副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒的制作方法
【專利摘要】一種副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒，包括由盒本體(1)，在本體(1)內(nèi)從上至下依次設(shè)置有第一海綿墊(2)、隔離硬紙板(3)、第二海綿墊(4)，第一海綿墊(2)上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置：10×PCR?Buffer(含Mg2+)試劑管(5)、dNTP試劑管(6)、引物pyrGA試劑管(7)、引物pyrG?B試劑管(8)，第二海綿墊(4)上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置：TaqDNA聚合酶試劑管(9)、Marker?DL-2000試劑管(10)、陰性對照試劑管(11)、陽性對照試劑管(12)，盒本體(1)底層放置說明書(13)。本試劑盒設(shè)計(jì)合理，不僅保持了PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高，使用方便、成本低而且能夠快速診斷病原。
【專利說明】副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒
【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本實(shí)用新型屬于生物【技術(shù)領(lǐng)域】，涉及副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒，是通過PCR技術(shù)擴(kuò)增出939bp的基因片段，檢測發(fā)病雞群中病雞的眶下竇分泌物中存在的副雞嗜血桿菌的PCR檢測試劑盒。
【背景技術(shù)】
[0002]雞傳染性鼻炎(infectious coryza IC)是由副雞嗜血桿菌(Haemophilusparagal I inarum Hp g)引起的一種雞的急性上呼吸道感染及毒素作用疾病。造成的最大損失是蛋雞產(chǎn)蛋率的下降(10% -40% )及育成雞和肉雞的生長不良和淘汰率增加，給養(yǎng)雞業(yè)造成了較大的經(jīng)濟(jì)損失。按Page的分型方法，可將副雞嗜血桿菌分為A、B和C三個(gè)血清型，各血清型之間沒有交叉保護(hù)，B型的免疫保護(hù)有一定的型特異性，所以了解病原的血清型分布可以更好的預(yù)防和控制本病。
[0003]已采用的幾種血清學(xué)方法中，血凝抑制試驗(yàn)幾乎是早期診斷傳染性鼻炎最合適的方法，三個(gè)血清型中有些共同抗原，所以用單一血清型制備的抗原仍有可能檢出不同型的凝集素。HI抗體的產(chǎn)生晚于凝集抗體和瓊擴(kuò)抗體，所使用的HI抗原主要用于A血清型菌株的測定；(:型菌株作HI試驗(yàn)時(shí)，抗原需用硫氰化鉀處理，超聲波裂解，紅細(xì)胞需要用戊二醛處理稀釋液為含0.1%牛血清白蛋白的PBS。但此法不適于早期感染或免疫雞的抗體水平。
[0004]目前比較成功的是DNA探針和PCR技術(shù)，陳小玲等于1996年從其建立的HpgDNA文庫中篩選出了 4個(gè)種特異性片斷并用地高辛進(jìn)行標(biāo)記，可檢測純化DNA量均在7.8-31.25ug之間.通過對最小探針部分序列的測定，設(shè)計(jì)了兩對PCR引物，建立了兩種PCR診斷方法，在對41個(gè)Hpg分離株測定時(shí)，結(jié)果均為陽性，而對26個(gè)非Hpg的測定.結(jié)果均為陰性，并均能檢測出Hpg的DNAlO3-1O3個(gè)菌細(xì)胞。該方法良好的特異性和敏感性使之可以用來直接檢測Hpg，用于臨床上直接樣品的檢測，從而提高了診斷的敏感性，但不能夠應(yīng)用于血清型的分類。而宋敏訓(xùn)等在2001年建立的aroA-PCR的敏感性更是進(jìn)了一大步。他們利用aroA基因設(shè)計(jì)了 I對引物.分別對10株標(biāo)準(zhǔn)副雞嗜血桿菌(Hpg)菌株、14株分離的Hpg菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增.結(jié)果均得到了與預(yù)期大小一致的片段.而對10株非Hpg菌株和3株病毒進(jìn)行擴(kuò)增則無相應(yīng)片段產(chǎn)生；該P(yáng)CR能檢到出10個(gè)菌細(xì)胞。
