本發(fā)明屬于動(dòng)物飼料配方研發(fā)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種抗菌肽生物飼料的制備工藝。

背景技術(shù)：

抗菌肽具有高效、廣譜抗菌，潛在的抗腫瘤活性，以及能加速機(jī)體免疫和傷口愈合過程等功能，使其可能成為代替?zhèn)鹘y(tǒng)抗生素藥物的一種新型藥物。

當(dāng)今，不同來(lái)源的抗菌肽在我們的生活中顯得越來(lái)越重要。我國(guó)是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國(guó)，但是近年來(lái)隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的高速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害問題嚴(yán)重，制約著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展?？咕氖囚~、蝦、貝類等動(dòng)物防御素系統(tǒng)的主要成分之一。水生生物抗菌肽研究主要集中在甲殼綱的一些種類，如：鱟、蟹、蝦、貝等，魚類方面也有一些報(bào)道，這顯示出抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)上的潛在應(yīng)用前景。研究表明，在對(duì)蝦的養(yǎng)殖過程中添加抗菌蛋白，可以顯著提高生長(zhǎng)速度、相對(duì)增重率、飼料系數(shù)、成活率及抗病能力等。水生生物抗菌肽的高效抗病毒、抗菌作用為水產(chǎn)養(yǎng)殖的抗病害問題提供了新的解決方案。國(guó)內(nèi)在水產(chǎn)養(yǎng)殖方面的研究已有很多報(bào)道，如：鱟素抗菌肽在不同溫度、ph、體外蛋白酶的作用，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)貽貝抗菌肽，從對(duì)蝦體內(nèi)克隆抗菌肽基因等。多種研究說明抗菌肽在水產(chǎn)養(yǎng)殖行業(yè)擁有廣泛的應(yīng)用前景。

抗菌肽具有獨(dú)特殺菌機(jī)制和抗菌廣譜性，且病原菌不易對(duì)抗菌肽產(chǎn)生耐藥性等特性，成為新型飼料添加劑進(jìn)入人們的視野。研究表明，在動(dòng)物飼糧中添加抗菌肽能夠抑制病菌繁殖，改善動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)，提高動(dòng)物生產(chǎn)性能。

益生菌是一類對(duì)宿主有益的活性微生物，是定植于腸道、生殖系統(tǒng)內(nèi)，能產(chǎn)生確切健康功效從而改善宿主微生態(tài)平衡、發(fā)揮有益作用的活性有益微生物的總稱。動(dòng)物體內(nèi)有益的細(xì)菌或真菌主要有：乳桿菌、雙歧桿菌、酵母菌等。目前世界上研究的功能最強(qiáng)大的產(chǎn)品主要是以上各類微生物組成的復(fù)合活性益生菌，其廣泛應(yīng)用于生物工程、工農(nóng)業(yè)、食品安全以及生命健康領(lǐng)域。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種抗菌肽生物飼料的制備工藝，添加抗菌肽后提高動(dòng)物免疫力，且有益菌能加快動(dòng)物生長(zhǎng)速度，從而放大效益。

本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種抗菌肽生物飼料的制備工藝，將植物物料、蛋白質(zhì)物料混合后拌入由嗜酸性乳桿菌、釀酒酵母、乳酸腸球菌、乳酸乳桿菌、兩歧雙歧桿菌和保加利亞乳桿菌混合制成的微生物物料中；對(duì)編號(hào)為bncc179313的高產(chǎn)抗菌肽菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液；最后將所述發(fā)酵液噴灑在所述微生物物料之中得到發(fā)酵生物飼料。

優(yōu)選的，包括以下步驟：

s1、將包含秸稈、玉米或麥麩的植物物料進(jìn)行粉碎、混勻和干燥；

s2、將包含肉類和/或豆類物料的蛋白質(zhì)物料冷凍干燥后進(jìn)行粉碎處理；

s3、將步驟s1處理的植物物料與步驟s2處理的蛋白質(zhì)物料混合均勻；

s4、將所述微生物物料加入步驟s3制備的混合物料中，制成半成品；

s5、將編號(hào)為bncc179313的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，培養(yǎng)得到發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用；

s6、在步驟s4制備的所述半成品中均勻噴灑步驟s5制備的發(fā)酵液，待混合均勻后，進(jìn)行干燥處理，分裝保存。

優(yōu)選的，步驟s1中，干燥后的所述植物物料的水分含量不高于20％。

優(yōu)選的，步驟s2中，冷凍溫度為-115～125℃，冷凍時(shí)間為5～10min。

優(yōu)選的，步驟s3中，所述植物物料與所述蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比(1～3)：1混合均勻。

