專利名稱：重組dna產(chǎn)生的博德特氏菌毒素亞基類似物的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了在大腸桿菌中高水平直接表達(dá)博德特氏菌外毒素的S1、S2、S3、S4和S5亞基重組類似物的方法，而不需與異源蛋白部分進(jìn)行融合。更具體地說，通過基因工程對亞基進(jìn)行修飾，提供了一類博德特氏菌毒素類似物，它們能誘發(fā)毒素中和水平的抗體，并且基本上不含有反應(yīng)原組分。通過基因工程得到的亞基能夠用來產(chǎn)生亞基疫苗，它們既具有免疫原效應(yīng)，又基本上不含反應(yīng)原組分。
名詞“博德特氏菌外毒素”是指一組由博德特氏菌屬不同組的基因組編碼的毒素，例如百日咳博德特氏菌(BordetellaPertussis)、副百日咳博德特氏菌(B.Parapertussis)和支氣管敗血性博德特氏菌(B.bronchiseptica)。通常用來指博德特氏菌外毒素的其它名詞還有百日咳毒素(“PTX”)、淋巴細(xì)胞增多促進(jìn)因子(“LPF”)和胰島活化蛋白(“IAP”)。
在世界許多地區(qū)，百日咳仍然是嬰兒發(fā)病和死亡的主要原因。百日咳博德特氏菌的完整細(xì)胞疫苗是控制此疾病的一種有效手段。但是，此疫苗的使用與溫和的副作用直接相關(guān)，有時甚至于更為嚴(yán)重，偶而與致命的、神經(jīng)性疾病相關(guān)。
已經(jīng)作出了廣泛的努力，以試圖消除已知與現(xiàn)行疫苗相關(guān)的有害副作用。這些努力導(dǎo)致了非細(xì)胞疫苗的生產(chǎn)和試驗，在基礎(chǔ)研究中，這些努力則導(dǎo)致了試圖去生產(chǎn)更為安全的重組產(chǎn)物。為了克隆和生產(chǎn)來自重組DNA的疫苗，關(guān)鍵性的第一步是測定百日咳毒素操縱子的順序，從而推測出單個亞基的氨基酸順序(Locht，C.和Keith，J.M.，1986，Science232∶1258-1264;Locht等人，1986，Nucl.AcidsRes.143251-3261;Nicosia等人，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA834631-4635)。
Nicosia等人(1987，Infect.Immun.55963-967)證實，編碼百日咳博德特氏菌S1、S2、S3、S4和S5中每一亞基的mRNA能夠由大腸桿菌中的克隆基因高效率地轉(zhuǎn)錄。盡管他們意欲表明天然百日咳毒素多順反子信息的高水平轉(zhuǎn)錄，但由直接表達(dá)產(chǎn)生的蛋白量仍然很低或難以測出。進(jìn)一步，隨后合成的融合蛋白不能誘發(fā)任何中和性或保護(hù)性免疫應(yīng)答。
Barbieri等人(1987，Infect.Immun.，551321-1323)證實了S1亞基作為融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)。此融合蛋白含有β-半乳糖苷酶的最前面6個氨基酸、由pUC18多人工接頭編碼的5個氨基酸，隨后是S1亞基的氨基酸2至235號。以少量生產(chǎn)的S1融合蛋白，只具有真正的或天然百日咳毒素的大約25%的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。
Locht等人(Abstract，ModernApproachestoNewVaccines，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約，1986年9月9-14日)能夠表達(dá)含有S1亞基2-187號氨基酸的融合蛋白。他們預(yù)測此構(gòu)建物沒有毒性，因為他們認(rèn)為它沒有與ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶有關(guān)的NAD結(jié)合位點，而此酶的活性被認(rèn)為是毒素反應(yīng)原性的來源。但隨后用此分子進(jìn)行的實驗表明，此截斷分子所具有的酶活性基本上沒有減少。在現(xiàn)有技術(shù)中已知的多個或單個亞基類似物中，沒有一個能夠誘發(fā)毒素中和水平的抗體，而又基本上不具有與反應(yīng)原性相關(guān)的酶活性。


圖1是PTX操縱子的順反子順序的概圖(現(xiàn)有技術(shù)，見上面的Locht和Keith)。標(biāo)有S1、S2、S4、S5和S3的區(qū)域代表對每種PTX亞基推測的可譯框架。每個順反子前的黑色區(qū)域代表推測的信號順序。緊靠每個順反子下游的限制性酶切位點標(biāo)明了用于將該順反子亞克隆入表達(dá)載體中的下游限制位點。位于每個信號順序區(qū)之內(nèi)的限制性酶切位點用來作為將完整順反子亞克隆入表達(dá)載體中的上游限制位點，在亞克隆時，用合適的寡聚脫氧核苷酸人工接頭使未成熟的PTX亞基的信號順序完整無損。在剛好位于每個成熟的PTX亞基的可譯框之內(nèi)的限制性酶切位點，與合適的寡聚脫氧核苷酸人工接頭一起，用作沒有信號順序的順反子的亞克隆的上游限制位點，以產(chǎn)生甲硫氨酰-成熟PTX亞基。
圖2是PTX重組亞基的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳及Western印跡法的結(jié)果。A圖左邊顯示了以可測數(shù)量產(chǎn)生的PTX重組亞基膠帶的考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果;圖A右邊是平行膠帶用兔多克隆抗-PTX超免疫血清所作的Westers印跡。PTX標(biāo)明含有商品級百日咳毒素的泳道。這些結(jié)果表明，所產(chǎn)生的重組體(r)S1、S2、S3和S5的數(shù)量都很大。Western印跡表明，rS1已由它的前蛋白分子進(jìn)行了完全的后加工，rS2和rS5只進(jìn)行了部分后加工，rS3在發(fā)酵條件下基本上未被后加工;rS4的產(chǎn)生數(shù)量還不足以被觀察到。圖B顯示了作為甲硫氨酰-成熟重組(rm)亞基的表達(dá)產(chǎn)物。這些亞基的產(chǎn)生量都很大，只是rmS1除外(數(shù)據(jù)未出示)。
圖3是Western印跡法結(jié)果，證實了上游非編碼順序?qū)τ趓S2表達(dá)的效應(yīng)。此圖的詳情參見后面的說明。
圖4是SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳的放射自顯影圖，表明重組S1的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性?；旧细鶕?jù)Manning等人(1984，J.Biol.Chem.，259749-756)和West等人(1985，J.Biol.Chem.，26014428-14430)所述的方法，使重組S1(500ng)、純化的天然百日咳毒素(1μg)和反應(yīng)緩沖液在〔32P〕NAD的存在下分別與牛轉(zhuǎn)導(dǎo)素(transducin)反應(yīng)。用10%的冷三氯乙酸使樣品沉淀，使沉淀進(jìn)行SDS-PAGE和隨后的放射自顯影。39Kd處的放射活性帶是已被核糖基化的轉(zhuǎn)導(dǎo)素亞基。A道反應(yīng)緩沖液對照;B道天然PTX;C道rS1。
圖5是放射免疫檢測的曲線圖，顯示rS1和rS4亞基在小鼠中的免疫原性。小鼠用重組S1、甲硫氨酰rS4、天然百日咳毒素(PTX)、市售百日咳疫苗或賦形劑(NMS)進(jìn)行超免疫;有些制劑含有完全Freund氏佐劑(CFA)。收集血清，利用固相放射性免疫檢測法檢查稀釋液的抗-PTX滴度。
圖6的曲線圖表明rS1和rS4在小鼠中針對百日咳博德特氏菌腦內(nèi)攻擊的免疫保護(hù)能力。此圖的詳情見下文。
圖7是對rS1突變體推測的氨基酸順序，該突變體是由pPTXS1(6A-3/4-1)的表達(dá)產(chǎn)生的。
圖8A和8B是S1重組類似物ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶和NAD-糖水解酶的活性的曲線圖。
圖9是純化的S1亞基蛋白SDS-聚丙烯酰胺凝膠(PAGE)的放射自顯影圖。
圖10是全毒素的天然的、非還原的、非變性的聚丙烯酰胺凝膠的放射自顯影圖，該全毒素來自天然B寡聚體與重組S1/1或重組S1/1-4的結(jié)合。
