專利名稱:一種具有抑菌活性的桑葉酚酸提取物制備方法和應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及桑葉提取物，具體的說，涉及一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物，本發(fā)明還涉及該桑葉酚酸提取物的制備工藝和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
我國桑樹資源極為豐富，桑葉被國家衛(wèi)生部列入“既是食品又是藥品的物品”名單，它不僅是廣東涼茶飲料的核心原料之一，也是中醫(yī)臨床廣泛使用的清熱解毒類中藥。研究發(fā)現(xiàn)桑葉中含有較豐富的酚酸類物質(zhì)，包括綠原酸、沒食子酸、香草酸、咖啡酸、安息香酸、黃芪苷、蘆丁、兒茶素、丁香酸、龍膽酸、表兒茶素、鄰苯二酚、愈創(chuàng)木酚、槲皮素、山奈素等，從桑葉中提取的桑葉酚酸類物質(zhì)，具有優(yōu)良的抗氧化、消炎殺菌、抗病毒、降血糖、降血月旨、降血壓、護(hù)肝抗癌等多種藥理活性。
有關(guān)桑葉提取物及其應(yīng)用于植物飲料的報(bào)道和專利已有不少，但通過文獻(xiàn)查詢，從桑葉中提取具有抑菌效果提取物的專利較少，公開號(hào)為102144643A的中國專利公開了“一種具有防腐功能的桑葉提取物及其應(yīng)用”，該專利涉及桑葉在一定條件下經(jīng)水提取、溶劑處理等步驟得到具有防腐功能的桑葉提取物及其在化妝品、食品中的應(yīng)用。公開號(hào)為101803781A的中國專利公開了“一種含中藥提取物的飲料”，該專利涉及一種含有桑葉提取物等的飲料。上述方法中，植物飲料的加工主要是通過中性水高溫浸提、高溫濃縮來完成的，植物的抑菌有效成分不僅提取不充分，而且在經(jīng)歷長時(shí)間的高溫之后破壞嚴(yán)重，植物中的功能活性成分損失較大，由此種常規(guī)工藝制成的植物飲料功能活性成分含量低，抑菌有效成分較少，功效較差，難以真正達(dá)到清熱解暑的功效。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物，該桑葉酚酸提取物中酚酸類有效成分含量高，且活性高。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供上述桑葉酚酸提取物的制備方法。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供上述桑葉酚酸提取物的應(yīng)用。
本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供一種含有上述桑葉酚酸提取物的植物飲料混合浸膏。
本發(fā)明的第一個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物，由以下方法制備而得
(1)提取取干燥桑葉粉和5(T70%酸性乙醇溶液按I:l(Tl: 20 (W/V)混合，超聲處理0. 5^1 min，然后45 1恒溫浸提4飛小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2 3次，合并提取液，過濾，4(T50°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液；
(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2.01.0，濃度為3.(T5.0mg/mL，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析；
(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2.(T4. 0的5(T70%酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(4)濃縮濃縮洗脫液，即得桑葉酚酸提取物浸膏。
本發(fā)明所述步驟 (2)中的濃度是指桑葉酚酸粗提液中的可溶性固形物的濃度。
本發(fā)明的第二個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，包括以下步驟
(1)提取取干燥桑葉粉和5(T70%酸性乙醇溶液按I:l(Tl: 20 (W/V)混合，超聲處理0. 5^1 min，然后45 1恒溫浸提4飛小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2 3次，合并提取液，過濾，4(T50°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液；
(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2.01.0，濃度為3.(T5.0mg/mL，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析；
(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2.(T4. 0的5(T70%酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；
(4)濃縮濃縮洗脫液，即得桑葉酚酸提取物浸膏。
本發(fā)明所述步驟(2)中的濃度是指桑葉酚酸粗提液中的可溶性固形物的濃度。
