一株具有解硒能力的柄桿菌t5m6及用途
【專利摘要】本發(fā)明屬于環(huán)境微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株具有硒氧化能力的柄桿菌T5M6及其在植物富硒方面的應(yīng)用。本發(fā)明的特征是從硒污染的土壤中分離得到一株對(duì)化學(xué)單質(zhì)硒有氧化作用的柄桿菌T5M6。該菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基和土壤中能將化學(xué)單質(zhì)硒和硒礦粉不可溶的低價(jià)硒氧化成可溶的高價(jià)硒，可溶的高價(jià)硒可以被植物利用并富集，從而達(dá)到微生物促進(jìn)植物富硒的目的。本發(fā)明菌株被命名為Caulobacter sp.T5M6，屬于一種硒氧化細(xì)菌，其保藏號(hào)為CCTCC NO：M2014647。通過盆栽實(shí)驗(yàn)初步研究表明，本發(fā)明的菌株在微生物促進(jìn)植物富硒方面具有良好的應(yīng)用前景。
CCTCC NO：M2014647
20141216
【專利說明】_株具有解砸能力的柄桿菌T5M6及用途

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001] 本發(fā)明屬于環(huán)境微生物【技術(shù)領(lǐng)域】，具體涉及一株對(duì)單質(zhì)硒具有氧化作用的柄桿菌 T5M6及用途，所述的柄桿菌分類為Caulobacter sp. T5M6該菌在純培養(yǎng)和土壤中能將不可 溶的單質(zhì)硒和硒礦粉轉(zhuǎn)化成可溶的高價(jià)硒的能力，同時(shí)，該菌還能促進(jìn)煙草和小白菜對(duì)硒 的富集。

【背景技術(shù)】
[0002] 硒是一種生命必需的微量元素，是硒半胱氨酸和含硒酶的必須組分，在抗癌、抗氧 化等方面發(fā)揮重要作用，適量的補(bǔ)硒有助于提高人體免疫力，而缺硒會(huì)引起許多疾病，如克 山病等。自然界中，硒主要以4種價(jià)態(tài)存在：Se(_2)、Se(0)、Se(+2)和Se(+4)，其中亞硒 酸鹽（+4)和硒酸鹽（+6)最容易被植物吸收，植物中的硒可以被人體有效吸收。我國72% 的土壤缺硒（< 0. 6mg/kg)，屬缺硒嚴(yán)重的國家。WHO和FAO建議人體硒攝入量每天30? 55 μ g。從全球范圍看，缺硒人群（日攝入量7?Ilyg)達(dá)5-10億以上，缺硒人群遠(yuǎn)遠(yuǎn)多 于硒過量的人群。因此，通過食品補(bǔ)硒具有重要意義。
[0003] Sarathchandra 等（1981)和 Dowdle 等（1998)最早分別在 Science 和 Environ. Sci. Technol上闡明硒的轉(zhuǎn)化離不開微生物的作用。目前已報(bào)道有上百篇關(guān)于微生物還原 硒酸鹽和亞硒酸鹽方面的文章，硒還原機(jī)制已得到部分解釋，而關(guān)于低價(jià)硒氧化方面已報(bào) 道的文章卻鮮有報(bào)道，硒氧化菌和應(yīng)用方面的研宄也未見相關(guān)的專利申請。
[0004] 目前使植物富硒的方式是通過在土壤中添加亞硒酸鹽或葉面噴灑亞硒酸鹽的化 學(xué)方式，但這些方式成本高，植物富硒效率一般，不可持續(xù)，且會(huì)對(duì)操作人員造成中毒和造 成河流等水體污染。而利用微生物將植物不可利用形態(tài)硒轉(zhuǎn)化可利用形態(tài)硒促進(jìn)植物富硒 的方式的研宄目前還未見報(bào)道，該方式成本低，操作方便，且不會(huì)對(duì)操作人員造成中毒和河 流造成污染，富硒效率比較高且穩(wěn)定，并具有一定的可持續(xù)性。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0005] 本發(fā)明目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和填補(bǔ)硒地理化學(xué)循環(huán)硒氧化方面的空白， 分離得到一株具有單質(zhì)硒氧化能力和能促進(jìn)煙草等植株富硒的柄桿菌T5M6。利用該菌可以 研宄硒氧化的機(jī)理和應(yīng)用到農(nóng)作物當(dāng)中促進(jìn)農(nóng)作物富集硒元素，克服現(xiàn)有植物富硒技術(shù)缺 陷。