[0005]細(xì)菌分離是檢測病雞病料中副雞禽桿菌常用的方法，但副雞禽桿菌的生長依賴NAD，對細(xì)菌的分離培養(yǎng)可按常規(guī)操作將病料接種于鮮血瓊脂培養(yǎng)基(在金黃色葡萄球菌劃線附近生長)，補(bǔ)充NAD的雞肉湯培養(yǎng)基。細(xì)菌的分離培養(yǎng)對確診是十分有必要的，但往往不能成功，這是因?yàn)楦彪u禽桿菌十分嬌嫩，難以滿足其生長需要。而PCR技術(shù)以其特異性強(qiáng)，所需病料組織少，敏感，方便等優(yōu)點(diǎn)已得到世界公認(rèn)，廣泛應(yīng)用于各種微生物、病原體等多種動物病原的臨床檢測和病原確診。

【發(fā)明內(nèi)容】

[0006]本實(shí)用新型的目的是為克服細(xì)菌分離鑒定分離率成功率不高，無法確診，檢測成本高的不足之處，采用PCR技術(shù)，提供一種副雞禽桿菌pyrG基因檢測試劑盒。
[0007]本實(shí)用新型試劑盒包括由盒本體，在本體內(nèi)從上至下依次設(shè)置有第一海綿墊、隔離硬紙板、第二海綿墊，第一海綿墊上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置:10XPCRBuffer (含Mg2+)試劑管、dNTP試劑管、引物pyrG A試劑管、引物pyrG B試劑管，第二海綿墊上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置=TaqDNA聚合酶試劑管、Marker DL-2000試劑管、陰性對照試劑管、陽性對照試劑管，盒本體I底層放置說明書。
[0008]檢測用引物有兩對:上游，pyrG A ;下游:pyrG B。
[0009]pyrG A 上游 5-GCGGGACACGATGTGGCTAT-3
[0010]pyrG B 下游 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0011]對照品分為陽性對照和陰性對照，陰性對照為陽性對照，陽性對照為副雞禽桿菌Apg-8標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC254)購自中國獸藥監(jiān)察所。
[0012]本試劑盒保存于4°C，盡量減少反復(fù)凍融。
[0013]本實(shí)用新型主要用于在病雞眶下竇組織中檢測細(xì)菌來對雞群進(jìn)行疫病診斷和病原確診，從而指導(dǎo)臨床病雞群的臨床用藥和飼養(yǎng)管理，預(yù)防副雞禽桿菌的發(fā)病和健康雞死亡，減少養(yǎng)殖場和養(yǎng)殖戶的損失。
[0014]本實(shí)用新型建立了利用PCR技術(shù)檢測副雞禽桿菌的方法，并經(jīng)檢測病雞框下竇分泌物標(biāo)本證實(shí)該方法切實(shí)可行。PCR檢測靈敏度很高。但是引物二聚體、單鏈二級結(jié)構(gòu)以及錯(cuò)誤的擴(kuò)增產(chǎn)物引起的假陽性會影響定量的精確性。在本檢測項(xiàng)目中，通過優(yōu)化引物和PCR反應(yīng)液，避免了非特異性的擴(kuò)增，同時(shí)保持了 PCR的高靈敏性，而且使得被檢測基因的特異性大大提高。與病料分離細(xì)菌法及探針法相比較，方便且便宜。
[0015]本試劑盒使用方法:
[0016]每次檢測均應(yīng)設(shè)立陽性和陰性對照。
[0017]模板DNA的制備