本發(fā)明所述步驟(I) 5(T70%酸性乙醇溶液的pH為2.0'4.0。由于本發(fā)明涉及食品技術(shù)領(lǐng)域：
，因此酸性乙醇溶液的PH值采用食用醋酸進(jìn)行調(diào)節(jié)。
本發(fā)明所述步驟(2)中，加入大孔吸附樹脂柱中的桑葉酚酸粗提液的體積為
5.(T7. 0柱體積，吸附流速為3. 5^5. 5柱體積/h。
本發(fā)明所述步驟(3)中，洗脫速率為2. (T3. 0柱體積/h，洗脫液的體積為3. (T4. 0柱體積。
本發(fā)明所述步驟(4)中，所述洗脫液在4(T50°C下減壓濃縮。
本發(fā)明所述步驟(4)中，所述桑葉酚酸提取物浸膏的相對(duì)密度為I. 2^1. 3g/cm3。
本發(fā)明的第二個(gè)目的提供的桑葉酚酸提取物新應(yīng)用是指桑葉酚酸提取物在植物飲料中的應(yīng)用。
本發(fā)明的第三個(gè)目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)一種含有上述桑葉酚酸提取物的植物飲料混合浸膏，包括以下質(zhì)量百分比含量的組分
桑葉酚酸浸膏50% 70%，菊花浸膏10% 30%，金銀花浸膏5% 15%，甘草浸膏5% 15%。
本發(fā)明所述的菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏采用常規(guī)的方法制備即可。但是為了提高菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏中有效成分的含量及其活性，以進(jìn)一步加強(qiáng)植物飲料的功能性，所述的菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏均采用上述桑葉酚酸提取物的制備方法相同進(jìn)行制備。
本發(fā)明所述的植物飲料混合浸膏加入純凈水、白砂糖、檸檬酸及AK糖調(diào)配，經(jīng)硅藻土過濾、脫氣、UHT殺菌后PP瓶灌裝，即得到具有清涼解渴、消炎殺菌和能促進(jìn)人體健康的植物飲料。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下有益效果
(I)本發(fā)明制備工藝簡單，采用低溫提取得到桑葉酚酸粗提取物，然后再用大孔吸附樹脂柱層析進(jìn)行純化，最大限度地保留了提取物的抑菌活性，獲得含有高純度桑葉酚酸的桑葉酚酸提取物，通過大孔吸附樹脂對(duì)桑葉酚酸的富集和純化，桑葉酚酸的純度為88. 41%，具有明顯的抗炎抑菌效果，而用常規(guī)熱水浸提方法提取的桑葉酚酸的純度只有10.75%。且在提取過程中避免了使用有機(jī)溶劑，不會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)品中有機(jī)溶劑殘留。因此，可用于開發(fā)具有抑菌活性的植物飲料的生產(chǎn)，不僅可以發(fā)揮清熱解毒的功能，還可減少中性飲料中防腐劑的添加量。
(2)本發(fā)明采用pH為2. (T4. 0的50 70%酸性乙醇溶液作溶劑和洗脫液，可將其中的大部分酚酸類化合物提取出來，使得酚酸類有效成分的提取及洗脫更加充分。
(3)本發(fā)明的桑葉酚酸浸膏的提取和濃縮均控制在4(T50°C的低溫進(jìn)行，相比傳統(tǒng)的高溫提取和濃縮工藝更有利用保證酚酸類有效成分的活性。
(4)本發(fā)明先以超聲波短時(shí)預(yù)處理破壞桑葉組織細(xì)胞，酚酸類有效成分更易溶出，使低溫浸提的時(shí)間大大縮短。
(5)桑葉、菊花、金銀花和甘草均為具有抑菌活性的植物原料，其主要抑菌活性成分為酚酸類化合物，它們的結(jié)合可以增強(qiáng)抑菌的活性。
具體實(shí)施方式
以下實(shí)施例僅用于闡述本發(fā)明，而本發(fā)明的保護(hù)范圍并非僅僅局限于以下實(shí)施例，所述技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)以上本發(fā)明公開的內(nèi)容，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。
實(shí)施例I
桑葉酚酸提取物浸膏的制備
(I)提取取干燥桑葉粉和PH為2.0的50%酸性乙醇溶液按I : 10(W/V)混合，超聲處理0. 5min，然后45 1恒溫浸提6小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取3次，合并提取液，過濾，40°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液。
(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2. (T4.0，濃度為3.0 mg/mL，進(jìn)行HPD-750型大孔吸附樹脂柱層析，加入大孔吸附樹脂柱中的桑葉酚酸粗提液的體積為5. 0個(gè)柱體積，吸附流速為3. 5柱體積/h。
(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2. (T-4. 0的50%的酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速率為2柱體積/h，洗脫液的體積為3柱體積，收集洗脫液。
(4)濃縮洗脫液在45飛(TC下減壓濃縮相對(duì)密度為I. 2^1. 3g/cm3,即得桑葉酚酸提取物浸膏，桑葉酚酸的純度為85. 46%。