[0006] 該發(fā)明發(fā)現(xiàn)一株細(xì)菌，具有將不可溶的零價(jià)單質(zhì)硒轉(zhuǎn)化為高價(jià)可溶態(tài)硒的能力。 該菌株在細(xì)菌培養(yǎng)基和土壤中能將化學(xué)單質(zhì)硒和硒礦粉不可溶的低價(jià)硒氧化成可溶的高 價(jià)硒，可溶的高價(jià)硒可以被植物利用并富集，從而達(dá)到微生物促進(jìn)植物富硒的目的。鑒定其 為柄桿菌T5M6 (Caulobacter sp. T5M6)，這個(gè)屬是化能有機(jī)營養(yǎng)型的一個(gè)屬，為嚴(yán)格的好氧 細(xì)菌，生長于貧養(yǎng)的水和有機(jī)質(zhì)貧乏的土壤中。該硒氧化菌株T5M6分離自湖北恩施高硒土 壤。
[0007] 本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：
[0008] 本發(fā)明人從中國湖北省恩施州高硒土壤中分離、篩選到一株具有單質(zhì)硒氧化能 力和在土壤中能促進(jìn)煙草等植株富硒的柄桿菌T5M6, 申請人:將該菌命名為柄桿菌T5M6， Caulobacter sp.T5M6,于2014年12月16日送交中國.武漢.武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物 保藏中心（CCTCC)保藏，其保藏號(hào)為CCTCC NO !M2014647。
[0009] 該菌株能在細(xì)菌培養(yǎng)基和土壤中能將化學(xué)單質(zhì)硒和硒礦粉不可溶的低價(jià)硒氧化 成可溶的高價(jià)硒，可溶的高價(jià)硒可以被植物利用并富集，從而達(dá)到微生物促進(jìn)植物富硒的 目的。通過盆栽實(shí)驗(yàn)初步研宄表明，本發(fā)明的菌株在微生物促進(jìn)植物富硒方面具有良好的 應(yīng)用前景。
[0010] 本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)如下：
[0011] (1)本發(fā)明分離的一株具有能將零價(jià)的化學(xué)單質(zhì)硒氧化成高價(jià)硒的柄桿菌T5M6， 填補(bǔ)現(xiàn)有硒氧化菌的缺乏。
[0012] (2)本發(fā)明的柄桿菌T5M6在土壤中能將單質(zhì)硒和硒礦粉的不可溶性硒轉(zhuǎn)化為可 溶性硒，有利于植物吸收。
[0013] (3)本發(fā)明為微生物促進(jìn)植物富硒的方式為植物富硒提供一種更環(huán)保的新途徑。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0014] 序列表SEQ ID NO :1是本發(fā)明分離的柄桿菌T5M6 (Caulobacter sp.)基因組16S rRNA基因的核苷酸序列。
[0015] 圖1 :本發(fā)明分尚的柄桿菌T5M6菌株在系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化地位圖。
[0016] 圖2 :是本發(fā)明的技術(shù)路線圖。
[0017] 圖3 :本發(fā)明的柄桿菌T5M6在1/5LB培養(yǎng)基中氧化單質(zhì)硒的結(jié)果圖。附圖標(biāo)記說 明：圖3中的T5M6表示只加柄桿菌T5M6不加硒的處理對(duì)照，CK+Se表示只加硒不加柄桿菌 T5M6的處理對(duì)照，T5M6+Se表示既加柄桿菌T5M6又加硒的實(shí)驗(yàn)處理；