[0018]挑眶下竇分泌物少許，加入20μ L水中，95°C加熱lOmin，然后_20°C存放10分鐘后做PCR，
[0019]PCR 擴(kuò)增
[0020]25 μ L 反應(yīng)體系(2.5μ LlOXbuffer,2.Ομ L dNTP、引物 A 和引物 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超純水 17 μ L)于 95°C變性 5min，然后 25 個(gè)循環(huán)(94°C lmin，53.9°C lmin，72°C 2min)最后72°C延伸lOmin。將電泳產(chǎn)物按膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收。
[0021]本實(shí)用新型具有的特點(diǎn)是:本實(shí)用新型通過優(yōu)化PCR的引物和PCR的條件，避免了非特異性的擴(kuò)增，并保持了 PCR的高靈敏性，使得被檢測基因的特異性大大提高。本實(shí)用新型設(shè)計(jì)合理，與現(xiàn)有培養(yǎng)法相比較，不需要病料分離提取細(xì)菌，使用方便而且成本低。
【專利附圖】

【附圖說明】
[0022]圖1為本實(shí)用新型試劑盒結(jié)構(gòu)示意圖。
【具體實(shí)施方式】
[0023]本實(shí)用新型結(jié)合具體實(shí)施例和附圖作進(jìn)一步說明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例僅用于說明目的，而不用于限制本發(fā)明范圍。
[0024]實(shí)施例1
[0025]參見圖1，本實(shí)用新型試劑盒包括由盒本體1，在本體I內(nèi)從上至下依次設(shè)置有第一海綿墊2、隔離硬紙板3、第二海綿墊4，第一海綿墊2上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放S =IOXPCR Buff er (含Mg2+)試劑管5、dNTP試劑管6、引物pyrG A試劑管7、引物pyrGB試劑管8，第二海綿墊4上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置=TaqDNA聚合酶試劑管9、Marker DL-2000試劑管10、陰性對照試劑管11、陽性對照試劑管12，盒本體I底層放置說明書13。
[0026]實(shí)施例2
[0027]副雞禽桿菌河南株pyrG基因PCR技術(shù)檢測及應(yīng)用
[0028]I材料及方法
[0029]1.1菌種及培養(yǎng)基
[0030]副雞禽桿菌Apg-8標(biāo)準(zhǔn)株(CVCC254)購自中國獸藥監(jiān)察所，疑似副雞禽桿菌待鑒定河南濮陽分離株編號為HN-1，其他對照菌株具由濱州職業(yè)想學(xué)院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供，副雞禽桿菌培養(yǎng)基參照資料自制。
[0031]1.2 病料
[0032]河南省濮陽送檢疑似傳染性鼻炎病死蛋雞，剖檢鼻腔和鼻竇粘膜卡他性炎癥，表面有大量粘液，鼻竇、眶下竇和眼結(jié)膜囊內(nèi)有干酪樣物，用無菌棉拭子采集典型發(fā)病雞的眶下竇
[0033]1.3主要試劑和工具酶
[0034]IOXBuffer (含 Mg2+)、dNTP、TaqDNA 聚合酶、pMD18_T Vector, DNA 凝膠回收試劑盒，均購自大連寶生物工程有限公司。感受態(tài)細(xì)胞DH5a，由本院重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提供。
[0035]1.4病料鏡檢及分離培養(yǎng)
[0036]分別取病雞的眶下竇分泌物涂片，革蘭氏染色后鏡檢。并將采取的50只雞的眶下竇病料分別劃線接種于雞鮮血瓊脂、雞肉湯瓊脂、麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上，以燭缸法置37°C條件下培養(yǎng)24h至48h，挑選灰白色、半透明、針尖大小菌落進(jìn)行純培養(yǎng)，同時(shí)涂片，革蘭氏染色，鏡檢。
