一種編碼紅肉桃myb10轉(zhuǎn)錄因子的dna序列及應(yīng)用的制作方法
【專利摘要】本發(fā)明涉及植物基因工程領(lǐng)域，提供了一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示，該DNA序列與質(zhì)粒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體、經(jīng)上述重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。本發(fā)明通過RACE-PCR技術(shù)克隆紅肉桃花青苷生物合成的轉(zhuǎn)錄因子PpMYB10基因，為桃優(yōu)異基因資源的保存提供保證，為利用基因工程手段培育富含花青苷的新型水果品種提供基石。本發(fā)明對培育紅色水果新品種具有重要意義，也為建立以花青素基因作為報(bào)告基因的植物轉(zhuǎn)基因可視化跟蹤表達(dá)系統(tǒng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)和基因資源。
【專利說明】一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列及應(yīng)用 【【技術(shù)領(lǐng)域】】
[0001] 本發(fā)明涉及基因工程【技術(shù)領(lǐng)域】，具體地說是一種編碼紅肉桃MYBlO轉(zhuǎn)錄因子的 DNA序列及應(yīng)用。 【【背景技術(shù)】】
[0002] 桃（Prunus persica(L. )Batsch)起源于中國，已有4000多年的栽培歷史（汪祖華 和莊恩及，2001)。我國桃資源豐富，桃果肉顏色可分為白色、黃色和紅色及其各種過渡色。 目前國內(nèi)外栽培桃?guī)缀醵际前兹夂忘S肉類型。而紅肉桃因?yàn)榭谖遁^酸等一直未受重視。紅 肉桃是一類數(shù)量稀少的桃種質(zhì)資源，具有重要的生產(chǎn)價值和育種價值。紅肉桃中花青素和 多酚含量明顯高于白肉和黃肉桃品種，其抗氧化能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于后兩種桃。目前，具有生物活 性物質(zhì)的紅色水果已成為當(dāng)前功能性水果開發(fā)研宄的熱點(diǎn)之一，頗具市場魅力。因此，積極 研宄紅肉桃著色機(jī)理對保護(hù)我國基因資源、推動桃品質(zhì)改良具有重要意義。
[0003] 紅肉桃果實(shí)的紅色來自于花青苷。花青苷的顏色主要由花青素結(jié)構(gòu)決定?；ㄇ?素是一種廣泛存在于植物中的黃酮類化合物，它是由一系列附著于細(xì)胞膜和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上 的酶催化合成，然后運(yùn)輸并積累在維管植物液泡中。在自然界中最常見的花青苷為矢車菊 素-3-葡萄糖苷。
[0004] 許多研宄表明，花青苷在疾病預(yù)防和抑制腫瘤發(fā)育方面有顯著療效。近年來，為了 滿足消費(fèi)者對桃的果品類型需求多樣化和營養(yǎng)科學(xué)的要求，果樹育種者致力于培育綜合品 質(zhì)優(yōu)良的紅肉品種，發(fā)揮果實(shí)的營養(yǎng)保健作用。
[0005] 隨著分子生物學(xué)、基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，進(jìn)一步闡明花青素合成的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)， 對于研宄花青素的生物學(xué)功能，利用基因工程技術(shù)改變花青素含量具有重要意義。
[0006] MYB是一類廣泛存在的保守的轉(zhuǎn)錄因子，是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一，廣泛 參與各種生命活動。包括三個不完全的重復(fù)，根據(jù)重復(fù)序列的數(shù)目，分為R1MYB、R2R3MYB和 R1R2R3MYB三類。在擬南芥中已發(fā)現(xiàn)130多種MYB類轉(zhuǎn)錄因子，根據(jù)其功能分為24個亞類， 其中第10亞類主要參與花青素的代謝調(diào)節(jié)。MYBlO基因組序列較為保守，通常含兩個內(nèi)含 子，第二個內(nèi)含子的長度在不同物種中差異較大。如蘋果第二內(nèi)含子為2995bp，擬南芥則為 89bp。擬南芥存在TT2、PAP1/PAP2等多種MYBlO基因，它們均特異調(diào)控花色素合成途徑的 結(jié)構(gòu)基因的時空表達(dá)模式和表達(dá)強(qiáng)度。
[0007] 目前對紅肉桃的呈色機(jī)理及其遺傳特性的研宄很少，紅肉桃果實(shí)花青苷生物合成 相關(guān)基因在紅肉桃中也尚未克隆。因此，深入系統(tǒng)研宄果實(shí)著色機(jī)理對園藝產(chǎn)品品質(zhì)改良 具有普遍意義，這對提高我國水果市場競爭力和提高果實(shí)綜合品質(zhì)具有特殊意義。 【
【發(fā)明內(nèi)容】
】
[0008] 本發(fā)明的目的是針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種編碼紅肉桃MYB轉(zhuǎn)錄因子的 DNA序列。
