檢測(cè)番茄斑萎病毒的rt-hda引物、試劑盒及方法
【專利摘要】本發(fā)明公開了一種檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA引物，試劑盒及方法，所述引物為序列表SEQ ID NO:1和SEQ ID No：2所示的寡核苷酸序列。所述的試劑盒包含如下組分：1）RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液；2）無(wú)RNA酶的去離子水，作為空白對(duì)照；3）陽(yáng)性對(duì)照樣品：含番茄斑萎病毒RNA模板；4）陰性對(duì)照樣品：不含番茄斑萎病毒的健康番茄組織RNA模板；檢測(cè)方法包括下列步驟：1）待檢樣品RNA提取，2）番茄斑萎病毒RNA進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增；3）電泳檢測(cè)結(jié)果及描述及判定。本發(fā)明的HDA檢測(cè)方法更快、更快捷，安全可靠，與PCR相比不需要PCR儀，設(shè)備要求簡(jiǎn)單，適用于對(duì)番茄斑萎病毒進(jìn)行快速檢測(cè)確證，可廣泛應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)及環(huán)境中的疫情監(jiān)控及進(jìn)出口貿(mào)易中該類病毒的監(jiān)測(cè)及檢測(cè)。
【專利說(shuō)明】檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA引物、試劑盒及方法

【技術(shù)領(lǐng)域】
[0001]本發(fā)明涉及一種檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA引物，試劑盒及方法，屬于病毒檢測(cè)【技術(shù)領(lǐng)域】。

【背景技術(shù)】
[0002]近年來(lái)，番前斑萎病毒(Tomato spotted wilt virus,TSffV)以其廣泛的寄主范圍和造成的巨大經(jīng)濟(jì)損失已被列為世界危害最大的十種植物病毒之一。在20世紀(jì)60?80年代，該病毒曾在歐美及非洲的煙草和番茄上大流行，每年的發(fā)病率為20%?50%，造成高達(dá)數(shù)10億美元的損失。在美國(guó)夏威夷、巴西、意大利和南非，TSWV在20世紀(jì)80?90年代的流行曾導(dǎo)致番茄、萵苣等作物近乎絕產(chǎn)。近年來(lái)，番茄斑萎病毒屬病毒特別是TSWV，已成為全世界引起多種經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物極大經(jīng)濟(jì)損失的重要因子。
[0003]我國(guó)目前種植的辣椒、洋蔥、生菜等蔬菜種子很多來(lái)自于世界各地，尤其是番茄種子基本依賴進(jìn)口，進(jìn)口國(guó)別包括美國(guó)、日本、荷蘭、泰國(guó)等國(guó)，這些進(jìn)口國(guó)目前都有番茄斑萎病毒的發(fā)生與報(bào)道，我國(guó)口岸曾于2012年在進(jìn)境的種子中截獲TSWV病毒。而傳統(tǒng)的TSWV檢測(cè)及確證方法一般通過(guò)生物寄主、形態(tài)學(xué)試驗(yàn)判定植株是否具有植物病毒，這些方法費(fèi)時(shí)，操作繁瑣，不能滿足病害防治的需要。
[0004]在現(xiàn)有的核酸檢測(cè)方法中，常用的有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(常規(guī)PCR和實(shí)時(shí)熒光PCR)，該方法靈敏、特異，但需要高品質(zhì)熱循環(huán)儀，而且因?yàn)闇囟妊h(huán)導(dǎo)致較長(zhǎng)。其他新開發(fā)的核酸擴(kuò)增方法，比如 NASBA(nucleic acid sequence-based amplificat1n)、3SR (self-sustained sequence replicat1n)> SDA(strand displacementamplificat1n)等，在擴(kuò)增循環(huán)，都有各自的創(chuàng)新點(diǎn)。NASBA和3SR使用一系列轉(zhuǎn)錄和反轉(zhuǎn)錄過(guò)程來(lái)循環(huán)以避免高溫變性作用，SDA則使用限制性內(nèi)切酶和修飾過(guò)的模板來(lái)循環(huán)擴(kuò)增。雖然它們的敏感性都很高，可以檢測(cè)并擴(kuò)增小于10個(gè)拷貝的核酸樣本，但是它們還有各自需要克服的缺點(diǎn)。技術(shù)要求、材料要求、技術(shù)本身特異性缺陷等方面嚴(yán)重束縛了這些技術(shù)的推廣應(yīng)用。因此，有必要提供一種更便捷，檢測(cè)靈敏度更高的檢測(cè)番茄斑萎病毒的方法。