分別以菊花、金銀花和甘草為原料，采用桑葉酚酸提取物浸膏的制備方法來制備菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏，所涉及的條件均與制備桑葉酚酸提取物浸膏的條件相同。
將50%桑葉酚酸提取物浸膏、30%菊花浸膏、10%金銀花浸膏和10%甘草浸膏混合的混合浸膏，再將混合浸膏以5:95的比例溶于水中，過濾澄清，再加入約3%的白砂糖，
0.012%的AK糖及0. 02%的檸檬酸，UHT殺菌，PP瓶灌裝。
實(shí)施例2
桑葉酚酸提取物浸膏的制備
(I)提取取干燥桑葉粉和pH為3. 0的60%酸性乙醇溶液按I : 15 (W/V)混合，超聲處理0. 8min,然后45°C恒溫浸提5小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取3次，合并提取液，過濾，45°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液。
(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酹酸粗提液pH值為2. (T4. 0,濃度為4. 0 mg/mL,進(jìn)行HPD-750型大孔吸附樹脂柱層析，加入孔吸附樹脂柱中的桑葉酚酸粗提液的體積為6. 0個(gè)柱體積，吸附流速為4. 5柱體積/h。
(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2. (T-4. 0的60%的酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速率為2. 5柱體積/h，洗脫液的體積為3. 5柱體積，收集洗脫液。
(4)濃縮洗脫液在45飛(TC下減壓濃縮相對(duì)密度為I. 2-1. 3g/cm3,即得桑葉酚酸提取物浸膏，桑葉酚酸的純度為8 1. 93%。
分別以菊花、金銀花和甘草為原料，采用桑葉酚酸提取物浸膏的制備方法來制備菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏，所涉及的條件均與制備桑葉酚酸提取物浸膏的條件相同。
將60%桑葉酚酸提取物浸膏、20%菊花浸膏、5%金銀花浸膏和15%甘草浸膏混合的混合浸膏，再將混合浸膏以5:95的比例溶于水中，過濾澄清，再加入約3%的白砂糖，0. 012%的AK糖及0. 02%的檸檬酸，UHT殺菌，PP瓶灌裝。
實(shí)施例3
桑葉酚酸提取物浸膏的制備
(I)提取取干燥桑葉粉和pH為4. 0的70%酸性乙醇溶液按I : 20 (W/V)混合，超聲處理I. Omin,然后45°C恒溫浸提4小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2次，合并提取液，過濾，50°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液。
(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酹酸粗提液pH值為2. (T4. 0,濃度為5. 0 mg/mL,進(jìn)行HPD-750型大孔吸附樹脂柱層析，加入孔吸附樹脂柱中的桑葉酚酸粗提液的體積為7. 0個(gè)柱體積，吸附流速為5. 5柱體積/h。
(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2. 0'4. 0的70%的酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，洗脫速率為2. 5柱體積/h，洗脫液的體積為3. 5柱體積，收集洗脫液。
(4)濃縮洗脫液在45飛(TC下減壓濃縮相對(duì)密度為I. 2^1. 3g/cm3,即得桑葉酚酸提取物浸膏，桑葉酚酸的純度為90. 17%。
分別以菊花、金銀花和甘草為原料，采用桑葉酚酸提取物浸膏的制備方法來制備菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏，所涉及的條件均與制備桑葉酚酸提取物浸膏的條件相同。
將70%桑葉酚酸提取物浸膏、10%菊花浸膏、15%金銀花浸膏和5%甘草浸膏混合的混合浸膏，再將混合浸膏以5:95的比例溶于水中，過濾澄清，再加入約3%的白砂糖，0. 012%的AK糖及0. 02%的檸檬酸，UHT殺菌，PP瓶灌裝。
實(shí)驗(yàn)例
抑菌試驗(yàn)
許多抗菌植物中都含有具抑菌活性的酚酸類化合物，桑葉、菊花、金銀花和甘草作為傳統(tǒng)中藥，也富含多種酚酸類化合物，提取純化后的酚酸類物質(zhì)具有明顯的抑菌及殺菌作用。
試驗(yàn)材料
I.樣品本抑菌試驗(yàn)的桑葉酚酸提取物和混合浸膏樣品由實(shí)施例I制備。
2.供試菌種
革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌。
革蘭氏陰性菌大腸桿菌、沙門氏菌。
3.試劑營養(yǎng)瓊脂；營養(yǎng)肉湯；二甲基亞砜(DMSO)。[0050]4.器材HZQ-QX型全溫振蕩器、超凈工作臺(tái)、蒸汽壓力滅菌器、EYELA N-1001旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、FA2004N賽多利斯精密電子天平、PHS-3C精密pH計(jì)、游標(biāo)卡尺、DragonMed手動(dòng)單道可調(diào)式移液器、DHG-9240A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱、漩渦混合器。