[0009] 其核苷酸序列如SEQ ID NO. 12所示，或與核苷酸序列如SEQ ID NO. 12互補(bǔ)的核 苷酸序列。
[0010] 本發(fā)明的第二個目的在于提供含有所述紅肉桃MYBlO轉(zhuǎn)錄因子基因的重組表達(dá) 載體。
[0011] 本發(fā)明的第三個目的在于提供質(zhì)粒，所述質(zhì)粒為PBI121。
[0012] 本發(fā)明的第四個目的在于提供含有所述紅肉桃MYBlO轉(zhuǎn)錄因子基因的宿主細(xì)胞。
[0013] 本發(fā)明的第五個目的在于提供一種編碼紅肉桃MYBlO轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列的應(yīng) 用。
[0014] 為實(shí)現(xiàn)上述第二及第三個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種重組表達(dá)載體， 所述的載體是由如上所述的DNA序列與質(zhì)粒或病毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體，所述的質(zhì)粒是 pBI121。所述的載體是通過下列步驟構(gòu)建的：a)把如上所述的DNA序列連入載體pMD 19-T， 得到載體pMD 19-T-PpMYB10;b)以重組載體pMD 19-T-PpMYB10 為模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17所示的DNA序列為引物擴(kuò)增得到含有BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)的ΡρΜΥΒΙΟ 基因片段，用BamH I和Sac I雙酶切后與BamH I和Sac I雙酶切pBI121回收的大片段連 接，獲得載體 PB 1121 -PpMYB 10。
[0015] 為實(shí)現(xiàn)上述第四個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種基因工程化的宿主細(xì)胞， 所述的宿主細(xì)胞是用如上任一所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。 所述的宿主細(xì)胞是細(xì)菌細(xì)胞、真菌細(xì)胞、植物細(xì)胞或動物細(xì)胞，或這些宿主細(xì)胞的后代。所 述的宿主細(xì)胞是農(nóng)桿菌細(xì)胞。
[0016] 為實(shí)現(xiàn)上述第五個目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案是：一種轉(zhuǎn)基因煙草愈傷組織和 植株呈現(xiàn)紫紅色的方法，所述的方法包括以下步驟：(a)構(gòu)建如上所述的重組表達(dá)載體； (b)利用步驟（a)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞，獲得工程菌；(c)利用步驟 (b)獲得的工程菌轉(zhuǎn)化煙草植株。所述的煙草植株是"Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN"煙草植株。
[0017] 本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化，將紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子基因 PpMYB 10轉(zhuǎn)入煙草中，通過調(diào) 控代謝途徑，在煙草中合成花青苷。本發(fā)明的基因?qū)ε嘤t色水果新品種具有重要意義，也 為建立以花青素基因作為報(bào)告基因的植物轉(zhuǎn)基因可視化跟蹤表達(dá)系統(tǒng)奠定技術(shù)基礎(chǔ)和基 因資源。 【【專利附圖】

【附圖說明】】
[0018] 圖1紅肉桃MYBlO轉(zhuǎn)錄因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ的PCR擴(kuò)增電泳圖（Ml :Marker ;M2 : IOObp DNA Ladder ;A:PpMYB10 片段擴(kuò)增產(chǎn)物；B :5' RACE Inner PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；C : 5' RACE Outer PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；D :3' RACE Outer PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；E :3' RACE Inner PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物；F :PpMYB10全長擴(kuò)增產(chǎn)物）；
[0019] 圖2表達(dá)載體pBim-PpMYBlO構(gòu)建示意圖；
[0020] 圖3表達(dá)載體PBim-PpMYBlO的T-DNA結(jié)構(gòu)圖；
[0021] 圖4轉(zhuǎn)基因煙草的ΡρΜΥΒΙΟ基因的PCR檢測電泳圖（M3 :2-Log DNA Ladder(0. 1-10. Okb) ;1 :陽性對照；2 :空白對照；3 :未轉(zhuǎn)化植株；Rl?R13 :轉(zhuǎn)化植株）；