[0005]依賴解旋酶恒溫基因擴(kuò)增技術(shù)(Helicase-Dependent IsothermalAmplificat1n, HDA)是2004年B1Helix的研宄人員模擬動(dòng)物體內(nèi)DNA的復(fù)制機(jī)制發(fā)明的一種新的體外恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。該技術(shù)利用DNA雙鏈解旋酶打開雙鏈DNA，同時(shí)在單鏈結(jié)合蛋白(SSB)DNA聚合酶的作用下，擴(kuò)增靶片段，實(shí)現(xiàn)目的基因的體外擴(kuò)增。HDA技術(shù)與其他基因擴(kuò)增技術(shù)比較，具有如下優(yōu)勢(shì):
[0006]1、與PCR技術(shù)相比，HDA技術(shù)模仿自然界DNA合成方式，憑借DNA解旋酶解開雙鏈并完成擴(kuò)增，而傳統(tǒng)PCR是通過(guò)變性-退火-延伸過(guò)程的多次循環(huán)實(shí)現(xiàn)。由于原理的不同，使得HDA的優(yōu)點(diǎn)尤其突出:①HDA反應(yīng)在同一溫度下進(jìn)行，因而不需要昂貴的PCR儀，有利于在基層實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用。②由于只用一種溫度擴(kuò)增使得HDA反應(yīng)時(shí)間明顯縮短，僅需Ih左右。③HDA技術(shù)采用去除了 5’ -3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，該酶兼具耐高溫性、高效擴(kuò)增反應(yīng)性、極好的條帶均一性及高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，不易引起非特異性擴(kuò)增，使得HDA技術(shù)具有更高的特異性和敏感性。
[0007]2、與其他恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)相比，HDA是一種真正意義上的恒溫基因擴(kuò)增方法。例如:SDA、LAMP等均需要熱變性，而HDA不需此部即可完成反應(yīng)。此外，盡管HDA的反應(yīng)體系組稍顯復(fù)雜，但操作簡(jiǎn)單易學(xué)。尤其引物設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單。SDA技術(shù)需要四條引物，同時(shí)還需要經(jīng)修飾過(guò)的dNTP作底物，而且靶序列的復(fù)雜性也限制了其應(yīng)用范圍。LAMP技術(shù)具有簡(jiǎn)單、快速、高效、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，但引物設(shè)計(jì)復(fù)雜，難度較大，且對(duì)靶序列的要求較高:目的序列長(zhǎng)度限制在200bp左右，從中設(shè)計(jì)的四至六條引物Tm互有差別，且能識(shí)別6個(gè)不同的區(qū)域。而HDA技術(shù)的引物設(shè)計(jì)與常規(guī)PCR方法相同，僅需兩條普通引物即可?？傊?，與同類新型PCR技術(shù)相比，HDA技術(shù)更簡(jiǎn)單，更有效，具有良好的應(yīng)用前景。
[0008]據(jù)最新報(bào)道，現(xiàn)有的HDA技術(shù)還包括一種不僅可擴(kuò)增大分子DNA片段，還可直接擴(kuò)增完整環(huán)狀質(zhì)粒DNA的環(huán)HDA法(T和circular heIicase-dependentamplificat1n, cHDA)。利用cHDA的特異性擴(kuò)增環(huán)狀DNA能力，可直接從病原體中檢測(cè)含有環(huán)狀DNA的病毒等。HDA技術(shù)與熒光標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合還可以實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)檢測(cè)。研宄表明，HDA技術(shù)能夠擴(kuò)增微生物基因組DNA、RNA、質(zhì)粒DNA和cDNA等。HDA方法擴(kuò)增能力強(qiáng)，現(xiàn)用的Uvrd系統(tǒng)擴(kuò)增可達(dá)100多萬(wàn)倍，能夠從基因組DNA中檢測(cè)到低于10個(gè)拷貝的靶基因。綜上所述，HDA技術(shù)是一種不可比擬的真正實(shí)用的恒溫基因擴(kuò)增方法，有望成為一種重要的診斷工具。