試驗(yàn)方法
I.菌懸液的制備將供試菌株接種于平板上培養(yǎng)后，分離典型單菌落接種于液體培養(yǎng)基中，搖床培養(yǎng)作為實(shí)驗(yàn)菌液備用。將菌液用無菌水進(jìn)行10倍順序稀釋為106cfu/mL。
2.平板抑菌試驗(yàn)在樣品中加入適量的二甲基亞砜溶解樣品，然后用蒸餾水稀釋為20. O mg/mL，空白對(duì)照(CK)用相應(yīng)的二甲基亞砜和蒸餾水。將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌接種在表面涂有菌懸液的營養(yǎng)瓊脂平板上，然后用直徑6 _的瓊脂打孔器均勻打孔，去除孔內(nèi)瓊脂并適當(dāng)封閉孔底，每板4孔。將相同量的供試藥液加于孔中，以滿而不溢為宜并作好標(biāo)記，然后置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，準(zhǔn)確測(cè)定抑菌 圈直徑，每種細(xì)菌作3個(gè)平行樣本。
3.最低抑菌濃度(MIC)測(cè)定
采用試管稀釋法，在樣品中加入適量的二甲基亞砜，然后用固體培養(yǎng)基梯度稀釋為20. 0、10· 0、5· 0、2· 5、1· 3、0· 6、0· 3mg/mL,將金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌接種在營養(yǎng)瓊脂上斜面，置于37 °C恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 ho沒有菌落生長的試管所對(duì)應(yīng)的最低藥物濃度即為最低抑菌濃度。
試驗(yàn)結(jié)果
I.樣品濃度為20 mg/mL時(shí)對(duì)受試菌的抑菌結(jié)果見表I。
表I桑葉酚酸提取物和混合浸膏的抑菌活性
---1
'_抑爾( ima)I
菌種 _................................................................................................................................................................................................................................................................................................I
'桑葉_1提取物黯浸膏CK I
—...........................................................................................................—........................................................................................................................................................................................................................................................—.....................................................................................................................................................................................................................——...............................................................................................................................................—^
金黃色葡萄球菌 ■ 13.04=8 J S14.86=0.1 6.. OCfetO. 0.0 |
拈萆芽麵蘭 I 13'45邊請(qǐng)13.37=0.296 W士 0.00
大涵桿菌 J 10.22=0.2 BJI邊25β.0·0.0
沙門 _ * 11.ICkOJfi12 JSrt. 4^00^0.00
試驗(yàn)結(jié)果表明桑葉酚酸提取物和混合浸膏對(duì)革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌都有較好的抑制作用，且混合浸膏對(duì)受試菌的抑菌效果要好于單一的桑葉酚酸提取物。
2.桑葉酚酸提取物和混合浸膏最低抑菌濃度結(jié)果見下表。
表2桑葉酚酸提取物和混合浸膏對(duì)供試菌的MIC
權(quán)利要求