圖11是光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞單層的照片，以檢查聚集細(xì)胞的存在。
本發(fā)明提供了一種重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S1亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，所述部分或片段或衍生物編碼的多肽具有如下的生物活性(a)誘發(fā)毒素中和水平的抗體以及(b)基本上不含有反應(yīng)原組分。S1多肽亞基，或其亞基類似物，含有一個主要的抗原決定簇，已知它對于針對百日咳毒性的免疫保護(hù)作用是很重要的。毒性中和水平的抗體提供了針對百日咳毒性的免疫保護(hù)作用。位點專一性誘變產(chǎn)生了基本上沒有酶活性的S1亞基類似物。
通過基因工程得到的博德特氏菌外毒素的S1亞基及此亞基的類似物，為預(yù)防百日咳提供了重組DNA產(chǎn)生的亞基疫苗。S1亞基及其類似物提供的疫苗產(chǎn)品，或是單獨的，或是與亞基S2、S3、S4和S5或其混合物結(jié)合的。亞基S2、S3、S4和S5能夠從百日咳博德特氏菌中純化得到，或通過基因重組作為融合或非融合產(chǎn)物產(chǎn)生。博德特氏菌外毒素的亞基S2、S3、S4和S5的高水平重組表達(dá)，在大腸桿菌中通過直接的非融合法也能達(dá)到。另外，可以選擇的重組宿主包括酵母，例如啤酒酵母(S.Cerivisiae)，細(xì)菌，例如鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)或傷寒沙門氏菌(S.typhi)、芽孢桿菌(Bacillus)，以及病毒，例如牛痘病毒，它們也可用來表達(dá)這些亞基類似物。
本發(fā)明為生產(chǎn)疫苗必需的所有PTX亞基提供了直接的高水平重組表達(dá)方法。此外，S1亞基類似物提供的生物活性具有高度的免疫原性，并基本上不含反應(yīng)原組分，這種組分具有毒素分子中與其毒性及反應(yīng)原性相關(guān)的酶活性，并且基本上不含有百日咳博德特氏菌的次要組分(如內(nèi)毒素)，而這些次要組分存在于由百日咳博德特氏菌提取出的疫苗物質(zhì)中，并已知它們具有反應(yīng)原性。單獨或與PTX的其他亞基結(jié)合使用S1類似物，能夠提供有效的咼綺罰⒋蟠蠼檔屠醋苑從υ櫸值母弊饔玫目贍芐?，而该讬螆?zhí)嬖謨諼淳奘蔚奶烊換蛑刈椴難腔小 百日咳博德特氏菌毒素的單個亞基S1、S2、S3、S4和S5分別亞克隆，并直接在大腸桿菌中單獨表達(dá)。信號順序似乎在重組S1(rS1)的表達(dá)中起著重要作用。沒有信號肽存在時，大腸桿菌中rS1的表達(dá)量很少。如果前蛋白上存在有S1亞基的天然前導(dǎo)順序或合成的前導(dǎo)順序，則可得到高水平表達(dá)，范圍在占細(xì)胞總蛋白的10-30%。如圖2所示，rS1表達(dá)細(xì)胞在分批式10升發(fā)酵罐中以生產(chǎn)規(guī)模發(fā)酵時(在8mgS1/OD-L的非最佳表達(dá)水平下)，使rS1的蛋白水解后加工差不多進(jìn)行完全而產(chǎn)生其成熟分子。以實驗規(guī)模發(fā)酵表達(dá)細(xì)胞時，S1的后加工進(jìn)行不完全;前蛋白和成熟蛋白都在細(xì)胞的對數(shù)生長后出現(xiàn)。合成的大腸桿菌的可切割前導(dǎo)順序并不能加強(qiáng)信號的后加工，這提示不完全切割的原因并不是大腸桿菌前導(dǎo)肽酶對于百日咳博德特氏菌蛋白水解切割位點的不相容識別。用高水平表達(dá)大腸桿菌前導(dǎo)肽酶的質(zhì)粒對細(xì)胞進(jìn)行其轉(zhuǎn)化以提高信號肽酶的合成，或使用低拷貝數(shù)載體降低S1的表達(dá)水平，都不能克服后加工的障礙，這表明問題并不在于切割途徑的飽和。這些結(jié)果表明，大腸桿菌中外源蛋白的轉(zhuǎn)譯后加工可能是由所知甚少的機(jī)理控制的，它們與生長細(xì)胞的生理狀態(tài)有關(guān)。
如圖2所示，在大腸桿菌中類似地表達(dá)了PTX亞基S2、S3、S4和S5。與重組S1一樣，rS2、rS3和rS5亞基在實驗規(guī)模的發(fā)酵中的后加工似乎不完全。由于rS1在生產(chǎn)規(guī)模下能進(jìn)行完全的后加工，則能使用相似的發(fā)酵條件以完全加工好的形式產(chǎn)生其它亞基。與rS1截然不同，rS4亞基能夠作為成熟的甲硫氨酰多肽高水平表達(dá)，但以其天然的前導(dǎo)肽順序表達(dá)時檢測不出。現(xiàn)在，亞基S2、S3、S4和S5都已作為甲硫氨酰成熟多肽得到了表達(dá)。這些分子的氨基酸分析表明，每個分子(S4除外)上的異源(非天然的)甲硫氨酰殘基基本上都由細(xì)胞的甲硫氨酸氨基肽酶切除，從而產(chǎn)生具有天然順序的完全成熟的蛋白。重組S4上的甲硫氨酰殘基基本上未被切除，是由于細(xì)胞酶的氨基末端識別順序的不相容性。從溶解細(xì)胞中以內(nèi)含體形式回收所有的重組蛋白。發(fā)現(xiàn)這些亞基在SDS-PAGE中的泳動圖形與真正的天然亞基基本一致，或在Western印跡法中與單克隆和多克隆抗毒素血清發(fā)生反應(yīng)。如圖2所示，在大腸桿菌中，通過直接的非融合方式高水平表達(dá)了重組亞基S1、S2、S3、S4和S5。
下面描述了本發(fā)明的優(yōu)選方法和材料，但在實施本發(fā)明時可使用不同的方法和材料。下面引用的所有參考文獻(xiàn)都并入本申請中作為參考文獻(xiàn)。
對亞基S1、S2、S3、S4和S5進(jìn)行重組表達(dá)的材料和方法材料DNA修飾酶購自NewEnglandBiolabs(Beverly，MA)，BethesdaResearchLaboratories(Gaithersburg，MD)，BoehringerMannheimBiochemicals(Indianapolis，IN)和InternationalBiotechnologies，Inc.，(NewHaven，CT);酶的使用根據(jù)廠家的說明進(jìn)行。所有的化學(xué)和生化試劑都是分析純的。純化的百日咳毒素PTX購自ListBiologicalLaboratories，Inc.(Campbell，CA)。根據(jù)Caruthers的方法(1982，inH.G.GussenandA.Lang〔eds〕Chemicalandenzymaticsynthesisofgenefragments，VerlagChemie，Weinheim，F(xiàn)RG，Pp71-79)合成寡核苷酸。針對完整PTX的兔抗血清是由Antibodies，Inc.(Davis，CA)生產(chǎn)的，而生產(chǎn)針對天然PTX亞基的NIAIDRockyMountainLaboratoryMonoclonal抗體是根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(KohlerandMilstein，1975，Nature256495-497;Nowinski等人，1979，Virology93111-126)進(jìn)行的。放射性碘標(biāo)記的蛋白A和兔抗鼠IgG購自NewEnglandNuclear(Wilmington，DEL)?？?S1單克隆抗體IB7(如Sato等人所述，1987，Infect.Immun.55909-915)是由日本京葉(Kelyo)NIH的H.Sato所贈送。
質(zhì)粒和菌株含有PTX操縱子的質(zhì)粒pPTX42已有過描述(見LochtandKeith，見上;以及Locht等人，見上)。表達(dá)質(zhì)粒pCFM1036，pCFM1146，pCFM1152及pCFM1156是由Amgen產(chǎn)生的。
Amgen表達(dá)載體系統(tǒng)的詳細(xì)描述見于公開的136，490號歐洲專利申請，該文引入本文作為參考文獻(xiàn)。這種質(zhì)?？珊幸粋€可誘導(dǎo)的啟動子，一個合成的核糖體結(jié)合位點，一串克隆的順序，質(zhì)粒復(fù)制原點，一個轉(zhuǎn)錄終止子，調(diào)節(jié)質(zhì)粒拷貝數(shù)的基因和卡那霉素抗性基的S1亞基預(yù)測的氨基端順序(Locht和Keith，見上)。免疫化學(xué)試驗證實此蛋白就是S1，因為在Western印跡法中，它能與鼠抗S1單克隆抗體發(fā)生反應(yīng)(圖2A右邊，rS1泳道)。