[0009]目前，國(guó)內(nèi)外還沒(méi)有關(guān)于HDA檢測(cè)植物病毒的研宄。我們將首次建立起快速檢測(cè)番前斑萎病毒的HDA技術(shù)。該發(fā)明成果將有望成為植物疫病分子診斷領(lǐng)域的突破性技術(shù)，是植物流行病學(xué)檢測(cè)技術(shù)體系的進(jìn)一步完善和發(fā)展。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0010]本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是:一種用于檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA擴(kuò)增引物及試劑盒，即利用RT-HDA擴(kuò)增方法檢測(cè)番茄斑萎病毒的引物和試劑盒，克服其他檢測(cè)方法在病毒檢測(cè)的局限性，為番茄斑萎病毒的檢測(cè)提供有效工具，能夠快速、特異性強(qiáng)、靈敏度高而且低成本的檢測(cè)番茄斑萎病毒。
[0011]為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案是:
[0012]本發(fā)明提供的番茄斑萎病毒RT-HDA檢測(cè)引物組，包括引物對(duì)HD-Pl和HD-P2，它們的堿基序列分別為SEQ ID NO:1?2。
[0013]本發(fā)明的試劑盒，包含如下組分:
[0014]I) RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液:
[0015]包含10 X RT-HDA 緩沖液 5 μ L、MgS04 (10mM) 2 μ L，NaCl (500mM) 4 μ L，dNTP (3.0mM) 3.5 μ L，酶混合液酶混合液(DNA 解旋酶 0.4 μ g,AMV-Bst 40U 和 ThermoScript反轉(zhuǎn)錄酶 4U) 3.5 μ L、RNase-Free Water 20 μ L、HD-Pl 和 HD-P2 各 I μ L0
[0016]其中10\奶-邢六緩沖液包括1011111101/1 KCL、20mmol/L Tris-Cl (Ph8.8，25°C )，所述引物HD-Pl和HD-P2分別具有序列表SEQ ID NO:1?2的堿基序列；
[0017]2)陽(yáng)性對(duì)照樣品:含番茄斑萎病毒RNA模板，作為陽(yáng)性模板；
[0018]3)陰性對(duì)照樣品:不含番茄斑萎病毒的健康番茄組織RNA模板，作為陰性模板；
[0019]4)空白對(duì)照樣品:為DEPC去離子水；
[0020]使用以上試劑盒，檢測(cè)樣品中番茄斑萎病毒的方法，依次包括下列步驟:
[0021]I)待檢樣品RNA提取
[0022]采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板，
[0023]2)番茄斑萎病毒RT-HDA擴(kuò)增
[0024]A:在反應(yīng)管中依次加入待檢模板RNA 10 μ L和RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液40 μ L，充分混勻；
[0025]B:在65°C恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)90min ；
[0026]擴(kuò)增時(shí)，應(yīng)設(shè)立3個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照(番茄斑萎病毒RNA模板代替樣品RNA模板)、陰性對(duì)照(以陰性模板RNA代替樣品RNA模板)、空白對(duì)照(DEPC水代替樣品RNA模板)
[0027]3)電泳檢測(cè)
[0028]取1.5g瓊脂糖，于10mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 μ L?6 μ LHDA擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。如果擴(kuò)增片段為131bp，說(shuō)明待檢病毒是TSWV，如果沒(méi)有出現(xiàn)131bp擴(kuò)增片段，則說(shuō)明待檢病毒不是TSWV。
[0029]上述番茄斑萎病毒RT-HDA檢測(cè)方法在番茄、辣椒上的應(yīng)用。
[0030]本發(fā)明提供的快速檢測(cè)番茄斑萎病毒的分子生物學(xué)方法，具有靈敏度高、特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益結(jié)果是:
[0031]1、簡(jiǎn)便易行:該檢測(cè)方法通過(guò)恒溫水浴鍋或有穩(wěn)定熱源的設(shè)備就能進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，通過(guò)反應(yīng)產(chǎn)物顏色變化即可判定結(jié)果，省去了昂貴的儀器設(shè)備、繁瑣的電泳過(guò)程；
[0032]2、檢測(cè)高效性:該檢測(cè)方法所用檢測(cè)時(shí)間不足I小時(shí)，而PCR擴(kuò)增時(shí)間較長(zhǎng)，一般需要2小時(shí)以上，這樣能大大提高了檢測(cè)的效率；
[0033]3、靈敏度高:以番茄斑萎病毒RNA為模板，該方法的檢測(cè)下限為1fg/μ L，是常規(guī)PCR 的 100 倍；
