專利名稱：一種博德特菌株及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域。具體的說，本發(fā)明涉及一株具有環(huán)氧琥珀酸水解酶的菌株， 該酶能水解環(huán)氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸。本發(fā)明可用于生物轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)D(-)-酒石酸。
背景技術(shù)：
像L(+)-酒石酸有很多重要用途一樣，D(-)-酒石酸在食品、醫(yī)藥、化工和輕工業(yè)上都 有不可替代的作用，D(-)-酒石酸有著比檸檬酸更強(qiáng)的酸味，因此可以用作食品酸味劑，也 可以用作穩(wěn)定劑和防腐劑。左旋的光學(xué)活性使得D(-)-酒石酸可在制藥工業(yè)和輕工業(yè)行業(yè) 中，充當(dāng)手性拆分劑，目前已有很多這方面的報(bào)道。
L(+)-酒石酸的生產(chǎn)方法己經(jīng)研究的相當(dāng)透徹，利用生物轉(zhuǎn)化生產(chǎn)L(+)-酒石酸的技術(shù) 也已經(jīng)非常成熟，大規(guī)模的工業(yè)化生產(chǎn)已成為現(xiàn)實(shí)。而關(guān)于D(-)-酒石酸生產(chǎn)方法的研究 卻很少見報(bào)道，用化學(xué)拆分的方法拆分消旋的酒石酸可以得到L(+)-酒石酸和D(-)-酒石酸， 但此方法操作困難，成本也高。生物轉(zhuǎn)化不失為一種能源節(jié)約、環(huán)境友好的方法，目前發(fā) 現(xiàn)的可以用生物轉(zhuǎn)化的方法生產(chǎn)D(-)-酒石酸的微生物僅有兩種，分別為Pw^fom朋^ pwf^a禾B 4/ca"ge"es sp.。 1996年，日本學(xué)者Yamagishi等從自然界中分離到一株可以轉(zhuǎn) 化順式環(huán)氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸的菌株，對其生理生化特性的鑒定結(jié)果顯示此菌為 Pseudomonas putida。 2000年，日本學(xué)者Ikuta等又分離到一株產(chǎn)D(-)-酒石酸的菌株，經(jīng) 過對其培養(yǎng)特性、生理生化特性、分類學(xué)特性進(jìn)行鑒定和對16SrRNA的分析，認(rèn)為此菌 是產(chǎn)堿桿菌"/cfl/z'ge"^), Asai等將^fca/^e"" w.內(nèi)的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶用硫酸銨 分級沉淀并以各種層析柱進(jìn)行純化，得到了分子量大小為80KDa的純酶，此酶由分子量 大小分別為40和35 Da的兩個(gè)亞基組成。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種博德特菌株，該菌株能用于水解順式環(huán)氧琥珀 酸從而生成D(-)-酒石酸。
為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供一種博德特菌株，該博德特菌(5oW"e/tosp.)菌株，保藏名稱為博德特菌1-3，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生
物中心，保藏日期2008年12月1日，保藏號CGMCC2779。
作為本發(fā)明的博德特菌株的改進(jìn)該菌體為直桿狀，大小為0.5Xl.2um，革蘭氏染 色呈陰性，無特殊結(jié)構(gòu)，不能運(yùn)動(dòng)，無鞭毛；好氧生長，過氧化氫酶反應(yīng)陽性，血平板上 生長時(shí)不形成溶血圈；可在質(zhì)量濃度為4。/。的NaCl溶液中生長；生長pH范圍5 10，生長溫 度20 40。C。
作為本發(fā)明的博德特菌株的進(jìn)一步改進(jìn)該菌體生長pH7.0;生長溫度3(TC。
本發(fā)明還同時(shí)提供了上述博德特菌株的用途水解順式環(huán)氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸。
作為本發(fā)明的博德特菌株的用途的改進(jìn)將博德特菌制成固化后的膠狀顆粒，按照