[0037]1.5模板DNA的制備
[0038]挑幾個(gè)菌落加入20 μ L水中，95°C加熱lOmin，然后_20°C存放10分鐘后做PCR。
[0039]1.6引物設(shè)計(jì)
[0040]參照GenBank中已知副雞禽桿菌pyrG部分基因序列,借助Primer5.0引物設(shè)計(jì)軟件設(shè)計(jì)I對引物，送上海生工合成，引物的序列如下:
[0041]pyrG A:5-GCGGGACACGATGTGGCTAT_3
[0042]pyrG B: 5-TGGCGATGACGTTCCTCAAT-3
[0043]1.7PCR 擴(kuò)增
[0044]25 μ L 反應(yīng)體系(2.5μ L10Xbuffer、2.0μ LdNTP、A和 B 各 1.0 μ L、模板 0.5 μ L、rTaq 酶 0.5 μ L、超純水 17 μ L)于 95°C變性 5min,然后 25 個(gè)循環(huán)(94°C lmin, 53.9V lmin,72 °C 2min)最后 72°C 延伸 IOmin。
[0045]1.8PCR產(chǎn)物的純化及克隆鑒定[0046]將電泳產(chǎn)物按膠回收試劑盒說明書進(jìn)行回收。然后按文獻(xiàn)操作，將回收產(chǎn)物插入PMD18-T克隆載體內(nèi)，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a中，菌液全部均勻涂到含有Amp抗生素的LB固
體培養(yǎng)基上。
[0047]1.9質(zhì)粒的提取和酶切鑒定
[0048]挑取單克隆菌落于含1.0mg/mL Amp的LB液體培養(yǎng)基中，37°C振蕩過夜培養(yǎng)，通過堿裂解法小量提取質(zhì)粒，經(jīng)BamH I和psk I雙酶切鑒定重組質(zhì)粒，反應(yīng)體系為:模板6ul，IOXKbufferl μ L, BamH0.5 μ L, pst 10.5 μ L,超純水 2 μ L,反應(yīng)過程為:37°C，2 個(gè)小時(shí)。
[0049]1.10序列測定與分析
[0050]取酶切鑒定陽性的質(zhì)粒，送上海生工測序。序列分析采用DNAStar軟件對所測基因序列與我們設(shè)計(jì)引物所用的序列進(jìn)行比較，分析其核苷酸的同源性。
[0051]2 結(jié)果
[0052]2.1病料涂片鏡檢和分離結(jié)果
[0053]鏡檢可見分泌物中有大量的單個(gè)、成對或短璉的兩極濃染的革蘭氏陰性細(xì)小桿菌。在麥康凱瓊脂、鮮血瓊脂平板上，均無菌生長。在雞肉湯瓊脂上生長出圓形、灰白色、半透明、凸起的小菌落，挑取菌落涂片，染色、鏡檢，仍可見到與病雞病料中相同的細(xì)菌。
[0054]2.2生長因子試驗(yàn)
[0055]在葡萄球菌落周圍生長出衛(wèi)星狀的菌落。用沾取I %輔酶I溶液直接在培養(yǎng)基劃線，也出現(xiàn)相同的現(xiàn)象，這符合副雞禽桿菌在輔酶I存在條件下生長時(shí)出現(xiàn)的“衛(wèi)星現(xiàn)象”。
[0056]2.3PCR 結(jié)果
[0057]將副雞禽桿菌Hpg-8，分離株HN-1，禽多殺性巴氏桿菌C48-1，豬傳染性胸膜肺炎放線桿菌265，副豬嗜血桿菌，雞葡萄球菌。雞沙門氏菌，雞大腸桿菌(O1) 8株細(xì)菌提取的DNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果Hpg-8，分離株HN-1均擴(kuò)增出一條分子量約Ikb的條帶。而其他細(xì)菌對照和超純水對照均未擴(kuò)增出任何條帶。
[0058]2.4PCR產(chǎn)物的純化及克隆鑒定