優(yōu)選的，步驟s4中，所述微生物物料為經(jīng)過發(fā)酵后處理的微生物菌體，占所述混合物料的質(zhì)量比為1.5％。

優(yōu)選的，所述嗜酸性乳桿菌的質(zhì)量百分比為20～30％，所述釀酒酵母的質(zhì)量百分比為20～30％，所述乳酸腸球菌的質(zhì)量百分比為15～25％，所述乳酸乳桿菌的質(zhì)量百分比為15～25％，所述兩歧雙歧桿菌的質(zhì)量百分比為15～25％，所述保加利亞乳桿菌的質(zhì)量百分比為15～25％。

優(yōu)選的，步驟s5中的培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23～27℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)120～160r/min，培養(yǎng)時(shí)間18～22h。

優(yōu)選的，步驟s6中，所述發(fā)酵液的效價(jià)不低于4500活性單位/ml，按每千克所述半成品加1l所述發(fā)酵液。

優(yōu)選的，所述干燥處理后的生物飼料含水量不高于14％。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：

本發(fā)明抗菌肽生物飼料的制備工藝，對(duì)編號(hào)為bncc179313的高產(chǎn)抗菌肽菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液并篩選；然后將植物物料、蛋白質(zhì)物料混合后拌入微生物物料；最后將上述前者篩出菌株bncc179313的發(fā)酵液噴灑在后者之中制成發(fā)酵生物飼料，將植物物料和蛋白質(zhì)物料混合均勻制成半成品，由有益微生物產(chǎn)生的蛋白酶、脂肪酶和纖維素酶能夠幫助動(dòng)物消化吸收，在一定程度上顯著提高了飼料的利用率，節(jié)約了開支，加入嗜酸性乳桿菌(lactobacillusacidophilus)與兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)有調(diào)整腸道菌群平衡，抑制腸道不良微生物的增殖的作用，其中嗜酸性乳桿菌是目前國(guó)內(nèi)外開發(fā)應(yīng)用的微生態(tài)制劑的主要菌種，廣泛分布在人和動(dòng)物的消化道中，飼料中加入嗜酸性乳桿菌可起到預(yù)防家畜急性腹瀉、腸道炎癥性疾病的效果，采用本發(fā)明制備工藝制備的飼料具有提高家畜抗病防病的能力，大大提高了初生動(dòng)物的存活率。

進(jìn)一步的，將植物物料與蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比1:1～3:1混合均勻，植物性伺料主要有谷類，如麥粉、玉米粉、米糠、豆渣等，投人一定量的富含纖維素的植物飼料，有利于促進(jìn)動(dòng)物的腸道蠕動(dòng)，提高攝食強(qiáng)度和飼料利用率。

進(jìn)一步的，飼料中加入釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)，由于其細(xì)胞原生質(zhì)中含量豐富的核苷酸和氨基酸/小肽等物質(zhì)，能夠?qū)?dòng)物產(chǎn)生強(qiáng)烈的誘食效應(yīng)，顯著促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)、提高飼料吸收利用效率，加入乳酸腸球菌(lactobacillusacidophilus)能夠維持家畜消化道機(jī)能，幫助增加腸道有益菌菌、刺激腸道蠕動(dòng)使排便較為順暢，加入乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)具有維護(hù)動(dòng)物機(jī)體健康和調(diào)節(jié)免疫功能，有一定預(yù)防及治療潰瘍性結(jié)腸炎的功效，保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)的加入提高了飼料的功能性特點(diǎn)和附加值，更利于動(dòng)物進(jìn)食，營(yíng)養(yǎng)成分更多且易于吸收。

