κ-酪蛋白來源生物活性肽的制備和應用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及蛋白領域，具體涉及多個來源于κ-酪蛋白的乳源性生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ。經(jīng)過體外抗氧化實驗和體外免疫功能促進實驗，發(fā)現(xiàn)了本發(fā)明的生物活性多肽具有不同的抗氧化生物學活性和促進細胞免疫的活性；研究結果表明本發(fā)明的三種乳源性生物活性肽作為一類小分子物質具有潛在的延緩衰老的功能。另外，模擬消化實驗結果表明發(fā)現(xiàn)的三條生物活性多肽在通常的動物體內(nèi)消化條件下穩(wěn)定，不會被進一步降解，能夠被動物機體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對開發(fā)具有抗氧化功能、增強免疫功能及延緩衰老的乳制品、保健品及藥物具有十分重要的意義。
【專利說明】K-酪蛋白來源生物活性肽的制備和應用

【技術領域】
[0001] 本發(fā)明涉及蛋白領域，具體涉及多種來源于K-酪蛋白的生物活性多肽及其制備 和應用。

【背景技術】
[0002] 由于生物活性肽作為促進健康的生物活性成分，具有傳遞生理信息，調(diào)節(jié)生理功 能的作用，對于人體的神經(jīng)、消化、生殖、生長、運動、代謝、循環(huán)等系統(tǒng)的正常生理活動的維 持非常重要。它們不僅具有抗病毒、細菌、抗高血壓、降膽固醇等作用，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑 具有調(diào)節(jié)免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清除自由基具有延緩衰老的功效，是當前國際食品 界最熱門的研宄課題和極具發(fā)展前景的功能因子。各種活性肽常作為功能食品添加成分用 于食品的實踐生產(chǎn)，特別是在乳飲料、食品添加劑的應用方面已經(jīng)取得良好效果。乳源性生 物活性肽生物的功能及對消費者的健康的影響正備受重視。
[0003] 近年來，越來越多的科學研宄表明很多來源于生物蛋白的小肽具有多種生物學活 性，如激素作用、免疫調(diào)節(jié)、抗血栓、抗高血壓、降膽固醇、抑菌、抗病毒、抗癌作用等。同時， 研宄發(fā)現(xiàn)小肽可以被人體更好地吸收和利用，改變了傳統(tǒng)的蛋白質只能被降解成氨基酸才 能被吸收利用的觀點。在眾多生物蛋白中各種牛乳蛋白是非常重要的生物活性多肽來源之 一，它們被乳酸菌分解利用，并發(fā)生了一系列生理生化反應，使蛋白質變?yōu)槎嚯幕蛘哂坞x的 氨基酸，最終被人體消化吸收或通過小腸上皮細胞的吸收轉運直接進入人體的血液循環(huán)， 發(fā)揮其生物活性作用。
[0004] 因此，這些生物活性小肽不僅成為篩選藥物的天然資源寶庫，也是功能性食品工 業(yè)的主要原料成分。目前，生物活性肽的制備及其應用開發(fā)已經(jīng)成為世界范圍內(nèi)研宄的熱 點。
[0005] 免疫活性肽是繼阿片肽發(fā)現(xiàn)后首次從乳中獲得并證明其生理活性的一類生 物活性肽。1981年，Jolles等人首次發(fā)現(xiàn)，利用胰蛋白酶水解人乳蛋白，從水解物中 得到一種免疫活性肽段，其氨基酸序列為Val-Glu-Pro-Ile-Pro-Tyr，該短肽被證明在 體外實驗中能夠增強小鼠腹腔巨噬細胞對綿羊血紅細胞的吞噬作用，靜脈注射，則能 增強小鼠對肺炎克氏桿感染的抵抗能力。Elitsur等人經(jīng)胃蛋白酶處理酪蛋白得到 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu-Glu 和 Arg-Tyr-Leu-Gly-Tyr-Leu，研宄證明該兩短肽不僅具 有阿片樣活性，也具有免疫調(diào)節(jié)活性，可增強淋巴細胞增殖，提高自然殺傷細胞（NK)能力， 促進噬中性白細胞的移動。張少輝等人利用瑞士乳桿菌發(fā)酵脫脂乳獲得了生物活性多肽 QEPVL及其降解產(chǎn)物QEPV，經(jīng)過體外抗氧化實驗、體外免疫功能促進實驗，驗證了多肽QEPV 具有較好的抗氧化生物學活性和促進細胞免疫的活性，一方面能夠清除機體內(nèi)的自由基， 減少自由基對人體的傷害；另一方面，生物活性多肽QEPVL和QEPV還能夠增強機體免疫力， 增強淋巴細胞、巨噬細胞的增殖能力，使巨噬細胞一氧化氮誘生量增加，并促巨噬細胞分泌 細胞因子。
[0006] 盡管牛乳蛋白內(nèi)隱含有許多具有生物活性的肽序列，但這些生物活性肽序列只有 通過一定的手段將其釋放出來才能發(fā)揮作用。獲取乳蛋白源活性肽的主要手段有兩種：發(fā) 酵，利用微生物（乳酸菌）發(fā)酵乳源蛋白獲?。幻附?，包括來自動物的消化道酶和來自植物 和微生物的蛋白酶。