應(yīng)當(dāng)注意，S1表達(dá)細(xì)胞在1升燒杯規(guī)模下的實驗室發(fā)酵不能完全切割掉rS1的信號肽，在大腸桿菌中表達(dá)其它PTX亞基也觀察到這一現(xiàn)象(見下面)。設(shè)計了一系列實驗試圖鑒別出燒杯規(guī)模下看到的信號加工的分子障礙，這些實驗是試圖提高前蛋白切割的程度;將S1基因插入低拷貝數(shù)的表達(dá)載體中，用合成的大腸桿菌的可切割信號順序(Picker等人，1983，Infect.Immun.42269-275)置換真正的S1信號肽，用含有大腸桿菌前導(dǎo)肽酶基因的表達(dá)質(zhì)粒對亞基表達(dá)細(xì)胞進(jìn)行共轉(zhuǎn)化(Date，見上)，以提高此酶的組成水平。這些努力沒有一個對信號切割產(chǎn)生了任何顯著的改變。然而，對分批式方法的發(fā)酵條件的改變，使前S1基本上完全被加工成其成熟的形式。
使S4亞基作為成熟的甲硫氨酰多肽(見下)進(jìn)行表達(dá)的成功，促進(jìn)了對rS1也使用同樣的戰(zhàn)略。但與大腸桿菌中rS4的表達(dá)不同，成熟的甲硫氨酰S1的表達(dá)非常低，必須用Western印跡法進(jìn)行檢測。與此相反，用其真正的信號順序表達(dá)rS1產(chǎn)生加工完好的多肽，表達(dá)水平為細(xì)胞總蛋白的10-30%。正如后面所述，通過重組手段截斷rS1成熟氨基末端能夠?qū)е潞芨咚降谋磉_(dá)。事實上，通過對成熟的S1順序進(jìn)行少至最初兩個殘基的置換(用Met-Val取代Asp-Asp)也會相對于甲硫氨酰成熟S1來說使表達(dá)顯著提高。
S2、S3、S4和S5的表達(dá)作為可行性試驗，首先使因。產(chǎn)生的質(zhì)粒在若干方面相互有別。質(zhì)粒pCFM1036可從pCFM836(136，490號歐洲專利申請)產(chǎn)生，即用下述寡核苷酸AatⅡECoRⅠ5′CATCGATTCTAG3′3′TGCAGTAGCTAAGATCTTAA取代單一的AatⅡ和EcoRⅠ限制性位點之間的DNA順序(其中含有合成的PL啟動子)。該質(zhì)粒在限制片段之前不含有可誘導(dǎo)的啟動子。質(zhì)粒pCFM1146可從pCFM836產(chǎn)生，即用下述寡核苷酸ClaⅠ5′CGATTTGATT3′3′TAAACTAAGATC5′取代單一的ClaⅠ和XbaⅠ限制性位點之間的短DNA順序，并破壞掉兩個內(nèi)源的NdeⅠ限制性位點，即用T4聚合酶填充末端后進(jìn)行平頭連接。該質(zhì)粒在緊靠限制性片段之前不含有合成的核糖體結(jié)合位點。質(zhì)粒pCFM1156能從pCFM1146產(chǎn)生，即用下述寡核苷酸XbaⅠKpnⅠ5′CTAGAAGGAAGGAATAACATATGGTTAACGCGTTGGAATTCGGTAC3′3′TTCCTTCCTTATTGTATACCAATTGCGCAACCTTAAGC5′取代單一的XbaⅠ和KpnⅠ限制性位點之間的短DNA順序。質(zhì)粒pCFM1152可從pCFM1156產(chǎn)生，即用來自質(zhì)粒pCFM512(136，490號歐洲專利申請)的相應(yīng)的DNA片段取代BglⅡ至BglⅡ的DNA片段(248堿基對)，后者含根據(jù)Hunkapiller等人的方法(1983，Meth.Enzymol.91227-236)從膠帶上洗脫多肽，根據(jù)Burnette(1981，Analyt.Biochem.112195-203)所述的方法進(jìn)行Western印跡法。對完整細(xì)胞的溶解物或內(nèi)含體制劑進(jìn)行SDS-PAGE，然后用考馬斯亮藍(lán)染色，并用集成化密度儀對產(chǎn)生的膠帶掃描，從而測定重組蛋白與細(xì)胞總蛋白或總內(nèi)含體蛋白的比例。根據(jù)前人所述的方法(Katada等人，1982，Proc.Natl.Acad.Sci.USA793129-3133;Lim等人，1985，J.Biol.Chem.2602585-2588)，檢測NAD-糖水解酶和ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。根據(jù)Gillenius等人的方法(1985，J.Biol.Stand.1361-66)，用針對各種重組亞基制劑的抗血清測定CHO細(xì)胞對PTX的形態(tài)應(yīng)答的降低(Hewlett等人，1983，Infect.Immun.401198-1203)。
表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建所有質(zhì)粒都如前述從一系列大腸桿菌普遍性表達(dá)載體構(gòu)建。利用現(xiàn)有技術(shù)圖1中所示的限制性位點，分離百日咳毒素中單個亞基基因的片段;上游限制位點剛好位于帶有信號肽的亞基的表達(dá)起始密碼之內(nèi)，或剛好位于成熟的加工好的亞基的氨基末端殘基的密碼之內(nèi)，所表達(dá)出來的是甲硫氨酰-成熟形式的亞基類似物。完整的B寡聚體的共表達(dá)，在一種情況中，是使用含有S2上游非編碼區(qū)至S3末端的片段，并略去了大腸桿菌表達(dá)載體的合成的核糖體結(jié)合位點;在另一種情況中，去掉了S2上游的非編碼區(qū)，插入了合成的大腸桿菌核糖體結(jié)合位點。使用合成的寡核苷酸人工接頭，以使表達(dá)質(zhì)粒中插入的基因片段位于合成的啟動子和核糖體結(jié)合位點下游有copB啟動子并編碼部分copB基因。此質(zhì)粒比pCFM1156的拷貝數(shù)低。
質(zhì)粒pBR322，pUC18，pUC19和噬菌體M13mp18和M13mp19DNA購自BethesdaResearchLaboratories。含有大腸桿菌引導(dǎo)肽酶基因的質(zhì)粒pTD125(Dale，T.1983，J.Bacteriol.14376-83)由W.Wickner(UCLA)惠贈。大腸桿菌FM5細(xì)胞是由AmgenInc.，(ThousandOaks，CA)產(chǎn)生的，它來自C.F.Morris的大腸菌K-12菌株(Bachmann等人，1976，Bacteriol.Rev.40116-167)，并含有整合的入噬菌體校正基因CI857(Sussman等人，1962，C.R.Acad.Sci.2541517-1579)。本文中敘述了如何構(gòu)建單個亞基的表達(dá)質(zhì)粒。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis等人，1982，MolecularCloning;ALaboratoryManual，冷泉港實驗室，Ny)進(jìn)行載體生產(chǎn)、細(xì)胞轉(zhuǎn)化和集落選擇。
分析程序根據(jù)引物延伸的鏈終止法(Sanger等人，1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA745463-5467;Heidecker等人，1980，Gene1069-73)測定DNA順序。蛋白質(zhì)順序分析利用ABI470A型氣相微量測序儀根據(jù)Edman自動降解法進(jìn)行(Hewick等人，1981，J.Biol.Chem.2567990-7997;Hunkapillar等人，1983，Meth.Enzymol.91399-413)。根據(jù)Laemmli(1970，Nature，227680-685)所述的方法進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)，的最佳位置。上游的人工接頭恢復(fù)了每個基因的可譯框架，所述基因或者位于真正的起始密碼之后(在前亞基構(gòu)建物的情況下)，或位于成熟亞基氨基末端的第一密碼之后;后者的寡核苷酸包括一個甲硫氨酰起始密碼。在某些情況下，所選擇的密碼能降低所產(chǎn)生的mRNA5′末端附近的二級結(jié)構(gòu)潛力。例如，用絲氨酸密碼取代S1亞基信號區(qū)的第3位半胱氨酸密碼(Locht和Keith，見上)，以消除二硫橋的可能的有害作用。
