專利名稱：改進的組織培養(yǎng)方法
若干年來，以組織培養(yǎng)法培養(yǎng)哺乳類細胞這一領(lǐng)域一直是生物科學(xué)中許多領(lǐng)域的研究中心。以組織培養(yǎng)培養(yǎng)這類細胞作為生化產(chǎn)物的來源，并供進行生化與生物技術(shù)方法的基礎(chǔ)研究。哺乳類細胞在組織培養(yǎng)中的生長與近來分子生物學(xué)的幾乎所有進展密切相關(guān)。
因此，當前研究組織培養(yǎng)的方法很重要，許多科學(xué)家正在研究組織培養(yǎng)的條件及組織培養(yǎng)細胞內(nèi)發(fā)生的一些機理。
本發(fā)明屬于生化領(lǐng)域，具體地說是屬于組織培養(yǎng)領(lǐng)域。
本發(fā)明提供一種在無血清組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細胞的方法，所述哺乳類細胞適于在組織培養(yǎng)中生長，并對組織培養(yǎng)基中所存在的胰島素呈陽性反應(yīng)，所述組織培養(yǎng)基含有約0.1至約10，000毫微克精氨酰-A-O-胰島素/毫升。
本發(fā)明還提供一種適于在組織培養(yǎng)方法中培養(yǎng)哺乳類細胞的無血清組織培養(yǎng)基，它含有約0.1～約10，000毫微克精氨酰-A-O-胰島素/毫升。
本發(fā)明的特征是以精氨酰-A-O-胰島素(AAO-胰島素)用作培養(yǎng)哺乳類細胞的組織培養(yǎng)基的生長促進劑。AAO-胰島素是從人胰島素原制備人胰島素(HI)過程中的付產(chǎn)品，所述方法已詳細發(fā)表，并以與可分裂的先導(dǎo)順序共價連接的人胰島素原開始，所述先導(dǎo)順序由為此目的進行了遺傳改造的微生物合成(Frank，B.H.，andChance，R.E.(1983)Munch.Med.Wschr.，125(Suppl.1)14-20.Frank，B.H.，andChance，R.E.(1985)Symposium“QuoVadis？”，Sanofi，May29-30，Toulouse-Labege，F(xiàn)rance，pp.138-146.Frank，B.H.，Petee，J.M.，Zimmerman，R.E.，andBurck，P.J.(1981)inPeptidesSynthesis-Structure-Function.ProceedingsoftheSeventhAmericanPeptideSymposium.D.H.RickandE.Grosseds.，PierceChemicalCo.，Rockford，Ill.，pp.729-738.)胰島素原用胰酶和羧肽酶B切割，最好在金屬離子存在下，如歐洲專利公報0264250(美國專利申請06/917939)所述。
眾所周知，人胰島素由一條30個氨基酸的B鏈與一條21個氨基酸的A鏈通過二硫橋連接而構(gòu)成，所述二硫橋在A-7位與B-7位及A-20位和B-19位連接半胱氨酸。人胰島素原是一種含有86個氨基酸的蛋白質(zhì)，其中在HI的A-1位的甘氨酸通過一個內(nèi)部連接肽(一個35個氨基酸的鏈)被連接到B-30位的蘇氨酸上。所述連接肽在人胰島素原轉(zhuǎn)化成HI的過程中被切割而除去。
所述切割過程當然并不完全，不完全切割產(chǎn)生一些付產(chǎn)物，其中一種是精氨酰-A-O-胰島素，它不同于HI，它在人胰島素氨基端A-1位額外地連接了一個精氨酰基。該付產(chǎn)物可通過陽離子交換層析與HI分離，如下列制備1所示。
有趣的是AAO-胰島素在體內(nèi)降低兔血葡萄糖的作用比HI弱。在兔的測試中，AAO-胰島素的效力為HI的75%(摩爾對摩爾)。但是，AAO-胰島素至少在刺激組織培養(yǎng)中哺乳類細胞的生長方面同胰島素一樣有效。
當生物學(xué)家和生物化學(xué)家最初開始在組織培養(yǎng)方法中培養(yǎng)哺乳類細胞時，在含有5-10%濃度的動物血清的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)這些細胞已成為常規(guī)。血清給細胞提供了大量的營養(yǎng)物，許多重要的實驗都是在這類培養(yǎng)中進行的。但是，由于需要更精確的實驗，人們已在合成培養(yǎng)基中培養(yǎng)組織培養(yǎng)細胞，其中所有的組成成分都是經(jīng)純化并準確定性的化學(xué)物質(zhì)。為了許多細胞的適當生長而應(yīng)該或必須加到合成培養(yǎng)基中的一種物質(zhì)便是胰島素。