[0018] 圖4 :是柄桿菌T5M6在土壤實(shí)驗(yàn)中氧化單質(zhì)硒和硒礦粉的結(jié)果圖。圖4A是柄桿 菌T5M6 土壤中氧化化學(xué)單質(zhì)硒增加可溶態(tài)硒的含量；圖4B是柄桿菌T5M6 土壤中氧化硒 礦粉增加可溶態(tài)硒的含量。附圖標(biāo)記說明：圖4A是柄桿菌T5M6在添加化學(xué)單質(zhì)硒處理的 土壤實(shí)驗(yàn)，附圖標(biāo)記說明：CK結(jié)果為0· 26±0· 02mg/kg(土），CK+Se結(jié)果為2. 38±0· 56mg/ kg (土），Se+T5M6結(jié)果為7· 61±0· 68mg/kg (土）。圖4Β·是柄桿菌T5M6在添加硒礦粉處 理的土壤實(shí)驗(yàn)，CK 結(jié)果為 0· 26±0· 02mg/kg(土），CK+Se 結(jié)果為 0· 77±0· 15mg/kg(土）， Se+T5M6結(jié)果為3. 11 ±0. 65mg/kg (土）。CK表示不加硒不加柄桿菌T5M6的空白對(duì)照，CK+Se 表不加硒不加柄桿菌T5M6的陽性對(duì)照，Se+T5M6表不加硒加柄桿菌T5M6的實(shí)驗(yàn)處理。
[0019] 圖5 :加柄桿菌T5M6處理后煙草植株吸收硒的效果圖。
[0020] 圖5A.是盆栽煙草葉部硒含量，圖5B.是盆栽煙草莖部硒含量，圖5C.是盆栽煙草 根部硒含量；附圖標(biāo)記說明：CK表不不加硒不加柄桿菌T5M6的空白對(duì)照，T5M6表不加柄桿 菌T5M6不加硒的對(duì)照處理，CK+Se表不加硒不加柄桿菌T5M6的陽性對(duì)照，Se+T5M6表不加 硒加柄桿菌T5M6的實(shí)驗(yàn)處理。
[0021] 圖6 :是柄桿菌T5M6在溫室大棚盆栽實(shí)驗(yàn)促進(jìn)白菜植株富硒后各部位的硒含量。 圖6A是盆栽白菜地上部分硒含量；圖6B是盆栽小白菜地下部分硒含量。附圖標(biāo)記說明： CK表不不加硒不加柄桿菌T5M6的空白對(duì)照，T5M6表不加柄桿菌T5M6不加硒的對(duì)照處理， CK+Se表示加硒不加菌的陽性對(duì)照，Se+T5M6表示加硒加菌的實(shí)驗(yàn)處理。

【具體實(shí)施方式】
[0022] 實(shí)施例1 :柄桿菌T5M6 (Caulobacter sp.)的分離、鑒定
[0023] (1)樣品采取： 申請人:與2012年7月從湖北省恩施土家族苗族自治州高硒地區(qū)表 層土壤中采集到本發(fā)明所用的高硒土樣品。
[0024] (2)菌體分離純化：稱取土樣IOg于裝有90ml無菌生理鹽水的三角瓶中，置28°C 搖床中振蕩半小時(shí)，再依次取Iml加入到9ml無菌生理鹽水中逐步稀釋至1(Γ2,1(Γ3,1〇Λ 1(Γ5,分別取0. Iml涂布1/10LB固體培養(yǎng)基中，每個(gè)梯度涂3個(gè)平板，置28°C恒溫培養(yǎng)箱 培養(yǎng)一周，挑取單菌落劃線純化，純化后按50%甘油：菌液（體積比1:1)保存于EP管 中，-80 °C保藏。
[0025] (3)硒氧化菌的篩選：稱取0. Ig單質(zhì)硒粉（CP)于含有100ml 1/10LB液體培養(yǎng)基 的250ml的三角瓶中在115°C滅菌20min，冷卻后，接入菌液150 μ 1，28°C，160rpm搖床培養(yǎng) 8d，中間定點(diǎn)取樣（上清），將所得上清液于SOOOrpm離心lOmin，使用原子熒光進(jìn)行檢測四 價(jià)硒的含量。若四價(jià)硒含量明顯增加，說明該菌對(duì)單質(zhì)硒具有氧化性。