用各種質(zhì)粒構(gòu)建體轉(zhuǎn)化大腸桿菌FM5細(xì)胞，在含有卡那霉素的瓊脂平板上培養(yǎng)，然后選擇合適數(shù)目的集落，進(jìn)行平板復(fù)制，以少量液體培養(yǎng)物生長(“微量制備物”)，再于42℃下誘導(dǎo)4小時。然后用光學(xué)顯微鏡檢查微量制備物，以篩選含有內(nèi)含體的細(xì)菌細(xì)胞。鑒別到明顯具有內(nèi)含體的制備物，使復(fù)制平板上的對應(yīng)集落在誘導(dǎo)溫度下進(jìn)行燒杯規(guī)模(1升)的實驗室發(fā)酵;某些制備物在后來用10升工業(yè)發(fā)酵罐進(jìn)行分批式發(fā)酵。在誘導(dǎo)后不同時間從發(fā)酵液中取樣，通過SDS-PAGE后用考馬斯亮藍(lán)染色及進(jìn)行Western印跡轉(zhuǎn)移，以檢查合適的PTX亞基的出現(xiàn);使印跡首先與合適的單克隆抗體反應(yīng)，通過放射性自顯影檢查，然后與多克隆抗-PTX血清反應(yīng)，進(jìn)一步進(jìn)行放射自顯影。每種表達(dá)克隆的質(zhì)粒的結(jié)構(gòu)，由分離質(zhì)粒的限制性圖譜得到證實，并由結(jié)合區(qū)的DNA順序分析得到確定。
重組S1的表達(dá)在分批式10升發(fā)酵罐中以生產(chǎn)規(guī)模于42℃下誘導(dǎo)時，含有S1表達(dá)質(zhì)粒(pPTXS1/1)的大腸桿菌細(xì)胞產(chǎn)生一種大約26，000道爾頓的主要胞內(nèi)蛋白(圖2A在左邊，rS1泳道)，在SDS-PAGE中，它與真正的PTXS1一起泳動。部分氨基酸的順序分析(5級循環(huán))確定，此多肽具有為成熟PTXS4亞基作為沒有天然前導(dǎo)肽的成熟的甲硫氨酰蛋白得到表達(dá)，并如上所述，在大腸桿菌中以高水平生產(chǎn)(圖2B左邊，rmS4泳道)。盡管相對于完整毒素制劑的S4來說，它在SDS-PAGE中的泳動稍有遲滯，但它具有預(yù)測的S4的氨基酸順序。通過HPLC從百日咳博德特氏菌純化的S4在凝膠電泳中表現(xiàn)出同樣的遲滯現(xiàn)象(Locht等人，見上)。重組S4在Western印跡中與多克隆抗血清反應(yīng)正常(圖2B右邊，rmS4泳道)，但與S4單克隆抗體的反應(yīng)性降低。
與用S1得到的結(jié)果不同，使S4帶著其天然的前導(dǎo)肽順序進(jìn)行表達(dá)時(Locht和Keith，見上)，檢測不到所產(chǎn)生的蛋白質(zhì)(末出示)。但應(yīng)當(dāng)注意，Nicosia等人(見上)預(yù)測在更上游處有一個不同的轉(zhuǎn)譯起始位點;有可能在S4的前導(dǎo)肽中使用比額外的順序會使表達(dá)水平高得多。重組S2、S3和S5都帶著其天然前導(dǎo)順序得到了表達(dá)(圖2A，分別為rS2、rS3和rS5泳道);在實驗室規(guī)模的發(fā)酵中，這些亞基中沒有一個得到了完全的加工，但在利用分批式方法的初級生產(chǎn)規(guī)模的發(fā)酵實驗中，使S2和S5的后加工得到顯著改善。還在大腸桿菌中以甲硫氨酰-成熟蛋白的形式表達(dá)了S2、S3和S5，其水平與帶有其天然前導(dǎo)肽的蛋白的表達(dá)水平差不多(圖2B，分別為rmS2、rmS3和rmS5泳道)。正如上面指出，S2、S3和S5的異源甲硫氨酸殘基通過細(xì)胞的甲硫氨酸氨基肽酶切除，以產(chǎn)生天然順序的完全成熟的多肽。
代表B寡聚體亞基(S2-S4-S5-S3)的完整的多順反子片段在PL啟動子的調(diào)控下表達(dá)。圖3說明上游非編碼區(qū)對于S2亞基生產(chǎn)的效應(yīng)。在一種情況中，表達(dá)質(zhì)粒保留有S1終止密碼和S2起始密碼之間的所有順反子間順序(Locht和Keith，見上)，但沒有在所有其他表達(dá)質(zhì)粒中所用的合成的核糖體結(jié)合位點。結(jié)果當(dāng)用抗-S2單克隆抗體進(jìn)行Western印跡檢查時，所合成的重組S2似乎得到了完全的后加工(圖3，D和E泳道);多克隆抗體的分析結(jié)果提示，其他的B寡聚體亞基也完全加工成其成熟形式，但這一結(jié)果并未給出。用合成的Shine-Delgarno順序取代非編碼的順反子間片段，導(dǎo)致rS2的合成水平大大提高(圖3，B和C泳道);但是此物質(zhì)的加工不完全。每個順反子的合成效率似乎與信使5′端的鄰近性直接相關(guān)，即S2＞S4＞S5＞S3。一個初步實驗，即將操縱子的剩余部分置于S1的高水平表達(dá)構(gòu)建體(見上)的下游，使每種亞基的合成水平非常低，加工也不完全(包括S1)。
PTX重組亞基的性質(zhì)盡管某些跡象表明，在外周胞質(zhì)使周圍空間可能存在有限量的完全加工好的rS1，但很少有(即使有的話)加工好的PTX亞基似乎是從大腸桿菌細(xì)胞中分泌出來。發(fā)現(xiàn)各種亞基的主體以內(nèi)含體的形式存在，構(gòu)成細(xì)胞總蛋白的10-30%。通過French壓力法得到的細(xì)胞溶解液經(jīng)低速離心后，產(chǎn)生的沉淀部分中的蛋白有高達(dá)65%是單個亞基。
所有的PTX亞基都能用多克隆的兔抗毒素血清通過Western印跡法檢測到(圖2)。如上指出，亞基rS1和rS2在Western印跡中能與特異的單克隆抗體正常反應(yīng)。以甲硫氨酰多肽制備的重組S4，與抗-S4單克隆抗體的反應(yīng)性降低。得不到針對亞基S3和S5的單克隆抗體，但由于rS3與S2具有密切同源的順序，因此，rS3能夠在Western印跡中用抗-S2單克隆抗體檢測出來(Locht和Keith，見上)。
使重組rS1粗制品在〔32P〕NAD存在下與由CHO細(xì)胞分離的膜保溫時，一個大約41，000道個頓的蛋白質(zhì)被ADP-核糖基化，與通過天然的完整PTX進(jìn)行的核糖基化一致;此分子被認(rèn)為是腺苷酸環(huán)化酶復(fù)合物的Ni膜調(diào)節(jié)蛋白(Bokoch等人，1983，J.Biol.Chem.2582072-2075;Hsia等人，1983，J.Biol.Chem.2591086-1090)。在進(jìn)行常規(guī)檢測時，可以使用牛轉(zhuǎn)導(dǎo)素作為核糖基酶的底物(圖4)，此分子被證實是百日咳毒素催化的由NAD進(jìn)行ADP-核糖轉(zhuǎn)移的受體(Manning等人，見上;Wost等人，見上)。此結(jié)果證實了ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性在毒素的A助催化劑(Promoter)(S1亞基)上的定位，并提示百日咳博德特氏菌重組蛋白在大腸桿菌中的折迭形式與其天然的三維結(jié)構(gòu)相近。進(jìn)一步，在A助催化劑中還鑒別到了表現(xiàn)出NAD糖水解酶活性的重組S1。用rS1的內(nèi)含體粗制品或純化的重組甲硫氨酰S4對小鼠進(jìn)行免疫及加強(qiáng)(通過腹膜內(nèi)注射)。所用的rS1亞基物質(zhì)含有完全加工的多肽和未加工的前蛋白，比例大約為1∶2;這兩種rS1分子的相對免疫原性還不了解。通過固相RIA測試血清樣品中是否有抗毒素抗體(圖5)。不管免疫劑量中是否含有完全Freund氏佐劑，接收重組S1的動物都表現(xiàn)出顯著的抗毒素應(yīng)答。僅以佐劑形式施用的重組S4，相對于加有佐劑的完整毒素褪惺鄣陌偃湛紉咼繢此狄簿哂瀉芮康拿庖咴浴 用完整的百日咳毒素處理CHO培養(yǎng)細(xì)胞導(dǎo)致“聚集的”形態(tài)學(xué)現(xiàn)象(Hewlett等人，見上)，這一現(xiàn)象所用抗毒素血清給以消除(Gellenius等人，見上)。在初步實驗中，如上述制備并具有相對較高的抗毒素抗體滴度的針對rS1或rS4的小鼠血清，并不能在常規(guī)條件下中和CHO細(xì)胞對天然毒素的應(yīng)答。
重組S1對小鼠的免疫保護(hù)用粗制的重組S1，純化的重組S4和合適的對照物質(zhì)(見上)免疫的小鼠，經(jīng)受百日咳博德特氏菌小鼠毒性株18323的腦內(nèi)攻擊，在攻擊后記錄長達(dá)45天的死亡率(圖6)。通過腹膜注射用50μg測試物質(zhì)(100μl以1∶35稀釋的市售百日咳疫苗)對小鼠免疫;接種后21天再用等量物質(zhì)給予加強(qiáng)，7天后用存活的百日咳博德特氏菌18323株(每只動物3×104個細(xì)胞)進(jìn)行腦內(nèi)攻擊。盡管沒有期望保護(hù)作用，因為在重組制劑中缺乏具有活性的全毒素，但令人驚奇地觀察到，rS1免疫的動物相對于未免疫的對照來說存活期延長了。進(jìn)一步，若干接受佐劑化rS1的小鼠完全抵抗住了攻擊;用佐劑化rS4免疫的小鼠，盡管表現(xiàn)出良好的抗體應(yīng)答(見圖5)，但得到的保護(hù)并不比未免疫的小鼠好。在另一個初步實驗中，佐劑化的rS1似乎能針對攻擊誘發(fā)劑量應(yīng)答性保護(hù)作用。在腦內(nèi)攻擊檢測中，不完全保護(hù)作用的原因可能是在免疫物質(zhì)中缺乏活性全毒素;然而，此初步研究中達(dá)到的保護(hù)作用證實，S1重組蛋白具有作為亞基疫苗物質(zhì)的潛力。后面的研究還沒有證實針對百日咳博德特氏菌小鼠毒性18323株的腦內(nèi)攻擊的免疫保護(hù)作用。