[0007] 研宄結果表明乳源性生物活性肽作為一類小分子物質，以其分子量低、活性強、用 量少的獨特優(yōu)勢，已越來越多的引起人們的重視。所以它們不僅僅作為功能性食品原料用 于各種功能性食品的制造，而且作為免疫調(diào)節(jié)劑具有調(diào)節(jié)免疫反應、抗腫瘤等功能；能夠清 除自由基具有延緩衰老的功效。此外，多數(shù)乳源性生物活性肽能夠抵抗胃腸道的消化，在小 腸內(nèi)以完整的形式被機體吸收，而不必被分解成單個氨基酸，具有易消化吸收，食用安全性 極高。因此乳源性生物活性肽的能夠提高機體抵御外界不良因素的刺激、降低機體發(fā)病率 等功能特性備受重視，有望成為具有清除自由基、減少患癌幾率和延緩衰老的非藥物性物 質原料，在功能性食品和醫(yī)藥領域具有非常廣闊的應用前景，今后必將成為國際食品界和 生物醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)界的最熱門的研宄課題，為提高人類健康水平、不得病或者說少得病、延緩衰 老、延長壽命發(fā)揮重要的作用。


【發(fā)明內(nèi)容】

[0008] 本發(fā)明的目的在于提供：
[0009] 一種分離的生物活性多肽NTVPA，其包括
[0010] (a)由 Asn-Thr-Val-Pro-Ala (SEQ ID NO :1)所示的氨基酸組成的多肽；
[0011] (b)或在SEQ ID NO :1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基 酸且具有同等活性的由（a)衍生的多肽；
[0012] 一種分離的生物活性多肽VVTIL，其包括
[0013] (c)由 Val-Val-Thr-Ile-Leu(SEQ ID NO :2)所示的氨基酸組成的多肽；
[0014] (d)或在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基 酸且具有同等活性的由（c)衍生的多肽；
[0015] -種分離的生物活性多肽PKKNQ，其包括
[0016] (e)由 Pro-Lys-Lys-Asn-Gln(SEQ ID NO :3)所示的氨基酸組成的多肽；
[0017] (f)或在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基 酸且具有同等活性的由（e)衍生的多肽。
[0018] 較優(yōu)的，所述生物活性多肽的來源為乳源性。
[0019] K-酪蛋白的氨基酸序列為既有技術，具體氨基酸序列如SEQ ID N0:4所示：
[0020] Met Met Lys SerPhePheLeu Val ValThr He LeuAlaLeuThrLeuGlyAlaGlnGlu GlnAsnGlnGluGlu Pro lie ArgCysGlu Lys Asp GluArgPhePheSer Asp Lys lie Ala Lys Tyr lie Pro lie Gln Tyr Val LeuSerArg Tyr Pro Ser Tyr GlyLeuAsn Tyr Tyr GlnGln Lys Pro Val AlaLeu lie AsnAsnGlnPheLeu Pro Tyr Pro Tyr TyrAla Lys Pro AlaAla Val ArgSer Pro AlaGln He LeuGlnTrpGln Val LeuSerAsnThr Val Pro Ala Lys SerCysGlnAlaGln Pro ThrThr Met AlaArg His Pro His Pro His Leu SerPhe Met Ala He Pro Pro Lys LysAsnGln Asp Lys ThrGlu He Pro Thr lie Asn Thr He AlaSerGlyGlu Pro ThrSerThrSerThr Pro ThrThrGluSerThr Val Leu Gly Asp Ser Pro Glu Val lie GluSer Pro ProGlu He AsnThr Val Gln Val ThrSer ThrAla Val〇
[0021] 本發(fā)明的生物活性多肽NTVPA為乳源性，具體來源于K酪蛋白，并且為K酪蛋白 (SEQ ID NO:4)第102?106位的氨基酸殘基。
[0022] 本發(fā)明的生物活性多肽VVTIL為乳源性，具體來源于κ酪蛋白（SEQ ID N0:4)第 8?12位的氨基酸殘基。
[0023] 本發(fā)明的生物活性多肽PKKNQ為乳源性，具體來源于κ酪蛋白（SEQ ID N0:4)第 131?135位的氨基酸殘基。