[0034]4、準(zhǔn)確性高:該不需要從樣本中純化RNA，可直接利用發(fā)病組織或病殘?bào)w提取RNA快速檢測(cè)，大大提高了檢測(cè)的準(zhǔn)確度；
[0035]5、特異性強(qiáng):HDA技術(shù)采用去除了 5’_3’外切酶活性的BstDNA聚合酶，該酶兼具耐高溫性、高效擴(kuò)增反應(yīng)性、極好的條帶均一性及高準(zhǔn)確性等特點(diǎn)，不易引起非特異性擴(kuò)增，使得HDA技術(shù)具有更高的特異性。

【專利附圖】

【附圖說(shuō)明】
[0036]圖1是本發(fā)明的RT-HDA特異性實(shí)驗(yàn)圖。1:番茄斑萎病毒；2:陽(yáng)性對(duì)照；3:鳳仙花壞死斑病毒；4:番前花葉病毒；5:番前黃化曲葉病毒；6:番前黑環(huán)病毒。
[0037]圖2是本發(fā)明的RT-HDA靈敏性實(shí)驗(yàn)圖。其中I?7:1.56X 10'1.56X 10'1.56 X 10' 1.56 X 10' 1.56 X 10' 1.56 X 10' 1.56 X l(T7ng/ μ LTSffV 感病材料總 RNA0
[0038]圖3是本發(fā)明的RT-PCR靈敏性實(shí)驗(yàn)圖。其中I?6:1.56X 10'1.56X 10'1.56 X 10' 1.56 X 10' 1.56 X 10' 1.56 X l(T6ng/ μ L TSffV 感病材料總 RNA0

【具體實(shí)施方式】
[0039]本發(fā)明采用RT-HDA技術(shù)，并根據(jù)番茄斑萎病毒N片段的基因序列設(shè)計(jì)了相應(yīng)的RT-HDA檢測(cè)引物組，包括引物對(duì):HD-P1和HD-P2，由此發(fā)明了用于檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA檢測(cè)方法及試劑盒。應(yīng)用本發(fā)明的檢測(cè)方法及試劑盒，僅需通過(guò)對(duì)辣椒、番茄等疑似感染植株樣品進(jìn)行RNA提取并進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增，即可快速檢測(cè)出是否感染番茄斑萎病毒，方便基層快速、準(zhǔn)確、簡(jiǎn)便地進(jìn)行病害診治，進(jìn)而采取適當(dāng)?shù)姆乐未胧?，減少病害帶來(lái)的損失。
[0040]實(shí)施例1特異性實(shí)驗(yàn)
[0041](I)引物設(shè)計(jì)
[0042]本發(fā)明根據(jù)NCBI核酸序列數(shù)據(jù)庫(kù)中TSWV的N基因全長(zhǎng)序列(KC294570.1 (昆明分離物)、HM581936.1 (南京分離物)、JF730744.1 (韓國(guó)分離物)、HM180089 (臺(tái)灣分離物)、HQ406984.1 (美國(guó)分離物)、KC494503.1 (新西蘭分離物)、KM379142.1 ( 土耳其分離物)、KF146703.1 (委內(nèi)瑞拉分離物))，在保證擴(kuò)增的兼并性和通用性的前提下通過(guò)比較分析TSWV N基因的高度保守區(qū)，設(shè)計(jì)RT-HDA引物對(duì)HD-Pl和HD-P2，設(shè)計(jì)完成后將引物在數(shù)據(jù)庫(kù)的Primer-Blast模塊下進(jìn)行比對(duì)驗(yàn)證，最后選取以下RT-HDA檢測(cè)引物組:
[0043]上游引物HD-Pl: GGCTTGAATCAGAGGGTGAGA (見序列表 SEQ ID NO:1),
[0044]下游引物HD-P2:TTGGAGCCACTGACATGACC(見序列表 SEQ ID NO: 2) ο
[0045](2)病毒RNA的提取
[0046]取0.1g番前斑萎病毒、番前黑環(huán)病毒、鳳仙花壞死斑病毒、番前花葉病毒、番茄黃化曲葉樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5mL離心管中，加入ImLTrizolReagent，顛倒混勾，2°C?8°C，12000g，離心 1min0 取上清，15°C?30°C，放置 5min ；加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，15s。15°C?30°C，放置2min?3min ;2°C?8°C，12000g，離心15min。小心吸取約為600 μ L的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加50(^1^異丙醇混合上清液，15°〇?30°〇，放置1011^11。2°C?8°C，12000g，離心lOmin。去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌；2°C?8°C，7500g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 μ L?50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0047](3)五種病毒RT-HDA擴(kuò)增