S1類似物利用蛋白質(zhì)工程和位點專一性誘變技術(shù)，制備截斷的S1類似物。發(fā)現(xiàn)以纈氨酸7和脯氨酸14為界的區(qū)域是S1分子ADP核糖基轉(zhuǎn)移酶活性的必需區(qū)域。與單克隆結(jié)合的抗原決定簇(例如，涉及誘發(fā)保護(hù)性應(yīng)答的抗原決定簇)至少有部分位于以纈氨酸7和脯氨酸14為界(包括二者)的區(qū)域之內(nèi)，所述抗體在小鼠中針對毒素活性具有被動保護(hù)作用。在以纈氨酸7和脯氨酸14為界(包括二者)的區(qū)域中使S1分子誘變，產(chǎn)生的S1類似物分子沒有酶促活性，但保留有保護(hù)性的抗原決定簇。保護(hù)性抗原決定簇對于針對百日咳毒性提供免疫保護(hù)作用是很重要的。對纈氨酸7至脯氨酸14的區(qū)域進(jìn)行修飾，包括一個或多個氨基酸的置換和/或缺失，能使S1類似物產(chǎn)品能夠誘發(fā)毒性中和水平的抗體，并基本上不含有反應(yīng)原組分。
PTXS1基因亞克隆入pUC18中含有百日咳博德特氏菌毒素(PTX)完整操縱子的質(zhì)粒pPTX42，是作為轉(zhuǎn)化的JM109細(xì)胞由J.Keith(NIAID，RockyMountainLaboratory)處得到的。使細(xì)菌培養(yǎng)在含有氨芐青霉素的L-肉湯中，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis等人，見上)回收和純化質(zhì)粒。通過用限制性酶AvaⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒，從pPTX42中分離出含有部分PTXS1基因(順反子)的792-bpDNA片段(Locht和Keith，見上)，進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳，然后從膠帶上洗脫DNA片段。此DNA片段始于剛好位于前S1蛋白可譯框架之內(nèi)的AvaⅠ位點，止于S1終止密碼處的XbaⅠ位點。還用AvaⅠ和XbaⅠ消化標(biāo)準(zhǔn)的克隆載體pUC18，用磷酯酶處理消化產(chǎn)物。利用T4DNA連接酶和標(biāo)準(zhǔn)條件，用消化的pUC18載體、pPTX42的792-bpDNA片段(AvaⅠ-XbaⅠ)進(jìn)行連接反應(yīng)。用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)DH52α細(xì)胞，在含有氨芐青霉素和“Blue-gal”(BethesdaResearchLaboratories，Gaithersburg，MD)的L-肉湯培養(yǎng)基瓊脂平板上選擇轉(zhuǎn)化體。選擇到12個白色集落，平板復(fù)制后以2ml液體培養(yǎng)物生長。細(xì)胞通過標(biāo)準(zhǔn)的堿性溶解法進(jìn)行“微量制備”，用AvaⅠ和XbaⅠ消化DNA，使消化產(chǎn)物進(jìn)行丙烯酰胺凝膠電泳。
rPTXS1表達(dá)質(zhì)粒pPTXS1/1的構(gòu)建如前述從質(zhì)粒pPTX42中分離792bp的AvaⅠ-XbaⅠ片段。大腸桿菌表達(dá)質(zhì)粒pCFM1156和pCFM1036得自CharlesF.Morris(AmgenInc.，ThousandOaks，CA)。用限制性酶SstⅠ和NdeⅠ消化質(zhì)粒pCFM1156，通過從瓊脂糖凝膠電泳洗脫至NA45濾紙(Schleicher&Schuell，Keene，N.H.)上分離到1.8Kb的DNA片段。用SstⅠ和XbaⅠ消化質(zhì)粒pCFM1036，通過同樣方法分離到2.8Kb的DNA片段。通過Caruthers等人(見上)的氨基膦化學(xué)法，合成寡聚脫氧核苷酸人工接頭的兩條互補鏈，從而重新組成S1可譯框架中的缺失部分。合成片段的順序一方面保留真正的氨基酸順序，一方面使其所用密碼本能降低信使RNA二級結(jié)構(gòu)的潛力;一個例外的情況是用絲氨酸密碼置換前蛋白信號順序中的第2位氨基酸半胱氨酸密碼，以消除前蛋白信號和成熟蛋白41和199處的兩個半胱氨酸殘基之間的任何二硫橋相互作用。此寡聚脫氧核苷酸人工接頭具有一個NdeⅠ粘性位點(用于pCFM1156)及一個AvaⅠ粘性末端(用于連接S1基因的792bpDNA片段的AvaⅠ位點)。此寡聚脫氧核苷酸的順序如下5′TATGCGTTCTAC3′3′ACGCAAGATGAGCC5′
用T4DNA連接酶和pCFM1036的2.8KbDNA片段、pCFM1156的1.8KbDNA片段，含有S1基因片段的792-bpDNA片段和寡聚脫氧核苷酸人工接頭進(jìn)行連接反應(yīng)。連接以后，用連結(jié)混合物轉(zhuǎn)化FM6細(xì)胞(得自C.F.Morris，AmgenInc.，ThousandOaks，CA)，在含有卡那霉素的L-肉湯培養(yǎng)基瓊脂平板上培養(yǎng)。選擇集落，根據(jù)堿性法(Maniatis等人，見上)進(jìn)行平板復(fù)制和微量制備。使微量制備的DNA樣品作限制性酶切圖譜，發(fā)現(xiàn)它具有所期望的DNA限制性片段。通過DNA順序分析，評價從合成的人工接頭至真正的S1基因可譯框架的區(qū)域。此質(zhì)粒經(jīng)過隨后的誘導(dǎo)導(dǎo)致S1重組蛋白的高水平表達(dá)。
rPTXS1表達(dá)質(zhì)粒pPTXS1/2的構(gòu)建通過AccⅠ和SphⅠ消化，從質(zhì)粒pPTXS1/1分離181bp的DNA片段;然后在聚丙烯酰胺凝膠上純化此DNA片段。此DNA片段位于S1基因內(nèi)部的左手部分。利用同樣的方法，從PTXS1中分離出代表該基因剩余的右手部分的564bp片段，并克隆至pUC18中。這是通過下述完成的用SphⅠ和BamHⅠ消化質(zhì)粒，BamHⅠ酶切割S1克隆位點(XbaⅠ)的下游，即位于pUC18克隆片段之內(nèi)的BamHⅠ位點。通過限制性酶NdeⅠ、SstⅠ和BamHⅠ消化，用瓊脂糖凝膠電泳分離及DNA片段的電泳洗脫，從表達(dá)載體pCFM1156中分離1.8Kb和2.8Kb的DNA片段。合成一個寡聚脫氧核苷酸人工接頭;此雙鏈人工接頭具有NdeⅠ和AccⅠ粘性末端和下述順序
5′TATGGACGATCCACCTGCTACCGT3′3′ACCTGCTAGGTGGACGATGGCATA5′利用來自pPTXS1/S的181-bp(AccⅠ-SphⅠ)和564-bp(SphⅠ-BamHⅠ)DNA片段，來自pCFM1156的1.8Kb(NdeⅠ-SstⅠ)和2.8Kb(SstⅠ-BamHⅠ)DNA片段，寡聚脫氧核苷酸人工接頭和T4DNA連接酶，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)方法(Maniatis等人，見上)進(jìn)行連接反應(yīng)。連接之后，用混合物轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)FM5細(xì)胞。得到卡那霉素抗性的轉(zhuǎn)化體，用質(zhì)粒DNA的微量制備物進(jìn)行限制性酶分析，結(jié)構(gòu)的證實是通過結(jié)合處DNA順序分析進(jìn)行的。
PPTXS1/2的Bal31消化及具有截斷S1基因的載體的構(gòu)建為了評價重要的抗原決定簇及成熟S1分子氨基末端附近的酶促活性位點，制備了此蛋白質(zhì)的截斷部分。用NdeⅠ消化表達(dá)質(zhì)粒pPTXS1/2，在標(biāo)準(zhǔn)條件下用核酸外切酶Bal31(IBI)處理，在長達(dá)110分鐘內(nèi)的不同時間取出等分試樣。在65℃下使Bal31純化15分鐘后，通過瓊脂糖凝膠電泳分析樣品中的泳動的上升。合并100分鐘和110分鐘收集的樣品(組分A)，再合并剩余的樣品并再用Bal31消化;在長達(dá)180分鐘的不同時間取出等分試樣。使反應(yīng)終止后，再次檢查等分試樣中泳動的上升，得到另外4個組分(B、C、D和E)。用SstⅠ單獨消化所有5種組分，從瓊脂糖凝膠中通過電泳洗脫分離3-3.5Kb的DNA片段。