[0024] 較優(yōu)的，所述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ均具有體外抗氧化活性和增強機 體免疫力的功能。
[0025] 本發(fā)明的生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ均可以通過基因工程的方法和化學 方法人工合成，也可以從乳制品中通過分離純化、酶降解的方法獲得。
[0026] 本發(fā)明還公開了編碼前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ的核苷酸片段。
[0027] κ -酪蛋白的氨基酸序列以及核苷酸序列為既有技術，編碼κ -酪蛋白第102? 106位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽NTVPA，編碼κ -酪蛋白第 8?12位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽VVTIL，編碼κ -酪蛋白第 131?135位氨基酸殘基的核苷酸片段能編碼成熟的生物活性多肽PKKNQ。
[0028] 本發(fā)明第二方面公開了前述生物活性多肽的制備方法，步驟如下：
[0029] 1)發(fā)酵：將瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus)添加到脫脂乳中進行厭氧 發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳；
[0030] 2)多肽的粗提：對步驟1)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進行低溫離心分離，取上清液；
[0031] 3)多肽的純化：
[0032] a.對步驟2)的上清液進行超濾處理，收集濾液；
[0033] b.固相萃取柱分離：收集的濾液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集 生物活性多肽混合物；
[0034] 4)多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽混合物，獲 得被消化后的生物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采 用的酶為胰酶。
[0035] 本發(fā)明所述脫脂乳為經(jīng)過脫脂處理的牛乳，通常脫脂乳中脂肪含量小于0. 1%。
[0036] 較優(yōu)的，步驟1)中，瑞士乳桿菌為瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus， CICC6024)。
[0037] 較優(yōu)的，步驟1)中，所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵溫度36?38°C，發(fā)酵培養(yǎng)6? 8h ;更優(yōu)選發(fā)酵溫度37°C，發(fā)酵培養(yǎng)7h。
[0038] 較優(yōu)的，步驟2)中，所述低溫離心的條件為：4°C，8000?lOOOOrpm，離心15? 30min〇
[0039] 較優(yōu)的，步驟3) a中，所述超濾處理所采用的是截留分子量分別為3kDa的超濾管。
[0040] 更優(yōu)的，步驟3)a中，所述超濾處理過程中，轉速為4800r/min，時間為30min，離心 溫度為4°C。
[0041] 較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離，具體方法為：活化和平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋后上樣，采用洗脫液洗脫，收集所得到 的洗脫液，即包含生物活性多肽混合物。
[0042] 較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，所采用的洗脫液為甲醇和CldH2O的混 合液，所述甲醇和CldH 2O的混合液中甲醇與CldH2O的體積比為80:20,所述甲醇和CldH2O的混 合液中含有〇· 1% (v/v)的甲酸。
[0043] 較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，采用甲醇活化Waters Sep-pak C18固 相萃取柱；優(yōu)選2ml甲醇。
[0044] 較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，采用ddH20平衡Waters Sep-pak C18 固相萃取柱；優(yōu)選lmlddH20。