每10g博德特菌轉(zhuǎn)化0. 1 1.0 mol順式環(huán)氧琥珀酸鹽的比例，將所述膠狀顆粒加入順式環(huán) 氧琥珀酸鹽溶液中，于0 5(TC的溫度在搖床上進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 450小時(shí)；經(jīng) 分離處理后，得D(-)-酒石酸。
本發(fā)明首先從自然界中篩選得到能降解環(huán)氧琥珀酸的微生物，之后對其轉(zhuǎn)化產(chǎn)物進(jìn)行 分析，篩選到能轉(zhuǎn)化D(-)-酒石酸的菌株，用于生物法生產(chǎn)D(-)-酒石酸。具體地說本發(fā) 明通過富集及篩選分離得到能轉(zhuǎn)化環(huán)氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸的菌株，之后對其產(chǎn)生的 環(huán)氧琥珀酸水解酶進(jìn)行確認(rèn)；并利用誘導(dǎo)培養(yǎng)的方法對該菌的環(huán)氧琥珀酸水解酶進(jìn)行誘 導(dǎo)，以提高酶的活性；之后將收集的微生物細(xì)胞通過各種固定化方法制成固定化細(xì)胞并用 于D(-)-酒石酸的生產(chǎn)。采用本發(fā)明的方法能環(huán)氧琥珀酸在溫和的催化條件下轉(zhuǎn)化為D(-)-酒石酸。


下面結(jié)合附圖對本發(fā)明的具體實(shí)施方式
作進(jìn)一步詳細(xì)說明。
圖1是搖瓶中菌株1-3的生長及產(chǎn)酶情況圖1中 酶活、生長量；
圖2是固定化細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)酒石酸的曲線圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例l、產(chǎn)D(-)-酒石酸菌株的篩選
1)、取1.0g寧波郊區(qū)土壤接種于20ml的細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(細(xì)菌篩選培養(yǎng)基D(-)_ 酒石酸，10.0 g;酵母粉，1.0 g; MgS04*7H20， 0.5 g; KH2P04， 0.5 g; K2HP04*3H20，2.0g;加水至1000ml; pH7.0。)中，于30。C揺床振蕩(搖床轉(zhuǎn)速120rpm)培養(yǎng)，培養(yǎng) 時(shí)間為三天；得初次培養(yǎng)液。
2) 、取步驟1)所得的0. 2ml初次培養(yǎng)液接種于10ml細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(同步驟1)的 細(xì)菌篩選培養(yǎng)基)上繼續(xù)培養(yǎng)，于3(TC揺床振蕩(搖床轉(zhuǎn)速120rpm)培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間為 三天；得培養(yǎng)液。
3) 、將所得的培養(yǎng)液按照上述步驟2)的培養(yǎng)條件再重復(fù)培養(yǎng)2次；得富集培養(yǎng)物。
4) 、用接種環(huán)蘸取一環(huán)步驟3)所得的富集培養(yǎng)物，于細(xì)菌篩選培養(yǎng)基(同步驟l) 的細(xì)菌篩選培養(yǎng)基)的平板上劃線分離，待菌落形成后，挑取單個(gè)菌落進(jìn)一步在平板上劃 線純化，然后將純化的菌株接種到基礎(chǔ)培養(yǎng)基(順式環(huán)氧琥珀酸，10.0g;酵母粉，10.0g; MgS(WH20, 0.5 g; KH2P04， 0.5 g; K2HP04'3H20， 2.0 g;加水至1000ml; pH 7.0)斜面 4度保存。
5) 、上述富集分離的菌株經(jīng)酶活鑒定后，得到一株菌株1-3，顯示了催化順式環(huán)氧琥 珀酸生成D (-)-酒石酸的活性。
菌株1-3菌體為直桿狀，大小為0.5X1.2um，革蘭氏染色呈陰性，無特殊結(jié)構(gòu)，不 能運(yùn)動(dòng)，電鏡觀察無鞭毛。在基礎(chǔ)培養(yǎng)基上生長時(shí)需2天才能形成菌落，菌落呈圓形，表 面凸起、光滑、半透明，邊緣整齊。