[0026] (4)硒氧化菌的分類鑒定：用牙簽挑取各菌株的單克隆于50yL無菌雙蒸 水中，混勻。用菌落PCR方法獲得PCR擴(kuò)增模板，擴(kuò)增體系為50 μ L體系，通用引物 27F(5' AGAGTTTGATCMTGGCTCAG3'）和 1492R(5' GGYTACCTTGTTACGACTT3'）。擴(kuò)增條件為：預(yù) 變性，95°C，5min ;變性，94°C，45sec ;退火，49°C，45sec ;延伸，72°C，1. 5min 變性-延伸 35 個(gè)循環(huán)；延伸：72°C，10min。得到如序列表SEQ ID N0:1所示的核苷酸序列，序列長度為 1395bp。用濃度為1%的瓊脂糖凝膠電泳來檢測PCR產(chǎn)物。送至測序公司（武漢擎科創(chuàng)新 生物科技有限公司）進(jìn)行測序。將得到的16S rRNA基因序列（如SEQ ID NO :1所示的序 列）與GenBank文庫中已有序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明分離的T5M6菌株相似度最高的兩 株菌分別為 Caulobacter segnis ATCC 21756 (T)和 Caulobacter vibrioides CB51 (T)，相 似度分別為98. 24%和98. 10%， 申請人:鑒定該菌為柄桿菌屬。通過N-J算法分析了該菌在 相似菌株中系統(tǒng)發(fā)育樹的進(jìn)化地位，結(jié)果如圖1所示。
[0027] 柄桿菌（Caulobacter sp. ) T5M6 的菌學(xué)特征：
[0028] 菌落為黃色，光滑整齊，凸面，不透明，菌落大小：較小，根據(jù)該菌的16S rRNA，申請 人鑒定該菌株為柄桿菌T5M6,分類命名為Caulobacter sp.
[0029] 實(shí)施例2 :柄桿菌T5M6的單質(zhì)硒氧化曲線
[0030] 具體步驟如下所述：
[0031] (1)準(zhǔn)備3瓶已滅菌的1/10LB液體培養(yǎng)基，每瓶100ml。取三瓶各加入0. Ig已 滅菌的單質(zhì)硒。接種對(duì)數(shù)期（0D600值約I. 0)T5M6菌液，接種量0. 25%?；靹蚝罅⒖倘?2ml，該樣作為首次取樣，置于干凈的離心管中。將各三角瓶置于28°C，160rpm恒溫?fù)u床中 培養(yǎng)。取樣時(shí)間分別為〇d、ld、2d、4d、5d、6d，該實(shí)驗(yàn)設(shè)置三重復(fù)。取樣結(jié)束后樣品作以下處 理；
[0032] (2)每次取的樣品2ml，12000rpm離心10min，保留上清液，上清于4°C冰箱保存；
[0033] (3)測樣前，取Iml上清于IOml離心管中，然后加入4ml去離子水稀釋混勻；
[0034] (4)用北京吉天儀器有限公司原子熒光光譜儀（HG-AFS)檢測樣品中硒的含量，載 流為 2. 4mol/L HCL (G. R)，還原劑為(λ 5% KOH(A. R) +2% KBH4 (G. R);
[0035] (5)以測得硒濃度（μ g/L)為縱坐標(biāo)，時(shí)間為橫坐標(biāo)構(gòu)建單質(zhì)硒氧化曲線圖（如圖 3所示）。
[0036] 實(shí)施例3 :利用土壤實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)柄桿菌T5M6對(duì)單質(zhì)硒和硒礦粉的氧化
[0037] 本實(shí)施例中，硒礦粉的硒含量是189mg/kg，單質(zhì)硒試劑（化學(xué)純，99% );
[0038] (1) 土樣的前期處理：選取土地平整，表面雜草長勢均勻，未被污染的健康土區(qū) 域，去除表層雜草，采集5-lOcm左右深的土壤，然后進(jìn)行風(fēng)干，碾磨，過40目篩，收集起來留 用；
[0039] (2)準(zhǔn)備6個(gè)250ml大小黑色盒子，每個(gè)盒子稱入50g風(fēng)干土，取三個(gè)盒子各加入 〇.5g硒礦粉，取三個(gè)盒子各加入0. Ig單質(zhì)硒，拌勻，然后在每盒中加入IOml去離子水，平衡 24h。實(shí)驗(yàn)每個(gè)處理設(shè)三重復(fù)；