用SstⅠ和HpaⅠ消化表達(dá)載體pCFM1156，用同樣方法分離1.8Kb的DNA片段。在標(biāo)準(zhǔn)條件下，利用T4DNA連接酶將來自pPTXS1/2的每一種3-3.5KbDNA片段(Bal31平頭-SstⅠ)與1.8Kb的DNA片段(SstⅠ-HpaⅠ)連接。用每一種連接混合物轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)FM5細(xì)胞，分離卡那霉素抗性轉(zhuǎn)化體。挑出組分A和B截斷物的轉(zhuǎn)化體，在42℃下誘導(dǎo)微量制備物，用光學(xué)顯微鏡檢查制劑中是否存在內(nèi)含體。內(nèi)含體陽性的制劑進(jìn)行微量制備，用XbaⅠ消化，通過瓊脂糖凝膠電泳檢查DNA插段的大小。選擇大小范圍在600-650bp的樣品進(jìn)行DNA順序測定，以證實截斷物的結(jié)構(gòu)。隨后對表達(dá)的重組蛋白所作分析表明，S1分子ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性和涉及誘發(fā)保護(hù)性應(yīng)答的抗原決定簇(即與單克隆抗體結(jié)合的抗原決定簇，該抗體能在小鼠中被動地抵抗毒素活性)的必需區(qū)域，位于成熟分子中以纈氨酸7和脯氨酸14(包括二者)為界的區(qū)域之內(nèi)(全氨基酸順序參見Locht和Keith，同上)。這些S1分子的截斷部分，由于載體的構(gòu)建，其氨基端都始于甲硫氨酰纈氨酰，后面則是截斷的順序。
S1的誘變?yōu)榱烁淖円岳i氨酸7和脯氨酸14為界的區(qū)域，以產(chǎn)生沒有酶活性的S1分子類似物，同時保留這一區(qū)域中的保護(hù)性抗原決定簇，使重組的S1基因進(jìn)行誘變。保護(hù)性決定簇的保留是通過與單克隆抗體1B7的反應(yīng)性定義的。這是通過用合成的寡聚脫氧核苷酸片段置換殘基纈氨酸7至脯氨酸14的真正編碼區(qū)而完成的。這些片段中含有一個或兩個密碼置換以改變真正的氨基酸順序。通過缺失和/或置換能夠進(jìn)行修飾。改變單一堿基以得到S1類似物的所需特性是在本發(fā)明范圍之內(nèi)。能夠改變單一堿基以修飾氨基酸順序。但本領(lǐng)域的專業(yè)人員將認(rèn)識到，改變單一堿基與改變至少兩個堿基相比較，基因型回復(fù)至野生型的統(tǒng)計學(xué)可能性更大。因此，在一優(yōu)選方案中，這些密碼變化中的每一個都至少涉及一個密碼中兩個堿基的置換，以降低回復(fù)的效率。合成具有AccⅠ和BspMⅡ粘性末端的寡聚脫氧核苷酸人工接頭，它們含有真正的S1順序，但具有表1所述人工接頭中指出的密碼有如下改變表1構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/5-1)密碼改變tyr8至Phe寡集脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATTCCGCTATGACTCCCGCCCG3′3′AGGCGATACTGAGGGCGGGCGGCC5′構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/4-1)密碼改變arg9至lys寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACAAGTATGACTCCCGCCCG3′3′TGTTCATACTGAGGGCGGGCGGCC5′構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/3-1)密碼改變asp11至glu寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACCGCTATGAATCCCGCCCG3′3′TGGCGATACTTAGGGCGGGCGGCC5′
表1(續(xù))構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/2-2)密碼改變Ser12至gly寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACCGCTATGACGGCCGCCCG3′3′TGGCGATACTGCCGGCGGGCGGCC5′構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/1-1)密碼改變arg13至lys寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACCGCTATGACTCCAAGCCG3′3′TGGCGATACTGAGGTTCGGCGGCC5′構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/8-1)密碼改變tyr8至leu以及arg9至glu寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATTGGAATATGACTCCCGCCCG3′3′ACCTTATACTGAGGGCGGGCGGCC5′構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/7-2)密碼改變arg9至asn以及ser12至gly寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACAACTATGACGGCCGCCCG3′3′TGTTGATACTGCCGGCGGGCGGCC5′
表1(續(xù))構(gòu)建體pPTXS1(6A-3/6-1)密碼改變asp11至Pro以及Pro14至asp寡聚脫氧核苷酸人工接頭順序5′ATACCGCTATCCGTCCCGCGAC3′3′TGGCGATAGGCAGGGCGCTGGGCC5′為了構(gòu)建表達(dá)質(zhì)粒，通過電泳洗脫從瓊脂糖凝膠中分離下述DNA片段。
1)來自pPTXS1(6A)的1824-bpDNA片段(AccⅠ至SstⅠ)，該質(zhì)粒如前述構(gòu)建，它表達(dá)重組S1的類似物分子，該分子缺失了門冬氨酸1和門冬氨酸2，并由甲硫氨酰纈氨酰所置換;
2)來自pPTXS1(33B)的3.56KbDNA片段(SstⅠ至BspMⅡ)，該質(zhì)粒如前述構(gòu)建，它表達(dá)S1的重組類似物，該類似物缺失了最初14個氨基酸殘基并以甲硫氨酰纈氨酰置換。在此特殊的基因構(gòu)建中，平頭末端連接使此前面縮短的分子中產(chǎn)生一個新的BspMⅡ位點。此限制位點不存在于天然的S1順反子元素中，使得能夠使用帶有AccⅠ和BspMⅡ粘性末端的相對較短的寡聚脫氧核苷酸人工接頭產(chǎn)生誘變。
在標(biāo)準(zhǔn)的連接條件下，使這兩個DNA片段與上述的單個的寡聚脫氧核苷酸片段連接。這些連接反應(yīng)導(dǎo)致新的S1基因的建成pPTXS1(6A)部分提供AccⅠ限制位點的上游密碼子，合成片段提供AccⅠ和BspMⅡ位點間的各種密碼突變，pPTXS1(33B)部分則提供新的限制位點BspMⅡ下游的S1編碼區(qū)的剩余部分。連接以后，用每種混合物轉(zhuǎn)化新鮮的感受態(tài)FM5細(xì)胞的分離制備物。挑出轉(zhuǎn)化體，以微量制備物生長，誘導(dǎo)產(chǎn)生重組蛋白，用光學(xué)顯微鏡鑒別內(nèi)含體陽性樣品。這些樣品在誘導(dǎo)溫度下以更大規(guī)模(1-6升)發(fā)酵，以制備更大量的各種重組類似物蛋白。細(xì)胞再懸浮于加有1mMDTT的蒸餾水中，然后分離細(xì)胞泥并用French壓力溶解。通過簡單的低速離心從這些溶解物中分離內(nèi)含體。這些內(nèi)含體蛋白制劑中含有少至30%，多至80%的重組蛋白。對每種制劑進(jìn)行分析，檢查其在Western印跡法(Burnette，見上)中與單克隆抗體B2F8結(jié)合的能力，此抗體是針對我們在研究中用截斷的S1類似物鑒別出的優(yōu)勢決定簇的，及其與單克隆抗體1B7結(jié)合的能力，此抗體已知能被動保護(hù)小鼠抵抗毒性百日咳博德特氏菌的腦內(nèi)攻擊(Sato等人，見上)。還評價樣品的ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性。所獲結(jié)果示于表2。
表225樣品抗體結(jié)合ADP-核糖基B2F81B7轉(zhuǎn)移酶活性無---PTX(市售品)+++rPTXS(pPTXS1/1)+++pPTXS1(6A-3/1-1)+++pPTXS1(6A-3/2-2)+++pPTXS1(6A-3/3-1)+++30pPTXS1(6A-3/4-1)++-pPTXS1(6A-3/5-1)+++pPTXS1(6A-3/6-1)---pPTXS1(6A-3/7-2)---pPTXS1(6A-3/8-1)---