例如，下列細胞類型為文獻中已描述過的對加入胰島素的組織培養(yǎng)基呈陽性反應(yīng)的類型。
大鼠垂體癌細胞人頸癌細胞犬腎癌細胞大鼠成神經(jīng)細胞瘤小鼠黑素瘤大鼠神經(jīng)膠質(zhì)瘤人乳腺癌細胞大鼠卵巢小鼠胚胎癌細胞小鼠睪丸人結(jié)腸癌細胞Balb/c小鼠胚胎大鼠成肌細胞人肺表皮樣癌細胞倉鼠腎人成纖維細胞人表皮樣癌細胞大鼠甲狀腺小鼠胚小鼠淋巴綿羊脂肪細胞顯然，胰島素是培養(yǎng)哺乳類細胞的培養(yǎng)基中的一種必要的共同因子。在培養(yǎng)所有受培養(yǎng)基中胰島素刺激的哺乳類細胞時都需使用本發(fā)明。因此，所用細胞的性質(zhì)和來源不限制本發(fā)明。
組織培養(yǎng)基也不是限制因素。30多年來，無血清組織培養(yǎng)基已被廣泛研究及公開。為方便讀者，下列文獻可作為關(guān)于培養(yǎng)基資料的來源，并作為本文的參考文獻。
JaymeandBlackman，CultureMediaforPropagationofMammalianCells，VirusesandOtherBiologicals，AdvancesinBiotechnologicalProcesses5，1-30，A.R.Liss，Inc.(1985)HamandMcKeehan，MethodsEnzymol.58，44-93(1979)TheGrowthRequirementsofVertebrateCellsInVitro，Waymouth，HamandChapple，Eds.，CambridgeUniversityPress(1981)MethodsforSerum-FreeCultureofCellsoftheEndocrineSystem，Barnes，SirbaskuandSato，Eds.，A.R.Liss，Inc.(1986)
一般說來，用于哺乳類細胞的無血清培養(yǎng)基由許多成份構(gòu)成，它們包括必需氨基酸如精氨酸、半胱氨酸、組氨酸、甲硫氨酸等;非必需氨基酸如丙氨酸、天冬酰胺、甘氨酸等;及氨基酸衍生物如谷胱甘肽、羥脯氨酸、丁二胺等。這類培養(yǎng)基通常還含有維生素如葉酸、生物素、煙酰胺、泛酸、吡多醇、核黃素及維生素B12。使用碳水化合物如葡萄糖和丙酮酸，常用的還有核酸衍生物如腺嘌呤、次黑嘌呤和胸腺嘧啶。
這類培養(yǎng)基含有一種類脂源如膽堿和異肌醇，無機離子包括鈣、鎂、鈉、磷酸根等。還常含有無機微量元素如鈷、鐵、硒和鋅。培養(yǎng)基通常是緩沖的以維持所需的pH，經(jīng)常用碳酸氫根離子或二氧化碳氣體緩沖。上面引用的Ham和Mckeehan的文章便是已通過使用證實的并在本領(lǐng)域內(nèi)公知的一個培養(yǎng)基配方的特別好的來源。在《TCA手冊》(theTCAManual，theTissueCultureAssociation出版，12111ParkLawnDrive，Rockville，MD.20852)中可找到關(guān)于組織培養(yǎng)基的更詳細的描述。
如上所述，AAO-胰島素是作為從人胰島素原制備HI的付產(chǎn)品而發(fā)現(xiàn)的，因此，只需從不純的HI產(chǎn)品中分離便可容易地得到而用于本發(fā)明。下面的制備為用于上述分離的層析方法和用于純化AAO-胰島素的結(jié)晶步驟。
制備1層析將含有AAO-胰島素和HI的混合物溶于32ml含有7M脲、0.05M醋酸鈉和0.1M氯化鈉的緩沖液(pH3.8)中。用硫代丙基TRISACRYL樹脂(Rhone-Poulenc的分部ReactifsIBF制造，顆粒大小為40-80微米)裝1×15cm層析柱。將AAO-胰島素溶液上柱，用9倍于柱體積的梯度緩沖液洗脫，所述緩沖液的組成與上面的相同，只是氯化鈉濃度升到0.2M。流速為1ml/分。從柱中的流出液通過在280nm處的吸收而監(jiān)測。發(fā)現(xiàn)胰島素最先流出，它基本上在梯度洗脫開始后的最初70ml中洗出。然后AAO-胰島素流出，在洗出液的72～105ml中收集，得到基本沒有HI污染的富含AAO-胰島素的部分。