菌株1-3生理生化特征如下在厭氧條件下不能生長，過氧化氫酶反應(yīng)為陽性，血平 板上生長時(shí)不形成溶血圈。可在質(zhì)量濃度為4%的NaCl溶液中生長；生長的pH范圍為 5-10，最適生長pH為7;菌株1-3可以在20-4(TC的溫度范圍內(nèi)生長，最適生長溫度為 30°C 。菌株1-3的DNA的Tm值約為80. 1 ，由此得到其的DNA G+C含量約為64mol % 。
Biolog鑒定系統(tǒng)測定了菌株1-3利用96種碳源的情況，與數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對的結(jié)果顯 示該菌株與博德特屬的相似性最高。
再以16SrDNA為指標(biāo)進(jìn)行鑒定。結(jié)果表明，1-3菌株與屬的多個(gè)菌種的序 列相似性為97%以上。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹分析，該菌株與^mfe"/to中各種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 很相近，尤其與^rafe^/a a似w戸7同源性較高。故該菌在發(fā)育地位上應(yīng)屬于A W&〃fl。 將該博德特菌(SoWe^Z/a sp.)菌株進(jìn)行保藏，保藏名稱為博德特菌1-3，保藏單
位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，地址是北京市朝陽區(qū)大屯路中
國科學(xué)院微生物研究所，保藏日期2008年12月1日，保藏號CGMCC2779。實(shí)施例2、微生物的產(chǎn)酶發(fā)酵
配制如下的培養(yǎng)基酵母膏7.8g，順式環(huán)氧琥珀酸9.8g， KH2P04 1.12g， K2HP(V3H20 3g， MgS04'7H20 0.625g，加水至1000ml， pH 7.0。裝液體積為75ml/500ml，用此培養(yǎng)基 培養(yǎng)菌株l-3，培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速120rpm， 3(TC培養(yǎng)48 h 。菌株的生長情況及產(chǎn)酶 情況如圖l所示，在培養(yǎng)過程中，前30h菌株的生物量迅速增加，之后趨于穩(wěn)定。菌株的 產(chǎn)酶在前30h時(shí)也逐漸升高，至1」3011時(shí)最高達(dá)9.271;/1111，之后，產(chǎn)酶有所回落，并趨于穩(wěn) 定。該酶為單亞基蛋白，其分子量33 OOODa，活性中心含有 Zi^離子，N端氨基酸序 列為MTRTKLIL。
實(shí)施例3、
1、細(xì)胞固定化及生物轉(zhuǎn)化
將實(shí)施例2所得的發(fā)酵產(chǎn)物離心收集菌體，離心條件為5000r卿，30分鐘。將10g 離心后所得的菌體和10ml蒸餾水混勻后于37'C水浴鍋中保溫，再配制質(zhì)量濃度2. 5%的 卡拉膠溶液80ml并降溫至37°C;然后將二者混勻滴入到400 ml質(zhì)量濃度2%KC1溶液中， 邊滴邊攪拌，顆粒形成后再放置兩個(gè)小時(shí)，即得到固定化好的膠狀顆粒。
經(jīng)過細(xì)胞固定化后，得到大約lOOg的膠體顆粒，直徑約3.5mm，乳白色半透明狀態(tài)。 將其加入lM的順式環(huán)氧琥珀酸鈉400ml中，于30'C的搖床(搖床轉(zhuǎn)速120rpm)上進(jìn)行 生物轉(zhuǎn)化，并定時(shí)測定溶液中酒石酸的濃度。在前10天內(nèi)，轉(zhuǎn)化液中酒石酸的量隨著時(shí) 間的延長緩慢增加，從11天以后，則趨于穩(wěn)定。轉(zhuǎn)化18天后結(jié)束，最終的轉(zhuǎn)化效率約為 69%。圖2為生物轉(zhuǎn)化的曲線。
向轉(zhuǎn)化后的溶液中加入過量的CaCl2，形成大量的酒石酸鈣沉淀后，將沉淀用蒸餾水 洗滌，之后加硫酸溶液，使懸濁液的pH達(dá)到1.5，然后將此懸濁液于85'C水浴兩個(gè)小時(shí) 使酒石酸鈣充分轉(zhuǎn)化成酒石酸。反應(yīng)完成后，離心去掉沉淀，并將上清用陰離子交換柱進(jìn) 行分離(洗脫液為1.0 mo1/1 HC1)，即得酒石酸溶液，蒸發(fā)除去溶液中的水份后，便得到 酒石酸的晶體。晶體形狀與標(biāo)準(zhǔn)D(-)-酒石酸一致。將其與標(biāo)準(zhǔn)D(-)-酒石酸一起用紅外光 譜、核磁共振及旋光度進(jìn)行分析之后，發(fā)現(xiàn)二者的圖譜具有極高度的相似性，故可以斷定， 轉(zhuǎn)化產(chǎn)物為D(-)-酒石酸。