S1類似物4-1(Arg9→Lys)很少或沒有表現(xiàn)出轉(zhuǎn)移酶活性，但保留了與中和性單克隆抗體1B7反應(yīng)的能力。只有在檢測中提高4-1蛋白的用量，才能觀察到極為少量的酶活性(圖8A);重復(fù)測定表明，S1類似物的專一性ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性被降低了至少5000倍。測量與單殘基置換突變有關(guān)的NAD-糖水解酶活性(圖8B)所揭示的圖形與評價ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶所獲相似。S1類似物4-1很少有或檢測不到糖水解酶活性，表明此活性的降低幅度至少為50至100倍。
由于重組S1的類似物分子保留有與被動保護(hù)性單克隆抗體結(jié)合的能力(即保留有主要的保護(hù)性決定簇)，并缺少毒素活性的主要標(biāo)志(即ADP-核糖基轉(zhuǎn)移酶活性)，因此，如圖7所示通過克隆的pPTXS1(6A-3/4-1)產(chǎn)生的這些類似物分子和其修飾物，能夠作為安全而經(jīng)濟(jì)的亞基疫苗加以應(yīng)用，單獨或與其它PTX亞基結(jié)合均可。通過克隆pPTX51(6A-3/4-1)產(chǎn)生的S1類似物(其中用賴氨酸置換了精氨酸9)，可用來說明具有為安全的亞基疫苗所必需的性質(zhì)的rS1類似物。6A-3/4-1的其它類似物可以包括(例如)，在位置1和2處的門冬氨酰門冬氨酰殘基，在位置0、1和2處的甲硫氨酰門冬氨酰門冬氨酰殘基，以及在位置0、1和2處的甲硫氨酰纈氨酰門冬氨酰殘基。
現(xiàn)行的非細(xì)胞疫苗含有S1、S2、S3、S4和S5亞基。最近的研究表明，百日咳毒素對培養(yǎng)的哺乳動物細(xì)胞產(chǎn)生的形態(tài)變化是S1亞基的性質(zhì)(Burns等人，1987，Infect.Immun.5524-28)，但此效應(yīng)只是在存在有B寡聚體時得到證實。此處所述的初步研究證實了這樣的可行性即使用rS1類似物的單-亞基疫苗，它保留有主要的保護(hù)性決定簇但缺乏毒素活性。S1類似物還能與亞基S2、S3、S4和S5結(jié)合應(yīng)用。這些亞基可能擴(kuò)大對于S1的免疫應(yīng)答，它們本身也可能具有保護(hù)性決定簇。含有S1亞基類似物的疫苗能夠進(jìn)一步包括博德特氏菌外毒素的至少一種所述的亞基S2、S3、S4、S5和其混合物，此疫苗也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。S2、S3、S4和S5能夠是來自百日咳博德特氏菌的亞基，或基因工程構(gòu)建的亞基和其類似物?；蚬こ虡?gòu)建的亞基產(chǎn)物能夠包括融合蛋白和非融合蛋白。
為了下面部分所述的實驗?zāi)康?，我們改變了表達(dá)系統(tǒng)以產(chǎn)生S1亞基類似物(S1/1-4)，它具有精氨酸9至賴氨酸的置換，但在其氨基末端同時具有天然的門冬氨酰門冬氨酸殘基。
S1/1-4類似物及S1/1的生物活性的評價通過包括細(xì)胞破碎、離心、脲增溶、離子交換層析和凝膠過濾層析的程序，由大腸桿菌生產(chǎn)細(xì)胞中分開分離天然順序(S1/1)和類似物S1/1-4(如上所述，含有Arg9至Lys的置換和天然順序的門冬氨酰門冬氨酸氨基末端殘基的重組S1蛋白。細(xì)胞泥懸浮于25mM Tris緩沖液中(PH8.5)，并通過高壓破碎(French壓力)溶解。使溶解液離心，不溶的沉淀(含有重組的S1蛋白)溶于8M脲、25mM Tris PH8.5中。加入濃度為50μM的CuSO4后，過夜攪動混合物，使之在重組S1蛋白中形成二硫鍵。用等體積的8M脲，25mM檸檬酸鈉PH3.8稀釋混合物，上到用8M脲(PH3.8)平衡的S-Sepharose(“快流”型)柱中。柱子用在8M脲、12.5mM檸檬酸鈉PH3.8中的Nacl線性梯度(0-0.5M)洗脫。從每個柱中收集寬峰，滴定至PH7.5。這些層析組分的收集液分別上到用2M脲、10mM磷酸鉀PH7.5平衡的SephacrylS-200柱中，收集洗脫物質(zhì)中代表每種分子(S1/1和S1/1-4)氧化單體型的重組S1蛋白的組分４炕腟1亞基蛋白通過SDS-PAGE分析，隨后對凝膠中的蛋白進(jìn)行銀染色(圖9)。使凝膠(12.5%的丙烯酰胺)在還原條件下電泳。泳道1，分子量標(biāo)準(zhǔn)(Pharmacia)。泳道2，2μg百日咳博德特氏菌全毒素(ListBiologicalLaboratories)。泳道3，0.2μg百日咳博德特氏菌S1亞基蛋白(ListBiologicalLaboratories)。泳道4，0.2μg重組的S1/1。泳道5，0.2μg重組的S1/1-4。泳道6，空白。泳道7，0.4μgS1亞基蛋白(List)。泳道8，0.4μg重組的S1/1。泳道9，0.4μg重組的S2/1-4。在此制備片段，重組S1分子的純度大于90%。
為了評價S1中Arg9→Lys突變的生物學(xué)活性，必須將突變類似物和天然順序的重組S1蛋白結(jié)合進(jìn)百日咳全毒素分子中。高度純化的百日咳毒素B寡聚體(毒素亞基S2、S3、S4和S5的五聚體結(jié)構(gòu))是由D.Burns(CenterforBiologicsEvaluationandResearch，F(xiàn)oodandDrugAdministration)提供的。通過下述方法，使兩種不同的S1亞基分子分別與B寡聚體結(jié)合以形成全毒素分子(含有S1/1或S1/1-4)。使等摩爾數(shù)量重組S1分子和B寡聚體在2M脲、10mM磷酸鉀PH7.5的溶液中結(jié)合，于37℃下保溫30分鐘。通過在自然的丙烯酰胺凝膠中的電泳評價全毒素的形成(圖10)。凝膠1，重組S1/1和天然寡聚體。凝膠2，重組S1/1-4和天然的B寡聚體。凝膠3，天然的B寡聚體。凝膠4，天然的百日咳博德特氏菌全毒素。凝膠5，重組的S1/1。膠帶表明全毒素分子是由天然B寡聚體和重組S1/1或重組S1/1-4的結(jié)合而裝配的。
然后檢查半重組全毒素(B寡聚體加工S1/1或類似物S1/1-4)體外誘發(fā)倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞的聚集應(yīng)答的能力;此應(yīng)答已表明是百日咳毒素細(xì)胞致病性的量度。將實驗樣品和合適的對照樣品稀釋至CHO細(xì)胞培養(yǎng)基中(Dulbecco改變的Eagle培養(yǎng)基，含有10%小牛血清)，通過超濾消毒，在96孔塑料培養(yǎng)皿中通過一系列轉(zhuǎn)移進(jìn)一步稀釋。在每孔中加入大約5-7×103剛用胰蛋白酶處理的CHO細(xì)胞(美國典型培養(yǎng)物收集中心CCL61，CHO-K1細(xì)胞)，培養(yǎng)皿在5%CO2中于37℃保溫48-72小時。用磷酸緩沖液洗滌細(xì)胞單層，用紫晶染色，通過光學(xué)顯微鏡檢查是否存在細(xì)胞聚集現(xiàn)象。
圖11給出了此分析的結(jié)果;特別有趣的是圖G、H和J的結(jié)果，它們與S1/1-4類似物有關(guān)。單獨用S1/1-4類似物，及稀釋1600倍的由S1/1-4類似物和B寡聚體形成的全毒素都沒有表現(xiàn)出細(xì)胞聚集，稀釋200倍時表現(xiàn)出可以忽略的聚集。圖A是僅用稀釋200倍的緩沖液處理的細(xì)胞。圖B僅用B寡聚體處理，稀釋度為1/200;此濃度下可觀察到少量聚集，可歸因于純化后殘留的天然S1亞基污染物。圖B可與同孔中的另一區(qū)域相比較(圖Ⅰ)，清楚表明B寡聚體制劑在1/200稀釋度時的聚集活性。圖C是用天然的商品級S1亞基(ListBiologicals)以1/2000稀釋度處理的細(xì)胞。圖D是以1/2000稀釋的天然的商品級百日咳全毒素(ListBiologicals)，表明百日咳毒素對于培養(yǎng)中的CHO細(xì)胞有顯著的細(xì)胞病理效應(yīng)。圖E是以1/2000稀釋的天然順序的重組S1亞基(S1/1)。圖F是1/2000稀釋的S1/1和B寡聚體的結(jié)合物;CHO細(xì)胞的聚集效應(yīng)似乎與用天然的全毒素一樣顯著，并支持表明B寡聚體和重組S1蛋白結(jié)合的全毒素的物理凝膠結(jié)果(見上)。圖G說明Arg9→Lys突變的S1/1-4本身對CHO細(xì)胞沒有效應(yīng)。圖H表明以1/1600稀釋的由S1/1-4類似物和B寡聚體形成的全毒素沒有CHO細(xì)胞聚集效應(yīng)。以1/200稀釋時(圖J)，能夠觀察到通過含有S1/1-4全毒素的某些聚集;但是，與B寡聚體本身在同樣稀釋度下的效應(yīng)(圖Ⅰ)比較，S1類似物分子對聚集效應(yīng)的貢獻(xiàn)似乎可以忽略。
