本發(fā)明涉及孜然精油中抗菌組分的分離與純化方法，是一種方便、快捷地提取和分離天然植物中有效抗菌組分的新方法，孜然精油作為一種天然食品防腐劑將得到廣泛的應(yīng)用，屬天然產(chǎn)物分離提取領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

孜然屬傘形科草本植物，又名孜然芹、野茴香和安息茴香等。孜然種子可作為食品的調(diào)味品使用，具有一定的抑制脂質(zhì)過(guò)氧化的作用和保護(hù)去氧核糖的能力。已有的關(guān)于孜然揮發(fā)油的提取及化學(xué)成分研究中，多采用有機(jī)溶劑萃取、水蒸氣蒸餾和微波萃取等方法得到孜然精油，并對(duì)精油成分進(jìn)行分析測(cè)試，但孜然精油的成分則因萃取方法的不同而差別較大。提取物成分含量不同使其具有不同程度的生物活性，目前主要研究的有抗氧化活性、殺菌活性和殺蟲活性等。為了提高孜然精油的抗菌效果，需要將其中抗菌組分進(jìn)行分離與純化，但因孜然精油中成分復(fù)雜，采用目前技術(shù)手段難以將孜然精油分離得到高效抗菌成分，限制了其在食品領(lǐng)域的推廣應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)目前孜然精油提取和有效抗菌組分分離中的技術(shù)難點(diǎn)，本發(fā)明的目的在于提供一種簡(jiǎn)便的、低成本、分離效率高的孜然精油中抗菌組分的分離與純化方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過(guò)對(duì)孜然精油組分提取及抗菌實(shí)驗(yàn)研究，發(fā)現(xiàn)孜然的石油醚提取物中含有對(duì)肉類有很好保鮮作用有效成分。

具體技術(shù)方案如下：

1、將孜然種子進(jìn)行干燥和粉碎處理，稱取孜然粉末，以沸程為30～60℃的石油醚作為溶劑，采用索氏抽提法在55℃-60℃下浸提，抽提液以無(wú)水硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑獲得孜然精油；

2、采用柱層析法將上述孜然精油中的飽和烴、芳香烴、非烴及膠質(zhì)四種組分依次分離；柱層析中的洗脫溶劑為：飽和烴使用正己烷，芳香烴用正己烷/二氯甲烷＝1:2(體積比)，非烴用二氯甲烷/甲醇＝9:1(體積比)，膠質(zhì)用甲醇；要求飽和烴、芳香烴、非烴和膠質(zhì)四個(gè)組分總收率達(dá)到85％～100％，低于該值做平等樣分析。

所述柱層析的層析柱用吸附劑選Al₂O₃和硅膠，使用前均進(jìn)行活化處理，活化條件分別為：Al₂O₃在400℃下活化3-4h，硅膠在150℃下活化5-6h；裝填按Al₂O₃/硅膠質(zhì)量比1:1，裝填順序是先加入Al₂O₃，再加入硅膠，填充均勻，加入正己烷潤(rùn)濕柱子。

采用GC-MS聯(lián)用儀，對(duì)分離得到的四種組分進(jìn)行了定性和定量分析：

柱層析分離得到飽和烴中主要為非極性組分的直鏈和支鏈烷烴；芳烴組分主要為含有苯環(huán)類的極性組分；非烴類主要為含有雜原子的強(qiáng)極性有機(jī)化合物；膠質(zhì)組分主要為配糖體、油脂和樹脂類化合物。從飽/芳比值可知，在孜然精油中飽和烴組分含量較低，大部分為環(huán)狀和含雜原子化合物。

經(jīng)過(guò)抑菌實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，分離純化得到四種組分中芳烴、非烴對(duì)各種菌的抑菌效果較明顯，可以把二者按一定的比例混合作為一種天然防腐劑，安全、無(wú)毒且作用時(shí)間長(zhǎng)，在食品防腐、肉食保鮮領(lǐng)域有潛在的使用價(jià)值和推廣應(yīng)用的前景。本發(fā)明制備的精油組分可以制成顆粒劑、水合劑、乳劑來(lái)使用，也可以同市售調(diào)味劑、防腐劑混合使用。

本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)及優(yōu)點(diǎn)在于：采用低沸點(diǎn)的溶劑、索氏抽提從孜然中獲得孜然精油，并建立了柱層析的組分分離方法，將同類型的有機(jī)物質(zhì)進(jìn)行了分類，方法重現(xiàn)性良好。并用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀對(duì)組分進(jìn)行分析鑒定，確定孜然精油中對(duì)食品起到抑菌防腐的主要組分，為天然植物源食品防腐劑的開發(fā)和應(yīng)用提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)和理論依據(jù)。

附圖說(shuō)明

圖1為采用本發(fā)明工藝提取的四種組分的離子流圖：a-飽和烴、b-芳烴、c-非烴、d-膠質(zhì)。

圖2為采用本發(fā)明工藝提取的組分對(duì)金黃葡萄球菌的抑菌圈照片，圖中，a-飽和烴、b-芳烴、c-非烴、d-膠質(zhì)。

圖3為采用本發(fā)明工藝提取的組分對(duì)大腸桿菌的抑菌圈照片，圖中，a-飽和烴、

b-芳烴、c-非烴、d-膠質(zhì)。

圖4為采用本發(fā)明工藝提取的組分對(duì)酵母菌的抑菌圈照片，圖中，a-飽和烴、b-芳烴、c-非烴、d-膠質(zhì)，e-精油。

具體實(shí)施方式

為對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更好地說(shuō)明，舉實(shí)施例如下：

實(shí)施例1

1、首先將市售孜然種子進(jìn)行干燥和粉碎處理，然后稱取孜然粉末，以沸程為30～60℃的石油醚作為溶劑，采用索氏抽提法在60℃下浸提，抽提液以無(wú)水硫酸鈉干燥后，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑獲得孜然精油；