[0022] 圖5紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子基因 ΡρΜΥΒΙΟ在煙草愈傷組織和植株中的表達(dá)結(jié) 果（Α :轉(zhuǎn)化ρΒΙ121的煙草愈傷組織；B :轉(zhuǎn)化pBim-PpMYBlO的煙草愈傷組織；C :轉(zhuǎn)化 PBI121的煙草植株；D :轉(zhuǎn)化pBI121-PpMYB10的煙草植株）。 【【具體實(shí)施方式】】
[0023] 以下結(jié)合具體實(shí)施例對本發(fā)明的技術(shù)路線做進(jìn)一步詳細(xì)說明。
[0024] 實(shí)施材料：
[0025] 培養(yǎng)基：（I)LB培養(yǎng)基：配方為酵母提取物5g，胰蛋白胨10g，NaCl 10g，pH 7. 2,固 體培養(yǎng)基加入瓊脂15g/100L。（2) YEB培養(yǎng)基，配方為牛肉浸膏5g/L，酵母膏l(xiāng)g/L，蛋白胨 5g/L，蔗糖5g/L，MgSO4 · 7H20 4g/L，pH 7. 4,固體培養(yǎng)基加入瓊脂15g/L。（3)MS培養(yǎng)基配 置見表1，培養(yǎng)基Hp H2、成配方如表2所不。
[0026] 表I MS培養(yǎng)基母液的配置
[0027]
【權(quán)利要求】
1. 一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列，其特征在于：DNA序列包括： (a) SEQ ID NO. 12所述的核苷酸序列，或 (b) 與（a)所述的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列。
2. 含有權(quán)利要求1所述基因的重組表達(dá)載體，所述重組表達(dá)載體由所述DNA序列與質(zhì) 粒或病毒所構(gòu)建的重組表達(dá)載體。
3. 根據(jù)權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述的質(zhì)粒是pBI 121。
4. 根據(jù)權(quán)利要求2所述基因的重組表達(dá)載體，其特征在于：所述重組表達(dá)載體是通過 下列步驟構(gòu)建的： (1) 將所述DNA序列連入載體pMD 19-T，得到載體pMD19 T-PpMYB10; (2) 以 pMD19 T-PpMYB10 為模板，以 SEQ ID NO. 16 和 SEQ ID NO. 17 所示的 DNA 序列 為引物擴(kuò)增得到含有BamH I和Sac I酶切位點(diǎn)的PpMYBlO基因片段，用BamH I和Sac I 雙酶切后回收再與BamH I、Sac I雙酶切pBI121回收的大片段連接，獲得重組表達(dá)載體 pBI121-PpMYB10。
5. 含有權(quán)利要求1所述基因的宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞是用權(quán)利要求2-4任一所述 的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞及其后代細(xì)胞。
6. 根據(jù)權(quán)利要求5所述基因的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為細(xì)菌細(xì)胞、真菌 細(xì)胞、植物細(xì)胞、動物細(xì)胞中的任意一種或者其宿主細(xì)胞的后代。
7. 根據(jù)權(quán)利要求5所述基因的宿主細(xì)胞，其特征在于：所述宿主細(xì)胞為農(nóng)桿菌細(xì)胞。
8. 根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列的應(yīng)用，其特征 在于：通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)，獲得含有編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA的煙草轉(zhuǎn)化植株，包括 以下步驟： (a) 構(gòu)建如權(quán)利要求4所述的重組表達(dá)載體； (b) 利用步驟（a)所述的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌，獲得工程菌； (c) 利用步驟（b)獲得的工程菌轉(zhuǎn)化煙草植株。
9. 根據(jù)權(quán)利要求8所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列的應(yīng)用，其特征 在于，所述的煙草植株是"Nicotiana tabacum L.cv.Samsun NN"煙草植株。
10. 根據(jù)權(quán)利要求8或9所述的一種編碼紅肉桃MYB10轉(zhuǎn)錄因子的DNA序列的應(yīng)用，其 特征是在于：所述DNA序列在煙草中表達(dá)，能有效地調(diào)控?zé)煵莼ㄇ嗨卮x途徑，獲得紫紅色 愈傷組織和紫紅色煙草植株。
【文檔編號】C12N1/15GK104498506SQ201410798349
【公開日】2015年4月8日 申請日期:2014年12月15日 優(yōu)先權(quán)日:2014年12月15日
【發(fā)明者】樊連梅, 劉更森, 原永兵 申請人:青島農(nóng)業(yè)大學(xué)