進(jìn)一步的，lb培養(yǎng)基由蛋白胨，酵母膏和nacl組成，其優(yōu)點(diǎn)在于：蛋白胨是經(jīng)過胰酶處理過的蛋白，處理后，大分子的蛋白分子量變小，細(xì)菌更容易利用；此外，還含有嘌呤，提供生長(zhǎng)因子，蛋白胨為細(xì)菌的生長(zhǎng)提供氮源，其次，培養(yǎng)基中的酵母膏酵母提取物主要成分是氨基酸，小肽，核甘酸，b族維生素，主要為細(xì)菌提供維生素和微量元素，是細(xì)菌生長(zhǎng)所必須的。氯化鈉在培養(yǎng)基中的作用是維持滲透壓，兼能可提供無(wú)機(jī)鹽。

進(jìn)一步的，在所述半成品中均勻噴灑制備的效價(jià)不低于4500活性單位/ml的發(fā)酵液，效價(jià)精準(zhǔn)抗菌能力得以保證，噴灑混合更為均勻。

綜上所述，本發(fā)明采用農(nóng)業(yè)部1126號(hào)公告《飼料添加劑品種目錄(2008)》中規(guī)定的可以直接飼喂動(dòng)物的飼料級(jí)微生物添加劑菌種，在養(yǎng)殖動(dòng)物體內(nèi)無(wú)殘留，同時(shí)減少了抗生素在養(yǎng)殖中的使用量，提供了一種安全、綠色的生物飼料，適用于禽畜、寵物與水產(chǎn)動(dòng)物等的養(yǎng)殖。

下面通過附圖和實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步的詳細(xì)描述。

附圖說明

圖1為本發(fā)明的抗菌肽生物飼料的制備方法的工藝流程圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明提供了一種抗菌肽生物飼料的制備工藝，首先，對(duì)北京北納創(chuàng)聯(lián)生物技術(shù)研究院編號(hào)為bncc179307，bncc179310，bncc179311，bncc179312，bncc179313，bncc179314，bncc179315的高產(chǎn)抗菌肽芽孢桿菌菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，得到發(fā)酵液并篩選；然后，將植物物料、蛋白質(zhì)物料按一定比例混合后拌入微生物物料；最后，將上述前者篩出菌株bncc179313的發(fā)酵液按一定比例噴灑在后者之中。

bncc179307的致病對(duì)象：微生物采集地：云南大理云龍縣菌落表面光滑濕潤(rùn)，微金黃，菌體桿狀，部分菌體呈弓形，菌體寬1.2μm，長(zhǎng)2-4μm；芽孢紡錘形，1.2×1.5μm，能抑制白粉菌；bncc179310的致病對(duì)象：微生物采集地：云南昆明從煙葉中分離得到。菌落中等，表面干燥，無(wú)皺，微黃色，菌體桿狀，芽孢不膨大；能抑制細(xì)菌及白粉菌，可生產(chǎn)生物抗菌劑；bncc179311的致病對(duì)象：微生物采集地:云南昆明菌落表面濕潤(rùn)，呈粒狀，微黃色，邊緣不整齊；菌體桿狀，部分呈弓形，芽孢紡錘形；能抵制黑曲霉，可用于生產(chǎn)生物抗菌劑；bncc179312的致病對(duì)象：微生物采集地：云南澄江縣菌臺(tái)干燥，白色，邊緣不齊，表面有皺；菌體長(zhǎng)桿狀，芽孢不膨大，能抑制根霉，毛霉，細(xì)菌等多種微生物,可用于生產(chǎn)生物抗菌劑；bncc179313的致病對(duì)象：微生物采集地:云南昆明菌落中等，表面干燥，無(wú)皺，黃白色，菌體桿狀，芽孢不膨大，紡錘形；能抑制細(xì)菌及白粉菌，可用于生產(chǎn)生物抗菌劑；bncc179314的致病對(duì)象：微生物采集地：云南勐海菌落大，邊緣不整齊，菌臺(tái)表面干燥，多皺，淺黃色；菌體桿狀，芽孢不膨大，承橢圓形；能抑制細(xì)菌,可用于生產(chǎn)生物抗菌劑；bncc179315的致病對(duì)象：微生物采集地：云南勐?？h菌落中等，邊緣不整齊，菌臺(tái)表面干燥，多皺，黃白色；菌體細(xì)桿狀，芽孢不膨大，中生；能抑制曲霉菌生長(zhǎng)，可用于生產(chǎn)生物抗菌劑。