[0045] 較優(yōu)的，步驟3)b中，固相萃取柱分離法中，將步驟3)a中收集的濾液進行稀釋50 倍后上樣，采用400ul洗脫液洗脫。
[0046] 較優(yōu)的，步驟3)b固相萃取柱分離法中，先采用2mL甲醇活化Waters Sep-pak C18 固相萃取柱，采用ImLddH2O平衡Waters Sep-pak C18固相萃取柱；上樣樣品為2mL;將步 驟3) a中收集的濾液稀釋50倍，采用400 μ L洗脫液洗脫。
[0047] 較優(yōu)的，步驟4)所述兩步酶解法具體步驟為將步驟3)得到的含有多肽的混合物 溶于滅菌去離子水中，調(diào)節(jié)pH值為2.0±0. 1，再加入胃蛋白酶，獲得反應液，于37±0. 5°C 的恒溫水浴中保溫反應90min，獲得第一步酶解液；將第一步酶解液的pH值調(diào)整為 7. 5±0. 1，并加入胰酶，于37±0. 5°C的恒溫水浴中保溫反應150min，獲得第二步酶解液； 將第二步酶解液采用沸水浴法使酶失活，時間為5min，獲得酶解產(chǎn)物；采用冷凍干燥獲得 粉狀酶解產(chǎn)物。
[0048] 更優(yōu)選的，所述沸水浴法為95°C水浴法。
[0049] 較優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶10?30mg/g底物；所述胰酶 的添加量為胰酶30?50mg/g底物。
[0050] 更優(yōu)的，步驟4)所述胃蛋白酶的添加量為胃蛋白酶20mg/g底物；所述胰酶的添加 量為胰酶40mg/g底物。
[0051] 較優(yōu)的，提取分子量為501. 26Da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽NTVPA ;提取 分子量為544. 38Da的多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽VVTIL ;提取分子量為614. 37Da的 多肽的洗脫峰，即為生物活性多肽PKKNQ。
[0052] 在本發(fā)明中，已知NTVPA的分子量，提取分子大小為501. 26Da的洗脫峰，即為本發(fā) 明的生物活性多肽NTVPA。具體的，本發(fā)明NTVPA分子大小為501. 26Da的洗脫峰其保留時 間為 I. 93min。
[0053] 在本發(fā)明中，已知VVTIL的分子量，提取分子大小為544. 38Da的洗脫峰，即為本發(fā) 明的生物活性多肽VVTIL。具體的，本發(fā)明NTVPA分子大小為544. 38Da的洗脫峰其保留時 間為 7. 30min。
[0054] 在本發(fā)明中，已知PKKNQ的分子量，提取分子大小為614. 37Da的洗脫峰，即為本發(fā) 明的生物活性多肽PKKNQ。具體的，本發(fā)明PKKNQ分子大小為614. 37Da的洗脫峰其保留時 間為 10. 36min。
[0055] 本發(fā)明第三方面公開了前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ或其衍生物在制 備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應用。
[0056] 本發(fā)明的生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ、或其衍生物可以用于酸奶等乳制品 以及各種食品、減少自由基對皮膚傷害的化妝品；并且由于本發(fā)明的生物活性多肽NTVPA、 VVTIL、PKKNQ能夠通過胃腸道直接吸收不被降解，因此可以用于制備提高免疫力的保健品， 或者用于制備具有抗氧化和/或增強機體免疫力的藥物。
[0057] 本發(fā)明第四方面公開了一種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、 PKKNQ或前述生物活性多肽的衍生物。
[0058] 本發(fā)明第五方面公開了一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽NTVPA、 VVTIL、PKKNQ或前述生物活性多肽的衍生物。
[0059] 本發(fā)明第六方面公開了 一種潛在的延緩衰老/抗衰老的保健產(chǎn)品，包含前述生物 活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ或前述生物活性多肽的衍生物。
[0060] 所述多肽的衍生物，是指在多肽的氨基酸側鏈基團上、氨基端或羧基端進行羥基 化、羧基化、羰基化、甲基化、乙酰化、磷酸化、酯化或糖基化等修飾，得到的多肽衍生物。