2、采用柱層析將上述孜然精油中的飽和烴、芳香烴、非烴及膠質(zhì)四種組分依次分離；柱層析中的洗脫溶劑為：飽和烴使用正己烷，芳香烴用正己烷/二氯甲烷＝1:2(體積比)，非烴用二氯甲烷/甲醇＝9:1(體積比)，膠質(zhì)用甲醇；要求飽和烴、芳香烴、非烴和膠質(zhì)四個(gè)組分總收率達(dá)到85％～100％，低于該值做平等樣分析。

所述柱層析的層析柱用吸附劑選Al₂O₃和硅膠，使用前均進(jìn)行活化處理，活化條件分別為：Al₂O₃是400℃下活化4h，硅膠是150℃下活化6h；裝填按Al₂O₃/硅膠質(zhì)量比1:1，裝填順序是先加入Al₂O₃，再加入硅膠，填充均勻，加入正己烷潤(rùn)濕柱子。

表1使用不同溶劑抽提得到的孜然精油收率及經(jīng)本發(fā)明工藝處理成份含量對(duì)比情況；

表1孜然精油收率及組成

可見(jiàn)采用石油醚作為溶劑，進(jìn)行索氏抽提孜然精油的收率高于正己烷溶劑。應(yīng)用例1：保鮮試驗(yàn)

以豬、牛、羊鮮肉為試驗(yàn)樣品，分別以鮮肉重量的1‰劑量，加入本發(fā)明精油分離的有效組分作為保鮮劑，進(jìn)行單因素試驗(yàn)。結(jié)果表明：在20～25℃條件下，經(jīng)保鮮劑處理的能夠保持新鮮達(dá)5-6天，而不經(jīng)處理的對(duì)照組豬肉經(jīng)1-2天即腐敗變質(zhì)，經(jīng)過(guò)保鮮劑處理的樣品均較好的延長(zhǎng)了保質(zhì)期，保鮮效果顯著。應(yīng)用例2：保鮮對(duì)比試驗(yàn)

孜然精油與本發(fā)明精油分離的有效組分作為保鮮劑對(duì)比，二者對(duì)鮮肉都具有保鮮作用，其濃度不同，保鮮效果也有不同。當(dāng)孜然精油與精油分離的有效組分的質(zhì)量濃度均為50mg/mL時(shí)，本發(fā)明精油分離的有效組分的保鮮效果更為顯著，常溫條件下，孜然精油分離的有效組分相對(duì)應(yīng)孜然精油處理效果的保質(zhì)期延長(zhǎng)2-3天。

應(yīng)用例2：殺菌活性試驗(yàn)

菌種采用金黃葡萄球菌、大腸桿菌和酵母菌。

測(cè)試方法：表面皿離體活性測(cè)定法：將200克馬鈴薯去皮切碎，在700毫升蒸餾水中煮沸，冷卻過(guò)濾，濾液與葡萄糖、瓊脂混合，再加水至900毫升，加熱至沸騰，冷卻后即得培養(yǎng)基。培養(yǎng)基、蒸餾水、培養(yǎng)皿一起滅菌。

用電子天平稱3mg左右本發(fā)明待測(cè)樣品，加少量DMF溶解，滴加1滴吐溫-80，加水配成1000ppm。

培養(yǎng)基高溫減壓滅菌15分鐘，滅菌后，用刻度試管趁熱取10毫升培養(yǎng)基，將其與1毫升，1000ppm溶液稀釋到10毫升的本發(fā)明待測(cè)樣品混勻，即制得50ppm的試樣，蓋好培養(yǎng)皿上蓋，水平放置冷卻。

用直徑5mm的打孔器取空白對(duì)照瓊脂片，用細(xì)鋼絲挑入培養(yǎng)皿內(nèi)，菌絲面朝下，每個(gè)培養(yǎng)皿放2-3個(gè)菌種。取菌前打孔器和鋼絲酒精燈灼燒消毒。用上述方法，加待測(cè)樣品，每一菌種做一次空白對(duì)照。然后置于無(wú)菌恒溫箱內(nèi)48～72小時(shí)后調(diào)查。測(cè)定菌斑直徑，根據(jù)空白，以抑菌圈的直徑表示藥效。

結(jié)合附圖2-4，通過(guò)對(duì)分離得到的四種組分抗菌試驗(yàn)，可以看出孜然精油中具有抑菌效果的組分是芳香烴和非烴，其中以芳香烴效果較顯著。采用色譜-質(zhì)譜對(duì)兩種組分定性分析可知，芳香烴組分主要為γ-萜品烯、β-蒎烯、α-蒎烯、β-側(cè)柏烯、β-月桂烯、α-水芹烯、枯茗醛、4-萜品醇等化合物；非烴主要含有枯茗酸、枯茗醇等化合物。如將芳香烴和非烴以一定比例混配，效果更佳。