結(jié)晶840ml的AAO-胰島素產(chǎn)品溶液，含有2.32gAAO-胰島素，用10%NaOH將其pH調(diào)至8.0。用截留分子量為3000的膜將溶液在4℃下濃縮至260ml，然后將濃縮液對280ml去離子水透析。將溶液稀釋至蛋白濃度為2g/l，并加入16.2ml冰醋酸和850ml去離子水，制成0.25M溶液(在醋酸中)。然后使其升溫至23℃，并加入0.93ml的20%氯化鋅水溶液。用濃氫氧化銨將pH調(diào)至6.0，然后在23℃下攪拌該混合物4小時。然后冷卻到4℃，并在此溫度下靜止保溫16小時。然后傾出上清液，將剩余的稠的結(jié)晶漿離心。所得的結(jié)晶用純水洗兩次。然后再用無水乙醇洗兩次，每次用23ml。將結(jié)晶在室溫下真空干燥，得到2.11g基本純凈的AAO-胰島素。
實例1在一種無血清培養(yǎng)基中，用AAO-胰島素培養(yǎng)中國倉鼠卵細胞，所述培養(yǎng)基已被證明對培養(yǎng)這類細胞有效。培養(yǎng)基由三份Dulbecco′s修改的Eagle′s培養(yǎng)基(DME)和一份(體積)F12培養(yǎng)基組成，還加入了10-8M硒、50μM乙醇胺、20mM羥乙基哌嗪乙磺酸和1μg/ml人鐵傳遞蛋白。下表所述的AAO-胰島素的量以各種比例加入培養(yǎng)基，在12孔的Corning培養(yǎng)皿中培養(yǎng)細胞，培養(yǎng)皿用昆布氨酸(一種促進細胞在培養(yǎng)孔上附著和分散的蛋白)預(yù)處理。每一種條件都重復(fù)進行。
每個裝滿培養(yǎng)基的培養(yǎng)孔在實驗的0天接種25，000個細胞，在第6天用Colter計數(shù)器計數(shù)。在這些實驗中用了4批不同的AAO-胰島素，AAO-胰島素以0.1N鹽酸溶液形式加入培養(yǎng)基，其濃度在所有情況中都以毫微克/毫升表示。
對照實驗不向培養(yǎng)基中加入胰島素或AAO-胰島素，細胞的數(shù)目為10，000～200，000細胞/孔。培養(yǎng)在含有HI或小牛胰島素(而不是AAO-胰島素)的同樣培養(yǎng)基中的同樣的細胞，生長情況和本文所描述的實驗一樣。
AAO-胰島細胞數(shù)(x1，000)素濃度批批批批ng/mlABCD0.2538028027033013703603302702.54804204203801054055054047025600600530510100670640580580上述實驗表明了AAO-胰島素刺激細胞生長的有效性，所述細胞是在組織培養(yǎng)中對胰島素有反應(yīng)的細胞。的確，在這些實驗中，根據(jù)AAO-胰島素的濃度不同，每孔的細胞平均數(shù)增加到240，000～610，000。
權(quán)利要求
1.一種適于培養(yǎng)哺乳類細胞的無血清組織培養(yǎng)基，它含有約0.1～10，000毫微克的精氨酰-A-O胰島素/毫升。
2.權(quán)利要求1的培養(yǎng)基，其中精氨酰-A-O胰島素的濃度約為1～1，000毫微克/毫升。
3.權(quán)利要求2的培養(yǎng)基，其中精氨酰-A-O胰島素的濃度約為1～100毫微克/毫升。
4.一種在權(quán)利要求1所述的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細胞的方法，所述哺乳類細胞適于在組織培養(yǎng)中生長，并對組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽性反應(yīng)。
5.一種在權(quán)利要求2所述的組織培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細胞的方法，所述哺乳類細胞適于在組織培養(yǎng)中生長，并對組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽性反應(yīng)。
6.一種在權(quán)利要求3所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)哺乳類細胞的方法，所述哺乳類細胞適于在組織培養(yǎng)中生長，并對組織培養(yǎng)基中存在的胰島素呈陽性反應(yīng)。
全文摘要
將精氨酰-A-O胰島素，一種由人胰島素原用生物技術(shù)合成人胰島素過程中的副產(chǎn)品，加入無血清組織培養(yǎng)基中，以刺激哺乳類細胞的生長，所述哺乳類細胞在組織培養(yǎng)中對胰島素呈陽性反應(yīng)。
文檔編號C12N5/00GK1045125SQ9010096
公開日1990年9月5日 申請日期1990年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1989年2月27日
發(fā)明者沃爾特·弗朗西斯·普勞蒂 申請人:伊萊利利公司