[0040] (3)平衡完后，均勻在土表層噴灑液，菌液量根據(jù)>1. 0X108cfu/g(土）來換算，本 實(shí)施例中加入柄桿菌T5M6的處理，使用量是Iml柄桿菌T5M6原液；不加柄桿菌T5M6的處 理用等量去離子水代替，拌勻后，稱取重量并記錄，然后置于28°C恒溫室培養(yǎng)1個(gè)月，期間 根據(jù)稱重來計(jì)算加水量，保持土壤恒定的含水率；
[0041] (4)培養(yǎng)完成后，將培養(yǎng)的土在70°C (溫度不能太高）烘箱烘干，碾磨，過100目 的篩，收集得到待測的土樣；
[0042] (5)根據(jù)吳少尉等（2004年）報(bào)道的"土壤硒形態(tài)提取方法"連續(xù)提取待測土樣中 可溶態(tài)硒的含量和處理提取的硒樣品；
[0043] (6)北京吉天儀器有限公司原子熒光光譜儀（HG-AFS)檢測待測土樣中硒的含量；
[0044] (7)將所測試的結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS Statisticsl7. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理〇11^口://\￥?^· ddooo. com/softdown/53379. htm)，以土壤單位重量可溶性硒含量（mg/kg(±))為縱坐標(biāo)，各 個(gè)處理為橫坐標(biāo)，Origin 8軟件做圖，結(jié)果如圖4所示。
[0045] 實(shí)施例4 :柄桿菌T5M6在促進(jìn)煙草富硒中的應(yīng)用
[0046] 在本實(shí)施例中的硒礦粉的硒含量是189mg/kg，試驗(yàn)植物煙草（烤煙品種為云煙1 號(hào)）。
[0047] (1) 土壤預(yù)處理：將風(fēng)干土稱重15kg/盆，然后施入硒礦粉396. 8g/盆（5mg/ 1^(土））和4(^/盆的復(fù)合肥做基肥（復(fù)合肥隊(duì)0:?205:1( 20 10:10:20)，拌勻，按15%含水 率加入水，平衡3d ;
[0048] (2)平衡完后，把用生理鹽水保存的菌母液用水稀釋（按菌量>107cfu/g⑴加入 盆后，土含水率為30% )，均勻地將菌液噴灑在土表面，然后拌勻，平衡4d(每天噴灑少量的 水，保持土濕潤），每個(gè)處理10個(gè)重復(fù)；
[0049] (3)平衡完后，移栽已經(jīng)培育好的煙苗（煙苗培育時(shí)間30d左右）；
[0050] (4)移栽后按煙草植株生長需求保持充足的水分；
[0051] (5) 50d后，添加追肥追菌（追肥為20g/盆上述復(fù)合肥，追菌量按>106cfu/g(±)追 加到每盆當(dāng)中），何時(shí)取樣進(jìn)行第一次取樣（包括植株全株樣品和土壤樣品）；
[0052] (6) 90d后，煙草成熟（煙草采收前）進(jìn)行第二次取樣（包括植物全株樣品和土壤 樣品）；
[0053] (7)將植物樣品按照常用的制茶工藝殺青、烘干（至含水率5%以下）、粉碎后，按 中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 500993-2010食品中砸的測定的方法（中華人民共和國衛(wèi)生 部于2010. 03. 26發(fā)布，2010. 06. 01實(shí)施）消解植株樣品；種植后土壤樣品根據(jù)吳少尉等 (2004年）報(bào)道的"土壤硒形態(tài)提取方法"提取各形態(tài)硒和處理提取的形態(tài)硒
[0054] (8)用北京吉天儀器有限公司原子熒光光譜儀（HG-AFS)測定植株樣品中的硒和 土壤中的硒；
[0055] (9)將所測試的結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS Statisticsl7. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理〇11^口://\￥?^· ddooo. com/softdown/53379. htm)，以植物單位重量硒含量（mg/kg)為縱坐標(biāo)，各個(gè)處理為 橫坐標(biāo)，Origin 8軟件做圖，結(jié)果如圖5所示。