[0048]Α:分別在反應(yīng)管中依次加入五種病毒的待檢模板RNA 10 μ L和RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液40 μ L，充分混勻。
[0049]B:在65°C恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行RT-HDA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)90min。
[0050](4)電泳檢測(cè)
[0051]取1.5g瓊脂糖，于10mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 μ g/mL,制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 μ L?6 μ LHDA擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。如果擴(kuò)增片段為131bp，說(shuō)明待檢病毒是TSWV，如果沒(méi)有出現(xiàn)131bp擴(kuò)增片段，則說(shuō)明待檢病毒不是TSWV。
[0052]該組引物經(jīng)在線BLAST的結(jié)果證實(shí)，具有很高的特異性，不會(huì)與其他病毒交叉反應(yīng)。番前斑萎病毒為番前斑萎病毒屬病毒，因此研宄選擇了同屬近似種病毒鳳仙花壞死斑病毒及其他三種番茄上常見的主要病毒為測(cè)試毒種。經(jīng)驗(yàn)證，除番茄斑萎病毒RNA出現(xiàn)擴(kuò)增131bp條帶外，其余病毒均無(wú)相應(yīng)擴(kuò)增條帶，與預(yù)期相符，證明該組引物的良好特異性，與上述毒株均無(wú)交叉反應(yīng)(見圖1)。
[0053]實(shí)施例2敏感性實(shí)驗(yàn)
[0054](I)用DEPC水將TSWV病毒RNA模板液向下做10倍梯度稀釋，依次為1.56 X 10'1.56X10'1.56 X 10'1.56 X 10'1.56 X 10'1.56 X 10'1.56 X l(T7ng/μ L，各取 2yL為模板分別進(jìn)行RT-HDA及RT-PCR擴(kuò)增反應(yīng)。擴(kuò)增引物組包含:
[0055]上游引物HD-Pl: GGCTTGAATCAGAGGGTGAGA (見序列表 SEQ ID NO:1),
[0056]下游引物HD-P2:TTGGAGCCACTGACATGACC(見序列表 SEQ ID NO: 2) ο
[0057](2)病毒RNA的提取
[0058]取0.1g不同稀釋濃度的樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5mL離心管中，加入ImL Trizol Reagent，顛倒混勾，2 °C?8 °C，12000g，離心lOmin。取上清，15°C?30°C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C?30°C，放置2min?3min ;2°C?8°C，12000g，離心15min。小心吸取約為600 μ L的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 μ L異丙醇混合上清液，15°C?30°C，放置lOmin。2°C?8°C，12000g，離心1mino去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌;2°C?8°C，7500g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 μ L?50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0059](3)不同濃度的番茄斑萎病毒RT-HDA擴(kuò)增
[0060]Α:分別在反應(yīng)管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNAlO μ L和RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液40 μ L，充分混勻。
[0061]B:在65°C恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)60min。
[0062](4) RT-PCR擴(kuò)增及檢測(cè)
[0063]RT-PCR擴(kuò)增體系參照TIANGEN公司的Quant —步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明配置，反應(yīng)條件為 50°C反轉(zhuǎn)錄 30min ;94°C預(yù)變性 2min ；94°C 30s, 53°C 30s, 72°C 30s，循環(huán)反應(yīng) 35次；65°C延伸 1min0