[0061] 本發(fā)明生物活性多肽的有益效果為：本發(fā)明的乳源性生物活性多肽NTVPA、 VVTIL、PKKNQ具有很好的抗氧化活性和促進機體免疫力活性；一方面能夠清除機體內(nèi)的自 由基，減少自由基對人體的傷害；另一方面，本發(fā)明的生物活性多肽還能夠增強機體免疫 力，增強巨噬細胞的吞噬功能，提高機體抵御外界病原體感染的能力，降低機體發(fā)病率，而 且模擬消化實驗結果表明發(fā)現(xiàn)的三條生物活性多肽在通常的動物體內(nèi)消化條件下穩(wěn)定，不 會被進一步降解，能夠被動物機體直接吸收利用發(fā)揮其具有的生物活性功能，對開發(fā)具有 抗氧化功能、增強免疫功能、延緩衰老的食品、保健品和藥品具有十分重要的意義和應用價 值。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0062] 圖1 :瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物的洗脫圖譜
[0063] 圖2 :質量色譜提取圖（m/z = 501. 26)
[0064] 圖3 :質荷比為501. 26的片段的一級質譜圖
[0065] 圖4 :質量色譜提取圖（m/z = 544. 38)
[0066] 圖5 :質荷比為544. 38的片段的一級質譜圖
[0067] 圖6 :質量色譜提取圖（m/z = 614. 37)
[0068] 圖7 :質荷比為614. 37的片段的一級質譜圖
[0069] 圖8 :質荷比為501. 26的片段的二級質譜圖
[0070] 圖9 :質荷比為501. 26預測得到的序列的az，by斷裂情況（NTVPA)
[0071] 圖10 :質荷比為544. 38的片段的二級質譜圖
[0072] 圖11 :質荷比為544. 38預測得到的序列的az，by斷裂情況（VVTIL)
[0073] 圖12 :質荷比為614. 37的片段的二級質譜圖
[0074] 圖13 :質荷比為614. 37預測得到的序列的az，by斷裂情況（PKKNQ)
[0075] 圖14 :對照組質量色譜提取圖（m/z = 544. 38)
[0076] 圖15 :對照組質荷比為544. 38的片段的一級質譜圖
[0077] 圖16 :對照組質荷比為544. 38的片段的二級質譜圖
[0078] 圖17 :對照組質荷比為544. 38預測得到的序列的az，by斷裂情況（VVTIL)
[0079] 圖18 :Trolox標準曲線

【具體實施方式】
[0080] 在進一步描述本發(fā)明【具體實施方式】之前，應理解，本發(fā)明的保護范圍不局限于下 述特定的具體實施方案；還應當理解，本發(fā)明實施例中使用的術語是為了描述特定的具體 實施方案，而不是為了限制本發(fā)明的保護范圍。
[0081] 當實施例給出數(shù)值范圍時，應理解，除非本發(fā)明另有說明，每個數(shù)值范圍的兩個端 點以及兩個端點之間任何一個數(shù)值均可選用。除非另外定義，本發(fā)明中使用的所有技術和 科學術語與本【技術領域】技術人員通常理解的意義相同。除實施例中使用的具體方法、設備、 材料外，根據(jù)本【技術領域】的技術人員對現(xiàn)有技術的掌握及本發(fā)明的記載，還可以使用與本 發(fā)明實施例中所述的方法、設備、材料相似或等同的現(xiàn)有技術的任何方法、設備和材料來實 現(xiàn)本發(fā)明。
[0082] 除非另外說明，本發(fā)明中所公開的實驗方法、檢測方法、制備方法均采用本技術 領域常規(guī)的分子生物學、生物化學、染色質結構和分析、分析化學、細胞培養(yǎng)、重組DNA技 術及相關領域的常規(guī)技術。這些技術在現(xiàn)有文獻中已有完善說明，具體可參見Sambrook 等 MOLECULAR CLONING :A LABORATORY MANUAL，Second edition，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989and Third edition，2001;Ausubel 等，CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY,John ffiley&Sons,New York,1987and periodic updates ；the series METHODS IN ENZYM0L0GY,Academic Press,San Diego ；ffolffe,CHROMATIN STRUCTURE AND FUNCTION， Third edition， Academic Press， San Diego,1998 ;METH0DS IN ENZYM0L0GY， Vol. 304,Chromatin(P. M. Wassarman and A. P. ffolffe,eds.) ,Academic Press，San Diego， 1999;和 METHODS IN MOLECULAR BIOLOGY，Vol. 119, Chromatin Protocols(P.B. Becker， ed. )Humana Press，Totowa，1999 等。
