除冷凝器后，加入硫酸鋰(Li2SO4)50g，蒸餾水50ml和數(shù)滴濃(99%)溴水搖勻，在通風(fēng)櫥中進(jìn)行，再煮沸15分鐘，以去除多余的溴，(冷后若仍有綠色需再加溴水，再煮沸除去過量的溴)，冷卻后加蒸餾水定容至1000ml，混合均勻過濾，試劑應(yīng)呈金黃色，貯存于棕色瓶內(nèi)，使用時以1份原福林溶液與2份蒸餾水混勻。
2.0.4N碳酸鈉稱取無水碳酸鈉(Na2CO3)42.4g，以蒸餾水溶解定容至1000毫升。
3.0.4M三氯醋酸稱取65.4g三氯醋酸，以蒸餾水溶解定容至1000ml。
4.0.02MPH7.5磷酸緩沖液稱取Na2HPO1·12H2O 6.02g和NaH2PO4·2H2O 0.5g以蒸餾水溶解定容至1000ml。
5.酪素溶液精確稱取酪素2.000g，先用少量0.5NNaOH濕潤后加入適量的0.02MPH7.5磷酸緩沖液，在沸水浴中加熱應(yīng)經(jīng)常攪拌)使完全溶解，冷卻(應(yīng)攪拌)后移入100毫升容量瓶，以0.02MPH7.5磷酸緩沖液定容到100ml。
附1).配制酪素定容時，若泡沫過多，則可加1-2滴酒精消泡。
2).酪素溶液在4℃冰箱保存一星期，如發(fā)現(xiàn)變質(zhì)應(yīng)重新配制。
6.100微克/毫升標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸溶液。
精確稱取予先于105℃干燥2-3小時的L-酪氨酸0.1g，逐步加入1NHCl6ml溶解，用0.2NHCl定容100ml，即得1mg/ml的酪氨酸溶液，取此溶液10ml，用0.2NHCl定容100ml，即成100ug/ml的酪氨酸溶液。
二、測定方法1.待測酶液制備精確稱取2.0000g，用少量0.02MPH7.5的緩沖液溶解，并用玻璃棒搗研，將上層液小心傾入容量瓶中，沉渣部分再加入少量上述緩沖液，如此反復(fù)搗研了3～4次，最后全部移入容量瓶中，用緩沖液定容到刻度搖勻，用4層紗布過濾。根據(jù)酶活力，再以上述緩沖液稀釋到適當(dāng)倍數(shù)，供測定用。
2.測定1).先將酪蛋白溶液放入40℃恒溫水浴中予熱3～5分鐘。
2).按圖3順序操作空白對照樣品中應(yīng)先加入三氯醋酸，然后再加入酪蛋白溶液。
三、計算1克酶粉或1ml酶液在40℃PH7.5的條件下，每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生1ug酪氨酸的酶量為一個酶活力單位。
酶活力單位＝4/10×K×0.D×n式中4-反應(yīng)試劑總體積4ml。
10-測定反應(yīng)時間為10分鐘。
K-標(biāo)準(zhǔn)曲線中0.D值為1所相當(dāng)?shù)睦野彼嵛⒖藬?shù)(g/ml)即比色計常數(shù)。
n-酶液稀釋總倍數(shù)。
附件2木瓜蛋白酶活力測定方法一、試劑1.酶液酶0.1g置研缽中，加入少量冰水研磨，冰水定容100ml。
2.酶稀釋液(臨用時新配制)取0.4577g半胱氨酸鹽酸鹽，取0.223gEDTA Na2定容10ml，定容前用4N氫氧化鈉或4N鹽酸調(diào)PH到5.0。
3.4N氫氧化鈉4.4N鹽酸5.酪蛋白溶液取1.79g磷酸氫二鈉定容100ml，為0.05M磷酸氫二鈉液，取0.6g酪蛋白加入上述磷酸氫二鈉溶液80ml，攪拌溶解后用1/10N鹽酸調(diào)PH＝7.0后定容100ml。
6.三氯醋酸溶液取99%冰乙酸1.896ml，加水溶解后加入1.805g乙酸鈉，溶解混勻后加入1.797g三氯醋酸溶解后定容100ml。
7.標(biāo)準(zhǔn)氨基酸(50.0g酪氨酸/ml)取5mg酪氨酸用1/10N鹽酸定容100ml。
二、測定方法1.取酶液5ml置10ml定量瓶中，加酶稀釋液定容10ml，此為供測酶液。
2.取供試酶液1ml于帶塞試管中放37℃水浴保溫10分鐘，加入予熱的酪蛋白液5ml，記時反應(yīng)10分鐘。
3.到10分鐘時加入三氯醋酸5ml，搖勻過濾。
4.取供試酶液1ml加三氯醋酸5ml，10分鐘后加酪蛋白液5ml，過濾，為空白液。
5.275nm測定吸收值A(chǔ)。
6.測標(biāo)準(zhǔn)酪氨酸的275nm吸收值(以水為空白)As。
三、計算木瓜蛋白酶的活力(單位/g)＝A/As×50× (供試品稀釋倍數(shù))/(供試品重)
權(quán)利要求
1.一種復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法，其特征在于采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶在下述條件下進(jìn)行酶解a、酶量鮮蛹量=1∶500～600(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/g)1∶200～300(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/g)b、鮮蛹量∶水量=1∶3.0～5.0(重量比)c、酶解溫度55～65℃d、酶解時間60～90分鐘e、酶解反應(yīng)液pH值6.0～8.0。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法，其特征在于采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合酶解的條件是a、酶量鮮蛹量＝1∶540(重量比)(木瓜蛋白酶活力60萬單位/g)＝1∶250(重量比)(中性蛋白酶活力20萬單位/g)b、鮮蛹量∶水量＝1∶4.0(重量比)c、酶解溫度60℃d、酶解時間兩種酶同時加入 60分鐘兩種酶先后加入 80分鐘e、酶解反應(yīng)PH值7.全文摘要
一種復(fù)合酶解蠶蛹蛋白的方法，它是以蠶蛹為原料采用中性蛋白酶和木瓜蛋白酶復(fù)合作用于蛹蛋白液，在中性常壓下于55～65℃反應(yīng)60～90分鐘，經(jīng)去腥處理得到蠶蛹蛋白的水解液，其內(nèi)所含的人體必需的氨基酸種類齊全且含量較高，可用于制備高、中檔營養(yǎng)保健品。本發(fā)明的工藝簡單、設(shè)備無需耐腐蝕、生產(chǎn)中無“三廢”污染。該方法較單一酶解方法的收率提高了25％左右，而成本卻降低25％以上。
文檔編號A23J3/34GK1071199SQ9010641
公開日1993年4月21日 申請日期1990年10月30日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月30日
發(fā)明者戴有盛, 姜明 申請人:遼寧師范大學(xué)