1.一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物，其特征在于，由以下方法制備而得 (1)提取取干燥桑葉粉和50 70%酸性乙醇溶液按1:10 1:20混合，超聲處理0.5 Imin,然后45 1恒溫浸提4飛小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2 3次，合并提取液，過濾，4(T50°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液； (2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2.01.0，濃度為3.(T5.0mg/mL，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析； (3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2.(T4. 0的5(T70%酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液； (4)濃縮濃縮洗脫液，即得桑葉酚酸提取物浸膏。
2.—種權(quán)利要求
I所述的具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，包括以下步驟 (1)提取取干燥桑葉粉和50 70%酸性乙醇溶液按1:10 1:20混合，超聲處理0.5 Imin,然后45 1恒溫浸提4飛小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2 3次，合并提取液，過濾，4(T50°C減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液； (2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2.01.0，濃度為3.(T5.0mg/mL，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析； (3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2.(T4. 0的5(T70%酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液； (4)濃縮濃縮洗脫液，即得桑葉酚酸提取物浸膏。
3.根據(jù)權(quán)利要求
2具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，加入大孔吸附樹脂柱中的桑葉酚酸粗提液的體積為5. (T7. 0柱體積，吸附流速為3.5 5. 5柱體積/h。
4.根據(jù)權(quán)利要求
2或3具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，洗脫速率為2. (T3. 0柱體積/h，洗脫液的體積為3. (T4. 0柱體積。
5.根據(jù)權(quán)利要求
2或3具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述洗脫液在4(T5(TC下減壓濃縮。
6.根據(jù)權(quán)利要求
2或3具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(4)中，所述桑葉酚酸提取物浸膏的相對(duì)密度為I. 2^1. 3g/cm3。
7.根據(jù)權(quán)利要求
2或3具抑菌活性的桑葉酚酸提取物的制備方法，其特征在于，所述步驟(I) 50 70%酸性乙醇溶液的pH為2. 0 4. O。
8.權(quán)利要求
I所述的桑葉酚酸提取物在植物飲料中的應(yīng)用。
9.一種含有權(quán)利要求
I所述的桑葉酚酸提取物的植物飲料混合浸膏，包括以下質(zhì)量百分比含量的組分 桑葉酚酸浸膏50% 70%，菊花浸膏10% 30%，金銀花浸膏5% 15%，甘草浸膏5% 15%。
10.根據(jù)權(quán)利要求
9所述的植物飲料混合浸膏，其特征在于，所述的菊花浸膏、金銀花浸膏和甘草浸膏均采用所述桑葉酚酸提取物的制備方法進(jìn)行制備。
專利摘要
本發(fā)明公開一種具抑菌活性的桑葉酚酸提取物，由以下方法制備而得(1)提取取干燥桑葉粉和50~70%酸性乙醇溶液按1:10~1:20混合，超聲處理0.5~1min，然后45℃恒溫浸提4~6小時(shí)后分離提取液，重復(fù)以上操作提取2~3次，合并提取液，過濾，40~50℃減壓濃縮至無乙醇，得桑葉酚酸粗提液；(2)吸附調(diào)節(jié)桑葉酚酸粗提液pH值為2.0~4.0，濃度為3.0~5.0mg/mL，進(jìn)行大孔吸附樹脂柱層析；(3)洗脫在吸附平衡后，以pH為2.0~4.0的50~70%酸性乙醇溶液為洗脫液進(jìn)行洗脫，收集洗脫液；(4)濃縮濃縮洗脫液，即得桑葉酚酸提取物浸膏。該桑葉酚酸提取物中酚酸類有效成分含量高，且活性高。本發(fā)明還公開了該桑葉酚酸提取物的制備方法及其應(yīng)用。
文檔編號(hào)A23L1/29GKCN102771862SQ201210255122
公開日2012年11月14日 申請(qǐng)日期2012年7月23日
發(fā)明者劉軍, 劉凡, 廖森泰, 施英, 沈維治, 穆利霞, 肖更生, 鄒宇曉 申請(qǐng)人:廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蠶業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品加工研究所導(dǎo)出引文BiBTeX, EndNote, RefMan