[0059]將所獲得PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化回收，與pMD18-T載體進(jìn)行連接，轉(zhuǎn)化E.coli DH5a。經(jīng)氨芐青霉素篩選，采用BamH I和psk I雙酶切，表明篩選出陽性重組質(zhì)粒
[0060]2.5PCR產(chǎn)物的克隆及序列測定
[0061]將酶切鑒定陽性的質(zhì)粒送樣測序，測序結(jié)果如下:
[0062]CTGTGGGCGATATTGAATCATTGCCGTTCTTAGAAGCGTTACGCCAGTTAGCTGTTGATGTTGGGCGTGAGCGAACCATTTTTATGCATTTGACCCTTGTGCCTTATATTCCGACTGCGGGCGAGGTGAAAACTAAGCCAACTCAGCATTCAGTGAAAGAGTTGTTGTCTATCGGTATTCAGCCTGATGTGTTGATTTGTCGTTCAGATCGTATGATACCACCAAATGAGCGAAGCAAAATTGCACTGTTCTGTAATGTGCCAGAGCGTGCGGTAATTTCTTTAAAAGATGTGAATTCTATTTATCAAATTCCAGCCTTATTGAAATCCCAAGGCTTAGATGAATTTATTTGTCAGCGTTTTCGTTTAGCTTGTCCAGAAGCTGATTTAAGCGAATGGGAACAAGTGCTTTATCAACAAGCTAACCCAACAGGCGAAGTTACTATTGGTATGGTAGGGAAATATACAGAATTGCCTGATGCTTATAAATCGGTTAATGAAGCATTGAAACACGGCGGGTTAAAAAATCGTTTGAATGTAAATATTAAATATATCGATTCTGAAGATGTAGAAAGTAAAGGCACGGAGGTGTTAGCTGGATTAGATGGAATTTTAGTGCCGGGAGGCTTTGGATATCGTGGTGTAGAGGGTAAAATTCGTACAGCACAATATGCCCGTGAGAACAATATTCCTTACTTAGGGATTTGTTTGGGAATGCAGGTGGCATTAATTGAATATGCACGTCATAAAGCGGGATTAACGGAAGCTAACTCCACGGAATTTGATAAAGACTGTAAACAACCTGTGGTAGGTTTAATTACTTGAATGGCAAGATGCGGAAGGCAAGATTGAAACCCGTAGTGATAAGTCTGATCTGGGTGGTACAATGCGTTTAGGAGCTCAACAATGCCACCTTG
CTGAGGGTAGTCTTGCACGCGAA
[0063]2.6序列對比分析
[0064]測序報(bào)告結(jié)果表明，從BZ-1中擴(kuò)增出的片斷長度為939bp，與預(yù)期大小完全一致，該序列與Genbank上收錄的3株其他Hpg的序列同源性98%。從分子水平表明我們分離的河南株確定為副雞嗜血桿菌。
【權(quán)利要求】
1.一種副雞嗜血桿菌pyrG基因PCR檢測試劑盒，包括由盒本體(I)，其特征在于:在本體(I)內(nèi)從上至下依次設(shè)置有第一海綿墊(2)、隔離硬紙板(3)、第二海綿墊(4)，第一海綿墊⑵上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置:10XPCR Buffer (含Mg2+)試劑管(5)、dNTP試劑管(6)、引物pyrGA試劑管(7)、引物pyrG B試劑管(8)，第二海綿墊(4)上設(shè)有4個(gè)放試劑管的小孔，分別放置:TaqDNA聚合酶試劑管(9)、Marker DL-2000試劑管(10)、陰性對照試劑管(11)、陽性對照試劑管(12)，盒本體⑴底層放置說明書(13)。
【文檔編號】C12M1/34GK203768362SQ201420065510
【公開日】2014年8月13日 申請日期:2014年2月14日 優(yōu)先權(quán)日:2014年2月14日
【發(fā)明者】吳憶春, 苗立中, 李金霞, 趙自國, 吳彬, 趙霞 申請人:濱州職業(yè)學(xué)院