以不同濃度的順式環(huán)氧琥珀酸為底物，于37'C測定酶活力。以Lineweaver-Burk作圖 法求得順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的米氏常數(shù)Km值為1Ommol/L。根據(jù)所測定得的順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的比活和分子量，計(jì)算出該酶的kcat約為5/s。
此外，以純化后的酶進(jìn)行測定，該順式環(huán)氧琥珀酸水解酶的N端氨基酸序列為MetThr
Arg Thr Lys Leu lie Leu。
最后，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發(fā)明的若干個(gè)具體實(shí)施例。顯然，本發(fā)明 不限于以上實(shí)施例，還可以有許多變形。本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員能從本發(fā)明公開的內(nèi)容直 接導(dǎo)出或聯(lián)想到的所有變形，均應(yīng)認(rèn)為是本發(fā)明的保護(hù)范圍。序列表
SEQIDNO: 1
Met Thr Arg Thr Lys Leu lie Leu 1 權(quán)利要求
1、一種博德特菌株，其特征是該博德特菌(Bordetella sp.)菌株保藏名稱為博德特菌1-3，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2008年12月1日，保藏號CGMCC 2779。
2、 根據(jù)權(quán)利要求l所述的博德特菌株，其特征是該菌體為直桿狀，大小為0.5X1.2 um，革蘭氏染色呈陰性，無特殊結(jié)構(gòu)，不能運(yùn)動(dòng)，無鞭毛；好氧生長，過氧化氫酶反應(yīng)陽性， 血平板上生長時(shí)不形成溶血圈；可在質(zhì)量濃度為4X的NaCl溶液中生長；生長pH范圍5 10， 生長溫度20 4(TC。
3、 根據(jù)權(quán)利要求2所述的博德特菌株，其特征是該菌體生長pH7.0;生長溫度3(TC。
4、 如權(quán)利要求l、 2或3所述的博德特菌株的用途，其特征是水解順式環(huán)氧琥珀酸生成 D(-)-酒石酸。
5、 根據(jù)權(quán)利要求4所述的博德特菌株的用途，其特征是將博德特菌制成固化后的膠狀 顆粒，按照每10g博德特菌轉(zhuǎn)化0. 1 1.0mol順式環(huán)氧琥珀酸鹽的比例，將所述膠狀顆粒加入 順式環(huán)氧琥珀酸鹽溶液中，于0 50'C的溫度在搖床上進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間24 450小時(shí)； 經(jīng)分離處理后，得D(-)-酒石酸。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種博德特菌株，該博德特菌(Bordetella sp.)菌株保藏名稱為博德特菌1-3，保藏單位中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心，保藏日期2008年12月1日，保藏號CGMCC 2779。該菌株能水解順式環(huán)氧琥珀酸生成D(-)-酒石酸，具體方法如下將博德特菌制成固化后的膠狀顆粒，然后將膠狀顆粒加入順式環(huán)氧琥珀酸鹽溶液中，于0～50℃的溫度在搖床上進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化時(shí)間24～450小時(shí)；經(jīng)分離處理后，得D(-)-酒石酸。
文檔編號C12N1/20GK101654663SQ200910096938
公開日2010年2月24日 申請日期2009年3月24日 優(yōu)先權(quán)日2009年3月24日
發(fā)明者盧紅波, 雷 開, 霞 李, 磊 王, 郭康平, 馬曉航 申請人:浙江大學(xué)