其中，菌株bncc179313經(jīng)鹽析后的蛋白粗提液抑菌圈明顯大于鹽析前菌液的抑菌圈。菌液經(jīng)透析后，對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈未見明顯變化。菌液對(duì)胃蛋白酶有一定敏感性，抑菌能力有所下降。綜合以上結(jié)果，可以初步判斷該菌液的抑菌物質(zhì)含有肽類物質(zhì)或蛋白質(zhì)。對(duì)其進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，獲得發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用。

請(qǐng)參閱圖1，本發(fā)明抗菌肽生物飼料的制備工藝的具體步驟如下：

s1、將植物物料粉碎，混勻，混勻后的植物物料經(jīng)初步干燥后水分含量不高于20％；

植物物料包括秸稈、玉米或麥麩。

s2、將蛋白質(zhì)物料冷凍干燥后進(jìn)行粉碎處理，冷凍溫度為-115～125℃，冷凍時(shí)間為5～10min。如果處理水分不徹底可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，蛋白質(zhì)物料包括肉類和/或豆類物料。

以豬飼料為例，粒度為400～500。

s3、將步驟s1處理的植物性物料與步驟s2處理的蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比為(1～3)：1混合均勻；

s4、按嗜酸性乳桿菌(lactobacillusacidophilus)20～30g、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)20～30g、乳酸腸球菌(lactobacillusacidophilus)15～25g、乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)15～25g、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)15～25g、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)15～25g的發(fā)酵產(chǎn)物物料的質(zhì)量將其混勻，而后按1.5％的質(zhì)量比拌入步驟s3的混合物料中(微生物物料可購(gòu)買也可自行發(fā)酵)；

s5、將編號(hào)為bncc179313的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用lb(luriabroth，g·l-1)培養(yǎng)基(胰蛋白胨10g，酵母粉5g，nacl10g，ph7.0)進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃,攪拌轉(zhuǎn)數(shù)140r/min，培養(yǎng)時(shí)間20h，培養(yǎng)得到發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用；

s6、在上述半成品中均勻噴灑效價(jià)不低于4500活性單位/ml，按每千克半成品加1l的比例的菌株bncc179313的發(fā)酵液；混勻后，進(jìn)行干燥處理，含水量不高于14％；分裝保存。

實(shí)施例1

1、將植物物料如：購(gòu)置秸稈、玉米等物料，去除其中的泥土砂石等雜質(zhì)，可用純凈的自來(lái)水水洗，晾干；干燥后粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，與麥麩混合得到混合原料，混合原料經(jīng)初步干燥后水分含量不得高于20％，防止霉變，于干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

2、將蛋白質(zhì)物料如肉類、豆類物料，冷凍干燥，冷凍溫度為-115℃，冷凍時(shí)間為5min。如果處理水分不徹底可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冷凍干燥好后的蛋白質(zhì)物料進(jìn)行粉碎處理；

3、將步驟1處理的植物性物料與步驟2處理的蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比為1:1混合均勻；

4、按嗜酸性乳桿菌(lactobacillusacidophilus)20g、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)20g、乳酸腸球菌(lactobacillusacidophilus)15g、乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)15g、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)15g、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)15g的發(fā)酵產(chǎn)物物料的質(zhì)量占比將其混勻，而后按1.5％的質(zhì)量比拌入步驟3的混合物料中(微生物物料可購(gòu)買也可自行發(fā)酵)；

5、將編號(hào)為bncc179313的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度23℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)120r/min，培養(yǎng)時(shí)間18h，培養(yǎng)得到發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用；

6、在上述半成品中均勻噴灑效價(jià)不低于4500活性單位/ml，按每千克半成品加1l的比例的量的菌株bncc179313的發(fā)酵液；混勻后，進(jìn)行干燥處理，含水量不高于14％；分裝保存。