[0064](4)電泳檢測(cè)
[0065]取1.5g瓊脂糖，于10mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 μ g/mL,制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 μ L?6 μ L擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
[0066](5)結(jié)果判定
[0067]RT-HDA產(chǎn)物鑒定:電泳結(jié)果顯示，番茄斑萎病毒使用RT-HDA方法能夠得到10_5稀釋倍數(shù)的模板(見圖2)，可達(dá)到fg級(jí)水平，使用RT-PCR方法能夠得到10_3稀釋倍數(shù)(圖3)，只有pg級(jí)水平。這說(shuō)明本發(fā)明的RT-HDA方法的檢測(cè)靈敏度高出PCR方法一個(gè)數(shù)量級(jí)。
[0068]實(shí)施例3:實(shí)際樣品檢測(cè)及對(duì)比實(shí)驗(yàn)
[0069]將從云南、山東、四川等地田間采集的具有典型TSWV癥狀的病樣及實(shí)驗(yàn)室留樣，分別采用RT-HDA、RT-PCR進(jìn)行檢測(cè)，比較兩種方法的效果，以進(jìn)一步評(píng)估RT-HDA方法的可靠性。
[0070]1、實(shí)際樣品RT-HDA檢測(cè)
[0071]I)病毒RNA的提取
[0072]取0.1g樣品，加液氮研磨成粉末狀，將研磨物迅速移入1.5mL離心管中，加入ImLTrizol Reagent，顛倒混勾，2°C ?8°C，12000g，離心 lOmin。取上清，15°C ?30°C，放置5min;加入0.2mL氯仿，用手劇烈震蕩(勿渦旋振蕩)，約15s。15°C?30°C，放置2min?3min ;2°C?8°C，12000g，離心15min。小心吸取約為600 μ L的上層水相，勿擾動(dòng)中間相和下層相。加500 yL異丙醇混合上清液，15°C?30°C，放置lOmin。2°C?8°C，12000g，離心1mino去除上清液，沉淀中加入ImL 75%乙醇，洗滌；2°C?8°C，7500g，離心5min。去除上清液，沉淀自然干燥后，將其溶于30 μ L?50 μ L無(wú)RNase的水中，即為待檢模板RNA。
[0073](2)不同來(lái)源樣品的番茄斑萎病毒RT-HDA擴(kuò)增
[0074]Α:分別在反應(yīng)管中依次加入不同稀釋倍比的待檢模板RNA 2 μ L和RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液A23yL，充分混勻。
[0075]B:在65°C恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行RT-HDA恒溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)60min。
[0076]3) RT-HDA 產(chǎn)物鑒定
[0077]紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄，電泳結(jié)果顯示，在9份樣品中3份樣品為陽(yáng)性，其他樣品為陰性。
[0078]2、PCR 擴(kuò)增
[0079]I)方法:普通RT-PCR反應(yīng)條件為50°C反轉(zhuǎn)錄30min ;94°C預(yù)變性2min ；94°C 30s，53°C 30s，72°C 30s，循環(huán)反應(yīng) 35 次；65°C延伸 lOmin。
[0080]2)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果:在9份樣品中，3份為陽(yáng)性，其余為6份。
[0081]結(jié)論:利用上述RT-HDA和PCR方法同時(shí)檢測(cè)實(shí)際樣品，兩種方法的符合率100%，但RT-HDA對(duì)設(shè)備要求更低，便捷性更高。
[0082]本發(fā)明所建立的檢測(cè)方法能快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)出番茄斑萎病毒，為科學(xué)研宄和生產(chǎn)實(shí)踐提供了一種簡(jiǎn)便、快速、成本低廉的檢測(cè)技術(shù)，也為斑萎病的早期預(yù)警及合理用藥提供了理論基礎(chǔ)和技術(shù)指導(dǎo)，對(duì)增加生態(tài)、社會(huì)和經(jīng)濟(jì)效益都具有現(xiàn)實(shí)而深遠(yuǎn)的意義。
【權(quán)利要求】
1.一組檢測(cè)番茄斑萎病毒的引物，其特征在于，所述的引物組的序列分別為序列表SEQID NO:1?2所示，其中SEQ ID NO:1為檢測(cè)番茄斑萎病毒的引物HD-P1，SEQ ID NO: 2為檢測(cè)番茄斑萎病毒的引物HD-P2。
2.權(quán)利要求1所述的引物組在檢測(cè)番茄斑萎病毒中的應(yīng)用。