[0083] 實施例I活性肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ的制備
[0084] -、瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的制備
[0085] 采用脫脂奶粉（新西蘭NZMP牌脫脂奶粉）與水配置12wt%的脫脂乳（12wt%的脫 脂乳的制備為將12g脫脂奶粉加入到88g水中，下同）。隨后，將購買的菌種活化即以2% 的量接種到12% (W/V)的滅菌脫脂乳中培養(yǎng)，溫度37°C，培養(yǎng)時間7h，即完成瑞士乳桿菌的 活化，連續(xù)活化2次，制得發(fā)酵乳，作為瑞士乳桿菌發(fā)酵乳發(fā)酵劑備用。
[0086] 取IOmL已制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵劑接種到500mL已滅菌的12wt%脫脂乳中（接 種率為2v/v% )，37°C發(fā)酵7小時后，攪開凝乳后，在4°C條件下保存，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵 乳。二、生物活性多肽混合物的制得和確認
[0087] 1.實驗方法
[0088] 1)樣品處理
[0089] 分別將前一步驟制備的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳和對照發(fā)酵乳，以及12wt%的脫脂乳裝 入離心管中進行低溫離心，離心條件為9000rpm/min，4°C，20min。離心后棄沉淀，取上清液。
[0090] 將上清液分別倒入超濾管中，濾膜的截留分子量為3kDa，超濾過程中，轉速為 4800r/min，時間為30min，離心溫度為4°C。收集瑞士乳桿菌發(fā)酵乳的濾液，于_4°C冷凍保 存。
[0091] 將2mL超濾液稀釋50倍后固相萃取，用ImL C18小柱，2mL甲醇活化柱子，ImLddH2O 平衡柱子，上樣樣品為2mL稀釋50倍后的濾液，最后400 μ L洗脫液洗脫，其中洗脫液為 80:20v/v甲醇/水和0· I % v/v的甲酸。
[0092] 將得到的洗脫液氮吹后凍干成干粉，后模擬胃腸道消化實驗：首先，采用滅菌去離 子水溶解干粉，在溶液中加入胃蛋白酶（購自Sigma公司），比例是每克樣品加入胃蛋白酶 20mg，調(diào)節(jié)反應液的pH值至2. 0,在37°C恒溫水浴中保溫90min ;然后將反應液的pH值調(diào) 整至7. 5,加入胰酶（Corolase PP，購自德國AB公司），比例是每克樣品加入胰酶40mg，在 37°C恒溫水浴中保溫150min ;最后置于95°C水浴中加熱5min使酶失活。同時設置對照組， 除不加入胃蛋白酶和胰蛋白酶外，在相同時間做相同的PH和溫度處理。將對照組和樣品組 真空冷凍干燥成粉末后，存儲于_80°C備用。
[0093] 2)液質分析
[0094] 液相色譜條件：
[0095] 儀器：Waters ACQUITY UPLC超高效液相色譜儀
[0096] 色譜柱規(guī)格：CSH C18色譜柱
[0097] 流速：0. 4mL/min
[0098] 溫度：45°C
[0099] 紫外檢測波長：220nm
[0100] 進樣量：5 μ L
[01 01 ]流動相 A 液：ddH20
[0102] 流動相B液：乙腈溶液
[0103] 梯度條件：0min-2. 5min 保持 99 % A 液，1 % B 液；2. 5min-5minB 液從 1 % 變 為5 %，A液從99 %變?yōu)?5 % ;5min-10minB液從5 %變?yōu)?0 %，A液從95 %變?yōu)?0 % ; 10min-17min% B 液從 10%變?yōu)?25%，A 液從 90%變?yōu)?75% ;17min-22min，B 液從 25%變 為 40 %，A 液從 75 % 變?yōu)?60 % ; 22min-27min，B 液從 40 % 變?yōu)?80 %，A 液從 60 % 變?yōu)?20 % ; 2711^11-29111丨11，8液從80%變?yōu)?00%，4液為0%，保持2111丨11;31111丨11-31.5111丨11，8液從100% 變?yōu)? %，A液從0 %變?yōu)?5 % ;31. 5min-32min，B液從5 %變?yōu)? %，A液從95 %變?yōu)?9 % ; 32min-34min，保持 99% A 液，1 % B 液。