實(shí)施例2

1、將植物物料如：購(gòu)置秸稈、玉米等物料，去除其中的泥土砂石等雜質(zhì)，可用純凈的自來(lái)水水洗，晾干；干燥后粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，與麥麩混合得到混合原料，混合原料經(jīng)初步干燥后水分含量不得高于20％，防止霉變，于干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

2、將蛋白質(zhì)物料如肉類、豆類物料，冷凍干燥，冷凍溫度為-120℃，冷凍時(shí)間為8min。如果處理水分不徹底可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冷凍干燥好后的蛋白質(zhì)物料進(jìn)行粉碎處理；

3、將步驟1處理的植物性物料與步驟2處理的蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比為2:1混合均勻；

4、按嗜酸性乳桿菌(lactobacillusacidophilus)25g、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)25g、乳酸腸球菌(lactobacillusacidophilus)20g、乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)20g、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)20g、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)20g的發(fā)酵產(chǎn)物物料的質(zhì)量占比將其混勻，而后按1.5％的質(zhì)量比拌入步驟3的混合物料中(微生物物料可購(gòu)買也可自行發(fā)酵)；

5、將編號(hào)為bncc179313的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度25℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)140r/min，培養(yǎng)時(shí)間20h，培養(yǎng)得到發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用；

6、在上述半成品中均勻噴灑效價(jià)不低于4500活性單位/ml，按每千克半成品加1l的比例的量的菌株bncc179313的發(fā)酵液；混勻后，進(jìn)行干燥處理，含水量不高于14％；分裝保存。

實(shí)施例3

1、將植物物料如：購(gòu)置秸稈、玉米等物料，去除其中的泥土砂石等雜質(zhì)，可用純凈的自來(lái)水水洗，晾干；干燥后粉碎機(jī)進(jìn)行粉碎，與麥麩混合得到混合原料，混合原料經(jīng)初步干燥后水分含量不得高于20％，防止霉變，于干燥處儲(chǔ)存?zhèn)溆茫?/p>

2、將蛋白質(zhì)物料如肉類、豆類物料，冷凍干燥，冷凍溫度為-120℃，冷凍時(shí)間為5min。如果處理水分不徹底可適當(dāng)延長(zhǎng)時(shí)間，冷凍干燥好后的蛋白質(zhì)物料進(jìn)行粉碎處理；

3、將步驟1處理的植物性物料與步驟2處理的蛋白質(zhì)物料按質(zhì)量比為3:1混合均勻；

4、按嗜酸性乳桿菌(lactobacillusacidophilus)30g、釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)30g、乳酸腸球菌(lactobacillusacidophilus)25g、乳酸乳桿菌(lactobacilluslactis)25g、兩歧雙歧桿菌(bifidobacteriumbifidum)25g、保加利亞乳桿菌(lactobacillusbulgaricus)25g的發(fā)酵產(chǎn)物物料的質(zhì)量占比將其混勻，而后按1.5％的質(zhì)量比拌入步驟3的混合物料中(微生物物料可購(gòu)買也可自行發(fā)酵)；

5、將編號(hào)為bncc179313的芽孢桿菌進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，用lb培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)；培養(yǎng)條件為：培養(yǎng)溫度27℃，攪拌轉(zhuǎn)數(shù)160r/min，培養(yǎng)時(shí)間22h，培養(yǎng)得到發(fā)酵液用于后續(xù)制備使用；

6、在上述半成品中均勻噴灑效價(jià)不低于4500活性單位/ml，按每千克半成品加1l的比例的量的菌株bncc179313的發(fā)酵液；混勻后，進(jìn)行干燥處理，含水量不高于14％；分裝保存。

以上內(nèi)容僅為說明本發(fā)明的技術(shù)思想，不能以此限定本發(fā)明的保護(hù)范圍，凡是按照本發(fā)明提出的技術(shù)思想，在技術(shù)方案基礎(chǔ)上所做的任何改動(dòng)，均落入本發(fā)明權(quán)利要求書的保護(hù)范圍之內(nèi)。