3.權(quán)利要求1所述的引物組在制備檢測(cè)番茄斑萎病毒的試劑盒中的應(yīng)用。
4.一種檢測(cè)番茄斑萎病毒的RT-HDA試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包含如下組分: 1)RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液: 包含 10 X RT-HDA 緩沖液 5 μ L、MgS04(100mM)2 μ L，NaCl (500mM)4 μ L，dNTP (3.0mM) 3.5 μ L，酶混合液 3.5 μ L,RNase-Free Water 20 μ L、HD_P1 和 HD-P2 各 I μ L ; 其中 10\奶-邢六緩沖液包括1011111101/1 KCL、20mmol/L Tris-Cl (pH8.8, 25°C),所述引物HD-Pl和HD-P2分別具有序列表SEQ ID NO:1?2的堿基序列； 所述的酶混合液包括DNA解旋酶0.4 μ AMV-Bst 40U和ThermoScript反轉(zhuǎn)錄酶4U ； 2)無(wú)RNA酶的去離子水，作為空白對(duì)照模板； 3)陽(yáng)性對(duì)照樣品:含番茄斑萎病毒RNA模板，作為陽(yáng)性模板； 4)陰性對(duì)照樣品:不含番茄斑萎病毒的健康番茄組織RNA模板，作為陰性模板。
5.一種應(yīng)用權(quán)利要求4所述的試劑盒檢測(cè)樣品中番茄斑萎病毒的方法，其特征在于，所述的方法包括下列步驟: 1)待檢樣品RNA提取 采取Trizol法或RNA提取試劑盒抽提RNA模板， 2)番茄斑萎病毒RNA進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增； 3)電泳檢測(cè)結(jié)果及描述及判定 1.電泳檢測(cè) 2.結(jié)果描述及判定 ①質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn): 陽(yáng)性對(duì)照在131bp處由特異性擴(kuò)增條帶； 陰性對(duì)照無(wú)特異性擴(kuò)增條帶； 如陰性對(duì)照和陽(yáng)性條件不滿足以上條件，此次試驗(yàn)視為無(wú)效； ②結(jié)果判斷: 陽(yáng)性:在131bp處由特異性擴(kuò)增條帶，表示樣本中含有番茄斑萎病毒； 陰性:無(wú)特異性擴(kuò)增條帶，表明樣品中無(wú)番茄斑萎病毒。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，擴(kuò)增完成后對(duì)RT-HDA擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序驗(yàn)證。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟2)番茄斑萎病毒RNA進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增具體為: A:在反應(yīng)管中依次加入待檢模板RNA 10 μ L和RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)液40 μ L，充分混勻； B:在65°C恒溫反應(yīng)條件下，進(jìn)行RT-HDA擴(kuò)增反應(yīng)90min ； 擴(kuò)增時(shí)，設(shè)立3個(gè)對(duì)照:陽(yáng)性對(duì)照番茄斑萎病毒RNA模板代替樣品RNA模板、陰性對(duì)照以陰性模板RNA代替樣品RNA模板、空白對(duì)照DEPC水代替樣品RNA模板。
8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，步驟3)中的電泳檢測(cè)具體為: 取1.5g瓊脂糖，于10mL電泳緩沖液中加熱，充分溶化，加入溴化乙錠貯存液至終濃度為0.5 μ g/mL，制膠，在電泳槽中加入電泳緩沖液，使液面剛剛沒(méi)過(guò)凝膠；將3 μ L?6 μ LHDA擴(kuò)增產(chǎn)物分別和適量加樣緩沖液混合，點(diǎn)樣；9V/cm恒壓電泳，直至溴酚藍(lán)指示劑迀移至凝膠中部；紫外檢測(cè)儀下觀察電泳結(jié)果并記錄。
9.上述番茄斑萎病毒RT-HDA檢測(cè)方法在番茄、辣椒上檢測(cè)番茄斑萎病毒的應(yīng)用。
【文檔編號(hào)】C12N15/11GK104450975SQ201410854297
【公開日】2015年3月25日 申請(qǐng)日期:2014年12月31日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月31日
【發(fā)明者】吳興海, 陳長(zhǎng)法, 魏曉棠, 紀(jì)瑛, 林超, 唐靜, 宋濤, 王英超 申請(qǐng)人:山東出入境檢驗(yàn)檢疫局檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心