[0104] 質譜條件：
[0105] 離子方式：ES+
[0106] 質量范圍（m/z) :50-2000
[0107] 毛細管電壓（Capillary) (kV) :3· 0
[0108] 采樣錐（V) :35.0
[0109] 離子源溫度（°C )) :105
[0110] 去溶劑溫度（°C ) :350
[0111] 錐孔氣流量（L/Hr) :50. 0
[0112] 去溶劑氣流（L/hr) :600. 0
[0113] 碰撞能量（eV):6. 0
[0114] 碰撞氣流（ml/min) :0· 6
[0115] 掃描時間（sec) :0· 26
[0116] 內(nèi)掃描時間（sec) :0· 02
[0117] 根據(jù)上述實驗條件，利用Masslynx軟件分析，得到瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物中 多肽物質保留時間和分子量，如表1所示，用Masslynx軟件提取多肽的質量色譜提取圖、一 級質譜圖，見圖2-7。
[0118] 表1瑞士乳桿菌發(fā)酵乳消化產(chǎn)物中的多肽核質比
[0119]

【權利要求】
1. 一種分離的生物活性多肽NTVPA，其包括 (a) 由SEQ ID NO :1所示的氨基酸組成的多肽； (b) 或在SEQ ID NO: 1所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且 具有同等活性的由（a)衍生的多肽； 一種分離的生物活性多肽VVTIL，其包括 (c) 由SEQ ID NO :2所示的氨基酸組成的多肽； (d) 或在SEQ ID NO :2所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且 具有同等活性的由（c)衍生的多肽； 一種分離的生物活性多肽PKKNQ，其包括 (e) 由SEQ ID NO :3所示的氨基酸組成的多肽； (f) 或在SEQ ID NO :3所示的氨基酸序列中經(jīng)取代、缺失或添加一個或幾個氨基酸且 具有同等活性的由（e)衍生的多肽。
2. 編碼權利要求1所述生物活性多肽NTVPA、VVTIUPKKNQ的核苷酸片段。
3. 權利要求1所述生物活性多肽的制備方法，步驟如下： 1) 發(fā)酵：將瑞士乳桿菌添加到脫脂乳中進行厭氧發(fā)酵，獲得瑞士乳桿菌發(fā)酵乳； 2) 多肽的粗提：對步驟1)的瑞士乳桿菌發(fā)酵乳進行低溫離心分離，取上清液； 3) 多肽的純化： a. 對步驟2)的上清液進行超濾處理，收集濾液； b. 固相萃取柱分離：收集的濾液采用Waters Sep-pak C18固相萃取柱萃取，收集生物 活性多肽混合物； 4) 多肽的消化及穩(wěn)定性：采用兩步酶解法酶解步驟3)的生物活性多肽混合物，獲得生 物活性多肽混合物；第一步酶解所采用的酶為胃蛋白酶，第二步酶解所采用的酶為胰酶。
4. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟1)所述厭氧發(fā)酵的條件為：發(fā)酵 溫度36?38°C，發(fā)酵時間6?8h。
5. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟2)中，所述低溫離心的條件為： 4°C，8000 ?lOOOOrpm，離心 15 ?30min。
6. 如權利要求3所述的制備方法，其特征在于，步驟3) a所述超濾處理所采用的是截留 分子量分別為3kDa的超濾管；所述超濾處理過程中，轉速為4800r/min，時間為30min，離心 溫度為4°C。
7. 權利要求1所述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ或前述生物活性多肽的衍生物 在制備抗氧化和/或增強機體免疫力的食品、保健品及藥物中的應用。
8. -種抗氧化藥物，包含前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ或前述生物活性多肽 的衍生物。
9. 一種增強機體免疫力藥物，包含前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、PKKNQ或前述生物 活性多肽的衍生物。
10. -種潛在的延緩衰老/抗衰老的健康產(chǎn)品，包含前述生物活性多肽NTVPA、VVTIL、 PKKNQ或前述生物活性多肽的衍生物。
【文檔編號】C12P21/06GK104479001SQ201410809413
【公開日】2015年4月1日 申請日期:2014年12月19日 優(yōu)先權日:2014年12月19日
【發(fā)明者】張少輝, 徐海紅, 金贏凱, 周婕慧, 胡亞菁, 沈鵬, 程志才 申請人:上海交通大學