[0056] 實(shí)施例5 :柄桿菌T5M6在在促進(jìn)白菜富硒中的應(yīng)用
[0057] 本實(shí)施例中硒礦粉的硒含量是189mg/kg，應(yīng)用的品種是白菜
[0058] (1) 土壤預(yù)處理：將風(fēng)干土稱重15kg/盆，然后施入硒礦粉396. 8g/盆（5mg/ kg(土）），拌勻，按15%含水率加入水，平衡3d ;
[0059] (2)平衡完成后，把用生理鹽水保存的柄桿菌T5M6母液用水稀釋（生理鹽水與柄 桿菌T5M6的配比，或者按照含菌的絕對(duì)量定義T5M6,按加入菌液（因?yàn)檫@個(gè)菌液中菌含量 是不清楚的，請用規(guī)范方法說明，如cfu/g)后每盆土含水率為30% )，均勻地將柄桿菌菌液 噴灑在土表面，然后拌勻，平衡4d (每天噴灑少量的水，保持土濕潤）。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)；
[0060] (3)平衡完后，撒上上海青小白菜種子；
[0061] (4)撒完種后按白菜生長需求保持充足的水分；
[0062] (5) 30d后，去掉多余的苗，保留3株；
[0063] (6) 60d后，白菜處于生長旺盛期，進(jìn)行第一次取樣（植物全株），每盆取兩株；
[0064] (7) 75d后，白菜開始包芯，取第二次樣（植物全株和土壤樣品）；
[0065] (8)樣品殺青按照常用的制茶工藝、烘干（至含水率5%以下）、粉碎后，按中華人 民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 500993-2010 "食品中硒的測定的方法"（中華人民共和國衛(wèi)生部于 2010. 03. 26發(fā)布，2010. 06. 01實(shí)施）消解植株樣品；種植后土壤樣品根據(jù)吳少尉等（2004 年）報(bào)道的"土壤硒形態(tài)提取方法"提取各形態(tài)硒和處理提取的形態(tài)硒
[0066] (9)用北京吉天儀器有限公司生產(chǎn)的原子熒光光譜儀（型號(hào)為HG-AFS)測定植株 樣品中的硒和土壤中的硒
[0067] (10)將所測試的結(jié)果數(shù)據(jù)用SPSS Statisticsl7. 0統(tǒng)計(jì)軟件處理（http://www. ddooo. com/softdown/53379. htm)，以植物單位重量硒含量（mg/kg)為縱坐標(biāo)，各個(gè)處理為 橫坐標(biāo)，Origin 8軟件做圖，結(jié)果如圖6所示。
[0068] 主要參考文獻(xiàn)
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【權(quán)利要求】
1. 一株分離的對(duì)單質(zhì)硒具有氧化作用的柄桿菌T5M6 (Caulobacter sp.) T5M6,保藏在 中國典型培養(yǎng)物保藏中心，其保藏號(hào)為CCTCC NO :M2014647。
2. 如權(quán)利要求1所述的一株分離的對(duì)單質(zhì)硒具有氧化作用的柄桿菌T5M6,其特征在于 該囷的16S rRNA基因序列如序列表SEQ ID N0:1所不。
3. 權(quán)利要求1或2所述的對(duì)單質(zhì)硒具有氧化作用的柄桿菌T5M6在缺硒環(huán)境中的應(yīng)用。
4. 如權(quán)利要求3所述的的應(yīng)用，其特征在于，所述的硒是零價(jià)硒。
【文檔編號(hào)】C12R1/01GK104498411SQ201410854944
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】王革嬌, 張富軍, 鄭世學(xué), 王瑞, 栗雨桑 申請人:華中農(nóng)業(yè)大學(xué)