已經(jīng)進(jìn)行了初步實驗，以定量確定為誘發(fā)CHO細(xì)胞聚集現(xiàn)象所需的各種百日咳毒素分子的有效濃度。初步結(jié)果表明，市售的百日咳毒素和含有重組S1/1的全毒素都能在低至0.25-0.30ng/ml的濃度下導(dǎo)致細(xì)胞聚集，與此相反，為了誘導(dǎo)聚集效應(yīng)，含有S1/1-4類似物的全毒素的必需濃度至少是10-25ng/ml。
這些結(jié)果證實，百日咳毒素的細(xì)胞毒性效應(yīng)存在于S1亞基部分，它直接與其酶促活性相關(guān)。更重要的是這些實驗表明，能夠從通過定位誘變產(chǎn)生的專一性重組毒素亞基形成相對無毒的百日咳毒素分子。
本發(fā)明應(yīng)當(dāng)包括所有這種變化和改進(jìn)，只要它們落入本發(fā)明的權(quán)利要求范圍內(nèi)。
權(quán)利要求
1.一種重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S1亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，所述部分或片段或衍生物編碼的多肽具有如下的生物活性(a)誘發(fā)毒素中和水平的抗體以及(b)不含有與毒素反應(yīng)原性結(jié)合的酶活性。
2.權(quán)利要求1的重組DNA分子，其中所述的編碼所述多肽的部分進(jìn)一步包括一個主要決定簇，已知它對于提供針對百日咳毒性的免疫保護(hù)作用是重要的。
3.權(quán)利要求1的重組DNA分子，其中所述的毒素中和水平的抗體提供針對百日咳毒性的免疫保護(hù)作用。
4.權(quán)利要求1的重組DNA分子，其中所述生物活性(b)是通過位點專一性誘變得到，該誘變導(dǎo)致基本上沒有酶活性的S1亞基類似物。
5.權(quán)利要求4的重組DNA分子，其中所述的S1亞基包括位于以纈氨酸7和脯氨酸14為界(包括二者)的區(qū)域中的S1亞基的位點專一性突變。
6.權(quán)利要求5的重組DNA分子，其中所述的位點專一性突變發(fā)生于精氨酸9位點。
7.權(quán)利要求6的重組DNA分子，其中的精氨酸9由賴氨酸取代。
8.權(quán)利要求1的重組DNA分子，其中所述的博德特氏菌外毒素從由下述組成的組中選出百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支氣管敗血性博德特氏菌。
9.一種博德特氏菌外毒素S1亞基的類似物，所述類似物具有如下的生物活性(a)能夠誘發(fā)毒素中和水平的抗體以及(b)與毒素反應(yīng)原性結(jié)合的酶活性。
10.權(quán)利要求9的類似物，其中所述的類似物進(jìn)一步包括至少一個主要決定簇，已知它對于提供針對博德特氏菌毒性的免疫保護(hù)作用是重要的。
11.權(quán)利要求9的類似物，其中所述的毒素中和水平的抗體提供針對博德特氏菌毒性的免疫保護(hù)作用。
12.權(quán)利要求9的類似物，其中所述的生物活性(b)是通過位點專一性誘變得到，該誘變使所述類似物基本上沒有酶活性。
13.權(quán)利要求12的類似物，其中所述的S1亞基包括位于以纈氨酸7和脯氨酸14為界(包括二者)的區(qū)域中的S1亞基的位點專一性突變。
14.權(quán)利要求13的類似物，其中所述的位點專一性誘變發(fā)生于精氨酸9位點。
15.權(quán)利要求14的類似物，其中的精氨酸9由賴氨酸取代。
16.權(quán)利要求9的類似物，所述的博德特氏菌外毒素從下面一組中選出百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支氣管敗血性博德特氏菌。
17.權(quán)利要求9的類似物，其中所述的氨基末端包括一個甲硫氨酰纈氨酰順序。
18.一種博德特氏菌外毒素亞基S1的類似物，所隼嗨莆鋨ㄍ 所公開的氨基酸順序。
19.一種改進(jìn)的疫苗，包括一種通過基因工程產(chǎn)生的博德特氏菌外毒素S1亞基，它具有如下生物活性(a)能夠誘發(fā)毒素中和水平的抗體和(b)不含有與毒素反應(yīng)原性結(jié)合的酶活性。
20.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的亞基S1至少包括一個提供針對博德特氏菌毒性的免疫保護(hù)作用的主要決定簇。
21.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的毒素中和水平的抗體提供針對博德特氏菌毒性的免疫保護(hù)作用。
22.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的生物活性(b)是通過位點專一性誘變得到，該誘變使亞基S1的類似物基本上沒有酶活性。
23.權(quán)利要求22的改進(jìn)疫苗，其中所述的位點專一性誘變發(fā)生于以纈氨酸7和脯氨酸14為界(包括二者)的區(qū)域內(nèi)。
24.權(quán)利要求23的改進(jìn)疫苗，其中所述的位點專一性誘變發(fā)生于精氨酸9位點。
25.權(quán)利要求24的改進(jìn)疫苗，其中的精氨酸9由賴氨酸所取代。
26.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的博德特氏菌外毒素從由下述構(gòu)成的組中選出百日咳博德特氏菌、副百日咳博德特氏菌和支氣管敗血性博德特氏菌。
27.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，它至少包括所述的博德特氏菌外毒素亞基S2、S3、S4和S5，及其混合物中的一種。
28.權(quán)利要求25的改進(jìn)疫苗，其中所述博德特氏菌外毒素中的亞基S2、S3、S4和S5，及其混合物中至少有一種是通過基因工程得到的。
29.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的由基因工程產(chǎn)生的亞基S2、S3、S4和S5是在重組宿主中以非融合蛋白表達(dá)的，所述宿主由下述構(gòu)成的組中選出大腸桿菌、啤酒酵母、鼠傷寒沙門氏菌、傷寒沙門氏菌、芽孢桿菌及牛痘病毒。
30.權(quán)利要求19的改進(jìn)疫苗，其中所述的由基因工程得到的亞基S2、S3、S4和S5包括亞基S2、S3、S4和S5的類似物，它們保留有誘發(fā)毒素中和水平抗體的能力。
31.一種重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S2亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，該片段或衍生物編碼亞基S2的甲硫氨酸-成熟類似物的多肽。
32.一個重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S3亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，該片段或衍生物編碼亞基S3的甲硫氨酸-成熟類似物的多肽。
33.一個重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S4亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，該片段或衍生物編碼亞基S4的甲硫氨酸-成熟類似物的多肽。
34.一個重組DNA分子，它至少包括一個編碼博德特氏菌外毒素S5亞基的部分，或所述部分的一個片段或衍生物，其中，該片段或衍生物編碼亞基S5的甲硫氨酸-成熟類似物的多肽。
全文摘要
通過DNA重組技術(shù)產(chǎn)生的博德特氏菌外毒素多個和單個亞基類似物提供的疫苗產(chǎn)品保留了其生物活性，具有高度的免疫原性，能夠提供針對疫病攻擊的保護(hù)作用。通過基因工程產(chǎn)生的亞基變化能夠?qū)е逻@樣的產(chǎn)物；它們保留了免疫原性，但不含有與毒素反應(yīng)原性結(jié)合的酶活性。
文檔編號C12P21/00GK1033072SQ8810705
公開日1989年5月24日 申請日期1988年9月5日 優(yōu)先權(quán)日1987年9月4日
發(fā)明者沃爾特·尼爾·伯內(nèi)特 申請人:安姆根有限公司